مقالة منهجية

عرض توضيحي للانتقال الغشائي للهستيدين باستخدام أكياس الماعز المعوية المقلوبة: أداة تربوية تجريبية للطلاب الجامعيين

DOI:

10.3791/66882

⸱

أكتوبر 4, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Sri Venkateswara College, University of Delhi

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نبلغ عن طريقة غير مكلفة وقابلة للتكرار توضح نقل غشاء الهستيدين في أمعاء الماعز. تحدث هذه العملية عن طريق النقل المشترك لأيونات الهستيدين والصوديوم التي يتيحها تدرج الصوديوم عبر غشاء الخلايا المعوية. تستغل هذه الطريقة طرق تدريس التعلم التجريبي لفهم حركة المذاب عبر الأغشية البيولوجية بشكل أفضل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهستيدين هو حمض أميني أساسي وهو أيضا مقدمة للمستقلبات المتورطة في الجهاز المناعي والتهوية الرئوية والدورة الدموية الوعائية. يعتمد امتصاص الهستيدين الغذائي إلى حد كبير على نقل الأحماض الأمينية المحايدة المقترنة بالصوديوم بواسطة ناقل الأحماض الأمينية المحايد الواسع (B0AT) الموجود على الغشاء القمي للخلية المعوية. هنا ، نوضح امتصاص الهيستيدين من قبل الخلايا المعوية الزغبية المعوية من التجويف باستخدام أكياس الماعز المقلوبة صائم. تم فحص الأكياس الصائمية المعرضة لتركيزات متفاوتة من الصوديوم والهستيدين لتحديد تركيز الهستيدين داخل الأكياس كدالة للوقت. تظهر النتائج امتصاص الهستيدين النشط. أدت زيادة تركيز الملح إلى امتصاص أعلى للهيستيدين ، مما يشير إلى وجود تناسق بين امتصاص الصوديوم والهستيدين في الأكياس المقلوبة المعوية للماعز. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لتصور الحركة المعوية للأحماض الأمينية أو المستقلبات الأخرى مع التعديلات المناسبة. نقترح هذه التجربة كأداة تربوية تجريبية يمكن أن تساعد الطلاب الجامعيين على فهم مفهوم النقل الغشائي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحاط الخلايا البيولوجية بطبقة ثنائية دهنية غشائية تفصل السيتوسول داخل الخلايا عن المحتوى خارج الخلية. يعمل الغشاء كحاجز شبه نافذ ينظم حركة المواد المذابة1. يتأثر النقل عبر الأغشية الحيوية بمعامل نفاذية المذاب، الذي يعتمد على عدة عوامل، بما في ذلك تركيز المذاب وشحنته. بشكل عام ، تتحرك المواد المذابة عبر الغشاء باستخدام ثلاث آليات (الشكل 1): الانتشار السلبي ، والانتشار الميسر ، والنقل النشط2. الانتشار البسيط هو العملية التي تمر من خلالها المواد المذابة القابلة للذوبان وغير المشحونة وغير القطبية عبر تدرج تركيزها عبر غشاء شبه منفذ (الشكل 1 أ). لا تساعد البروتينات الغشائية في هذه العملية؛ لأنها تتضمن حركة المواد المذابة من منطقة ذات تركيز أعلى إلى منطقة ذات تركيز أقل. يعتمد معدل الانتشار على قانون فيك3. من ناحية أخرى ، فإن الانتشار الميسر هو نقل يعتمد على البروتين حيث يسمح الغشاء فقط للمواد المذابة الانتقائية بالمرور على طول تدرج التركيز دون إنفاق الطاقة (الشكل 1 ب). هذا النوع من النقل محدد ويختلف عن الانتشار البسيط في إظهار حركية التشبع.

النقل النشط هو نقل يعتمد على البروتين للجزيئات مقابل تدرج تركيزها ، أي من منطقة التركيز المنخفض إلى منطقة ذات تركيز أعلى باستخدام ATP أو التدرجات الأيونية (الشكل 1C). عندما يتحلل الناقل ATP ، يطلق على النقل النقل النشط الأساسي (الشكل 1C ؛ اللوحة اليسرى). شكل آخر من أشكال النقل النشط هو النقل النشط الثانوي (الشكل 1C ؛ اللوحة اليمنى). في النقل النشط الثانوي، تتحرك المواد المذابة بناء على تدرج كهروكيميائي. يحدث ذلك عندما يقرن بروتين ناقل حركة أيون (عادة Na +) أسفل تدرج تركيزه بحركة جزيء آخر أو أيون مقابل تدرج تركيزه. يمكن أن يكون هذا النوع من حركة المذاب عبارة عن نقل مشترك (Symport) حيث يتحرك كل من المذاب والأيون في نفس الاتجاه أو تبادل (Antiport) ، وفي هذه الحالة يتحرك المذاب والأيون في اتجاهين متعاكسين.

يتم امتصاص الأحماض الأمينية الغذائية والسكريات الأحادية من مصادر الغذاء في الأمعاء الدقيقة. يمكن تقسيم الأمعاء الدقيقة وظيفيا إلى ثلاثة أجزاء: الاثني عشر والصائم والدقاق (الشكل 2). يحدث امتصاص المذاب في جميع أنحاء الأمعاء الدقيقة، مع حدوث أقصى امتصاص عند الصائم وعند الطرف القريب من الدقاق. الخلايا المعوية المعوية هي خلايا مستقطبة ، والوصلات الضيقة التي تربط خليتين متجاورتين تخلق موقعين غشائيين متميزين - موقع الغشاء القاعدي والقمي (الشكل 2). يحدث امتصاص المواد المذابة اللمعية الناتجة عن الهضم في موقع الغشاء القمي4.

يعد نقل الهستيدين في الخلايا المعوية المعوية المعوية في الغشاء القمي مثالا على التماثل النشط الثانوي الذي يعتمد على الصوديوم. في النهاية القاعدية ، ينتقل الهستيدين الذي يدخل الخلية المعوية إلى أسفل تدرج التركيز في الدورة البابية الكبدية. يتم الحفاظ على تركيزات الصوديوم داخل الخلايا المعوية عند 12 مليمول / لتر1 ، وهو أقل من التركيزات خارج الخلية / اللمعية ، بسبب الضخ النشط للصوديوم خارج الخلية بواسطة Na + K + ATPase الموجود على الغشاء القاعدي (الشكل 3). في الغشاء القمي للخلايا المعوية ، يعد B0AT وناقل الأحماض الأمينية المحايدة الصوديوم (SNAT) 5 من الناقلات الرئيسية التي لا تنقل الهستيدين فحسب ، بل تنقل أيضا الأحماض الأمينية مثل الهليون والجلوتامين في النقل المشترك المعتمد على الصوديوم 5,6. بروتين نقل آخر يسمى ناقل الأحماض الأمينية الكبيرة (LAT)1 الموجود في الغشاء القاعدي للخلايا المعوية ينقل الأحماض الأمينية المحايدة الكبيرة مثل الليوسين والتريبتوفان والتيروزين والفينيل ألانين عبر الغشاء7.

بهدف تدريس مفهوم النقل الغشائي المتكامل مع تقنيات مثل القياس الطيفي والمقايسات الكيميائية الحيوية الروتينية من خلال علم أصول التدريس التجريبي ، من الضروري تطوير منهجيات لا يمكنها فقط إظهار المفهوم بعبارات سهلة الفهم ولكن أيضا تمكين التعلم التشاركي للطلاب الجامعيين. حاليا ، هناك موارد محدودة متاحة للطلاب للمشاركة العملية لتعلم مفاهيم الكيمياء الحيوية هذه. هنا ، نبلغ عن بروتوكول بسيط لإثبات انتقال الهستيدين عبر غشاء معوي الماعز يسهل إعادة إنتاجه في المختبرات الجامعية ويمكن تكييفه لتقييم نقل المستقلبات الأخرى أيضا. والأهم من ذلك ، أن الطريقة تستخدم مواد غير مكلفة في مختبر جامعي ، مما يتيح التعلم التجريبي حتى في أبسط الإعدادات المختبرية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تصوير البروتوكول بأكمله مع جميع الخطوات كمخطط تخطيطي في الشكل 4. تم تكييف الطريقة من دراسة سابقة باستخدام أمعاء الفئران8. تم إجراء التجربة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. تم شراء العينات المستخدمة في هذه الدراسة من بائع تجاري.

تنبيه: ارتد قفازات أثناء هذه التجربة.

1. تحضير أكياس الصائم المقلوبة

  1. قبل معالجة وتنظيف الصائم الماعز.
    1. اشتر أحشاء ماعز صحي تم التضحية به حديثا من بائع مرخص.
    2. ضع الأحشاء في محلول ملحي عازل 1x 1x (PBS) بحيث يتم غمرها بالكامل للتنظيف.
    3. افصل الأمعاء الدقيقة عن الأمعاء الغليظة ، وتأكد من إزالة النسيج الضام الخارجي باستخدام المقص.
    4. اغسل الأمعاء الدقيقة برفق باستخدام 1x PBS باستخدام حقنة سعة 10 مل ، مما يضمن إزالة المواد الغذائية غير المهضومة للحصول على كيس مجوف من الأمعاء الدقيقة. كرر هذه العملية ثلاث مرات على الأقل لتنظيف فعال.
      ملاحظة: تجنب استخدام القوة المفرطة أو الإبر أثناء التنظيف. يمكن أن يؤدي استخدام القوة إلى ثقب جدران الأمعاء وبالتالي إتلاف الخلايا المعوية المعوية.
    5. قم بقياس الطول الكامل للأمعاء الدقيقة باستخدام مسطرة للحصول على الأجزاء الثلاثة: الاثني عشر (1/4من الأمعاء الدقيقة) والباقي ينقسم بالتساوي إلى الصائم والدقاقي.
    6. تابع التجربة باستخدام جزء الصائم.
  2. تحضير الصائم المقلوب.
    1. نظف جزء الصائم عن طريق إزالة كل النسيج الضام باستخدام شفرة.
    2. يقطع الصائم إلى أجزاء بطول 12-15 سم ، ويغسل باستخدام 1x PBS ، ويوضع في طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني.
    3. اقلب أجزاء الصائم باستخدام قضيب زجاجي للسماح بكشف جزء الزغب من الخارج.
      تنبيه: تجنب استخدام قضيب زجاجي ذو حواف حادة. علاوة على ذلك ، يجب ألا يكون قطر القضيب الزجاجي أكبر من قطر الكيس.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن للمرء أن يتصور الزغابات تحت المجهر الضوئي (الشكل 4).
    4. اغسل أجزاء الصائم المقلوبة برفق باستخدام 1x PBS.
    5. تحقق من وجود أي تسرب من جوانب الصائم المقلوب.
    6. قطع أجزاء الصائم المقلوبة إلى أكياس بطول 5 سم.
    7. اربط أحد طرفيها بخيوط وأعد التحقق من وجود تسريبات مرئية في الطرف المربوط عن طريق ملء الأكياس ب PBS.
    8. اربط الطرف الآخر لإنشاء كيس مقلوب فارغ مع الزغب على السطح الخارجي.
    9. أعد التحقق من وجود تسربات خارجية عن طريق التربيت على الكيس المقلوب على ورق الترشيح.
  3. موازنة الأكياس المقلوبة في 1x PBS.
    1. تابع التجربة في نفس اليوم أو قم بتخزين الأكياس طوال الليل في 1x PBS عند 4 درجات مئوية.

2. الإعداد التجريبي لنقل الهستيدين

  1. قم بتجميع مجموعتين من ثلاثة أنابيب سعة 50 مل وفقا لتركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم كما هو موضح في الجدول 1.
  2. اغمس الأكياس المعوية المحضرة في الأنابيب المحددة لمدة 30 دقيقة و 60 دقيقة لكل مجموعة.
  3. بعد الوقت المحدد ، قم بإفراغ المحلول داخل الكيس في أنبوب طرد مركزي منفصل سعة 1.5 مل وحدد الحجم.
  4. نضح السائل داخل الكيس باستخدام حقنة 2 مل. بدلا من ذلك ، قم بفك أحد طرفي الكيس واجمع المحتويات في أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
  5. فحص 0.1 مل من العينات التي تم جمعها لتقدير الهستيدين وحساب التركيز باستخدام الرسم البياني القياسي.

3. تقدير الهستيدين باستخدام تفاعل بولي

  1. إعداد منحنى قياسي للهستيدين.
    1. تحضير المحاليل بتركيزات متفاوتة من الهستيدين كما هو موضح في الجدول 2 باستخدام محاليل مخزون الهستيدين (5 mM) والماء.
    2. أضف حمض الكبريتيليك (0.5 مل) ونترات الصوديوم (0.5 مل) إلى كل أنبوب.
    3. احتضان الأنابيب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم أضف 1 مل من كربونات الصوديوم والإيثانول إلى كل أنبوب.
    4. احتضان الأنابيب لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (~ 20 درجة مئوية) ولاحظ الامتصاص عند الطول الموجي 490 نانومتر.
    5. ارسم منحنى قياسي للامتصاص مقابل تركيز الهستيدين.
      ملاحظة: يعتمد اختبار الهيستيدين هذا على خاصية الهستيدين لتشكيل مركب ديازو (الشكل 5).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 4 والجدول 1 والجدول 2 سير العمل التجريبي لإظهار حركة الأمعاء من خلال امتصاص الهستيدين بواسطة الزغابات المعوية في تجويف الأكياس المقلوبة. تم إجراء ثلاثة إعدادات تجريبية مستقلة ، ويتم عرض البيانات التمثيلية في الشكل 6.

في ظل الظروف التجريبية المعطاة ، اتبع تقدير الهستيدين باستخدام تفاعل بولي قانون لامبرت بير حتى 300 ميكرومتر (الشكل 6 أ). يعتمد اختبار الهيستيدين هذا على الاقتران بين الأحماض الأمينية وأيون الديازونيوم في الكاشف. يحتوي كاشف باولي على حمض الكبريتيك المذاب في حمض الهيدروكلوريك المركز. يخضع هذا الحمض للديازوت في وجود نترات الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك. يتفاعل ملح الديازونيوم p-phenyldiazosulphonate مع جزيئات الهستيدين في ظل الظروف القلوية لتشكيل أحمر غامق / برتقالي إلى مركب أصفر اللون ، والذي يمكن قراءته طيفيا عند 490 نانومتر (الشكل 5)9. تجدر الإشارة إلى أن هذا الاختبار يعطى بواسطة الهستيدين والتيروزين. الاختبار المستخدم في هذه الدراسة هو نسخة معدلة قليلا من التفاعل الأصلي بحيث يتم استخدام نترات الصوديوم مباشرة في درجة حرارة الغرفة (~ 20 درجة مئوية) بدلا من استخدام نتريت الصوديوم في ظل ظروف مبردة9.

يوضح تفاعل باولي الإيجابي الذي لوحظ مع العينة المستعادة من داخل الأكياس المقلوبة امتصاص الهستيدين عبر الزغابات المعوية. يوضح الشكل 6B وجود علاقة بين امتصاص تركيزات الهستيدين والصوديوم في الخلايا المعوية الصائمية. تشير الزيادة في امتصاص الهستيدين مع زيادة وقت الحضانة من 30 إلى 60 دقيقة إلى النقل النشط الثانوي.

figure-results-1
الشكل 1: أنواع مختلفة من النقل الغشائي. رسم تخطيطي يوضح الأنواع المختلفة لأنظمة نقل الأغشية. (أ) الانتشار السلبي. (ب) تيسير الانتشار. ج: النقل النشط الأولي (يسار) والنقل النشط الثانوي (يمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تنظيم الخلايا المعوية في الزغابات المعوية. يركز هذا الشكل على الأمعاء الدقيقة ويوضح الأجزاء الثلاثة المتميزة ، وهي الاثني عشر والصائم والدقاقي. تحتوي الأمعاء الدقيقة أيضا على بعض النتوءات الشبيهة بالإصبع تسمى الخملات ، والتي تزيد من مساحة السطح لامتصاص الطعام المبتلع. تحتوي الزغابات الدقيقة على خلايا تسمى الخلايا المعوية التي تحتوي على ناقلات محددة لامتصاص الأحماض الأمينية. تمنع الوصلات الضيقة حركة المواد المذابة بين الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: خلية معوية تحتوي على ناقلات أحماض أمينية. يمثل الرسم الكاريكاتوري خلية معوية واحدة تظهر النهايات القمية والقاعدية. تحتوي النهاية القمية على ناقلات مثل بروتينات B0AT و SNAT5 ، ويحتوي الغشاء القاعدي الجانبي على ناقل LAT1. معا ، هذه البروتينات هي المسؤولة عن امتصاص الهستيدين من تجويف الأمعاء إلى الدورة الدموية البابية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تمثيل تخطيطي للبروتوكول يوضح النقل الغشائي للهستيدين باستخدام الأكياس المقلوبة لأمعاء الماعز. تم شراء أمعاء الماعز ومعالجتها مسبقا وتنظيفها كما هو موضح. لفترة وجيزة ، تم استئصال الصائم ، وتم إعداد الأكياس المقلوبة. تم استخدام هذه الأكياس لإعداد التجربة لتحديد امتصاص الهستيدين بتركيزات الملح المختلفة. شوهدت الزغابات بتكبير 400x باستخدام مجهر ضوئي. يتم توفير الإجراء التفصيلي في النص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: رد فعل طريقة باولي. يتضمن اختبار باولي تكوين أيونات الديازونيوم في كاشف يحتوي على حمض الكبريتيك في حمض الهيدروكلوريك المركز. في ظل الظروف القلوية ، يتفاعل الهستيدين مع ملح الديازونيوم ، مما يؤدي إلى تكوين مركب أحمر اللون يمكن قياس امتصاصه عند 490 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: تقدير الهستيدين بطريقة باولي. أ: المنحنى القياسي للهستيدين. تعرضت تركيزات متفاوتة من الهستيدين تتراوح من 0-300 ميكرومتر لتفاعل بولي ، وتم قياس المركب المتشكل بطول موجي 490 نانومتر. (ب) تم اتباع نقل الهستيدين في الأكياس المعوية لمدة 30 دقيقة و 60 دقيقة في وجود 150 mM (أسود صلب) و 200 mM محلول ملح NaCl (رمادي صلب). تم تقدير تركيز الهستيدين داخل الأكياس المقلوبة باستخدام المنحنى القياسي (الشكل 6 أ). يتم الإبلاغ عن القيم فيما يتعلق بالتحكم (0 mM NaCl). وأجريت ثلاث نسخ تقنية متماثلة، وقدمت بيانات تمثيلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: الإعداد التجريبي للحركة المعوية للهستيدين. يوضح هذا الجدول حضانة الأكياس المعوية بتركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم خلال نقطتين زمنيتين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: إعداد المنحنى القياسي للهستيدين. يوضح هذا الجدول الخطوات والمكونات المختلفة لتفاعل باولي مع تركيزات معروفة من الهستيدين تتراوح من 0-300 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد النقل الغشائي أحد أهم المفاهيم الأساسية التي يتم تدريسها للطلاب الجامعيين في جميع تخصصات العلوم البيولوجية الرئيسية ، الأساسية أو التطبيقية. تقليديا ، تم تصور الحركة عبر الأغشية باستخدام المستقلبات الموسومة بالنظائر المشعة. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب خطيرة للغاية وغير مجدية للتعليم أو التعلم. في حين أن التعلم التجريبي هو أفضل تقنية تربوية لفهم مثل هذه المفاهيم المعقدة ، إلا أنه يمثل تحديا يتفاقم بسبب نقص البنية التحتية ، والأصباغ / المستقلبات باهظة الثمن القائمة على التألق ، والأهم من ذلك ، الحظر المفروض على تجارب تشريح. وبالتالي ، هناك حاجة لتطوير أدوات وطرق بديلة ليست آمنة فحسب ، بل أيضا غير مكلفة وممكنة في بيئة المختبر الجامعية. هنا ، تم تطوير طريقة جديدة لتدريس النقل الغشائي للطلاب الجامعيين. يوضح البروتوكول المبلغ عنه ، وهو تكيف من Agar et al. 19548 ، النقل الغشائي النشط أحادي الاتجاه للهيستيدين عبر خلايا أمعاء الماعز. أجريت هذه الدراسة لإثبات استخدام مقايسة قائمة على قياس الألوان لتصور امتصاص الهستيدين عبر الأغشية المعوية. إنه بسيط وقابل للتكرار ومفهوم للطلاب ويمكن إجراؤه في أي بيئة معملية.

تم تطوير نموذج الكيس المعوي المقلوب لأول مرة بواسطة Wilson و Wiseman10 ، والذي تم تحسينه لاحقا لزيادة صلاحية الأنسجة. تم توضيح آليات وحركية امتصاص الدواء باستخدام الأكياس المقلوبة المعوية11. تشمل مزايا هذا النموذج مساحة كبيرة للامتصاص ؛ ومع ذلك ، فإن صلاحية الأنسجة هي واحدة من المعلمات المحدودة. تم الإبلاغ عن أن الأنسجة المعوية لا تزال قابلة للحياة ونشطة الأيض في ظل الظروف الفسيولوجية ل ~ 2 h11. تحذير آخر محتمل لهذا النهج يجب أخذه في الاعتبار هو عدم القدرة على إزالة الغشاء المخاطي العضلي والمصل من مستحضرات الكيس المقلوب. قد يؤدي ارتباط بعض المركبات بالطبقة العضلية إلى الحد من نقل هذه المركبات أو التقليل من شأنها. على الرغم من أن نموذج الكيس المعوي المقلوب حساس ومحدد ، إلا أن مجموعة متنوعة من العوامل يمكن أن تؤثر على النتائج. بعض هذه العوامل تشمل العمر والجنس والأنواع والنظام الغذائي وحالة المرض للحيوان ، وكذلك جزء الأمعاء المستخدمة للتحليل (الدقاق ، الصائم ، الاثني عشر ، والقولون). العوامل البيئية مثل درجة الحموضة والتهوية ودرجة الحرارة ستؤثر أيضا على النتائج12.

وقد تبين أن التأخير في حصاد الأمعاء والحالة الحيوانية (حية / ميتة) يؤثر على النقل النشط في أجزاء الاثني عشر من أمعاء الفئران. يضمن الحصاد من المخدرة الحد الأدنى من التأخير الزمني ، وتجنب تدهور الناقل13. ومع ذلك ، في ضوء الحظر المفروض على تشريح في الجامعات ، تم استخدام الأمعاء من التي تم التضحية بها حديثا في إعدادنا التجريبي. في حين يمكن استخدام هذا البروتوكول بنجاح لإنشاء امتصاص نوعي للمستقلب عبر الخلايا المعوية ، فإن استخدامه في الدراسات التي تنطوي على حركية نقل الغشاء محدود. الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي الإعداد الناجح للأكياس المعوية المقلوبة المقاومة للتسرب مع الخلايا المعوية القابلة للحياة. تشكل الطبيعة الحساسة وصلاحية الزغابات والخلايا المعوية تحديا يمكن التغلب عليه بالممارسة. علاوة على ذلك ، بالنظر إلى أن المادة الأولية ليست من أي مجموعة حيوانية متجانسة ، فإن التباين في النتائج بين التجارب يعد عيبا كبيرا. يمكن التغلب على ذلك باستخدام نسخ متماثلة متعددة من نفس. مع الأخذ في الاعتبار هذه الاعتبارات ، فإن الطريقة المقدمة في هذه الدراسة تستخدم بشكل صارم كأداة تربوية في التدريب العملي الجامعي.

تم استخدام البروتوكول المبين بنجاح لإثبات نقل الهستيدين. يشير الامتصاص أحادي الاتجاه لكل من الصوديوم والهستيدين في الأكياس المقلوبة إلى نوع متماثل من النقل النشط الثانوي. يتبع الامتصاص المعوي للأحماض الأمينية المحايدة الحركية المتجهة التي تعتمد على تدرج التركيز الذي أنشأه Na + K + ATPase. يحافظ الإعداد المماثل على جهد الغشاء السالب داخل الخلايا وتركيز الصوديوم خارج الخلية البالغ 150 مللي مول. كلاهما يدفع النقل النشط للأحماض الأمينية المحايدة بواسطة B0AT في النهاية القمية والحركة اللاحقة خارج الخلية المعوية في النهاية القاعدية بواسطة LAT1. ومن المثير للاهتمام ، عند تركيزات الملح الأعلى (200 مللي مول) ، لم يكن هناك فرق كبير في الامتصاص كدالة للوقت. وفي هذه المرحلة، لا يمكننا التعليق على سبب هذه الملاحظة؛ ومع ذلك, يمكن توسيع نفس الإعداد التجريبي ليشمل تركيزات الصوديوم متعددة مع نقاط زمنية متغيرة وضوابط مع 150 mM كلوريد الكولين لعرض النقل المعتمد على الصوديوم والمساهمة المحتملة بسبب التشبع.

من حيث المبدأ ، يمكن استخدام أكياس الصائم المقلوبة من الماعز / الخنزير / الجرذ / الفأر لإثبات امتصاص الأمعاء لمجموعة متنوعة من المستقلبات الغذائية ، بشرط وجود مقايسة كيميائية حيوية للتقدير. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا تحليل تأثير المكونات الأخرى التي يمكن أن تتداخل مع امتصاص الأمعاء أو مثبطات نقل الغشاء. تم استخدام الأكياس المقلوبة بكفاءة كأداة في الأبحاث الصيدلانية لدراسة امتصاص الأدوية في المختبر ، والتمثيل الغذائي المعوي للأدوية ، ودور الناقل في امتصاص الدواء. أخيرا ، هذه التقنية هي مثال على عرض خارج الجسم الحي لنقل الغشاء ولا تعتمد على مستخلص خال من الخلايا (في المختبر) ولكن على عينة من الأنسجة. ومع ذلك ، يتم تعويض هذه الميزة من خلال توافر أمعاء الماعز / الخنازير / الفئران غير المصابة ، والتي يمكن أن تكون عاملا مقيدا.

من بين العديد من الأدوات التربوية المتاحة للمعلم لتعزيز عملية التعلم ، فإن التعلم التجريبي أو "التعلم بالممارسة" هو فلسفة ومنهجية التدريس التي تعد الطريقة الأكثر تقدما وفعالية للتعليم والتي توفر للطلاب فرصة للحصول على فهم شامل لموضوعات المحاضرات. يضمن التعلم التجريبي المشاركة العملية للطلاب وكذلك المعلم ، الذي يقدم الدعم والإرشاد خلال عملية التعلم النشط هذه14. إنه بمثابة بديل ممتاز للتعليم النظري التقليدي في الفصول الدراسية ، لا سيما في بعض المفاهيم الثقيلة والتكاملية مثل النقل الغشائي الذي غالبا ما يجد الطلاب صعوبة في تصوره. ومن شأن هذه التدريبات أيضا أن تشجع التعلم التفاعلي والتعاوني من الأقران والموجهين على حد سواء. تعد المبادرة الحالية خطوة إلى الأمام في اتجاه إنشاء وتمكين تجربة تعليمية ليست غنية بالمعلومات فحسب ، بل لا تنسى أيضا ويمكن أن تكون تحويلية للطالب ، مما يؤثر بشكل كبير على تجربة التعلم الشاملة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل قسم الكيمياء الحيوية ، كلية سري فينكاتيسوارا ، جامعة دلهي. ويشكر المؤلفون موظفي المختبر على دعمهم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 مل أنابيب الطرد المركزيTARSONS500020
أنابيب اختبار 10 ملBOROSIL9800U04
50 مل أنابيب الصقر المعقمةTARSONS546041
500 مل دورقبوروسيل10044977
500 مل قارورة مخروطيةبوروسيل691467
D-GlucoseSRL42738
مقياس الطيف الضوئي الرقميSYSTRONICS2710
الإيثانولإمشور1009831000
FinpipettesTHERMOFISHER4642090
قضيب النمام الزجاجيBOROSIL9850107
L-Histidine SRL17849
NaClSRL41721
قفازات النتريلKIMTECH112-4847
طبق بتري  TARSONS460090
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (درجة الحموضة 7.4)SRL95131
أطراف الماصةABDOSP10102
كربونات الصوديومSRL89382
نترات الصوديوم  SRL44618
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (اللامائية)SRL53046
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (اللامائية)SRL22249
حمض الكبريتيك  15354ريال
الدقيقة سعودي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. 7th Edition. , W.H. Freeman and Company. (2017).
  2. Stillwell, W. Membrane Transport. An Introduction to Biological Membranes. , Elsevier Science. (2013).
  3. Fick, A. V. On liquid diffusion. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 10 (63), 30-39 (1855).
  4. Sherwood, L. Introduction to Human Physiology. , Brooks/Cole Cengage Learning. (2013).
  5. Bröer, S. Intestinal amino acid transport and metabolic health. Annu Rev Nutr. 43, 73-99 (2023).
  6. Avissar, N. E., Ryan, C. K., Ganapathy, V., Sax, H. C. Na+-dependent neutral amino acid transporter ATB0 is a rabbit epithelial cell brush-border protein. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (3), C963-C971 (2001).
  7. Bröer, S. Amino acid transport across mammalian intestinal and renal epithelia. Physiol Rev. 88 (1), 249-286 (2008).
  8. Agar, W. T., Hird, F. J. R., Sidhu, G. S. The uptake of amino acids by the intestine. BBA - Biochim Biophys Acta. 14 (1), 80-84 (1954).
  9. Pauly, H. Über die Konstitution des Histidins. I. Mitteilung. Biological Chemistry. 42 (5-6), 508-518 (1904).
  10. Wilson, T. H., Wiseman, G. The use of sacs of everted small intestine for the study of the transference of substances from the mucosal to the serosal surface. J Physiol. 123 (1), 116-125 (1954).
  11. Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. Eur J Drug Metab Pharmacokinet. 23 (2), 313-323 (1998).
  12. Alam, M. A., Al-Jenoobi, F. I., Al-Mohizea, A. M. Everted gut sac model as a tool in pharmaceutical research: Limitations and applications. J Pharm Pharmacol. 64 (3), 326-336 (2012).
  13. Pento, J. T., Mousissian, G. K. Time-dependent deterioration of active transport in duodenal segments of rat intestine. J Pharmacol Methods. 20 (1), 9-14 (1988).
  14. Williams, L., Sembiante, S. F. Experiential learning in U.S. undergraduate teacher preparation programs: A review of the literature. Teach Teach Educ. 112, 103630(2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة