نصف بروتوكول قلب الفئران العامل المعزول خارج الجسم الحي لاختبار استراتيجيات الحفاظ على قلب المتبرع. تصف هذه الورقة بروتوكول الاستخدام في التخزين البارد الثابت لقلوب المتبرعين بالقوارض. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام البروتوكول لقلوب المتبرعين التي تم الحصول عليها بعد التبرع بعد الموت أثناء الدورة الدموية وموت الدماغ.
مقالة منهجية
استخدام نموذج قلب الفئران العامل المعزول لاختبار استراتيجيات الحفاظ على قلب المتبرع
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لعب تحسين حلول الحفاظ على قلب المتبرعين دورا رئيسيا في الحد من إصابة نقص التروية وإعادة التروية في قلوب المتبرعين أثناء استرجاع الأعضاء ونقلها وزرعها. أظهر العمل السابق من مختبرنا أن إضافة ثلاثي نترات الجلسريل والإريثروبويتين إلى حلول الحفاظ على قلب المتبرع يمكن أن يحسن بشكل كبير من تعافي وظائف القلب بعد التخزين البارد لفترات طويلة والتبرع بعد قلوب الموت في الدورة الدموية. تم تنفيذ بروتوكول المكملات هذا في الاستخدام السريري في وحدات الزرع في جميع أنحاء أستراليا وبلجيكا والمملكة المتحدة. هنا ، نحدد بروتوكولا لاختبار استراتيجيات المكملات باستخدام دائرة تروية قلب الفئران العامل المعزول خارج الجسم الحي (IWRH). باستخدام هذه المنهجية ، يمكن اختبار استراتيجيات المكملات في سياق التخزين الساكن البارد لفترات طويلة ، والتبرع بعد موت الدماغ ، والتبرع بعد الحفاظ على قلب المتبرع بالدورة الدموية. يمكن استخدام الانتعاش الوظيفي للقلب ، الذي يقاس بتدفق الأبهر ، والتدفق التاجي ، والنتاج القلبي ، وضغط النبض ، ومعدل ضربات القلب ، لتحديد ما إذا كانت استراتيجية حفظ معينة يمكن أن تقلل من إصابة نقص التروية وإعادة التروية في قلب المتبرع.
المقدمة
يمكن أن يتأثر نجاح عملية زرع القلب بشكل كبير بطريقة الحفظ المستخدمة لقلب المتبرع. تتعرض قلوب المتبرعين لإهانات إقفارية طوال عملية استرجاع الأعضاء ونقلها وزرعها. يمكن التخفيف من درجة الضرر الإقفاري الذي يلحق بالعضو المتبرع عن طريق اختيار استراتيجية مناسبة للحفاظ على قلب المتبرع. يظل التخزين الساكن البارد (CSS) الطريقة الأكثر جدوى وشيوعا للحفاظ على قلب المتبرع. ومع ذلك ، قد لا يكون CSS بالضرورة هو الخيار الأفضل لجميع مسارات التبرع بالقلب. على سبيل المثال ، يتم الحفاظ على القلوب التي تم شراؤها عن طريق التبرع بعد مسار الموت الدوري (DCD) وتقييمها للتأكد من صلاحيتها باستخدام نضح الآلة القياسي ، في حين يمكن الحفاظ على القلوب التي يتم شراؤها عن طريق التبرع بعد موت الدماغ (DBD) باستخدام CSS أو التروية الآلية المنخفضة للحرارة. محدد مهم آخر لاستراتيجية الحفظ المستخدمة هو مقدار نقص التروية الدافئ (ل DCD) أو نقص التروية الباردة (ل DBD) الذي يتعرض له القلب أثناء شراء الأعضاء ونقلها.
تستخدم العديد من المراكز مكملات دوائية إضافية لمحلول الحفاظ على القلب لزيادة تحمل الإقفار وتحسين وظيفة القلب بعد الزراعة. أظهرت دراسات القوارض من مختبرنا أن مكملات شلل القلب مع الإريثروبويتين والجليسريل ثلاثي نترات كانت قادرة على تحسين الانتعاش الوظيفي للقلب بشكل كبير بعد التخزين البارد لفترات طويلة لقلب المتبرع1،2. ثم تقدمت هذه الدراسات إلى دراسات الخنازير للحفاظ على قلب المتبرعين وقدمت الأساس قبل السريري الذي أدى إلى دمج الإريثروبويتين والجلسريل ثلاثي نترات في محلول شلل القلب للقلوب الذي تم شراؤه عبر مسار DCD باستخدام نضح آلة الحرارةالعادية 3،4،5. حاليا ، يتم استخدام مكملات الإريثروبويتين وثلاثي نيترات الجلسريل أيضا في وحدات الزرع الأسترالية لاسترجاع القلب السريري DBD الذي يتضمن CSS. الهدف العام لبروتوكول نضح قلب الفئران العامل المعزول (IWRH) الموضح أدناه هو اختبار استراتيجيات الحفاظ على قلب المتبرع في بيئة معملية واختبار فعاليتها في الحفاظ على وظيفة قلب المتبرع بعد إعادة التروية. تم استخدام بروتوكول قلب الفئران العامل المعزول الموصوف لأكثر من عقدين من الزمن داخل مختبرنا وأثبت أنه مفيد للغاية في فحص المكملات الغذائية و / أو الاستراتيجيات المحتملة التي يمكن أن تحسن الحفاظ على قلب المتبرع2،7،8،9.
البروتوكول
تلقت جميع رعاية إنسانية وفقا لإرشادات المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (أستراليا). تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات التابعة لمعهد غارفان للبحوث الطبية (سيدني ، أستراليا).
1. تحضير المخزن المؤقت Krebs-Henseleit (KH)
- قم بإعداد 2 لتر من محلول مخزون 20x من KH المخزن المؤقت الذي يحتوي على 2.36 M كلوريد الصوديوم ، 0.094 M KCl ، 0.024 M MgSO4 ، 0.024 M KH2PO4. Aliquot في أنابيب 50 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- قبل التجربة ، قم بإعداد قارورتين 2 لتر من Erlenmyer من 1x KH buffer تحتوي على 1900 مل من الماء منزوع الأيونات ، و 100 مل من مخزن KH 20x ، و 4.20 جم من NaHCO3 (25 ملم) ، و 3.96 جم من الجلوكوز (11 مل).
- ضع قوارير عازلة في حمام مائي 37 درجة مئوية وقم بغاز المحلول بالكربوجين (95٪ أكسجين ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، ضبط معدل التدفق على 2 لتر / دقيقة) عبر أحجار الهواء (مرشح مدخل الانزلاق) لمدة 5 دقائق ، ثم أضف 2.8 مل من 1 M CaCl2 (1.4 مل). استمر في غلي المحلول لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل بدء التجربة. يساعد استخدام حجر الهواء في التهوية المنتظمة للمخزن المؤقت.
- ضع حجما صغيرا (~ 50 مل) من المخزن المؤقت في طبق معدني دائري عند -20 درجة مئوية ليبرد ويشكل طبقة من العازلة المثلجة.
2. إعداد دائرة التروية
- تأكد من نظافة جميع الأنابيب والأواني الزجاجية مع عدم وجود نمو / تلوث مرئي.
- إعداد ارتفاعات الغرف الزجاجية لتتوافق مع ضغوط التروية المطلوبة على أساس ارتفاع2درجة حرارة 1 سم يعادل 1.36 مم زئبق: لانغندورف إلى القلب 100 سم (حوالي 75 مم زئبق)، العمل قبل التحميل من جانب إلى قلب 15 سم (حوالي 11 مم زئبق)، حجرة من القلب إلى الحمل اللاحق 100 سم (حوالي 75 مم زئبق).
- ابدأ تدوير الماء الساخن حول الدائرة قبل 10 دقائق على الأقل من نضح القلب.
- ضع مرشحات الألياف الدقيقة (1.2 ميكرومتر) في حاملات المرشحات وثبتها بإحكام.
- قم بتجهيز الدائرة باستخدام المخزن المؤقت KH ، مما يضمن إزالة كل الهواء ، واستخدم مشبك أنبوب التحكم في التدفق لضبط التدفق على جانب Langendorff (الشكل 1A ، B) إلى ~ 50 مل / دقيقة. يسمح التدفق البطيء بسهولة قنية الأبهر ويمنع إزاحة القلب قبل الربط. ضع مقياس حرارة داخل الدائرة عبر موصل أنبوب على شكل حرف T لمراقبة درجة حرارة المخزن المؤقت عند ~ 37 درجة مئوية.
3. إعداد برنامج مخطط المختبر (تحليل البيانات)
- تأكد من تشغيل Powerlab (نظام الحصول على البيانات) ومقياس الجريان وتوصيلهم بالكمبيوتر قبل فتح برنامج تحليل البيانات.
- افتح ملفا جديدا.
- يمكنك إعداد جمع البيانات عن طريق تحديد القائمة المنسدلة الإعدادات واختيار إعدادات القناة. حدد ضغط الأبهر وتدفق الأبهر ومعدل ضربات القلب (الشكل 2 أ).
- قم بإعداد كل قناة بالإعدادات الموضحة في الشكل 2 ب.
4. تحضير لعزل قلب الفئران
ملاحظة: فيما يلي طريقة عزل قلب الفئران والتروية للقلوب غير DBD وغير DCD للتخزين الساكن البارد. تتشابه طرق أجهزة القلب في دائرة التروية نسبيا بغض النظر عن طريقة التبرع المستخدمة. تحدث الاختلافات في بروتوكول التبرع بقلب الفئران DBD و DCD بشكل أساسي من وقت سريان التخدير الحيواني إلى وقت استئصال القلب من.
- قم بوزن ، مع التأكد من أن وزنه >330 جم. نطاق الوزن المثالي لذكور الفئران هو 330-420 جم.
- يتم تطبيق حقنة داخل الصفاق من الكيتامين (80 ملغ/كغ) والزيلازين (10 ملغ/كغ). تأكد من مستوى التخدير الجراحي المناسب بناء على عدم وجود منعكس دواسة (منعكس قرصة إصبع القدم) وانعكاس وميض العين.
- ضع في وضع ضعيف ، وقم بتأمين الأطراف بشريط لاصق. قم بإعطاء الأكسجين للحيوان عبر مخروط الأنف.
- احصل على حاوية معدنية من الثلج عازلة KH وحاوية معدنية صغيرة بها ثلج في محطة التشريح. انقع شاشا مقاس 7.5 سم × 7.5 سم في مخزن KH وضعه على الحاوية مع الثلج.
- بمجرد التأكد من مستوى التخدير الجراحي الكافي ، احلق الجلد في موقع الشق الجراحي ونظف الجلد بمادة معقمة مثل البيتادين أو 70٪ كحول. قم بعمل شق جانبي عبر البطن (بضع البطن) وحرك المعدة والأمعاء إلى الجانب للسماح بالوصول إلى الوريد الكلوي الأيسر. حقن 1500 وحدة دولية من الهيبارين واضغط على موقع الحقن حتى يتوقف النزيف. اترك 1-2 دقيقة حتى يدور الهيبارين قبل الاستمرار في استرجاع القلب.
- افتح تجويف الصدر عن طريق قطع القفص الصدري على كلا الجانبين وقطع الحجاب الحاجز. أمسك كتلة القلب والرئة وارفعها بحذر أثناء قطع الشريان الأورطي الهابط ، مع التأكد من بقاء قوس الأبهر سليما. سيسمح ذلك بطول الشريان الأورطي الكافي للبقاء للقنية.
- يتم القتل الرحيم للفأر عن طريق إزالة القلب والرئتين أثناء التخدير. اغمر كتلة القلب والرئة في طين الجليد العازل KH للسماح للقلب بالاعتقال.
5. قنبل القلب على دائرة نضح القلب العاملة المعزولة
- انقل كتلة القلب والرئة إلى شاش على الجليد. قم بتشريح الدهون الزائدة حول الشريان الأورطي ، وقم بقص الشريان الأورطي ليترك طولا 3-5 مم للقنية ، وقم بعمل شق صغير ~ 1-2 مم في الشريان الرئوي. سيسمح ذلك بمسار للنفايات السائلة التاجية.
- ضع كتلة القلب والرئة المشذبة (بينما لا تزال على الجليد) أسفل القنيات مباشرة. اضبط التدفق من جانب Langendorff باستخدام مشبك أنبوب التحكم في التدفق لتسهيل قنية الأبهر. قم بتقطيع الشريان الأورطي بعناية على القنية اليسرى ، وامسكه بمشبك أسود ، واربطه بخياطة حريرية 2-0.
- قم بزيادة التدفق من نضح Langendorff عن طريق فتح مشبك أنبوب التحكم في التدفق بالكامل. افتح مشبك ما بعد التحميل. تأكد من وجود تدفق مستمر من غرفة Langendorff. ابدأ في مراقبة نشاط القلب باستخدام البرنامج.
ملاحظة: إذا كانت قيمة تدفق الأبهر على شاشة مقياس الجريان <10 مل / دقيقة ، فتأكد من أن بضع الشرايين الرئوية بحجم كاف. يمكن أن يشير تتبع / قيمة تدفق الأبهر المنخفض أيضا إلى أن قنية الأبهر قد تم إدخالها بعيدا جدا. - اضبط كتلة القلب والرئة بحيث يكون السطح الأمامي للرئتين مواجها للمشغل. اربط فص الرئة الأيسر بخياطة حريرية 2-0 واقطع أنسجة الرئة اليسرى الزائدة. اربط فصوص الرئة المتبقية في عملية مسح واحدة بخياطة حريرية 2-0 وقطع الأنسجة. قم بتدوير القلب بحيث تكون الرئتان المقيدتان باتجاه الخلف.
- باستخدام مقص Vannas الصغير ، قم بقص حافة 2-3 مم من الزائدة الأذينية اليسرى ، مما يضمن تحقيق فتحة صغيرة في الأذينين. قم بتدوير الملحق الأذيني الأيسر بعناية إلى القنية اليسرى ، وامسكه بمشبك أسود ، واربطه بخياطة حريرية 2-0. يوضح الشكل 3 أ وضع كلا القنيات.
- اضبط سترة الماء في حجرة القلب بحيث يجلس القلب داخل وسط الغرفة.
- افتح محول الضغط في الهواء وقم بتصفير محول الضغط في البرنامج عن طريق تحديد القائمة المنسدلة للضغط الأبهري > Bridge Amp > Zero. انقر فوق موافق.
- قم بتنقيب القلب في وضع Langendorff لمدة 10 دقائق. تأكد من أن تدفق الأبهر Langendoff يقيس بين 10-20 مل / دقيقة (مثالي 20 مل / دقيقة).
- قبل تبديل وضع العمل ، تأكد من وضع حجر الهواء (مرشح المدخل المنزلق) من خزان Langendorff KH العازل في خزان KH العازل العامل.
- قم بتبديل القلب إلى وضع العمل عن طريق إغلاق المشبك الكبير المؤدي إلى قنية الأبهر وفتح التدفق المؤدي إلى الزائدة الأذينية اليسرى. فتح الصنبور ثلاثي الاتجاهات يؤدي من التعقيم العمل. انقل أنبوب الإرجاع المشترك (إعادة المخزن المؤقت KH إلى الخزان) من خزان Langendorff إلى خزان العمل.
- قم بتفريخ القلب في وضع العمل لمدة 15 دقيقة. يجب أن تكون قيم تدفق الأبهر من الناحية المثالية >30 مل / دقيقة في نهاية 15 دقيقة من التروية. بمجرد استقرار القلب ، ابدأ في تسجيل البيانات في برنامج تحليل البيانات.
- قم بقياس النفايات السائلة التاجية (تدفق الشريان التاجي) في 1 دقيقة و 5 دقائق و 10 دقائق و 15 دقيقة.
ملاحظة: يجب أن تكون قيم التدفق التاجي بين 10-20 مل / دقيقة. يشير التدفق التاجي الأكبر من 22 مل / دقيقة بشكل عام إلى تسرب ينشأ من وعاء رئوي غير مقيد. يجب أن يكون معدل ضربات القلب بين 200-300 نبضة في الدقيقة. يمكن جمع النفايات السائلة التاجية لتحليل المصب لعلامات إصابة الأنسجة (على سبيل المثال ، التروبونين I ، إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات).
6. إدارة شلل القلب للتخزين البارد للقلب
- املأ حجرة شلل القلب (الموضوعة على ارتفاع 60 سم لإنتاج ضغط نضح يبلغ حوالي 40 مم زئبق) ب 50 مل من محلول الحفاظ على القلب المخصص (مع أو بدون مكملات).
- اخفض سترة الماء وأغلق الصنبور ثلاثي الاتجاهات على جانب وضع العمل.
- أوقف التدفق نحو القنية الأذينية اليسرى عن طريق إغلاق المشبك.
- افتح التدفق إلى قنية الأبهر.
- أغلق المشبك من جانب Langendoff وعلى التحميل اللاحق.
- افتح المشبك من خط شلل القلب واغسل 15 مل من شلل القلب من خط الضغط. أغلق الصنبور عند خط الضغط.
- اسمح للقلب باحمرار شلل القلب عبر قنية الأبهر وجمع النفايات السائلة التاجية. قم بتشغيل شلل القلب لمدة 3 دقائق وسجل حجم شلل القلب الذي يتم إعطاؤه.
- توقف عن تسجيل البيانات في البرنامج واحفظ الملف.
- بعد 3 دقائق ، أغلق مشبك شلل القلب والمشبك الأزرق الصغير المؤدي إلى قنية الأبهر.
- ضع مشبك البلدغ على قنية الأبهر ومشبك بولدوج ثان على القنية اليسرى. افصل كتلة قنية القلب عن الدائرة وضعها في دورق يحتوي على شلل القلب في صندوق ثلج (الشكل 3 ب ، ج).
- قم بتخزين القلب في الثلاجة لمدة 6 ساعات (أو وقت التخزين البارد المطلوب).
7. إعادة تروية القلب بعد التخزين البارد الساكنة
- قم بإعداد المخزن المؤقت KH وفقا للقسم 1.
- قم بتجهيز دائرة التروية وفقا للقسم 2.
- افتح الملف المحفوظ من التروية الأساسية.
- قم بإزالة كتلة قنية القلب بعناية من صندوق الثلج وثبتها في دائرة التروية. قبل إعادة توصيل قنية الأبهر ، استخدم حقنة غير حادة 18 G مملوءة بعازلة KH لإزالة أي هواء من القنية. قم بتوصيل قنية الأبهر أولا ، وافتح مشبك الأنبوب على جانب Langendorff ، وتأكد من فتح مشبك أنبوب ما بعد التحميل.
- أعد توصيل القنية الأذينية اليسرى ، مع التأكد من إزالة الهواء من القنية قبل الاتصال بدائرة التروية. احتفظ بمشبك جانب العمل مغلقا حتى يحين وقت التبديل من Langendorff إلى وضع العمل.
- قم بدمج القلب في وضع Langendorff لمدة 15 دقيقة. تأكد من بدء تسجيل البيانات في بداية إعادة تروية Langendorff.
- قبل التبديل إلى وضع العمل ، ضع كلا الحجرين الفقاعيين في المخزن المؤقت KH ، وافتح الصنبور ثلاثي الاتجاهات على جانب العمل ، وانقل أنابيب الإرجاع الشائعة إلى خزان العمل.
- أغلق مشبك Langendorff الأبيض ، وافتح المشبك الجانبي الأبيض ، وقم بنفخ القلب لمدة 30 دقيقة. قياس وجمع النفايات السائلة التاجية في نقاط زمنية محددة لتحليل المصب (على سبيل المثال ، علامات إصابة القلب). تأكد من إيقاف تسجيل البرنامج لإعادة تشغيله لبدء مقطع جديد (أو بدلا من ذلك، إضافة تعليق).
- عند حوالي 15 دقيقة من إعادة التروية في وضع العمل ، أغلق الصنبور ثلاثي الاتجاهات.
- في نهاية إعادة التروية ، احفظ ملف البيانات ، وأوقف التدفق عبر الدائرة ، وافصل كتلة القلب. جمع عينات البطين الأيسر للمعالجة النسيجية و / أو التجميد المفاجئ للدراسات المستقبلية (على سبيل المثال ، استخراج البروتين لدراسات اللطخة الغربية).
- قم بإزالة المرشحات من حاملات المرشح ، واستنزاف المخزن المؤقت من الدائرة ، واغسلها مرتين ب 5 لترات من الماء المقطر.
ملاحظة: على الرغم من أنه ليس ضروريا ، إلا أنه يساعد في تسخين الماء المقطر مسبقا في وعاء كبير داخل الحمام المائي.
8. تحليل الانتعاش الوظيفي
- افتح ملف LabChart.
- قم بتمييز منطقة لا تقل عن 30 ثانية من التسجيل، ثم انقر على > "الأوامر إضافة تحديد البيانات" أو الإضافة المتعددة إلى البيانات. سيؤدي هذا إلى إضافة المعلمات المطلوبة إلى ملف DataPad داخل البرنامج.
- حدد القائمة المنسدلة نافذة > DataPad.
- قم بتمييز قيم الاسترداد وانسخها من DataPad إلى جدول بيانات لتحليل الاسترداد الوظيفي. احسب الاسترداد الوظيفي كنسبة مئوية من قيمة خط الأساسالخاصة به 1،6،7.
النتائج
ستحدد نتائج التروية الأساسية ما إذا كانت التجربة الأولية (التخزين المسبق) ناجحة أم لا. يجب أن يتراوح تدفق الأبهر المعروض أثناء وضع Langendorff بين 14 - 22 مل / دقيقة. يتم عرض تدفق Langendorff كقيمة سالبة على مقياس التدفق بسبب التروية الارتجاعية للشريان الأورطي. يظهر مثال على أثر Langendorff المقبول في الشكل 4 أ.
بمجرد التبديل إلى وضع العمل ، يجب أن يكون تدفق الأبهر 30 مل / دقيقة على الأقل بمجرد استقرار القلب. من الطبيعي أن يرتفع التدفق في البداية إلى حوالي 50 مل / دقيقة ، ثم ينخفض إلى حوالي 25 مل / دقيقة قبل أن يرتفع مرة أخرى إلى تدفق الأبهر الأساسي المستقر. بمجرد أن تكون معلمات خط الأساس مرضية (التركيز البؤري التلقائي > 30 مل / دقيقة ، CF 10-20 مل / دقيقة ، HR 200-300 نبضة في الدقيقة) ، يمكن تخزين القلب. يظهر مثال على تتبع خط الأساس الجيد في الشكل 4 ب.
اعتمادا على محلول الحفظ الذي تم اختباره ، لن تسفر بعض القلوب عن تعافي جيد بعد التخزين الثابت البارد لفترات طويلة على الرغم من وجود خط أساس ممتاز. يظهر مثال على أثر يشير إلى ضعف الاسترداد في وضع العمل في الشكل 4C.
يمكن حساب الاسترداد الوظيفي النهائي لتدفق الأبهر بناء على قراءة التدفق الأبهري النهائية كنسبة مئوية من قيمة خط الأساس. على سبيل المثال ، إذا كان الضبط البؤري التلقائي الأساسي للقلب 40 مل / دقيقة ، وكان الرجفان البؤري التلقائي في نهاية إعادة التروية بعد التخزين الساكن البارد 20 مل / دقيقة ، فإن استرداد الرجفان الأذيني لهذا القلب كان 50٪. يظهر مثال على تمثيل البيانات هذا في الشكل 5.
الشكل 1: دائرة نضح القلب العاملة. (أ) صورة لدائرة نضح قلب الفئران العاملة المعزولة. يشير المربع الأحمر إلى مكان وضع القلب المعزول. (ب) تخطيطي لدائرة نضح القلب العامل المعزول يشير إلى اتجاه تدفق المخزن المؤقت KH عبر الدائرة ل Langendorff (الخط المنقط) ووضع العمل (الخط الصلب) التروية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد برنامج LabChart. (أ) إعداد إعدادات القناة للضغط الأبهري والتدفق الأبهري ومعدل ضربات القلب. (ب) مثال على قالب LabChart الذي تم إعداده بثلاث قنوات. يعرض Windows على اليمين كل قناة على حدة تم إعدادها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: القنية وشلل القلب. (أ) قنية القلب قبل وضعها داخل حجرة السترة المائية. يتم إدخال القنية اليسرى في الشريان الأورطي، ويتم إدخال القنية اليمنى في البطين الأيسر عبر الزائدة الأذينية اليسرى. تم ربط الأوعية الرئوية وتشريح أنسجة الرئة. (ب) بعد إعطاء شلل القلب ، يوضع القلب في دورق يحتوي على محلول شلل القلب. تم تثبيت القنيات بمشابك البلدغ قبل فصلها عن الحفارة. (ج) مثال على القلوب الموضوعة داخل صندوق ثلج للتخزين البارد لفترات طويلة. هنا ، تم تخزين قلبين لإعادة التروية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: أمثلة على آثار LabChart. آثار الضغط (الرسم البياني الأحمر) ، وتدفق الأبهر (الرسم البياني الأزرق) ، ومعدل ضربات القلب (الرسم البياني الأخضر) للقلب الذي يحتوي على (أ) أثر لانجندورف جيد ، (ب) انتعاش جيد أثناء إعادة تروية وضع العمل ، (ج) ضعف التعافي أثناء إعادة تروية وضع العمل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الرسوم البيانية التمثيلية للتعافي الوظيفي. (أ) تدفق الأبهر ، (ب) تدفق الشريان التاجي ، (ج) النتاج القلبي ، و (د) معدل ضربات القلب. وقد أعيد استخدام هذا الرقم بإذن من غاو وآخرون8. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
المناقشة
نظرا للطبيعة الحساسة لوظيفة خط الأساس للقلب ، يجب توخي الحذر للحفاظ على جهاز التروية نظيفا وبمكونات متوافقة. على سبيل المثال ، يجب استخدام الأنابيب البلاستيكية الصحيحة. يمكن أن تساهم بعض مواد الأنابيب، مثل السيليكون، في انخفاض تدفق الأبهر والانقباض، والذي قد يكون بسبب فقدان الأكسجين عبر الأنبوب. في حين أن هناك دوائر نضح قلب الفئران العاملة المعزولة المتاحة تجاريا ، فإن معظمها يستخدم بشكل أساسي في نضح Langendorff فقط. بشكل عام ، يمكن الحصول على القياسات الوظيفية في نموذج نضح لانجيندوف عن طريق إدخال قسطرة بالون في البطين الأيسر للحصول على قياسات الضغط الانبساطي للبطين الأيسر (LVDP). ومع ذلك ، فإن القدرة على قياس قياسات تدفق الأبهر الخام والنتاج القلبي في نظام نضح لانجيندوف غير ممكنة. تتمثل الميزة الرئيسية لبروتوكول IWRH في القدرة على الحصول على قياسات وظيفية لتدفق الأبهر ونتاج القلب دون الحاجة إلى تدخلات إضافية للقلب (أي قسطرة بالون). هناك خيارات تجارية لنظام نضح قلب الفئران العامل ، وعلى الرغم من أنه يمكن تخصيصها لمتطلبات الدراسة الفردية ، إلا أن هذه الأنظمة يمكن أن تكون مكلفة.
هناك خطوات حاسمة في البروتوكول لضمان الوظيفة الأساسية المثلى لقلب القوارض أثناء التروية. يجب ألا يزيد عمر تحضير حلول المخزون المخزن المؤقت من KHB عن 4 أسابيع. يجب أن تكون دائرة التروية خالية من أي فقاعات هواء عند التحضير. يجب توخي الحذر عند قنية الزائدة الأذينية اليسرى. يمكن أن يؤدي التعامل المفرط مع الأنسجة إلى زيادة خطر التمزق ويمكن أن يزيد أيضا من التهيج الوظيفي للقلب.
يمكن تحديد جودة أداء دائرة التروية IWRH بشكل عام من خلال قراءات خط الأساس التي تم الحصول عليها في القلوب (AF > 30 مل / دقيقة ، CF ~ 20 مل / دقيقة). يمكن إجراء مزيد من اختبارات مراقبة الجودة في نموذج CSS عن طريق إيقاف القلب وتخزينه في محلول حفظ درجة مئوية مكمل ب 1 ميكرولتر / لتر زونيبوريد بالإضافة إلى 0.1 مجم / مل ثلاثي نترات الجلسريل. تضمن القلوب التي تم القبض عليها ب Celsior المكملة بثلاثي نترات الجلسريل بالإضافة إلى الزونيبوريد التعافي الفوري من نبات Langendorff والتعافي الوظيفي النهائي بين 40-60٪ بعد 6 ساعات من التخزين البارد. إذا كنت تشك في ما إذا كانت الحفارة تعمل بشكل جيد ، فإن مكملات مراقبة الجودة هذه مفيدة للاختبار.
تم وصف طرق استخدام قلوب القوارض التي يتم شراؤها عن طريق التبرع بعد موت الدورة الدمويةسابقا 10،11. باختصار ، يتم تخدير الفئران ، وتسمية الشريان السباتي ، والحصول على قراءات الضغط. يتم حقن الهيبارين (500 وحدة دولية) عن طريق قنية الشريان السباتي. ترتبط القصبة الهوائية ببدء سحب أجهزة دعم الحياة. بمجرد الوصول إلى الوقت الإقفاري الدافئ المطلوب ، يمكن استئصال القلب وتقميته في دائرة التروية. لإعطاء محلول الحفظ في قلب DCD ، يتم مسح 60 مل من محلول الحفظ من خلال الشريان الأورطي (~ 20 مل / دقيقة) عبر خط الضغط على الدائرة. يتم ربط الأوعية الرئوية ، وتشريح الرئتين ، وإدخال القنية اليسرى ، ثم يتم شطف 40 مل من محلول الحفظ عبر خط الضغط. ثم يتم تغذية القلب وفقا للبروتوكول أعلاه. يؤخذ الاسترداد الوظيفي كقيمة أولية لديناميكا الدم الوظيفية ، ويتم إجراء التحليل الإحصائي من خلال مقارنة القيم بتلك القلوب التي تم تشغيلها بشكل زائف (ومع ذلك ، لم يتم مسح DCD على الحفارة).
تم وصف طرق استخدام قلوب القوارض التي تم شراؤها بعد موت الدماغسابقا 12. باختصار ، يتم تخدير وتنبيبها وتهويتها ، مع مراقبة ديناميكية الدم وفقا لبروتوكول القوارض DCD. يتم إجراء ثقب لدغ في الجمجمة الصدغية ، ويتم وضع قسطرة استئصال الصمة 3F دون دائمة. تحتوي أدوات التحكم الوسادة على فتحات لدغ ولكن لا يوجد إدخال قسطرة. يتم نفخ البالون ب 0.3 مل من الماء على مدى دقيقتين ويبقى منفوخا لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة واحدة من الملاحظة الديناميكية الدموية ، يتم زرع القلوب ووضعها في دائرة نضح القلب العاملة المعزولة ، ويتم تسجيل قياسات خط الأساس ، ويتم إعطاء شلل القلب ، ويتم تخزين القلوب على البارد كما هو موضح أعلاه.
القيد الرئيسي لاستخدام دائرة التروية IWRH هو عدم القدرة على استخدام عازلة التروية القائمة على الدم للدوران عبر النظام. سيكون من المستحيل الحصول على ما يكفي من دم القوارض لإضافته إلى الريش. لذلك ، فإن التروية الدموية غير ممكنة. من المحتمل أن تحتاج النماذج البديلة ، مثل زراعة القلب غير المتجانس للقوارض أو دراسات زراعة القلب تقويم الكبيرة ، لاختبار تأثير التروية الدموية. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطرق البديلة خبرة في مهارات الجراحة المجهرية و / أو مرافق جراحة الكبيرة وأطباء التخدير ذوي الخبرة وأخصائيي التروية وجراحي القلب والصدر.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل الدراسات الموصوفة هنا من خلال المنح الممنوحة ل P.S Macdonald من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا ، ومؤسسة عيادة سانت فنسنت ، ومنحة الباحثين الرئيسيين لقدرة أبحاث القلب والأوعية الدموية الصحية في نيو ساوث ويلز.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.5 مل أنبوب Eppendorff عديم اللون ، 1000 لكل صندوق | Bio Strategy Pty Ltd | 0030.125.150 | |
| 15 مل سنت / أنابيب (S) كم / 25 PP الشركة التونسية للملاحة / 500 | Sigma-aldrich Pty Ltd | CLS430791-500ea | |
| BP محول الطاقة / مجموعة الكابلات | ADnstruments | MLT1199 | مضخم جسر الحصول على البيانات |
| ADInstruments | FE221 | الحصول على البيانات | |
| الكربوجين 555G2 | BOC | BOC002 | |
| Checktemp1 ميزان الحرارة | Hanna Instruments | HI98509 | قرصة مشبك بناء الحفارة |
| 1 / 4-7 / 16 PK 12 | Thomas Scientific | 2848Y40 | Rig Construction |
| Clamp W / Extension Stem Med. | توماس سيانتيفيك | 8847T08 | مشبك بناء الحفارة |
| ث / تمديد الجذعية SM. | توماس سيانتيفيك | 8847T02 | مشابك بناء |
| الحفارة ، وعاء ، 60 جرام ضغط | متماسك علمي | 14121 | معدات جراحية |
| موصل مغلق | توماس سيانتيفك | 8847E25 | بناء |
| منصة Covidien Sofsilk 2-0 أسود مسبق القطع 45 سم صندوق من 24 | مستلزمات طبية متخصصة | S195 | مستهلكات جراحية |
| حسب الطلب 250 مل مزيل الغازات المغلفة | مخصص في مهب الأواني الزجاجية Pty المحدودة | N / A | Rig Construction |
| مخصص 750 مل خزان | مخصص في مهب الأواني الزجاجية Pty Ltd | N / A | Rig Construction |
| D- (+) - الجلوكوز اللامائي SigmaUltra | Sigma-aldrich Pty Ltd | G7528-1Kg | لجعل Krebs |
| Buffer Dual Channel Console | ADInstruments | TS402 | Data Acquisition |
| Erlenmyer Flasks 2 L & nbsp ؛ | |||
| فلتر من الألياف الدقيقة من النوع GF / C ألياف زجاجية 47 مم ، 100 | Bio-strategy Pty Ltd | 1822047 | |
| ، 15 سم ، 0.3 مم ، CRVD | متماسك علمي | 14114 | معدات جراحية |
| أربعة مشابك بذراع بطول 9 مم × 115 مم لحمل أجسام بقطر 2-70 مم. الفينيل المغلفة | Met-App Australia Pty Ltd | 1352 | جهاز الحفر |
| سخان البناء Circulator. التحكم الرقمي في الحالة الصلبة. (1020 واط / 240 فولت) | Thermoline Scientific | TU3 | Rig Construction |
| Heparin 5000 U / 5 مل مربع 50 Pfizer 02112115 | Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd | أدوية | |
| 1258693 Ilium Xylazil 20 Inj 50 مل | Cenvet Australia Pty Ltd | X5010 | مخدر |
| جونز هوبكنز بولدوج المشبك | متماسك علمي ؛ | CS-WPI-14117 | |
| الكيتامين 100 مجم / 50 مل | بروفيت (نيو ساوث ويلز) بي تي واي المحدودة | KETAI1 | |
| كبريتات المغنيسيوم المخدرة سباعي الهيدرات AR 500 جم Chemsupply | Bio Strategy Pty Ltd | MA048-500g | لجعل محول مفصلي كربس عازلة |
| ذكر / أنثى | توماس سيانتيفيك | 8847V08 | جهاز البناء |
| Masterflex L / S رأس سهل التحميل للأنابيب الدقيقة ، PPS ، دوار | CRSمقص John Morris | 1015164 | Rig Construction |
| Metzenbaum ، 11.5 سم منحني | مقص معدات جراحية علمية متماسكة | WPI-501748 | |
| مقص Metzenbaum ، 14.5 سم مستقيم | متماسك علمي | WPI-501252 | معدات |
| جراحية تصاعد الأجهزة F / 2-HEADS SS | John Morris | 1014414 | مسامير التثبيت لرؤوس المضخات |
| موصل مفتوح الجانب | Thomas Scientific | 8847E05 | Rig Construction |
| Paraformadehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | معالجة العينات |
| كلوريد البوتاسيوم (AnalaR NORMAPUR) 500 جم | VWR Chemicals | 26764.26 | لجعل كربس عازلة |
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة | Sigma-Aldrich Pty Ltd | P5379-500g | لصنع Krebs Buffer |
| Powerlab 2/26 ، مسجل 2 قناة + برنامج Labchart | ADInstruments | ML826 | أجهزة وبرامج |
| الكمبيوتر الدقة XN مستشعر التدفق المضمن ، 3.2 مم (1/8 بوصة) ID ME4PXN-KR37 XF | ADInstruments | ME4PXN | مشرط بناء |
| جهاز البناء بمقبض يمكن التخلص منه # 11 بكت / 10 | BSN Medical (Aust) Pty Ltd | 73252-36 | |
| حشية سيليكون ل Swinnex 47 مم 5 / PK | Merck Millipore | SX0004701 | Rig Construction |
| سيليكون O-Ring 5-329 10 / PK | Merck Millipore | XX1104707 | Rig Construction |
| Single Buret | Clamp Thomas Scientific | 8847T32 | Rig Construction |
| Slip-on Engine Filter حجم المسام 10 & micro ؛ م (فقاعات) | Sigma-aldrich | 59277 | Rig Construction |
| Sm. 360 موصل دوران | Thomas Scientific | 8847E35 | Rig Construction |
| بيكربونات الصوديوم | Sigma-Aldrich Pty Ltd | S6297 - 250g | لصنع حامل مرشح Krebs Buffer |
| Swinnex ، 47 مم | Merck Millipore | SX0004700 | |
| محاقن البناء 1 مل صندوق / 100 | بكتون Dickinson Pty Ltd | 302100 | |
| ثلاثة مشابك ذات شق بقطر 9 مم × ذراع بطول 125 مم وبرغي مزدوج لعقد 5-80 مم | Met-App Australia Pty Ltd | 1356 | أنابيب البناء |
| TS410 | ADInstruments | TS410 | الحصول على |
| البيانات PVC 6.35 مم معرف × 9.52 مم OD 50 قدم لفة 15.24 م ، شفاف ، خالي من الفثالات DEHP ، درجة الغذاء تلبي REAC | Thermo Fisher | NAL 8701-0600 | بناء الحفارة |
| أنابيب PVC 7.94 مم معرف × 11.1 مم OD 50 قدم لفة 15.24 م ، شفاف ، خالي من الفثالات DEHP ، درجة الغذاء تلبي REAC | Thermo Fisher | NAL 8701-0900 | أنابيب بناء الحفارة |
| PVC 9.52 مم معرف × 12.7 مم OD 100 قدم لفة | ثيرمو فيشر | NAL 8701-4120 | مقص فاناس للبناء |
| ، 8.5 سم ، مستقيم ، 7 مم شفرات | متماسكة علمية | WPI-500-086 | المعدات |
| الجراحيةحمام مائي 30 لتر مع صينية معلقة | Thermoline Scientific | TLWB-30 | Rig |
المراجع
- Kwan, J. C., Gao, L., Macdonald, P. S., Hicks, M. Cardio-protective signalling by glyceryl trinitrate and cariporide in a model of donor heart preservation. Heart Lung Circ. 24 (3), 306-318 (2015).
- Watson, A. J., et al. Enhanced preservation of the rat heart after prolonged hypothermic ischemia with erythropoietin-supplemented Celsior solution. J Heart Lung Transplant. 32 (6), 633-640 (2013).
- Chew, H. C., et al. Outcomes of donation after circulatory death heart transplantation in Australia. J Am Coll Cardiol. 73 (12), 1447-1459 (2019).
- Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).
- Joshi, Y., et al. Heart transplantation from DCD donors in Australia: Lessons learned from the first 74 cases. Transplantation. 107 (2), 361-371 (2023).
- Villanueva, J. E., et al. Functional recovery after dantrolene-supplementation of cold stored hearts using an ex vivo isolated working rat heart model. PLoS One. 13 (10), e205850(2018).
- Villanueva, J. E., et al. The cardioprotective potential of the sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor empagliflozin in donor heart preservation. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1151-1153 (2020).
- Gao, L., et al. Critical role of the STAT3 pathway in the cardioprotective efficacy of zoniporide in a model of myocardial preservation - the rat isolated working heart. Br J Pharmacol. 162 (3), 633-647 (2011).
- Cropper, J. R., Hicks, M., Ryan, J. B., Macdonald, P. S. Cardioprotection by cariporide after prolonged hypothermic storage of the isolated working rat heart. J Heart Lung Transplant. 22 (8), 929-936 (2003).
- Gao, L., et al. Enhanced functional recovery of the heart donated after circulatory death determination with antemortem heparin. J Heart Lung Transplant. 39 (6), 607-609 (2020).
- Villanueva, J. E., et al. The effect of increasing donor age on myocardial ischemic tolerance in a rodent model of donation after circulatory death. Transplant Direct. 7 (6), e699(2021).
- Kumarasinghe, G., et al. Improved heart function from older donors using pharmacologic conditioning strategies. J Heart Lung Transplant. 35 (5), 636-646 (2016).
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن