تحديد مستوى 8-oxo-dG باستخدام مقايسة ELISA لتقييم تلف الحمض النووي التأكسدي في خلايا MCF-7

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة للكشف الكمي عن الضرر التأكسدي للحمض النووي في خلايا MCF-7 بواسطة تقنية ELISA.

الملخص

قاعدة 8-Oxo-7،8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) هي الشكل السائد للضرر التأكسدي للحمض النووي الذي يتم ملاحظته بشكل شائع. يؤثر ضعف الحمض النووي بشكل عميق على التعبير الجيني ويعمل كعامل محوري في تحفيز الاضطرابات التنكسية العصبية والسرطان والشيخوخة. لذلك ، فإن القياس الكمي الدقيق ل 8-oxoG له أهمية سريرية في التحقيق في منهجيات الكشف عن تلف الحمض النووي. ومع ذلك ، في الوقت الحاضر ، تشكل الأساليب الحالية للكشف عن 8-oxoG تحديات من حيث الراحة والنفعية والقدرة على تحمل التكاليف والحساسية المتزايدة. استخدمنا تقنية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، وهي طريقة قياس لوني عالية الكفاءة وسريعة ، للكشف عن الاختلافات في محتوى 8-oxo-dG في عينات خلايا MCF-7 المحفزة بتركيزات مختلفة من بيروكسيد الهيدروجين (H₂O₂). حددنا تركيز H₂O₂ الذي تسبب في الضرر التأكسدي في خلايا MCF-7 عن طريق الكشف عن قيمة IC₅₀ في خلايا MCF-7. بعد ذلك ، عالجنا خلايا MCF-7 ب 0 و 0.25 و 0.75 mM_{H 2}O₂ لمدة 12 ساعة واستخلصنا 8-oxo-dG من الخلايا. أخيرا ، خضعت العينات ل ELISA. باتباع سلسلة من الخطوات ، بما في ذلك نشر اللوحة ، والغسيل ، والحضانة ، وتطوير اللون ، وإنهاء التفاعل ، وجمع البيانات ، اكتشفنا بنجاح التغييرات في محتوى 8-oxo-dG في خلايا MCF-7 التي يسببها H₂O₂. من خلال هذه المساعي ، نهدف إلى إنشاء طريقة لتقييم درجة الضرر التأكسدي للحمض النووي داخل عينات الخلايا ، وبذلك ، ندفع قدما في تطوير مناهج أكثر ملاءمة وملاءمة للكشف عن تلف الحمض النووي. يستعد هذا المسعى لتقديم مساهمة ذات مغزى في استكشاف التحليلات الترابطية بين الضرر التأكسدي للحمض النووي ومختلف المجالات ، بما في ذلك البحوث السريرية حول الأمراض والكشف عن المواد السامة.

المقدمة

الضرر التأكسدي للحمض النووي هو نتيجة لعدم التوازن بين توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ونظام الدفاع الخلوي المضاد للأكسدة¹. وهو ينطوي في المقام الأول على أكسدة الحمض النووي البيورين وقواعد^{البيريميدين 2,3}. هذا التعديل التأكسدي لقواعد الحمض النووي لا يضر بسلامة الجينوم فحسب ، بل يشمل أيضا مجموعة واسعة من المشكلات المرضية ، بما في ذلك السرطان والأمراض التنكسية العصبية وأمراض القلب والأوعية الدموية ^4,5. قاعدة الجوانين في الحمض النووي لديها أقل إمكانية اختزال وهي الأكثر عرضة للأكسدة⁶. لذلك ، يعمل 8-oxo-7،8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) كعلامة أولية لتقييم مدى الضرر التأكسدي للحمض النووي ^7,8. أصبح القياس الكمي الدقيق ل 8-oxo-dG قضية حاسمة في معالجة الجوانب المختلفة لحدوث المرض وتطوره وتقييم عبء الأكسدة متعدد العوامل⁹.

الطرق التقليدية للكشف عن 8-oxo-dG ، مثل اللوني السائل عالي الأداء مع الكشف الكهروكيميائي (HPLC-ECD) ، وقياس الطيف الكتلي ، والتقنيات الواصلة ذات الصلة ، تظهر حساسية عالية وخصوصية^10،11،12. ومع ذلك ، غالبا ما يكون لهذه التقنيات متطلبات تشغيلية معقدة وتكاليف عالية ، مما يعوق قابليتها للتطبيق على نطاق واسع وعمليتها في تحليل العينات عالي الإنتاجية. مع التقدم المستمر للعلوم والتكنولوجيا ، ظهرت مجموعة متنوعة من الأساليب الجديدة والفعالة والدقيقة. يتيح لنا تطبيق هذه التقنيات الجديدة تحديد مستوى 8-oxo-dG بشكل أكثر دقة ويوفر أدوات أكثر قوة لإجراء دراسة متعمقة للارتباط بين الإجهاد التأكسدي والمرض. على سبيل المثال ، طبق الباحثون تقنية المسام النانوية للكشف الكمي عن الحمض النووي¹³ وتسلسله ، وتحديد أنواع تلف الحمض النووي باستخدام استراتيجية تسلسل الكود بنقرة واحدة¹⁴ ، وتطوير طرق تسلسل عالية الإنتاجية ، وإنشاء مستشعرات حيوية قائمة على 8-oxoG من خلال دمج البيوتين ستربتافيدين مع ELISA¹⁵. من بينها ، ELISA ، بمزاياها المعترف بها من حيث الخصوصية والفحص عالي الإنتاجية والتكلفة ، هي واحدة من الحلول المثالية للكشف عن 8-oxo-dG. لذلك ، من الأهمية بمكان تطوير طريقة عالية الإنتاجية وحساسة للغاية ومريحة وسريعة للكشف عن 8-oxo-dG.

تقدمت تقنية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، التي تم تطويرها في 1971¹⁶ ، بسرعة على مدار ال 50 عاما الماضية وأصبحت الآن واحدة من أكثر طرق الكشف شيوعا في مجالات البيولوجيا والطب^17،18،19. تظهر تقنية ELISA حساسية وخصوصية عالية ، وتمتلك وقت رد فعل قصير ، وسهلة الاستخدام ، مما يجعلها خيارا معترفا به على نطاق واسع لاختبار العينات على نطاق واسع وتحليل عالي الإنتاجية²⁰. نتيجة لذلك ، تم استخدام ELISA على نطاق واسع للتحليل الكمي أو شبه الكمي للمركبات أو البروتينات أو الأجسام المضادة أو الجزيئات داخل الخلايا^21،22،23. على سبيل المثال ، تم استخدامه في الكشف عن المؤشرات الحيوية المرتبطة بالأمراض المختلفة وبقايا الأدوية والجزيئات الحيوية²⁴. يمكن تصنيف ELISAs إلى أربعة أنواع رئيسية بناء على التصميم التجريبي والمبادئ²⁵. تشمل هذه الطرق ELISA المباشر ، و ELISA غير المباشر ، و ELISA الساندويتش ، و ELISA^26,27 التنافسي. من بين هذه ، شطيرة ELISA ، التي تستخدم اثنين من الأجسام المضادة المحددة ، واحد لالتقاط الجزيء المستهدف والآخر للكشف ، تم اختياره للدراسة في هذه الورقة. المبدأ التجريبي لشطيرة ELISA هو كما يلي: أولا ، يتم تثبيت جسم مضاد معين في آبار الصفيحة الدقيقة لالتقاط المادة المراد تحليلها. بعد إضافة المعيار أو العينة، يرتبط المحلول المراد تحليله بالجسم المضاد المتجمد. بعد ذلك ، يضاف جسم مضاد مسمى يتعرف على حاشية مختلفة على المستضد ، مكونا بنية شطيرة. بعد إزالة الأجسام المضادة غير المنضمة ، تتم إضافة الركيزة. تحت التأثير الحفاز للجسم المضاد الثانوي ، يحدث تفاعل اللون ، وترتبط شدة اللون ارتباطا إيجابيا بتركيز المادة المراد تحليلها في العينة. أخيرا ، تم قياس الكثافة الضوئية (OD) لتحديد تركيز العينة. يتميز Sandwich ELISA بمزايا زيادة الحساسية والنوعية للعينات المستهدفة ، مما يجعله مناسبا للكشف عن تركيزات منخفضة من التحليلات المستهدفة والعينات المعقدة²⁸. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس النتائج التي تم الحصول عليها لمزيد من التحليل. هذه العوامل تجعل شطيرة ELISA طريقة كشف شائعة الاستخدام في كل من البحث العلمي والمختبرات السريرية²⁹.

تهدف هذه الدراسة إلى الكشف الكمي عن 8-oxo-dG في خلايا MCF-7 لتحديد درجة الضرر التأكسدي للحمض النووي في الخلايا. تتكون هذه الدراسة من جزأين رئيسيين: بناء نموذج الضرر التأكسدي للحمض النووي لخلية MCF-7 والكشف عن 8-oxo-dG باستخدام ELISA. أولا ، تم استزراع خلايا MCF-7 في المختبر ومعالجتها بتركيزات مختلفة من H₂O₂ لفترات مختلفة. تم تقييم صلاحية الخلية باستخدام مقايسة CCK-8 لتحديد التركيز المثبط نصف الأقصى (IC₅₀) ل H₂O₂ في خلايا MCF-7. بناء على قيم IC₅₀ ، تم اختيار_{وقت علاج H 2}O 2 المناسب وتركيز الحث. لاستخراج عينات من خلايا MCF-7 التي تضررت من الأكسدة ، تم الحصول على عينات الخلايا والمواد الطافية وإضافتها إلى الآبار المرتبطة بالإنزيم المطلية مسبقا بأجسام مضادة 8-oxo-dG. سوف يرتبط 8-oxo-dG الموجود في العينة بالأجسام المضادة المرتبطة بحامل الطور الصلب. بعد ذلك ، تمت إضافة 8-oxo-dG الأجسام المضادة الموسومة ببيروكسيديز الفجل. تم تحضين خليط التفاعل عند درجة حرارة ثابتة لضمان الارتباط الكامل للعينة والجسم المضاد. تمت إزالة الإنزيم غير المنضم عن طريق الغسيل ، ثم تمت إضافة الركيزة اللونية ، والتي أنتجت لونا أزرق. تحت تأثير الحمض ، تحول المحلول إلى اللون الأصفر. أخيرا ، تم قياس قيمة OD لعينات بئر التفاعل عند 450 نانومتر ، وكان تركيز 8-oxo-dG في العينة متناسبا مع قيمة OD. من خلال توليد منحنى قياسي ، يمكن حساب تركيز 8-oxo-dG في العينة.

البروتوكول

1. بناءنموذج الضرر التأكسدي للحمض النووي الناجم عن H₂O₂ في خلايا MCF-7

1. استعادة الخلايا MCF-7
   1. انقل الأنبوب المبرد لزراعة الخلايا ، والذي يحتوي على 3.5 × 10⁶ خلايا MCF-7 ويتم تخزينه في ثلاجة -80 درجة مئوية ، بسرعة إلى صندوق رغوة يحتوي على النيتروجين السائل. استرجع الأنبوب بالملقط وضعه في حمام مائي بدرجة حرارة ثابتة 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة تقريبا لإذابة الخلايا المحفوظة.
      ملاحظة: أثناء عملية الذوبان في حمام مائي ، هز الخلايا بشكل متقطع لضمان تسخين موحد للكريوفيال.
   2. ضع المبرد في جهاز طرد مركزي وجهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة عند 150 × جم لمدة 5 دقائق.
   3. استخدم ماصة للتخلص من المادة الطافية من أنبوب التخزين المبرد وإضافة 1 مل من وسط الاستزراع الكامل. تخلط جيدا وتنقل إلى طبق استزراع 10 مم ، وتكمل 7 مل إضافية من وسط الاستزراع الكامل.
   4. رج طبق الاستزراع في نمط متقاطع لضمان خلط موحد ، واستزراع في حاضنة CO₂ عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
      ملاحظة: يتكون وسط الاستزراع الكامل من وسط زراعة DMEM المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ و 1٪ بنسلين وستربتومايسين.
2. تقييم صلاحية الخلية
   1. حدد خلايا MCF-7 في مرحلة النمو اللوغاريتمي ذات الحالة الخلوية الجيدة للتجربة. خلال مرحلة النمو اللوغاريتمي ، تظهر الخلايا عادة دورة انقسام أقصر وتواترا عاليا لانقسام الخلايا.
      1. مراقبة مورفولوجيا ومعدل نمو خلايا MCF باستخدام المجهر الإلكتروني. عندما تقدم الخلايا مورفولوجيا أحادية الطبقة موحدة ومعبأة بكثافة ، ويكون تكاثر الخلايا واضحا ، يمكن تحديد أن الخلايا في الأساس في مرحلة النمو اللوغاريتمي.
   2. غسل الخلايا: استخدم ماصة لإزالة وسط الاستزراع من طبق الاستزراع ، وأضف 1 مل من المخزن المؤقت PBS لغسل الخلايا ، ثم تخلص من PBS.
   3. انفصال الخلايا: أضف 1 مل من التربسين لغسل الخلايا ، وانتظر لمدة دقيقة تقريبا حتى يفصل التربسين الخلايا تماما عن طبق الاستزراع. اضغط برفق على طبق الثقافة. مراقبة حركة الخلية
      في أوراق يشير إلى انفصال الخلية شامل.
   4. إنهاء انفصال الخلايا وعد الخلايا: أضف 8 مل من وسط الاستزراع الكامل لإنهاء الانفصال ، وخلايا الماصة برفق ، وحدد تركيز تعليق الخلية باستخدام جهاز عد الخلايا.
      ملاحظة: تأكد من أن تعليق الخلية متجانس قبل العد عن طريق سحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل.
   5. بذر الخلايا: اضبط تعليق الخلية المخفف لتحقيق كثافة خلية تبلغ 5000 خلية لكل 100 ميكرولتر. قم بتلقيح معلق الخلية في 21 بئرا من صفيحة 96 بئرا باستخدام مسدس ماصة ، مع توزيع 100 ميكرولتر في كل بئر. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS إلى الآبار المحيطة بالآبار المزروعة لمنع التبخر المفرط لوسط الاستزراع.
   6. تحضير الوسط المحتوي على H₂O₂: اختر 9 آبار على لوحة زراعة الخلايا المكونة من 12 بئرا وقم بتعيين الملصقات بناء على تدرج تركيزات H₂O₂ (0 ، 0.25 ، 0.50 ، 0.75 ، 1.0 ، 1.5 ، 2.0 mM). أضف 720 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى الآبار المسماة 2.0 mM و 1.5 mM وأضف 360 μL من الوسط الكامل إلى الآبار المتبقية.
      1. باستخدام ماصة ، قم بتوزيع 1.63 ميكرولتر و 1.22 ميكرولتر من كاشف H₂O₂ بنسبة 3٪ في الآبار المسمى 2.0 mM و 1.5 mM ، على التوالي. خلط الحل جيدا. باستخدام ماصة ، انقل 360 ميكرولتر من 2.0 mM_{H 2}O₂ إلى البئر المسمى 1.0 mM واخلطه ؛ ثم ، قم بنقل 360 ميكرولتر من 1.0 mM H₂O₂ إلى 0.5 mM المحدد جيدا واخلطه ؛ وأخيرا نقل 360 ميكرولتر من 0.5 mM_{H 2}O₂ إلى البئر ملحوظ 0.25 mM. ماصة 360 ميكرولتر من 1.5 mM_{H 2}O₂ في البئر المسمى 0.75 mM لتخفيف وتحقيق التركيز المطلوب. (الشكل 1).
         ملاحظة: تأكد من نقل محلول المخزون H₂O₂ في الماصة بالكامل إلى الآبار لتجنب أي محلول متبقي. تأكد من الخلط الشامل للحلول قبل الشروع في التخفيف.
   7. الحضانة: بعد حوالي 24 ساعة من بذر الخلايا ، استخدم ماصة لإزالة وسط الاستزراع من الصفيحة المكونة من 96 بئرا بمجرد التصاق الخلايا بالأسطح. وفقا لتدرج التركيز ، أضف الوسط المحتوي على H₂O₂ المعني إلى كل بئر. أعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 12 ساعة.
   8. إضافة كاشف CCK-8: بعد فترة المعالجة المحددة لمدة 12 ساعة ، استخدم ماصة لإزالة وسط الاستزراع من لوحة 96 بئرا ، وإضافة 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل و 10 ميكرولتر من كاشف CCK-8 إلى كل بئر ، وتشمل ثلاثة آبار تحكم فارغة. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: أثناء عملية إضافة العينات ، تجنب تكوين الفقاعات لمنع أي تداخل مع قراءة قيمة OD.
   9. قياس الامتصاص: أخرج لوحة 96 بئرا من الحاضنة ، وقم بقياس الامتصاص بطول موجي يبلغ 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، وسجل النتائج.
   10. وفقا لصيغة حساب IC₅₀ ،
       معدل التثبيط (٪) = (OD للمجموعة التجريبية للدواء - متوسط OD لثقب التحكم في الدواء) / (متوسط OD لثقب التحكم في الخلية - متوسط OD لثقب التحكم في الدواء) × 100٪
       احسب النتائج كنسبة مئوية من الامتصاص في مزارع التحكم.
   11. قم باستيراد البيانات التجريبية المعالجة إلى برنامج تحليل إحصائي ، وحدد نوع التحليل الانحدار غير الخطي ، وقم ببناء النموذج اللوجستي المكون من أربعة معلمات ، وتابع النقر فوق الزر Fit Curve لتركيب المنحنى. بعد عملية التركيب ، سيقوم البرنامج تلقائيا بحساب قيمة IC₅₀ .
3. تجربة أكسدة الخلايا MCF-7 المستحثة H₂O₂
   1. استرجع خلايا MCF-7 في مرحلة النمو اللوغاريتمي مع حالة خلية جيدة للتجريب.
   2. اغسل ، وقم بإجراء انفصال الخلية ، وقم بإنهاء الانفصال ، وعد الخلايا (راجع الخطوة 1.2 للحصول على طرق محددة).
   3. بذر الخلية: اضبط كثافة تعليق الخلية إلى 1 × 10⁶ خلايا لكل طبق ، مع 4 مل من المعلق لكل طبق قطره 6 سم.
   4. قم بتسمية أنبوبي طرد مركزي دقيق سعة 5 مل على أنهما 0.25 مللي متر و 0.75 مللي مول 3٪ H₂O₂. أضف 4 مل من الوسط الكامل لكل أنبوب ، ثم أضف 1.13 ميكرولتر و 3.40 ميكرولتر من 3٪ H₂O₂ ، على التوالي. هز الأنابيب برفق لضمان الخلط الشامل. استبدل وسط الاستزراع في الأطباق الثلاثة بوسط كامل يحتوي على تركيزات H₂O₂ من 0 و 0.25 و 0.75 mM.
   5. احتضان الثقافات: أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة 12 ساعة.

2. تحضير العينات الخلوية وإعداد كواشف ELISA

1. جمع عينات استخراج الخلايا
   1. جمع العينات: تخلص من طاف زراعة الخلايا MCF-7 ، وشطفه ، وقم بإجراء انفصال الخلايا ، وإنهاء الانفصال ، وجمع الخلايا. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
   2. الطرد المركزي: جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق لجمع حبيبات الخلية. أضف 200 ميكرولتر من PBS لإعادة تعليق كل عينة خلية وتعطيل الخلايا عن طريق دورات التجميد والذوبان المتكررة. أجهزة الطرد المركزي تحلل الخلية عند 1500 × جم لمدة 10 دقائق واستخدم ماصة لجمع المادة الطافية لتحليلها.
      ملاحظة: عندما تكون كمية الخلية منخفضة ، قم بتقليل حجم PBS المستخدم للتعليق. يمكن تخزين العينات في 4 °C لمدة تصل إلى 1 أسبوع إذا كان التحليل الفوري غير ممكن. للتخزين طويل الأجل ، قم بتقسيم العينات بناء على الكميات ذات الاستخدام الواحد وتخزينها في -80 درجة مئوية لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة.
2. تحضير كواشف ELISA
   1. إذابة الكواشف: اسمح لكواشف ELISA ، بما في ذلك أغشية الختم ، والألواح المطلية مسبقا ، والمعايير ، ومخفف العينة ، والأجسام المضادة للكشف عن HRP ، وركيزة الكروموجين ، ومحلول التوقف ، ومخزن الغسيل المركز (20x) ، وعينات الاختبار للوصول إلى درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة قبل بدء الفحص. افتح قارئ ELISA مسبقا قبل 15 دقيقة من الاستخدام.
   2. تحضير المخزن المؤقت للغسيل: احسب الحجم المطلوب من المخزن المؤقت للغسيل المخفف ، ثم قم بتخفيف محلول الغسيل المركز 20x بالماء المقطر أو منزوع الأيونات إلى محلول عمل 1x. أعد أي مخزن مؤقت مركز غير مستخدم إلى الثلاجة على درجة حرارة 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب تحضير المخزن المؤقت للغسيل طازجا قبل الاستخدام. إذا كانت البلورات موجودة في مخزن الغسيل المركز المخزن في الثلاجة ، اتركه يصل إلى درجة حرارة الغرفة ورجه برفق حتى تذوب البلورات تماما قبل الاستخدام.
   3. إعداد المعيار
      1. تحضير حلول العمل للعينات القياسية بتركيزات 1.25 و 2.5 و 5 و 10 و 20 و 40 نانوغرام / مل على التوالي. لضمان دقة النتائج التجريبية ، امزج العينات القياسية بعناية لأعلى ولأسفل قبل الاستخدام لتجنب تكوين الفقاعات أثناء عملية الذوبان.

3. تجربة إليسا

1. طلاء اللوحة: صمم العدد الإجمالي للآبار للمعايير والعينات والفراغات / الضوابط مسبقا وأخرج شرائط الألواح المطلوبة. أضف 50 ميكرولتر من محلول العمل القياسي وعينات الكشف بتركيزات مختلفة إلى آبار التفاعل. تنفيذ المعايير في ثلاث نسخ والامتناع عن إضافة أي عينات إلى الآبار الفارغة / التحكم²⁵.
   ملاحظة: تظهر الخطوات التجريبية لمقايسة ELISA بشكل تخطيطي في الشكل 2. إذا تجاوز تركيز العينة نطاق الكشف ، فيجب تخفيف العينة بمخفف العينة قبل أخذ العينات. عند إضافة عينات ، أضفها إلى أسفل اللوحة ، وتجنب لمس جدران البئر ، واهتز برفق للخلط ، وتجنب تكوين الفقاعات. لضمان دقة التجربة ، يجب إكمال كل إضافة عينة في غضون 10 دقائق.
2. الحضانة: باستثناء الآبار الفارغة ، أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة للكشف عن بيروكسيديز الفجل (HRP) إلى كل بئر تفاعل ، وأغلق الآبار بختم صفيحة ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في حاضنة درجة حرارة ثابتة.
3. الغسيل: تخلص من السائل ، وتخلص من السائل في آبار الألواح ، واتركه حتى يجف على ورق ماص ، وأضف 350 ميكرولتر من محلول الغسيل إلى كل بئر تفاعل ، واتركه لمدة 1-2 دقيقة ، ثم تخلص من المخزن المؤقت للغسيل. كرر عملية الغسيل 5x.
   ملاحظة: الغسيل الشامل أمر بالغ الأهمية لأنه يؤثر بشكل مباشر على دقة النتائج التجريبية. تأكد من التخلص من المخزن المؤقت للغسيل تماما بعد كل غسلة. امسح بعناية أي بقايا في الجزء السفلي من اللوحة بعد الغسيل لتجنب التأثير على قياس الامتصاص.
4. تفاعل اللون: أضف 50 ميكرولتر من الركيزة A و 50 ميكرولتر من الركيزة B إلى كل بئر تفاعل ، وأغلق اللوحة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: بعد إضافة كاشف اللون ، لاحظ تغير اللون في آبار التفاعل على الفور. إذا كان اللون داكنا جدا ، أضف محلول التوقف لإنهاء التفاعل مسبقا.
5. قم بإنهاء التفاعل وقياس الامتصاص: أضف 50 ميكرولتر من محلول التوقف إلى كل بئر تفاعل ، وقم على الفور بقياس قيمة OD عند الطول الموجي 450 نانومتر باستخدام قارئ ELISA (في غضون 15 دقيقة).
6. تحليل البيانات: استيراد البيانات التجريبية المعالجة إلى برنامج التحليل الإحصائي ، حدد نوع التحليل الانحدار الخطي. قم ببناء منحنى معايرة عن طريق رسم تركيز المعايير على المحور X مقابل قيم الكثافة الضوئية (OD) على المحور Y. استخدم منحنى المعايرة المحدد للتأكد من تركيز 8-oxo-dG الموجود في العينات. قم ببناء نموذج رياضي لوجستي وتابع النقر فوق الزر Fit Curve لتركيب المنحنى. بعد عملية التركيب ، يقوم البرنامج تلقائيا بحساب المنحنى القياسي وقيمة P.
   ملاحظة: لا يمكن إعادة استخدام المنحنى القياسي ويجب تحديده من جديد لكل تجربة.

النتائج

كما هو موضح في الشكل 3 ، يشير المحور X إلى تركيز H₂O₂ المطبق على خلايا MCF-7 ، بينما يشير المحور Y إلى صلاحية الخلية. العلاج ب 0.75 mM لمدة 12 ساعة قلل من صلاحية خلايا MCF-7 إلى 67٪. وبالتزامن مع الزيادة في التركيز، كان هناك انخفاض كبير في صلاحية خلايا MCF-7، وخاصة عند تركيز 1.5 مليمول، حيث انخفضت صلاحيتها إلى أقل من 3٪ (الجدول 1). اقترحت النتائج التجريبية IC₅₀ من 0.7655 mM لخلايا MCF-7.

في هذه السلسلة من التجارب ، استخدمنا تقنية ELISA المحسنة لتحديد مستويات 8-oxo-dG. من خلال تحليل البيانات ، تكون معادلة الانحدار للمنحنى القياسي هي:

ص = 23.66 × × + 0.07038.

كما هو موضح في الشكل 4 أ ، أظهر منحنى المعايرة خطية عالية (R² = 0.978) ، ويبين الشكل 4B أن العلاقات بين التركيزات المقاسة ل 8-oxo-dG في العينات والكميات المضافة المقابلة لها كانت مرتبطة ارتباطا وثيقا ، مما يشير إلى دقة جيدة (كان معامل الاختلاف أقل من 5٪). علاوة على ذلك ، يشير اتساق النتائج التي تم الحصول عليها عبر نسخ متماثلة متعددة إلى موثوقية الطريقة التجريبية وقابليتها للتكرار.

باختصار ، تشير البيانات التجريبية إلى أن طريقة ELISA المحسنة لدينا قادرة على اكتشاف التقلبات بنجاح في مستويات 8-oxo-dG في ظل ظروف جيدة التحكم. هذا له آثار كبيرة على التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية في مجموعة واسعة من أنواع العينات لرصد تلف الحمض النووي الناجم عن الإجهاد التأكسدي. على الرغم من بعض القيود ، تبدو آفاق تطبيق الطريقة واعدة عند تحسين الظروف التجريبية.

الشكل 1: تحضير التخفيفات H₂O₂ . يحدد الرسم التخطيطي طريقة تحضير تخفيفات بيروكسيد الهيدروجين (H₂O₂) ، والتي تتضمن مزيجا دقيقا من المحاليل والنقل الدقيق لتركيزات H₂O₂ المتنوعة إلى أنابيب تحمل علامة 1.0 mM و 0.5 mM و 0.25 mM في المقابل. يتم تحقيق التركيز المستهدف عن طريق نقل 1.5 mM_{H 2}O₂ إلى الأنبوب المخصص على أنه 0.75 mM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للكشف عن مولد الضد. يصور هذا الرسم التخطيطي الخطوات المتسلسلة لمقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للكشف عن المستضد: إضافة عينة وإعداد فارغ. حضانة المستضد المسمى HRP ؛ الغسيل وإعداد اللوحة. إضافة الركيزة والحضانة. إنهاء التفاعل وقياس الكثافة الضوئية (OD). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: H₂O₂ تثبيط تكاثر خلايا MCF-7. تم تقييم صلاحية الخلية بواسطة مقايسة CCK-8 المعالجة بتركيزات مختلفة من H₂O₂ (0 ، 0.25 ، 0.50 ، 0.75 ، 1.0 ، 1.5 ، أو 2.0 mM) لمدة 12 ساعة وتم حساب IC₅₀ للحالة المشار إليها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التحليل الكمي ل 8-oxo-dG في خلايا MCF-7 بعد علاج H₂O₂. (أ) منحنى ELISA القياسي ل 8-oxo-dG. يصور العلاقة بين التركيزات المعروفة ل 8-oxo-dG (1.25 و 2.5 و 5 و 10 و 20 و 40 نانوغرام / مل) وقيم الامتصاص الخاصة بكل منها. معادلة الانحدار للمنحنى القياسي هي Y = 23.66 × X + 0.07038. (ن = 3 ، ص² = 0.978). (ب) تركيز 8-oxo-dG في خلايا MCF-7 المعالجة H_{2O 2}. يعرض الرسم البياني مستويات 8-oxo-dG في خلايا MCF-7 المعرضة لتركيزات مختلفة من H₂O₂ (0 و 0.25 و 0.75 mM). تمثل كل نقطة بيانات متوسط ±SE (خطأ معياري) من ثلاث تجارب مستقلة (n = 3) ، مما يوضح تأثير الإجهاد التأكسدي على تلف الحمض النووي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

البارامتر
تركيز H2O2 ، mM	0	0.25	0.5	0.75	1	2
MCF-7 صلاحية الخلية ،٪	100	82.8	81.37	61.07	13.4	2.77

الجدول 1: صلاحية الخلايا لخلايا MCF-7 المعالجة ب H₂O₂.

المناقشة

يحمل تطوير طرق ELISA أهمية كبيرة لكل من منهجيات الكشف عن تلف الحمض النووي الحالية والجديدة. بالمقارنة مع تقنيات HPLC التقليدية وقياس الطيف الكتلي ، فإن هذا النهج ليس سهل الاستخدام فحسب ، بل يظهر أيضا حساسية عالية ويلبي متطلبات الفحص عالي الإنتاجية³⁰. يتيح ذلك مراقبة 8-oxo-dG في دراسات فحص الأمراض على نطاق واسع ، مما يسهل فهما أعمق للعلاقة بين هذه العلامة الحيوية والأمراض المختلفة.

أثناء الإجراءات التجريبية ، هناك العديد من الخطوات الحاسمة ضرورية لضمان موثوقية النتائج وإمكانية تكرارها. في البداية ، قيمت التجربة ببراعة حساسية خلايا MCF-7 إلى H₂O₂ ، بقيمة IC₅₀ تبلغ 0.7655 mM عند 12 ساعة ، مما يسلط الضوء على مستوى تحمل خلايا MCF-7. هذه النتيجة ذات أهمية علمية كبيرة لفهم آليات الدفاع المضادة للأكسدة لخلايا MCF-7 وبقائها تحت الإجهاد التأكسدي مع توفير مؤشر مرجعي مهم للفحص المستقبلي للأدوية المضادة للأكسدة أو آليات العلاج ذات الصلة³¹. علاوة على ذلك ، يعد اختيار وإقران الأجسام المضادة 8-oxo-dG أمرا حيويا للكشف عن ELISA ويؤثر بشكل مباشر على خصوصية وحساسية نظام الكشف ELISA. بالإضافة إلى ذلك ، يعد تحسين استراتيجية تضخيم الإشارة وخطوات معالجة العينات من العوامل المهمة التي تؤثر على دقة الكشف. وجدنا أن استخدام نظام تفاعل الركيزة المستقر يمكن أن يقلل من أخطاء الخلفية ويزيد من نطاق حساسية الكشف.

أثناء العملية التجريبية ، قد تحدث مشكلات فنية مثل الأجسام المضادة غير المستقرة وتقلبات الإشارة والتفاعل المتبادل للمواد المتفاعلة. لمعالجة هذه المشكلات ، اعتمدنا بروتوكولا تجريبيا أكثر استقرارا ، والذي تضمن استخدام مذيبات الأجسام المضادة المستقرة لتحسين استقرار الأجسام المضادة وتحسين الظروف التجريبية وتعديلها. بالإضافة إلى ذلك ، لمعالجة الخطأ الناجم عن تقلبات الإشارة ، قمنا بتوحيد التجربة باستخدام عينات 8-oxo-dG القياسية لضمان اتساق النتائج.

فيما يتعلق بقيود الطريقة التجريبية ، على الرغم من أن ELISA يوفر نهجا عالي الإنتاجية ، إلا أنه قد لا يزال محدودا بتغطية الأجسام المضادة المحددة والتفاعل المتبادل الحتمي للركيزة³². لذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى خطوات إضافية لتنقية العينات أو المعالجة المسبقة للعينات المعقدة. علاوة على ذلك ، قد يتطلب الكشف عن العينات ذات التركيزات المنخفضة مزيدا من تحسين نشاط الأجسام المضادة لتلبية متطلبات البحث.

في الختام ، فإن طريقة الكشف عن ELISA ل 8-oxo-dG لها آثار مهمة على مجالات بحثية محددة. له قيمة تطبيقية محتملة في المراقبة البيئية وتقييم مخاطر الأمراض والتشخيص المبكر ويوفر نهجا جديدا للكشف عن 8-oxo-dG في الزراعة وسلامة الأغذية وفحص الأدوية³³. على سبيل المثال ، في المراقبة البيولوجية البيئية ، يمكن أن يساعد الكشف عن إجهاد الضرر التأكسدي للحمض النووي الناجم عن السموم البيئية في الكائنات الحية في تحديد المخاطر المحتملة في الوقت المناسب³⁴. في المستقبل ، مع زيادة تحسين تكنولوجيا الكشف وتطبيقها في تخصصات متعددة ، من المتوقع أن تلعب هذه الطريقة دورا أكثر أهمية في أبحاث علوم الحياة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.25٪ Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25200-072
مجموعة عد الخلايا -8	Dojindo	CK04
لوحة عد الخلايا	QiuJing	XB-K-25
CO2< / sub> حاضنة	حراري	51032872
DMEM الأساسية (1X)	Gibco	C11995500BT
FBS	PAN	ST30-3302
GraphPad Prism X9	GraphPad Software		التحليل الإحصائي
برنامج الطرد المركزي عالي السرعة	Thermo	& nbsp ؛ 9AQ2861
مجموعة ELISA البشرية 8-oxo-dG	Zcibio	ZC-55410
L-1000XLS + Pipettes	Rainin	17014382
L-20XLS + Pipettes	Rainin	17014392
خزان النيتروجين السائل	Mvecryoge	YDS-175-216
MCF-7 CELL	BNCC	BNCC100137
Multiskan FC مقياس ضوئي دقيق	محلول Thermo	1410101
PBS	Solarbio	P1020
Penicillin-Streptomycin ، 100X	Beyotime	C0222
مجهر الخلايا الحية ثلاثي العينيات	Motic	1.1001E + 12
فريزر بدرجة حرارة منخفضة للغاية	Haire	V118574