مقالة منهجية

الاستخلاص المعزز للحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي من مياه الصرف الصحي لإجراء تقييم شامل لمقاومة مضادات الميكروبات

2.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66899

⸱

يوليو 19, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Ashoka University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا تقنية بسيطة لتقييم المقاومة البيئية لمضادات الميكروبات (AMR) من خلال تعزيز نسبة الحمض النووي خارج الخلية منخفض الوزن الجزيئي. يسمح العلاج المسبق ب 20٪ -30٪ PEG و 1.2 M NaCl باكتشاف كل من جينات AMR المنقولة جينيا وأفقيا. يفسح البروتوكول نفسه لعملية خالية من الأدوات مع تحسين إضافي.

الملخص

من المسلم به أن المراقبة البيئية أداة مهمة لتقييم الصحة العامة في حقبة ما بعد الجائحة. برزت المياه ، ولا سيما مياه الصرف الصحي ، كمصدر مفضل لأخذ عينات من أعباء مسببات الأمراض في البيئة. مياه الصرف الصحي من المصارف المفتوحة ومحطات معالجة المياه المجتمعية هي خزان لكل من مسببات الأمراض وجينات مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) ، وكثيرا ما تتلامس مع البشر. في حين أن هناك العديد من الطرق لتتبع مقاومة مضادات الميكروبات من الماء ، فإن عزل الحمض النووي عالي الجودة بإنتاجية عالية من عينات غير متجانسة لا يزال يمثل تحديا. للتعويض ، غالبا ما تحتاج أحجام العينات إلى أن تكون عالية ، مما يخلق قيودا عملية. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يكون الحمض النووي البيئي مجزأ ، وتتكون مصادر AMR (البلازميدات ، العاثيات ، الحمض النووي الخطي) من الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي. ومع ذلك ، فقد ركز عدد قليل من عمليات الاستخراج على طرق استخراج عالية الغلة للحمض النووي الخطي والمنخفض الوزن الجزيئي. هنا ، تم الإبلاغ عن طريقة بسيطة لاستخراج الحمض النووي الخطي عالي الإنتاجية من كميات صغيرة من مياه الصرف الصحي باستخدام خصائص هطول الأمطار للبولي إيثيلين جلايكول (PEG). تقدم هذه الدراسة حجة لزيادة غلة الحمض النووي الإجمالية من عينات المياه التي تم جمعها للتحليلات الميتاجينومية عن طريق إثراء نسبة الحمض النووي الخطي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تعزيز الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي يتغلب على المشكلة الحالية المتمثلة في نقص أخذ عينات مقاومة مضادات الميكروبات البيئية بسبب التركيز على الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي وداخل الخلايا. من المتوقع أن تكون هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص عند وجود الحمض النووي خارج الخلية ولكن بتركيزات منخفضة ، كما هو الحال مع النفايات السائلة من محطات المعالجة. كما ينبغي أن يعزز أخذ العينات البيئية لشظايا جينات مقاومة مضادات الميكروبات التي تنتشر من خلال النقل الأفقي للجينات.

المقدمة

أكد SARS-CoV-2 وعواقبه على أهمية المراقبة البيئية في مراقبة تفشي الأمراض المعدية 1,2 والتنبؤ بها. في حين أن الأوبئة الفيروسية واضحة ، غالبا ما يوصف ارتفاع مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) بأنه جائحة خبيثة وتشكل مصدر قلق رئيسي للصحة العامة في جميع أنحاء العالم 3,4. وبالتالي، هناك حاجة ملحة إلى استراتيجيات منسقة لفهم تطور وانتشار مقاومة مضادات الميكروبات. يمكن أن تكون المسطحات المائية ، وكذلك مياه الصرف الصحي ، بمثابة خزانات لكل من مسببات الأمراض وAMR 5،6،7،8. وبالتالي ، فإن مصادر المياه المشتركة هي مصدر قوي لانتقال الأمراض بين البشر ، لا سيما في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل (LMIC) حيث يسير سوء النظافة والزيادة السكانية جنبا إلى جنب9،10،11. منذ فترة طويلة يستخدم اختبار مصادر المياه لتقييم صحة المجتمع12،13،14. في الآونة الأخيرة ، أثبتت مياه الصرف الصحي من محطات معالجة مياه الصرف الصحي في المناطق الحضرية مؤشرا مسبقا جيدا لحالات COVID فيالعيادة 1،2،15،16،17،18.

وبالمقارنة مع رصد أمراض معينة، فإن الكشف عن مقاومة مضادات الميكروبات وتتبعها في البيئة يطرح مشكلة أكثر تعقيدا. إن العدد الكبير من المضادات الحيوية المستخدمة ، وجينات المقاومة المتنوعة ، وضغوط الانتقاء المحلية المختلفة ، ونقل الجينات الأفقي بين البكتيريا تجعل من الصعب تقييم عبء مقاومة مضادات الميكروبات الحقيقي ، وبمجرد تقييمه ، ربطه بالملاحظات السريرية19،20،21،22. ونتيجة لذلك، في حين يجري الترصد المنسق لمقاومة مضادات الميكروبات السريرية من قبل العديد من المنظمات في جميع أنحاء العالم3،23،24، لا يزال الرصد البيئي لمقاومة مضادات الميكروبات في مهده، وقد تمت مراجعته في19،25،26.

في السنوات الأخيرة ، تم الإبلاغ عن طرق مختلفة لتتبع مقاومة مضادات الميكروبات البيئية 5,27 ، تمت مراجعتها في28,29. نقطة البداية لمعظم هذه هي استخراج الحمض النووي عالي الجودة من عينات بيئية غير متجانسة ، في حد ذاته تحدي. بالإضافة إلى ذلك ، عادة ما يكون الحمض النووي البيئي مجزأ بسبب التعرض لمحيط معاد. منذ فترة طويلة تم التعرف على الحمض النووي المجزأ خارج الخلية كمستودع مهم لجينات مقاومة مضادات الميكروبات (تمت مراجعته في30،31،32) ، مع إمكانية إضافية لدخول البكتيريا ومغادرتها عبر نقل الجينات الأفقي. ومن ثم، فمن المهم أن يقوم أي بروتوكول يهدف إلى قياس عبء مقاومة مضادات الميكروبات في البيئة بأخذ عينات من الحمض النووي الخطي والمنخفض الوزن الجزيئي على أفضل وجه ممكن. والمثير للدهشة أنه كان هناك القليل من التركيز على تطوير طرق خاصة بالاستخراج عالي الغلة للحمض النووي الخطي والمنخفض الوزن الجزيئي: يركز هذا العمل على معالجة الفجوة.

من الطرق الشائعة والبسيطة لترسيب الحمض النووي (DNA) الجمع بين البولي إيثيلين جلايكول (PEG) والأملاح مثل كلوريد الصوديوم (NaCl)33. PEG هو عامل ازدحام جزيئي كبير يستخدم لتحقيق ترسيب خاص الحجم لشظايا الحمض النووي34,35. كلما انخفض تركيز PEG ، زاد الوزن الجزيئي للحمض النووي الذي يمكن ترسيبه بكفاءة. استخدمت العديد من الدراسات PEG أثناء الاستخراج البيئي للحمض النووي والحمض النووي الريبي 1,2 (ملخصة في الجدول 1 17,33,36,37,38,39) إما في الخطوة النهائية 33,36,37 أو لتركيز عينات المياه الكبيرة لاستخراج الجسيمات الفيروسية كما هو الحال مع SARS-CoV-2 15,40. في العمل الحالي ، وجد أن تركيزات PEG المستخدمة سابقا لاستخراج الحمض النووي البيئي (التي تحددها إلى حد كبير بروتوكولات المراقبة الفيروسية) لا تلتقط الحمض النووي الخطي منخفض الوزن الجزيئي. لذلك ، فإنها تفقد أخذ عينات من شظايا الحمض النووي القصيرة وغير مناسبة لتقييم محتوى مقاومة مضادات الميكروبات بدقة. استغلت هذه الدراسة خصائص البولي إيثيلين جلايكول وكلوريد الصوديوم لترسيب شظايا الحمض النووي الخطية منخفضة الوزن الجزيئي بشكل فعال بإنتاجية عالية يمكن أن تؤدي في المستقبل إلى طريقة استخراج الحمض النووي الفعالة من حيث التكلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة لإثراء نسبة الحمض النووي المجزأ والمنخفض الوزن الجزيئي من العينات الطبيعية المعقدة ، وبالتالي التقاط صورة أكثر دقة لمقاومة مضادات الميكروبات البيئية. مع مزيد من التحسين ، فإن هذه التقنية تفسح المجال للتطبيق السهل والمنخفض التكلفة من قبل الشركات البلدية المحلية والهيئات الحكومية الأخرى لاستخدامها كأداة مراقبة مع الحد الأدنى من التدريب التقني.

البروتوكول

1. أخذ عينات مياه الصرف الصحي

  1. اغمس دورق بولي بروبيلين سعة 500 مل في خزان محطة معالجة الصرف الصحي أو محطة معالجة مياه الصرف الصحي المفتوحة (STP) وجمع ~ 300 مل من عينة مياه الصرف الصحي.
  2. نقل ~ 250 مل من العينة إلى زجاجة بولي بروبيلين معقمة سعة 250 مل.
  3. المسمار على غطاء الزجاجة وإغلاقها مع فيلم من البلاستيك. احتفظ بالزجاجة في وضع مستقيم في كيس مغلق.
  4. انقل العينة في وضع مستقيم في حاوية مغلقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بتعطيل العينة بالحرارة عند 70 درجة مئوية في فرن الهواء الساخن لمدة 4 ساعات قبل معالجتها لاستخراج الحمض النووي.

2. استخراج الحمض النووي من عينات مياه الصرف الصحي

  1. بمجرد تبريد عينة مياه الصرف الصحي ، قم بدامة العينات بأقصى سرعة واترك الحطام / الحمأة يستقر.
  2. صب 27.5 مل من مياه الصرف الصحي في أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل وإضافة 13.5 جم من PEG-8000 (التركيز النهائي 30٪) و 3 جم من كلوريد الصوديوم (التركيز النهائي 1.2 متر) إليها وتخلط جيدا حتى تذوب تماما.
  3. احتضان العينة طوال الليل (~ 16-18 ساعة) عند 4 درجات مئوية.
  4. أجهزة الطرد المركزي العينة عند 15500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. تخلص من المادة الطافية.
    ملاحظة: PEG-8000 بنسبة 30٪ شديد اللزوجة ، ويمكن إزاحة الحبيبات أثناء التخلص من المادة الطافية. يجب صب المادة الطافية ببطء وبعناية لضمان عدم فقد الحبيبات. يتم تنفيذ الخطوات من 2.6 إلى 2.23 باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي للتربة وفقا لتعليمات المجموعة مع بعض التعديلات.
  6. قم بإذابة الحبيبات في 800 ميكرولتر من محلول تحلل المجموعة وأضف المحلول إلى أنبوب حبة الزركونيوم المختلط.
    ملاحظة: في حالة معالجة كميات أكبر, تجميع الكريات من العدد المطلوب من الأنابيب. على سبيل المثال ، في حالة معالجة 160 مل من العينة ؛ سيكون هناك أربعة أنابيب سعة 50 مل تحتوي على مياه الصرف الصحي مع PEG و NaCl. بعد الطرد المركزي لجميع الأنابيب الأربعة عند 15500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة ، تخلص من المادة الطافية من جميع الأنابيب الأربعة. أضف 200 ميكرولتر من محلول CD1 لكل منها ، وأعد تعليق الكريات ، وقم بتجميعها معا في أنبوب حبة واحدة.
  7. تأمين أنبوب حبة أفقيا على دوامة. دوامة الأنبوب بأقصى سرعة لمدة 20-30 دقيقة.
    ملاحظة: الدوامة المطولة تضمن التحلل الكامل والتجانس للعينات ، مما يحسن إنتاجية الحمض النووي.
  8. قم بتدوير الأنابيب عند 8000 × جم لمدة 15 ثانية لتسوية الخرزات في الأسفل ، وإزالة الرغوة ، ونقل المادة الطافية تماما من الأنبوب إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. قد يتم أيضا نقل بعض الخرز خلال هذه الخطوة.
  9. جهاز طرد مركزي طافي 15000 × ز لمدة 1 دقيقة.
  10. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي صغير نظيف سعة 2 مل. قد لا يزال يحتوي الطافي على بعض الجسيمات العالقة.
  11. أضف 200 ميكرولتر من محلول الراسب والدوامة بأقصى سرعة لمدة 5 ثوان. احتضان في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يزيد التحضين عند 4 درجات مئوية من كفاءة ترسيب البروتينات والحطام الخلوي بينما يبقى الحمض النووي في المحلول. من الممكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه الخطوة لمدة تصل إلى 2 ساعة دون انخفاض كبير في إنتاجية وجودة الحمض النووي المستخرج.
  12. أجهزة الطرد المركزي عند 15000 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). تجنب الحبيبات وانقل المادة الطافية الشفافة إلى أنبوب طرد مركزي صغير نظيف سعة 2 مل.
  13. أضف 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط لكل 700 ميكرولتر من المادة الطافية والدوامة بأقصى سرعة لمدة 5 ثوان.
  14. قم بتحميل 700 ميكرولتر من المحللة على عمود دوران السيليكا ، واحتضانها لمدة 2 دقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 15000 × جم لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: حضانة المحللة على عمود السيليكا تعزز ارتباط الحمض النووي بالعمود ، مما يؤدي إلى إنتاجية أفضل للحمض النووي.
  15. تخلص من التدفق وكرر الخطوة 2.14 حتى تمر كل المحللة عبر عمود الدوران.
  16. ضع عمود الدوران بعناية في أنبوب تجميع نظيف سعة 2 مل. تأكد من عدم رش أي تدفق على عمود الدوران.
  17. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل إلى عمود الدوران وطرد مركزي عمود الدوران عند 15000 × جم لمدة 1 دقيقة.
  18. تخلص من التدفق وأعد عمود الدوران إلى نفس أنبوب التجميع سعة 2 مل.
  19. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل الإيثانول إلى عمود الدوران. أجهزة الطرد المركزي في 15000 × ز لمدة 1 دقيقة.
  20. تخلص من التدفق من خلاله وضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل.
  21. أجهزة الطرد المركزي في 16000 × غرام لمدة 2 دقيقة لإزالة الإيثانول المتبقي. ضع عمود الدوران في أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
  22. أضف 100 ميكرولتر من محلول الشطف (مسخن مسبقا إلى 55 درجة مئوية) إلى مركز غشاء المرشح الأبيض واحتضانه لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يزيد المخزن المؤقت للشطف الساخن ، جنبا إلى جنب مع الحضانة على الغشاء ، من كفاءة شطف الحمض النووي ، وخاصة الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي.
  23. أجهزة الطرد المركزي في 15000 × ز لمدة 1 دقيقة. تجاهل عمود الدوران.
  24. إلى الحمض النووي المستخلص، أضف 10 ميكرولتر من 3 M NaCl (حجم 1/10 من شطف الحمض النووي) و 250 ميكرولتر من الإيثانول المطلق المبرد (حجم 2.5 من شطف الحمض النووي). اقلب لخلط جيدا وقم بتدوير المحتويات عند 8000 × جم لمدة 15 ثانية.
  25. احتضان خليط الحمض النووي والإيثانول عند -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
    ملاحظة: يمكن زيادة حضانة خليط الحمض النووي والإيثانول إلى 16 ساعة دون انخفاض كبير في إنتاجية أو جودة الحمض النووي المستخرج.
  26. جهاز طرد مركزي عند 19000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب.
  27. أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول المبرد بنسبة 70٪ إلى الحبيبات.
  28. جهاز طرد مركزي عند 19000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب.
  29. اقلب الأنبوب الموجود على المناديل الورقية واضغط عليه برفق لإزالة الإيثانول المتبقي عن طريق العمل الشعري.
  30. جفف حبيبات الحمض النووي تماما عن طريق إبقاء الأنابيب مفتوحة على كتلة تسخين لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية حتى يتبخر كل الإيثانول.
  31. أعد تعليق حبيبات الحمض النووي في 30-50 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج المعقم (ddH2O). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
  32. قم بتدوير الحمض النووي عند 8000 × جم لمدة 15 ثانية.
  33. حدد تطبيق dsDNA ضمن إعدادات الأحماض النووية في مقياس الطيف الضوئي Nanodrop.
    1. نظف القاعدة بمناديل ورقية خالية من النسالة وماء. استخدم ddH2O لإفراغ الجهاز ثم تحميل 2 ميكرولتر من عينة الحمض النووي على قاعدة التمثال.
    2. قياس نسب التركيز والامتصاص (A260/280 و A260/230) لتحديد النقاء.
  34. قم بتخزين عينة الحمض النووي عند -20 درجة مئوية.

3. ترسيب الحمض النووي الخطي المتسلسل لتفاعل البوليميراز (PCR) للتحقق من استعادة الحمض النووي عبر مجموعة من الأوزان الجزيئية

  1. باستخدام الحمض النووي الجينومي من E. coli MG155 ، قم بتضخيم شظايا الجينات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد مجموعة من الشظايا الخطية من الجينات التالية: fusA ، lacZ ، gapA ، rpsD ، 16S rRNA ، marR (انظر الجدول 2 لتسلسل التمهيدي وظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل).
  2. قم بتنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل وتجميع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل معا.
  3. قسم الأمبليكونات المجمعة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل بأحجام متساوية - قم بتسمية أنبوب واحد باسم "إدخال الحمض النووي".
  4. أضف PEG و NaCl وفقا للظروف المطلوبة (9٪ ، 20٪ ، 30٪ PEG-8000 ؛ 0.3 M ، 1.2 M NaCl) إلى كل أنبوب باستثناء الأنبوب المسمى "إدخال الحمض النووي" وتشكل الحجم النهائي إلى 1 مل.
  5. احتضان الأنابيب طوال الليل (~ 16-18 ساعة) عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بالنسبة لبقية الخطوات حتى 3.16 ، يتم الاحتفاظ ب "إدخال الحمض النووي" دون تغيير في الثلاجة.
  6. قم بتدوير الأنابيب في جهاز طرد مركزي دقيق على سطح الطاولة وفقا للسرعة المطلوبة (15000 × جم أو 20000 × جم) لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  7. قم بإزالة 900 ميكرولتر من المادة الطافية بعناية من الجانب المقابل للحبيبات باستخدام ماصة صغيرة.
  8. أول غسل بالإيثانول: أضف 900 ميكرولتر من الإيثانول المبرد بنسبة 70٪ إلى الحبيبات واخلطها عن طريق قلب الأنابيب برفق.
  9. أدر الأنابيب بنفس السرعة المستخدمة في الخطوة 3.6 (15000 × جم أو 20000 × جم) لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  10. إزالة طاف عن طريق الصب.
  11. غسل الإيثانول الثاني: أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول المبرد بنسبة 70٪ إلى الحبيبات.
  12. أدر الأنابيب بنفس السرعة المستخدمة في الخطوة 3.6 (15000 × جم أو 20000 × جم) لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب.
  13. اقلب الأنبوب الموجود على المناديل الورقية واضغط عليه برفق لإزالة الإيثانول المتبقي عن طريق العمل الشعري.
  14. جفف حبيبات الحمض النووي تماما عن طريق إبقاء الأنابيب مفتوحة على كتلة تسخين لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية حتى يتبخر كل الإيثانول.
  15. أعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج المعقم.
  16. قم بقياس تركيز الحمض النووي المترسب بسبب الظروف المختلفة و "الحمض النووي المدخل" باستخدام مقياس الطيف الضوئي Nanodrop أو مقياس الفلورومتر.
  17. قم بتحميل الحمض النووي المترسب على هلام أغاروز 1٪ لتصور الحمض النووي.

  

النتائج

وضع بروتوكول لاستخراج الحمض النووي عالي الغلة من عينات مياه الصرف الصحي
تم استخدام نسخة معدلة من البروتوكولات الموضوعة سابقا لاستخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي عالي الجودة من عينات المياه17. تم الحصول على العينات من المصارف المفتوحة وكذلك محطات معالجة مياه الصرف الصحي في منطقة دلهي-NCR في شمال الهند. بعد المعالجة المسبقة باستخدام PEG و NaCl (الشكل 1) ، تمت معالجة العينات من خلال مجموعات لاستخراج الحمض النووي من التربة والماء. في جميع الحالات ، لوحظ شريط بارز عالي الوزن الجزيئي يتوافق على الأرجح مع الحمض النووي البكتيري داخل الخلايا ومسحة الخلفية ، كما هو الحال في العينات البيئية37 ، (الشكل 2).

عدم كفاءة استخراج الحمض النووي من النفايات السائلة لمحطة معالجة مياه الصرف الصحي (STP)
على الرغم من الحصول على عائد معقول من إجمالي الحمض النووي من المصارف المفتوحة ومؤثرات STP (الجدول 3) ، لم يكن من الممكن الحصول على الحمض النووي من النفايات السائلة المعالجة النهائية ؛ تم وصف مشاكل الغلة المنخفضة في العمل السابق أيضا41 (الشكل 3). بعد المعالجة ، والتي تشمل كلورة مياه الصرف الصحي ، وفي بعض الحالات ، معالجات الأشعة فوق البنفسجية والترشيح الفائق42 ، من المتوقع أن يكون الحمل الميكروبي منخفضا ، وسيتم تخفيف أي حمض نووي متبقي (يتكون من الحمض النووي خارج الخلية والمجزأ). يمكن أن يؤدي التركيز المنخفض الأولي ل PEG المستخدم في تركيز العينة وترسيب الحمض النووي إلى استبعاد الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي. بعبارة أخرى، يمكن فقدان الحمض النووي المجزأ في خطوة التركيز الأولية.

تؤدي زيادة تركيزات PEG و NaCl إلى ترسيب الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي
لاختبار ما إذا كانت زيادة تركيز PEG تساعد في إثراء الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي ، تم إنشاء معيار مختبري لشظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل بأطوال مختلفة ، مما أدى إلى إنشاء مجموعة من شظايا الحمض النووي الخطية (الشكل 4). تعرض المعيار لأربعة ظروف هطول مختلفة - 9٪ PEG-8000 + 0.3 M NaCl (التركيبة الأصلية) ، 9٪ PEG-8000 + 1.2 M NaCl (رفع الملح فقط) ، 30٪ PEG-8000 + 0.3 M NaCl (رفع PEG فقط) و 30٪ PEG-8000 + 1.2 M NaCl (رفع كل من الملح و PEG). تم اختيار الظروف بناء على البروتوكول القياسي المستخدم لترصد SARS-CoV-217 ومن الظروف المبلغ عنها في دراسة الطرق المعيارية لاستخراج الحمض النووي من العينات البيئية33. تم استخدام سرعتين مختلفتين للطرد المركزي - 15000 × جم و 20000 × جم - بناء على تأثيرات السرعات التفاضلية على تكوير الحمض النووي43. عند زيادة تركيزات PEG و NaCl إلى 30٪ و 1.2 M ، على التوالي ، زاد إجمالي استرداد الحمض النووي بنسبة 70٪ تقريبا ، وتم ترسيب شظايا الحمض النووي الصغيرة مثل 150 زوجا أساسيا (bp) بشكل فعال (الشكل 5). لم يكن للاختلاف في السرعة تأثير كبير على العائد (الشكل 6 أ) وقد يكون بسبب وقت الطرد المركزي الطويل المستخدم. نظرا لأن إجمالي استعادة الحمض النووي كان أقل في تركيبة PEG / NaCl الأصلية ، كان من الممكن أن تكون نطاقات الوزن الجزيئي الأقل ، على الرغم من وجودها ، بتركيز أقل من حد التصور. لاختبار ذلك ، تم زيادة كمية الحمض النووي المدخل لهطول الأمطار ، وتم تحميل فائض من الحمض النووي المقابل لكل علاج (1.5 ملغ) على هلام الأغاروز للتصور. فقط العلاج بنسبة 30٪ PEG أظهر انتعاشا جيدا لأقل وزن جزيئي ، أي نطاق 150 bp (الشكل 6B).

ترسيب الحمض النووي الدائري (الحمض النووي الجينومي البكتيري والبلازميد) لا يتبع نفس الاتجاه
الإشريكية القولونية تم استخدام الحمض النووي الجينومي MG155 والبلازميد (pRSV ، ~ 4 كيلو بايت) لهطول الأمطار بتركيزات مختلفة من PEG و NaCl. على عكس الحمض النووي الخطي ، لم يكن هناك تأثير كبير لرفع مستويات PEG و NaCl (الشكل 7) ، مما يشير إلى أن غلة الحمض النووي الدائري وعالي الوزن الجزيئي (عادة الحمض النووي داخل الخلايا) لا تتأثر برفع PEG. هذا على النقيض من الملاحظات السابقة مع ترسيب البروتين44 ، حيث انخفضت قابلية الذوبان بشكل حاد مع تركيز PEG. بالنظر إلى أن PEG يعمل كعامل ازدحام ، فمن المفترض أن مساحة سطح الجزيء المتاح للتفاعل تلعب دورا مهما في فعاليته كعامل ترسيب. مع الحمض النووي الخطي ، مع زيادة الحجم ، من المعقول افتراض أن المساحة المتاحة للتفاعل تزداد أيضا. مع الحمض النووي الدائري ، من الممكن أن تكون تركيزات PEG المنخفضة كافية بالفعل لتشبع الجزيء ، وقد لا يؤدي زيادة التركيز إلى زيادة مساحة السطح الفعالة للتفاعل.

ضعف إنتاجية الحمض النووي من مياه الصرف الصحي عند حذف المعالجة المسبقة لهطول الأمطار باستخدام PEG و NaCl
لاختبار ما إذا كانت مياه الصرف الصحي المعالجة المسبقة ضرورية لاستخراج الحمض النووي ، تم رفع 20 مل من مياه الصرف الصحي المعطلة بالحرارة (70 درجة مئوية ، 4 ساعات) مع 10 ملغ من المعيار الخطي المعد مسبقا وحضنها طوال الليل عند 4 درجات مئوية (أ) بدون PEG + NaCl ، (ب) مع 9٪ PEG + 0.3 M NaCl (تركيبة أصلية) ، و (ج) مع 20٪ PEG + 1.2 M NaCl (زيادة PEG والملح). ثم تمت معالجة العينات من خلال مجموعة التربة لاستخراج الحمض النووي ، كما هو موضح في البروتوكول. وجد أن إنتاجية الحمض النووي المستخرج تزداد بنسبة 60٪ في عينات مياه الصرف الصحي المعالجة المسبقة مع 9٪ PEG + 0.3 M NaCl عند مقارنتها بعدم وجود خطوة معالجة مسبقة (الشكل 8) ، مما يشير إلى أن ترسيب PEG و NaCl للمعالجة المسبقة أمر حيوي للحصول على الحمض النووي عالي الإنتاجية من عينات مياه الصرف الصحي. من الجدير بالذكر أيضا أنه في حين أن إجمالي إنتاج الحمض النووي ، بما في ذلك الحمض النووي الجينومي عالي الوزن الجزيئي (gDNA) ، يكون أقل عند استخدام PEG العالي والملح لهطول الأمطار ، يتم إثراء نسبة الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي (الشكل 8). يمكن أن يعزى الانخفاض في العائد الإجمالي على رفع PEG والملح إلى الطبيعة شديدة اللزوجة ل PEG ، والتي يمكن أن تؤدي إلى فقدان حبيبات الحمض النووي أثناء إزالة المادة الطافية. هذا يعزز حالة طريقة استخراج الحمض النووي التدريجي المقترحة (الشكل 9) ، حيث يمكن أولا استخراج الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي باستخدام ترسيب PEG و NaCl المنخفض ، ويمكن إخضاع المادة الطافية الناتجة لجولة أخرى من المعالجة المسبقة مع زيادة PEG و NaCl لاستخراج الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي بكفاءة الذي نجا من الجولة الأولى من هطول الأمطار.

figure-results-1
الشكل 1: المعالجة المسبقة لعينات مياه الصرف الصحي. رسم تخطيطي يوضح سير العمل من جمع العينات إلى استخراج الحمض النووي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: ملف تعريف هلام نموذجي للحمض النووي المستخرج من عينات مياه الصرف الصحي. تم تعطيل حجم 50-100 مل (كما هو موضح في الشكل) من مياه الصرف الصحي المأخوذة من مواقع مختلفة بالحرارة عن طريق الحضانة عند 70 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. ثم تم تحضينه بنسبة 9٪ PEG و 0.3 M NaCl طوال الليل عند 4 درجات مئوية ثم تمت معالجته لاستخراج الحمض النووي باستخدام التربة أو مجموعة المياه. تم تحميل ما يقرب من 150 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي المستخرج على هلام أغاروز 1٪ جنبا إلى جنب مع سلم أزواج قاعدة 1 كيلو (kb) كعلامة وتعرض للرحلان الكهربائي (90 فولت ، 30 دقيقة). تم تصور الحمض النووي تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) باستخدام صبغة SYBR SAFE. يوضح الجدول الموجود على اليمين تفاصيل مصادر جمع العينات ، وحجم مياه الصرف الصحي المعالجة ، والمجموعة المستخدمة لاستخراج الحمض النووي لكل حارة. (STP: محطة معالجة مياه الصرف الصحي؛ UVR: الأشعة فوق البنفسجية) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تظهر عينات النفايات السائلة STP ضعف إجمالي إنتاجية الحمض النووي. تم تعطيل حجم 40 مل من مياه الصرف الصحي التي تم أخذ عينات منها من تأثير STP والنفايات السائلة بالحرارة عن طريق الحضانة عند 70 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. ثم تم تحضينه بنسبة 9٪ PEG و 0.3 M NaCl طوال الليل عند 4 درجات مئوية ثم تمت معالجته لاستخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة التربة أو الماء أو مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي البكتيري. تم تحميل ما يقرب من 150 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي المستخرج على هلام أغاروز 1٪ مع سلم 1 كيلو بايت كعلامة وتعرض للرحلان الكهربائي (90 فولت ، 30 دقيقة). تم تصور الحمض النووي تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) باستخدام صبغة SYBR SAFE. كان تركيز الحمض النووي المستخرج لعينات النفايات السائلة أقل من 1 نانوغرام / مل من مياه الصرف الصحي وبالتالي لا يمكن تصوره. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: توليد معيار خطي لحجم الحمض النووي (DNA) لاختبار فعالية ترسيب الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي. تم إنشاء خمس شظايا مختلفة الحجم من الحمض النووي عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الحمض النووي الجيني للإشريكية القولونية (MG1655) كقالب وبادئات وشروط كما هو موضح في الجدول 2. تم تحميل الحمض النووي المنقى (~ 1 ميكروغرام) مع مجموعة تنقية PCR على هلام أغاروز 1٪ مع سلم 1 كيلو بايت كعلامة وتعرض للرحلان الكهربائي (90 فولت ، 40 دقيقة). تم تصور الحمض النووي تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) باستخدام صبغة SYBR SAFE. يتم تمييز الممرات بأسماء الجينات التي تم تضخيم الجزء منها وحجم amplicon المتوقع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: يتم استرداد الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي بكفاءة فقط عند أعلى تركيز PEG (30٪). تمت معالجة الحمض النووي المدخل (3.34 ميكروغرام) من معيار الحجم الذي تم إنشاؤه سابقا بمجموعات مختلفة من PEG و NaCl كما هو موضح في الشكل واستخرجت كما هو مفصل في البروتوكول. كانت سرعة الطرد المركزي المستخدمة 15000 × جرام. بالنسبة للإدخال (الحارة 3) و 1.2 M NaCl + 30٪ PEG (الحارة 7) ، تم تحميل 0.8 ميكروغرام من الحمض النووي على الهلام. بالنسبة للباقي ، نظرا لأن العائد الإجمالي كان منخفضا ، تم تحميل الكمية الإجمالية للحمض النووي المستخرج في 16 ميكرولتر وتم تحميل سلم 1 كيلو بايت كعلامة حجم على هلام أغاروز 1٪ وتعرض للرحلان الكهربائي (80 فولت ، 45 دقيقة). تم تصور الحمض النووي تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) باستخدام صبغة SYBR SAFE. يبرز المربع الأبيض أدنى نطاق يبلغ 150 نقطة أساس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: يتم تحديد استعادة الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي من خلال تركيزات PEG العالية بدلا من تركيزات الملح العالية. (أ) عولج الحمض النووي المدخل (14 ميكروغرام) من معيار الحجم بتوليفات مختلفة من PEG وNaCl، كما هو مبين في الشكل، واستخلصه باستخدام ترسيب الإيثانول كما هو مفصل في البروتوكول. كانت سرعة الطرد المركزي المستخدمة 15000 × جم و 20000 × جم ، كما هو موضح في الشكل. تم تحميل كامل كمية الحمض النووي المدخل والحمض النووي المستخرج ، جنبا إلى جنب مع سلم 1 كيلو بايت ، على هلام أغاروز 1٪ وتعرض للرحلان الكهربائي (90 فولت ، 30 دقيقة). تم تصور الحمض النووي تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) باستخدام صبغة SYBR SAFE. (ب) تمت معالجة الحمض النووي المدخل (15.67 ميكروغرام) من معيار الحجم المتولد سابقا بمجموعات مختلفة من PEG و NaCl ، كما هو موضح في الشكل ، واستخرجت كما هو مفصل في البروتوكول. كانت سرعة الطرد المركزي المستخدمة 15000 × جرام. تم تحميل الحمض النووي المستخرج (1.5 ميكروغرام) في كل حارة وتم تحميل سلم 1 كيلو بايت كعلامة حجم على هلام أغاروز 1٪ وتعرض للرحلان الكهربائي (80 فولت ، 45 دقيقة). تم تصور الحمض النووي تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) باستخدام صبغة SYBR SAFE. يبرز المربع الأبيض أدنى نطاق يبلغ 150 نقطة أساس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: لا يتأثر استرداد الحمض النووي الجينومي والحمض النووي البلازميدي بشكل كبير بزيادة تركيز PEG و NaCl. تمت معالجة الحمض النووي المدخل (9 ميكروغرام ؛ 4.5 ميكروغرام بلازميد و 4.5 ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي) بمجموعات مختلفة من PEG و NaCl كما هو موضح في الشكل واستخرجت كما هو مفصل في البروتوكول. كانت سرعة الطرد المركزي المستخدمة 15000 × جرام. تم تحميل كامل كمية الحمض النووي المدخل والحمض النووي المستخرج ، جنبا إلى جنب مع سلم 1 كيلو بايت ، على هلام أغاروز 1٪ وتعرض للرحلان الكهربائي (90 فولت ، 45 دقيقة). تم تصور الحمض النووي تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) باستخدام صبغة SYBR SAFE. تشير المربعات البيضاء إلى الحمض النووي الجيني والحمض النووي البلازميدي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 8: المعالجة المسبقة لهطول الأمطار باستخدام PEG و NaCl أمر بالغ الأهمية لاستخراج الحمض النووي عالي الغلة من مياه الصرف الصحي. تم رفع مياه الصرف الصحي المعطلة بالحرارة (70 درجة مئوية ، 4 ساعات) (20 مل) مع 10 ملغ من المعيار الخطي المعد مسبقا وتم تحضينها طوال الليل عند 4 درجات مئوية بدون PEG و NaCl أو تركيزات PEG و NaCl متفاوتة كما هو موضح في الشكل. ثم تمت معالجته لاستخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة التربة. تم تحميل الحمض النووي المدخل (4 ميكروغرام) المستخدم في الارتفاع (الممر 1) ، والحمض النووي المستخرج (4 ميكروغرام) مع خطوة المعالجة المسبقة بنسبة 9٪ PEG + 0.3 M NaCl (الحارة 3) على هلام أغاروز 1٪. بالنسبة لبقية الظروف ، تم تحميل كامل كمية الحمض النووي المستخرج على الجل لأن العائد كان منخفضا. تم تحميل سلم 1 كيلو بايت أيضا كعلامة حجم. تعرض الجل للرحلان الكهربائي (70 فولت ، 2 ساعة). تم تصور الحمض النووي تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) باستخدام صبغة SYBR SAFE. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9
الشكل 9: الطريقة التدريجية المقترحة لاستخلاص الحمض النووي (DNA) من مياه الصرف الصحي لإثراء الحمض النووي (DNA) ذي الوزن الجزيئي المرتفع والمنخفض. مخطط انسيابي يصور طريقة من خطوتين لاستخراج الحمض النووي من مياه الصرف الصحي مع خطوة معالجة أولية مسبقة باستخدام تركيز PEG و NaCl منخفض. يتعرض الطافي من الخطوة الأولى لجولة أخرى من ترسيب المعالجة المسبقة مع زيادة PEG و NaCl لاستخراج الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي والمنخفض بشكل فعال من مياه الصرف الصحي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. الاستخدام السابق ل PEG و NaCl في دراسات استخراج الحمض النووي من العينات البيئية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2. تسلسل التمهيدي وشروط PCR للتوليد القياسي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3. إنتاجية الحمض النووي وجودته التي تم الحصول عليها من عينات مياه الصرف الصحي على مدى شهرين في عام 2023. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

تعد مقاومة مضادات الميكروبات واحدة من أكبر 10 تهديدات صحية اليوم ، كما هو مدرج من قبل منظمة الصحة العالمية ، ومن المسلم به أن المراقبة البيئية لمقاومة مضادات الميكروبات أداة مهمة في جميع أنحاء العالم. كما هو مذكور في المقدمة ، يتضمن السجل الشامل لمقاومة مضادات الميكروبات البيئية الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي والمجزأ وخارج الخلية. يحقق بروتوكول المعالجة المسبقة المذكور هنا باستخدام تركيز عال من PEG مع الملح (30٪ PEG و 1.2 M NaCl) هذه النتيجة من خلال إثراء نسبة الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي دون التأثير على استخراج كسور الوزن الجزيئي الأعلى (إلى حد كبير الحمض النووي الجينومي والبلازميد). هذا على عكس الطرق السابقة للتركيز باستخدام بروتوكولات PEG و Direct Kit المنخفضة (بدون معالجة مسبقة) والتي تكون مرهقة بسبب الحاجة إلى معالجة كميات كبيرة. كانت المعالجة المسبقة بتركيزات PEG أقل غير فعالة في استعادة الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي (تشير كلمة "منخفض" إلى نطاقات الحمض النووي التي تقل عن 600 نقطة أساس هنا). عندما لا يتم استخدام PEG أثناء المعالجة المسبقة ، يكون استخراج الحمض النووي ضعيفا ، مما يؤدي إلى استرداد 10٪ فقط من الحمض النووي المدخل مقابل 70٪ عند استخدام PEG و NaCl (الشكل 8). بالإضافة إلى إضافة PEG و NaCl ، هناك خطوة مهمة أخرى تتمثل في إزالة الإيثانول المتبقي بعد استخراج الحمض النووي من المجموعة للحصول على الحمض النووي النقي للمعالجة النهائية. من المهم تحديد الحجم الأولي للمياه اللازمة للحصول على كمية إجمالية لا تقل عن ~ 300 نانوغرام إلى 5 ملغ من الحمض النووي بحجم 30-50 مل عند الشطف. على النقيض من 1 لتر أو أكثر من المياه التي تتم معالجتها عادة لاستخراج الحمض النووي من مياه الصرف الصحي 27,41 ، وجد أنه مع خطوة المعالجة المسبقة المقترحة هنا ، يكفي 27.5-40 مل فقط للحصول على حمض نووي عالي الجودة للمعالجة النهائية. تحتوي مياه الصرف الصحي أيضا على جسيمات ومواد عضوية ، والتي يمكن أن تحتوي على خلايا بكتيرية ممتزة وحمض نووي خارج الخلية. ومن ثم، فإن امتزاز الخلايا والحمض النووي المصحوب بتحلل الخلايا يعد خطوة مهمة لزيادة إنتاج الحمض النووي (DNA). تركيزات PEG العالية تجعل العينة لزجة ويمكن أن تعيق خطوات التحلل والامتزاز لاستخراج الحمض النووي ، كما ذكرنا سابقا. لتجنب ذلك ، تم اقتراح طريقة تدريجية لاستخراج الحمض النووي ، كما هو موضح في المخطط الانسيابي (الشكل 9). ستكون هذه الطريقة مفيدة في استخراج كل من الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي داخل الخلايا (الشكل 7) ، والحمض النووي المجزأ والدائري منخفض الوزن الجزيئي خارج الخلية.

أحد القيود الحالية لهذا البروتوكول من حيث النفقات هو المعالجة المستمرة للحمض النووي المخصب منخفض الوزن الجزيئي من خلال مجموعة لتحسين الجودة. يمكن تجاوز هذا القيد باستخدام طرق أخرى لتنظيف الحمض النووي ، مثل استخراج الفينول كلوروفورم. هناك قيد عملي آخر وهو التعامل مع تركيزات PEG العالية حيث يمكن فقد الحبيبات بسبب اللزوجة العالية للمحلول. حاليا ، يتم إجراء المعالجة المسبقة باستخدام PEG و NaCl ، تليها نسخة معدلة من بروتوكول مجموعة موجود ، أي أن المجموعة لا تزال تستخدم لتنقية الحمض النووي النهائية. يتم تحسين تنقية الحمض النووي بدون عدة ، والتي تعطي إنتاجية عالية من الحمض النووي ولكن ذات نقاء منخفض (لم يتم الإبلاغ عنها هنا) ، لتحسين جودة الحمض النووي المستخرج. نظرا للطبيعة اللزجة لحلول PEG ، يجب استهداف تركيز PEG الأمثل الذي يمكن أن ينتج عنه مجموعة كاملة من أحجام الحمض النووي ومع ذلك يتم التعامل معه بشكل مريح. خفض التركيز إلى 20٪ (الشكل 6B) حقق نتيجة متوسطة لكفاءات الاستخراج منخفضة (9٪) وعالية (30٪) PEG ؛ وقد يكون من المفيد متابعة ذلك في الأعمال المقبلة.

يستخدم PEG بشكل روتيني خلال خطوات مختلفة لاستخراج الحمض النووي من العينات البيئية. ومع ذلك، لم يتم توحيد استخدام PEG لاستخراج الحمض النووي في سياق مراقبة مقاومة مضادات الميكروبات. يستلزم ترصد مياه الصرف الصحي الكشف عن مقاومة مضادات الميكروبات في العديد من المجالات المختلفة ، بما في ذلك STPs (المؤثرة والنفايات السائلة) والمصارف المفتوحة والمغلقة 8,27. في حين أن المعلومات المتعلقة بمقاومة مضادات الميكروبات في المؤثرين توفر معلومات مهمة عن المقاومة المنتشرة في المجتمع ، فإن وجود جينات مقاومة مضادات الميكروبات في النفايات السائلة مهم بنفس القدر لقياس ظهور فاشيات المقاومة والتنبؤ بها. عادة ما يكون لعينات النفايات السائلة حمولة ميكروبية منخفضة لأن معظم الخلايا تقتل أثناء عملية المعالجة ، مما يؤدي إلى انخفاض شديد في إنتاج الحمض النووي الخلوي. ومع ذلك ، تحتوي النفايات السائلة على حمض نووي عائم حر خارج الخلية يتكون من الحمض النووي الجينومي عالي الوزن الجزيئي والبلازميد منخفض الوزن الجزيئي والفاجميد والحمض النووي المجزأ. يمكن نقل جينات مقاومة مضادات الميكروبات الموجودة في الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي (المجزأ والبلازميد / الفاغميدات) إلى الخلايا الحية المتبقية في النفايات السائلة ، مما يؤدي إلى نشر المقاومة30،41،45. وبالتالي ، من المهم اكتشاف الحمض النووي خارج الخلية منخفض الوزن الجزيئي في مياه الصرف الصحي. الطرق الأخرى المستخدمة لاستخراج الحمض النووي من مياه الصرف الصحي أثناء تقييم مقاومة مضادات الميكروبات لا تضمن عادة الإثراء الأولي للحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي. يمكن استخدام هذا النهج لاستخراج الحمض النووي من مياه الصرف الصحي لتوفير معلومات حول مقاومة شاملة للبيئة.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نحن نقر بدعم التمويل من مؤسسة روكفلر (رقم منحة مؤسسة روكفلر 2021 HTH 018) كجزء من فريق APSI India (التحالف من أجل ابتكارات مراقبة مسببات الأمراض https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). كما نعترف بالمساعدة المالية التي قدمها بنك Axis في دعم هذا البحث ومدرسة Trivedi للعلوم البيولوجية في جامعة أشوكا للمعدات وغيرها من أشكال الدعم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
جهاز طرد مركزي دقيق ذو 24 مقعداجهاز طرد مركزي Eppendorf 5425 REP5406000046
الإيثانول المطلق (Emsure ACS ، ISO ، Reag. Ph Eur الإيثانول المطلق للتحليل)Supelco100983-0511
AgaroseInvitrogen16500500
مقعد أعلى جهاز طرد مركزي مبردEppendorf جهاز طرد مركزي 5920 REP5948000131
ChemiDocالتصوير BioRad12003153
DNeasy PowerSoil Pro KitQiagen47014
DNeasy PowerWater Pro KitQiagen14900-100-NF
dNTPs (مزيج dNTP 10 ملي متر لكل منهما ، 0.2 مل ، R0191)ثيرمو فيشرR0191
دريم تك بوليميراز الحمض النووي ، 5 U/µ ؛ L + 10x DreamTaq Buffer *ThermofscientificEP0702
E-Gel 1 كيلو بايت Plus Express DNA سلمInvitrogen10488091
Maxiamp أنابيب PCR 0.2 ملTarsons510051
بيولوجيا جزيئية درجة المياه ل PCRHiMediaML065-1.5ML
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis مقياس الطيف13400519علمي حراري
بارافيلمبيميسS37440
PEG-8000SRL54866
QIAquick PCR & طقم تنظيف الجلQiagen28506
كيوبت 4 مقياس الفلور (مع WiFi)ThermofisherQ33238
أنابيب فحصكيوبيت ThermofisherQ32856
مجموعة كاشف Qubitt للحمض النووي ds ، مجموعة واسعةمن Thermo ScientificQ32853 (500 فحص)
كلوريد الصوديومHiMediaTC046M-500G
SYBR صبغة جل الحمض النووي الآمنةInvitrogenS33102
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
Thermo Cycler (نظام ProFlex 3 × 32-well PCR)Applied Biosystems4484073
Wizard Genomic DNA Purification KitPromegaA1125
نظام الضوئي

المراجع

  1. Kirby, A. E., et al. Using wastewater surveillance data to support the COVID-19 response - United States, 2020-2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 70 (36), 1242-1244 (2021).
  2. Amman, F., et al. Viral variant-resolved wastewater surveillance of SARS-COV-2 at national scale. Nat Biotechnol. 40 (12), 1814-1822 (2022).
  3. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: A systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  4. The L. Antimicrobial resistance. The L. Antimicrobial resistance: Time to repurpose the global fund. Lancet. 399 (10322), 335(2022).
  5. Munk, P., et al. Genomic analysis of sewage from 101 countries reveals global landscape of antimicrobial resistance. Nat Commun. 13 (1), 7251(2022).
  6. Parnanen, K. M. M., et al. Antibiotic resistance in European wastewater treatment plants mirrors the pattern of clinical antibiotic resistance prevalence. Sci Adv. 5 (3), 9124(2019).
  7. Grenni, P. Antimicrobial resistance in rivers: A review of the genes detected and new challenges. Environ Toxicol Chem. 41 (3), 687-714 (2022).
  8. Siri, Y., Precha, N., Sirikanchana, K., Haramoto, E., Makkaew, P. Antimicrobial resistance in southeast Asian water environments: A systematic review of current evidence and future research directions. Sci Total Environ. 896, 165229(2023).
  9. Hunter, P. R., Macdonald, A., Carter, R. C. Water supply and health. PLoS Med. 7 (11), e1000361(2010).
  10. Bain, R., et al. Fecal contamination of drinking-water in low- and middle-income countries: A systematic review and meta-analysis. PLoS Med. 11 (5), e1001644(2014).
  11. Collignon, P., Beggs, J. J., Walsh, T. R., Gandra, S., Laxminarayan, R. Anthropological and socioeconomic factors contributing to global antimicrobial resistance: A univariate and multivariable analysis. Lancet Planet Health. 2 (9), e398-e405 (2018).
  12. Asghar, H., et al. Environmental surveillance for polioviruses in the global polio eradication initiative. J Infect Dis. 210, Suppl 1 S294-S303 (2014).
  13. Gracia-Lor, E., Rousis, N. I., Hernandez, F., Zuccato, E., Castiglioni, S. Wastewater-based epidemiology as a novel biomonitoring tool to evaluate human exposure to pollutants. Environ Sci Technol. 52 (18), 10224-10226 (2018).
  14. Choi, P. M., et al. economic correlates of food and chemical consumption measured by wastewater-based epidemiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21864-21873 (2019).
  15. Hemalatha, M., et al. Surveillance of SARS-COV-2 spread using wastewater-based epidemiology: Comprehensive study. Sci Total Environ. 768, 144704(2021).
  16. Westhaus, S., et al. Detection of sars-cov-2 in raw and treated wastewater in Germany - suitability for COVID-19 surveillance and potential transmission risks. Sci Total Environ. 751, 141750(2021).
  17. Lamba, S., et al. SARS-COV-2 infection dynamics and genomic surveillance to detect variants in wastewater - a longitudinal study in Bengaluru, India. Lancet Reg Health Southeast Asia. 11, 100151(2023).
  18. Stockdale, S. R., et al. RNA-seq of untreated wastewater to assess COVID-19 and emerging and endemic viruses for public health surveillance. Lancet Reg Health Southeast Asia. 14, 100205(2023).
  19. Bengtsson-Palme, J., et al. Towards monitoring of antimicrobial resistance in the environment: For what reasons, how to implement it, and what are the data needs. Environ Int. 178, 108089(2023).
  20. Bengtsson-Palme, J., Kristiansson, E., Larsson, D. G. J. Environmental factors influencing the development and spread of antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev. 42 (1), 053(2018).
  21. Dunachie, S. J., Day, N. P., Dolecek, C. The challenges of estimating the human global burden of disease of antimicrobial resistant bacteria. Curr Opin Microbiol. 57, 95-101 (2020).
  22. Hughes, D., Andersson, D. I. Evolutionary trajectories to antibiotic resistance. Annu Rev Microbiol. 71, 579-596 (2017).
  23. World Health Organization. Global antimicrobial resistance and use surveillance system (GLASS). World Health Organization. , (2022).
  24. Walia, K., et al. Establishing antimicrobial resistance surveillance & research network in india: Journey so far. Indian J Med Res. 149 (2), 164-179 (2019).
  25. Hart, A., Warren, J., Wilkinson, H., Schmidt, W. Environmental surveillance of antimicrobial resistance (AMR), perspectives from a national environmental regulator in 2023. Euro Surveill. 28 (11), (2023).
  26. Huijbers, P. M. C., Flach, C. F., Larsson, D. G. J. A conceptual framework for the environmental surveillance of antibiotics and antibiotic resistance. Environ Int. 130, 104880(2019).
  27. Liguori, K., et al. Antimicrobial resistance monitoring of water environments: A framework for standardized methods and quality control. Environ Sci Technol. 56 (13), 9149-9160 (2022).
  28. Hayward, C., Ross, K. E., Brown, M. H., Whiley, H. Water as a source of antimicrobial resistance and healthcare-associated infections. Pathogens. 9 (8), 667(2020).
  29. Booton, R. D., et al. One health drivers of antibacterial resistance: Quantifying the relative impacts of human, animal and environmental use and transmission. One Health. 12, 100220(2021).
  30. Sivalingam, P., Pote, J., Prabakar, K. Extracellular DNA (eDNA): Neglected and potential sources of antibiotic resistant genes (ARGs) in the aquatic environments. Pathogens. 9 (11), 874(2020).
  31. Woegerbauer, M., Bellanger, X., Merlin, C. Cell-free DNA: An underestimated source of antibiotic resistance gene dissemination at the interface between human activities and downstream environments in the context of wastewater reuse. Front Microbiol. 11, 671(2020).
  32. Kittredge, H. A., Dougherty, K. M., Evans, S. E. Dead but not forgotten: How extracellular DNA, moisture, and space modulate the horizontal transfer of extracellular antibiotic resistance genes in soil. Appl Environ Microbiol. 88 (7), 0228021(2022).
  33. Lever, M. A., et al. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front Microbiol. 6, 476(2015).
  34. Lis, J. T., Schleif, R. Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol. Nucleic Acids Res. 2 (3), 383-389 (1975).
  35. He, Z., Zhu, Y., Gu, H. A new method for the determination of critical polyethylene glycol concentration for selective precipitation of DNA fragments. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (20), 9175-9183 (2013).
  36. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. Biotechniques. 49 (3), 631-640 (2010).
  37. Arbeli, Z., Fuentes, C. L. Improved purification and PCR amplification of DNA from environmental samples. FEMS Microbiol Lett. 272 (2), 269-275 (2007).
  38. Verma, S. K., Singh, H., Sharma, P. C. An improved method suitable for isolation of high-quality metagenomic DNA from diverse soils. 3 Biotech. 7 (3), 171(2017).
  39. Narayan, A., Jain, K., Shah, A. R., Madamwar, D. An efficient and cost-effective method for DNA extraction from athalassohaline soil using a newly formulated cell extraction buffer. 3 Biotech. 6 (1), 62(2016).
  40. Sapula, S. A., Whittall, J. J., Pandopulos, A. J., Gerber, C., Venter, H. An optimized and robust peg precipitation method for detection of sars-cov-2 in wastewater. Sci Total Environ. 785, 147270(2021).
  41. Calderon-Franco, D., Van Loosdrecht, M. C. M., Abeel, T., Weissbrodt, D. G. Free-floating extracellular DNA: Systematic profiling of mobile genetic elements and antibiotic resistance from wastewater. Water Res. 189, 116592(2021).
  42. Sangamnere, R., Misra, T., Al Bherwani, H. E. t A critical review of conventional and emerging wastewater treatment technologies. Sustain Water Resour Manag. 9, 58(2023).
  43. Weiss, N., Heng, S. W., Lim, H. W. Centrifugation at 30,000 x g. in plasmid DNA precipitation allows better recovery rates and shorter centrifugation times. Application note no: 234, Eppendorf. , Available from: https://www.eppendorf.com/product-media/doc/en/157398_Application/Eppendorf_Centrifugation_Application-Note_234_Centrifuge-5430-familiy_Safe-Lock-Tubes_Centrifugation-at-30_000-x-g-plasmid-DNA-precipitation-allows-better-recovery-rates-shorter-centrifug.pdf (2017).
  44. Atha, D. H., Ingham, K. C. Mechanism of precipitation of proteins by polyethylene glycols. Analysis in terms of excluded volume. J Biol Chem. 256 (23), 12108-12117 (1981).
  45. Sivalingam, P., et al. Extracellular DNA includes an important fraction of high-risk antibiotic resistance genes in treated wastewaters. Environ Pollut. 323, 121325(2023).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الاستخلاص المعزز للحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي من مياه الصرف الصحي لإجراء تقييم شامل لمقاومة مضادات الميكروبات
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.