مقالة منهجية

نقل الميتوكوندريا عبر الأنابيب النانوية النفقية بين الخلايا الجذعية الوسيطة والظهارة الصبغية لصبغة الشبكية في المختبر

1.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66917

⸱

أكتوبر 4, 2024

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا يتضمن تتبع الميتوكوندريا ، وإجراءات الزراعة المشتركة المباشرة للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) والخلايا الظهارية الصبغية للشبكية (ARPE19) ، بالإضافة إلى طرق مراقبة وتحليل الأنابيب النانوية الأنفاقية (TNT) ونقل الميتوكوندريا لتوصيف تبادل الميتوكوندريا عبر TNTs بين الخلايا الجذعية الجذعية الوسيطة وخلايا ARPE19.

الملخص

نقل الميتوكوندريا هو ظاهرة فسيولوجية طبيعية تحدث على نطاق واسع بين أنواع مختلفة من الخلايا. في الدراسة حتى الآن ، فإن أهم مسار لنقل الميتوكوندريا هو من خلال الأنابيب النانوية الأنفاقية (TNTs). كانت هناك العديد من الدراسات التي أفادت بأن الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) يمكن أن تنقل الميتوكوندريا إلى خلايا أخرى عن طريق TNTs. ومع ذلك ، فقد أظهرت دراسات قليلة ظاهرة نقل الميتوكوندريا ثنائي الاتجاه. هنا ، يصف بروتوكولنا نهجا تجريبيا لدراسة ظاهرة نقل الميتوكوندريا بين الخلايا الجذعية الجذعية والخلايا الظهارية الصبغية في الشبكية في المختبر بواسطة طريقتين لتتبع الميتوكوندريا.

لقد شاركنا في استزراع الخلايا الجذعية الجذعية المنقولة ب mito-GFP مع خلايا ARPE19 المنقولة ب mito-RFP (خط خلايا ظهارية صبغية الشبكية) لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم تلطيخ جميع الخلايا بالفالودين وتصويرها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. لاحظنا الميتوكوندريا مع التألق الأخضر في خلايا ARPE19 والميتوكوندريا مع التألق الأحمر في الخلايا الجذعية الجذعية ، مما يشير إلى أن نقل الميتوكوندريا ثنائي الاتجاه يحدث بين الخلايا الجذعية الجذعية وخلايا ARPE19. تشير هذه الظاهرة إلى أن نقل الميتوكوندريا هو ظاهرة فسيولوجية طبيعية تحدث أيضا بين الخلايا الجذعية الجذعية وخلايا ARPE19 ، ويحدث نقل الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الجذعية إلى خلايا ARPE19 بشكل متكرر أكثر من العكس. تشير نتائجنا إلى أن الخلايا الجذعية الجذعية يمكنها نقل الميتوكوندريا إلى ظهارة صبغة الشبكية ، وتتنبأ بالمثل بأن الخلايا الجذعية الجذعية يمكن أن تحقق إمكاناتها العلاجية من خلال نقل الميتوكوندريا في ظهارة صبغة الشبكية في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك ، لا يزال يتعين استكشاف نقل الميتوكوندريا من خلايا ARPE19 إلى الخلايا الجذعية الجذعية بشكل أكبر.

المقدمة

تعمل الميتوكوندريا كمصدر أساسي للطاقة لمعظم أنواع الخلايا ، حيث يؤثر الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا بشكل خاص على الأنسجة التي تتطلب طاقة عالية مثل شبكيةالعين 1. يمكن أن تؤدي التغيرات الأيضية في شبكية العين إلى أزمة طاقة حيوية ، مما يؤدي في النهاية إلى موت المستقبلات الضوئية و / أو خلايا RPE2. أظهرت العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) فعاليتها في علاج تنكس العين ، ويمكن أن تعزى إحدى الآليات الدقيقة الكامنة وراء التأثيرات المفيدة للخلايا الجذعية الوسيطة على أنسجة الشبكية إلى النقل الوظيفي للميتوكوندريا3،4،5،6. في عام 2004 ، رستم وآخرون أبلغ لأول مرة عن ظاهرة نقل الميتوكوندريا من خلال تفاعل جديد من خلية إلى خلية يسهله الأنابيب النانوية الأنفاقية (TNTs)7.

في الثقافة ثنائية الأبعاد ، يتم تحديد الأنابيب النانوية الأنفاقية (TNTs) من خلال نتوءاتها الغشائية الرقيقة (20-700 نانومتر) التي يتراوح طولها من عشرات إلى مئات النانومترات ، والتي يتم تعليقها فوق الركيزة ويمكنها إنشاء اتصالات مباشرة بين خليتين أو أكثر من الخلايا المتجانسة وغير المتجانسة. يتم إثراء هذه الهياكل بشكل ملحوظ في F-actin وتسهل نقل البضائع ، مثل الميتوكوندريا ، بين الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، تمتلك TNTs فتحات في كلا الطرفين ، مما يتيح استمرارية المحتوى السيتوبلازمي بين الخلايا المترابطة8.

من الصعب اكتشاف نقل الميتوكوندريا بوساطة مادة تي إن تي في الجسم الحي بسبب الترتيب الخلوي الكثيف والتحديات في تتبع الميتوكوندريا. تسمح التجارب المختبرية ، باستخدام تقنيات الزراعة المشتركة للخلايا وتتبع الميتوكوندريا ، بمراقبة تكوين مادة تي إن تي ونقل الميتوكوندريا8،9. لاحظنا أيضا ظاهرة نقل الميتوكوندريا بوساطة مادة تي إن تي عن طريق الزراعة المشتركة للخلايا الجذعية الجذعية والخلايا الظهارية الصبغية في الشبكية في المختبر10.

لاحظت العديد من الدراسات السابقة فقط نقل الميتوكوندريا أحادي الاتجاه من الخلايا الجذعية الجذعية إلى الخلاياالأخرى 3،4،5،6. في السابق ، حاولنا أيضا تحليل نقل الميتوكوندريا ثنائي الاتجاه باستخدام نوعين من الخلايا المسماة باللون الأخضر الميتو المتعقب والأحمر الميتو ، على التوالي ، لكن الحديث المتبادل للأصباغ تداخل مع النتائج التجريبية. لدراسة النقل ثنائي الاتجاه للميتوكوندريا بشكل أكثر دقة ، هنا ، قمنا ببناء خطين خلويتين بمضان مختلف للميتوكوندريا باستخدام تقنية تعداء الفيروسات ، وبعد ذلك ، لاحظنا وحللنا ظواهر تكوين TNT والنقل ثنائي الاتجاه للميتوكوندريا عن طريق الزراعة المشتركة المباشرة في المختبر.

باختصار ، يتم وصف بروتوكول خطوة بخطوة وقابل للتنفيذ هنا حول كيفية تتبع الميتوكوندريا ، والزراعة المشتركة للخلايا الجذعية الجذعية مع خلايا ARPE19 ، وتحليل تكوين مادة تي إن تي ونقل الميتوكوندريا. أظهرت نتائج هذه التجربة نقل الميتوكوندريا ثنائي الاتجاه بوساطة مادة تي إن تي ، والذي لم يثبت فقط أن نقل الميتوكوندريا هو ظاهرة فسيولوجية شائعة ولكنه أظهر أيضا القدرة العلاجية المحتملة للخلايا الجذعية الجذعية على خلايا الشبكية.

البروتوكول

1. توليد خطوط الخلايا MSC-mito-GFP و ARPE19-mito-RFP

  1. زراعة الخلايا
    ملاحظة: يتم إستخدام MSCs فقط هنا كمثال.
    1. استزراع الخلايا الجذعية الجذعية البشرية في صفيحة ذات 6 آبار في وسط hMSC مع 1٪ بنسلين وستربتومايسين (انظر جدول المواد) حتى تصل كثافة الخلية إلى 80٪ -90٪. اعتمادا على كثافة نمو الخلايا ، قم بتغيير الوسط مرة كل 2-3 أيام.
      1. قم بإزالة الوسط الأصلي وغسل الخلايا مرة واحدة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) (انظر جدول المواد). أضف 1 مل من خليط التربسين - EDTA - DPBS (0.05٪ Trypsin-EDTA: 0.25٪ Trypsin-EDTA مخفف ب DPBS بنسبة 1: 5 ؛ انظر جدول المواد) ، واحتضانه لمدة 3-4 دقائق (حسب الخلايا) في حاضنة 37 درجة مئوية.
        ملاحظة: راقب هضم الخلايا تحت المجهر وأوقف الهضم إذا كانت معظم الخلايا مستديرة ومنفصلة.
      2. اضغط برفق على اللوحة المكونة من 6 آبار لفصل الخلايا الملتصقة بالسطح ، ثم أضف 1 مل من الوسط الكامل الطازج لإنهاء عملية الهضم.
      3. أعد تعليق جميع الخلايا برفق باستخدام مسدس ماصة ثم انقل جميع الخلايا المجمعة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
      4. الطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
      5. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا بإضافة 1 مل من الوسط الطازج. خذ 10 ميكرولتر من معلق الخلية لعد الخلايا.
      6. قبل ثمانية عشر إلى 24 ساعة من تعداء الفيروسات ، تقوم خلايا MSC بكثافة 1 × 105 خلايا لكل بئر في ألواح 6 آبار ، مما يضمن أن كثافة الخلايا في وقت التعدي حوالي 50٪.
  2. تعداء فيروس العدسات
    ملاحظة: يجب إجراء جميع العمليات المتعلقة بتعد الفيروسات في خزانة السلامة البيولوجية.
    1. استبدل الوسط الأولي ب 2 مل من الوسط الطازج في اليوم التالي ، وأضف 25 ميكرولتر من تعليق فيروس العدسي (5.00E + 08 TU / mL) مع المواد المساعدة ، متبوعا بالحضانة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: تم إجراء تغليف فيروس العدسات باستخدام بلازميد Mito-GFP (pCT-Mito-copGFP) (انظر جدول المواد والشكل التكميلي S1) من قبل شركة.
    2. بعد 6 ساعات من الحضانة ، استبدل الوسط المحتوي على الفيروس ب 2 مل من الوسط الطازج. استمر في احتضان وتغيير الوسيط مرة واحدة في اليوم.
      ملاحظة: لوحظ تعبير مضان كبير للميتوكوندريا في الخلايا الجذعية الجذعية بعد 48 ساعة من التعدي ، مع مزيد من التحسين الواضح في النقطة الزمنية البالغة 72 ساعة.
    3. نجح فحص الخلايا المنقولة عن طريق استكمال وسط المزرعة بالبورومايسين (1 ميكروغرام / مل) بعد يومين من التعدين. في الوقت نفسه ، أضف تركيزا مكافئا من بورومايسين إلى الخلايا الجذعية الوسيطة التي تفتقر إلى تعداء الفيروس كعنصر تحكم.
      ملاحظة: تم تصميم الناقل الفيروسي mito-GFP ليشمل جين مقاومة البيرومايسين.
    4. قم بتغيير الوسط يوميا مع إدخال بورومايسين (1 ميكروغرام / مل). توقف عن إضافة بورومايسين عند موت الخلايا شبه الكامل في المجموعة الضابطة.
      ملاحظة: لا يحتوي الوسيط على هذا التركيز من البيرومايسين. لا يلزم إضافة بورومايسين إلا عند إضافة الوسيط إلى طبق مكون من 6 آبار.
    5. استمر في الزراعة بدون بورومايسين حتى يتم تمرير الخلايا وتجميدها. قم بتسمية هذا النوع من الخلايا باسم MSC-mito-GFP.
      ملاحظة: تم اشتقاق خلايا ARPE19 من بنك الخلايا ATCC وتم زراعتها في DMEM / F12 التي تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين وستربتومايسين (انظر جدول المواد) ، وطرق هضمها ومرورها هي نفسها تلك الخاصة بالخلايا الجذعية الجذعية الجذعية تم تعديل البلازميد Mito-RFP من Mito-GFP من قبل شركة. أخيرا ، أطلقنا على الخلايا التي تم نقلها بنجاح باسم ARPE19-mito-RFP.

2. الزراعة المشتركة المباشرة لخلايا MSC و ARPE19

ملاحظة: في نظام الزراعة المشتركة هذا ، ستعمل خلايا MSC-mito-GFP كخلايا مانحة بينما ستعمل خلايا ARPE19-mito-RFP كخلايا متلقية. للتمييز بين الخلايا المانحة والمتلقية ، قمنا بتتبع الخلايا المتلقية.

  1. قم بتسمية خلايا ARPE19-mito-RFP باستخدام CellTrace Violet (انظر جدول المواد) في الغشاء السيتوبلازمي.
    ملاحظة: إثارة وانبعاث صبغة CellTrace البنفسجي هي 405 نانومتر و 450 نانومتر على التوالي.
    1. قم بإعداد محلول مخزون CellTrace Violet (انظر جدول المواد) عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى قارورة من كاشف CellTrace البنفسجي وخلطه جيدا قبل الاستخدام مباشرة.
    2. قم بزراعة خلايا ARPE19-mito-RFP إلى الكثافة المطلوبة من 80٪ -90٪.
    3. قم بتخفيف محلول مخزون CellTrace Violet في DPBS دافئ مسبقا (37 درجة مئوية) إلى تركيز العمل المطلوب (1: 1,000). هذا هو حل التحميل.
      ملاحظة: يجب إجراء تخفيف CellTrace Violet باستخدام DPBS ولا يمكن استبداله بوسط الثقافة لأن هذا سيؤدي إلى نتائج تلطيخ سيئة للغاية.
    4. قم بإزالة وسط الاستزراع واستبدله ب 1 مل من محلول التحميل. احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا سمحت الظروف ، يمكن ملاحظة التلوين تحت المجهر الفلوري بعد 5 دقائق. يمكن إنهاء التلوين بمجرد تحقيق النتائج المرجوة ، حيث قد لا تتمكن بعض الخلايا من تحمل التعرض المطول ل DPBS.
    5. قم بإزالة محلول التحميل ، واغسل الخلايا 2x باستخدام DPBS ، واستبدلها ب 2 مل من الوسط الكامل الطازج. احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق على الأقل بعد التلوين للسماح ل CellTrace Violet بالخضوع للتحلل المائي للأسيتات.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية للخلايا للعودة إلى حالتها المثلى وتجنب التدخل في التجارب اللاحقة.
  2. قم بإعداد طبق 24 بئرا عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من DPBS إلى كل بئر. بعد ذلك ، أدخل زجاج الغطاء (بقطر محدد يبلغ 15 مم) (انظر جدول المواد) في اللوحة واتركه يستقر لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة DPBS من الآبار ، باستخدام الضغط السلبي للتأكد من أن شريحة الغطاء قريبة من قاع الطبق.
  3. قم بتربسين الخلايا الجذعية الجذعية المانحة وخلايا ARPE19 المتلقية كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.
  4. عد الخلايا
    1. ضع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية على لوحة العد للتعداد.
      ملاحظة: إذا كانت كثافة الخلايا عالية جدا ، فيمكن تخفيفها 10 أضعاف مع الوسط ثم المتابعة على النحو الوارد أعلاه.
    2. قم بزرع 10,000 MSCs و 10,000 خلية ARPE19 في 500 ميكرولتر من الوسط لكل بئر من صفيحة 24 بئرا. امزج الخلايا جيدا قبل إضافتها إلى الطبق المكون من 24 بئرا. انظر الحسابات الموضحة أدناه مع مراعاة عدد MSC البالغ A / مل وعدد خلايا ARPE19 ب / مل.
      ملاحظة: بالنسبة ل 4 آبار ، يلزم وجود 40,000 MSCs و 40,000 خلية ARPE19 في 2 مل من المتوسط.
      حجم معلق MSC (C) الذي يحتوي على 40,000 MSCs = 40,000 / A μL
      حجم معلق ARPE19 (D) الذي يحتوي على 40,000 MSCs = 40,000 / B μL
      اصنع الحجم إلى 2 مل مع 2 - (C + D) مل من المتوسط.
  5. راقب الخلايا تحت المجهر ، وهز اللوحة حتى يتم توزيع الخلايا بالتساوي ، ثم احتضانها في الثقافة لمدة 24 ساعة.

3. الزراعة المشتركة غير المباشرة لخلايا MSC و ARPE19 في نظام transwell

  1. قم بإجراء زراعة الخلايا ووضع العلامات والهضم والعد كما هو موضح في الخطوات من 2.1 إلى 2.4.1.
  2. قم بزرع 20,000 خلية ARPE19 في 1 مل من الوسط لكل بئر من صفيحة 24 بئرا.
    ملاحظة: في هذه التجربة ، استخدمنا خلايا ARPE19 بدون ميتوكوندريا مصنفة.
  3. ضع الملحق في البئر حيث تم زرع الخلية.
  4. بذرة 10,000 MSCs في 100 ميكرولتر من الوسط في حجرة الخلية العلوية لكل بئر.
  5. كرر الخطوة 2.5.

4. تلطيخ الهيكل الخلوي

ملاحظة: الحماية من الضوء طوال التجربة.

  1. قم بإزالة الوسط من الألواح المكونة من 24 بئرا. اغسل جميع الخلايا مرة واحدة باستخدام 500 ميكرولتر / بئر من 4٪ بولي فورمالدهيد (PFA) ، وأضف 500 ميكرولتر من 4٪ PFA الطازج ، وقم بإصلاح العينات لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: يتم التخلص من مداخل نظام transwell.
    ملاحظة: نظرا لأن الأنابيب النانوية هشة للغاية ، فقد قمنا بغسل الخلايا مباشرة باستخدام 4٪ PFA بدلا من DPBS لزيادة الاحتفاظ بالأنابيب النانوية السليمة.
  2. قم بإزالة المثبت واغسل العينات لمدة 3 × 10 دقائق باستخدام DPBS.
  3. أضف 500 ميكرولتر / بئر من محلول الحجب المكون من 0.5٪ Triton X-100 (انظر جدول المواد) و 4٪ ألبومين مصل البقر (BSA) (انظر جدول المواد) واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  4. قم بإزالة محلول المنع واغسل العينات لمدة 3 × 10 دقائق باستخدام DPBS.
  5. تحضير محلول تلطيخ الفالودين (انظر جدول المواد)
    ملاحظة: إثارة وانبعاث الفالودين هي 650 نانومتر و 668 نانومتر على التوالي.
    1. قم بإعداد محاليل المخزون عن طريق إذابة محتويات القارورة في 150 ميكرولتر من DMSO اللامائي للحصول على محلول مخزون 400x.
    2. قم بإعداد محلول التلوين عن طريق تخفيف محلول التخزين 400x إلى 1x باستخدام DPBS. هذا هو محلول تلطيخ الفالويدين.
  6. أضف 200 ميكرولتر من محلول تلطيخ الفالويد إلى كل بئر واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  7. استرجع محلول التلوين واغسل العينة 3 × 10 دقائق باستخدام DPBS.
    ملاحظة: عند غسل الخلايا باستخدام DPBS ، سيكون من الأفضل ترك اللوحة على شاكر.
  8. اختر زجاج الغطاء بإبرة حقنة واتركه يجف في الهواء.
    ملاحظة: الحالة المثلى هي الحالة التي لا يمكن فيها رؤية سائل مرئي على زجاج الغطاء ولكنه أيضا غير جاف.
  9. ضع كمية صغيرة من وسيط التثبيت (انظر جدول المواد) على الشريحة واقلب زجاج الغطاء على الشريحة بعناية للتأكد من أن الوسيط يغطي السطح بالكامل بالتساوي. ختم الحواف بطلاء الأظافر.
    ملاحظة: انتظري بضع دقائق للسماح لطلاء الأظافر بالجفاف.
  10. التقط صورة متحدة البؤر على الفور أو انقلها إلى صندوق شرائح وقم بتخزينها عند 4 درجات مئوية لفترة وجيزة.
    ملاحظة: وقت التخزين المثالي هو 2 أسابيع. إذا تم تجاوز هذا الوقت ، فقد يتدهور تأثير التصوير.

5. التصوير متحد البؤر

ملاحظة: يتم إجراء التصوير متحد البؤر وفقا لدليل التشغيل وقد يختلف بين المجاهر. هنا نعطي فقط بعض الخطوات الرئيسية.

  1. ابدأ المجهر متحد البؤر وافتح أربع قنوات ليزر (405 ، 488 ، 561 ، 640) وفقا لدليل التشغيل.
  2. قم بالوصول إلى البرنامج الموجود على الكمبيوتر وقم بإجراء المعلمات الأولية للبرنامج.
    1. أضف قنوات الفلورسنت CF-405 وCF-488 وCF-561 وCF-640 داخل لوحة إدارة العمليات .
    2. اضبط وقت التعريض الضوئي لكل قناة مضان على 200 مللي ثانية واضبط شدة الكسب على 2 في لوحة التحكم في الكاميرا .
    3. اضبط مجمع الليزر / LED على قيمة 80.
  3. قم بمعالجة لوحة التحكم الخارجية للمجهر لضبط العدسة الشيئية على تكبير 20x وتأكد من وضع العدسة في أدنى إعداد لها.
  4. ضع الشريحة في اتجاه مقلوب على الجدول الكبير.
  5. قم بتنشيط ليزر 405 نانومتر ومعالجة التركيز باستخدام لوالب التركيز البؤري الخشنة والدقيقة. راقب العينة الموجودة أسفل العدسة حتى تظهر الخلايا الفلورية الزرقاء.
  6. حدد Live Imaging (تصوير مباشر ) في واجهة البرنامج على الكمبيوتر، وقم بالتبديل إلى قناة CF-405، وأعد ضبط لولب التركيز البؤري الدقيق حتى تظهر صورة مميزة للخلايا التي تظهر التألق الأزرق على شاشة الكمبيوتر.
  7. اضبط العدسة الموضوعية على تكبير 40x وانتقل إلى قناة CF-640 ، ثم اضبط التركيز بعناية حتى يظهر هيكل خروس دقيقة خلوي مميز.
  8. الحفاظ على بعد بؤري ثابت ، والانتقال إلى قنوات CF-405 و CF-488 و CF-561 بالتتابع ، وتعديل معلمات وقت التعرض الأمثل ، وشدة الكسب ، ومجمع الليزر / LED للتصوير داخل كل قناة ، حسب الضرورة.
  9. قم بتنشيط وظيفة Z Image Stack وحدد نقطتي البداية والنهاية للمحور Z عن طريق معالجة البعد البؤري لالتقاط صورة بعمق باستخدام المحور Z.
  10. انقر فوق الزر ابدأ في لوحة إدارة العمليات لالتقاط صورة.
  11. حدد 10 حقول عرض عشوائية لكل شريحة.
    ملاحظة: يجب ألا يكون هناك تداخل بين أي من مجالي الرؤية.
  12. قم بتنشيط وظيفة اللقطات المتتابعة، مع تحديد مدة تصوير إجمالية تبلغ 24 ساعة وفاصل تصوير يبلغ 5 دقائق بعد تحديد مجال الرؤية المطلوب.
    ملاحظة: لالتقاط تسلسل بفاصل زمني ، من الضروري تلقيح الخلايا في طبق ذو قاع زجاجي ووضعها داخل صندوق جيد التهوية يحتوي على 5٪ غاز ثاني أكسيد الكربون.
  13. حفظ وتصدير جميع الصور.
    ملاحظة: لتعزيز التدقيق في TNT ونقل الميتوكوندريا ، تم استخدام التصوير فائق الدقة. تم إجراء التصوير فائق الدقة باستخدام HIS-SIM تجاري ، يسمى HIS-SIM (شريحة SIM عالية الذكاء والحساسة) مقدمة من شركة. تم الحصول على الصور باستخدام هدف غمر الزيت 100x / 1.5 NA.

6. تحليل البيانات

  1. للتحليل الإحصائي لكل صورة ، حدد العدد الإجمالي للخلايا ، وعدد الأنابيب النانوية ، وعدد خلايا ARPE19-mito-RFE الموجبة للبنفسج ، وعدد الخلايا الموجبة البنفسجية التي تظهر مضان أخضر (يمثل عدد خلايا ARPE19 مع نقل الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية ، وعدد الخلايا السالبة البنفسجية التي تظهر مضان أحمر (يمثل عدد خلايا MSC مع نقل الميتوكوندريا من خلايا ARPE19).
    1. لتحديد تكوين مادة تي إن تي ، احسب نسبة عدد الأنابيب النانوية بين الخلايا إلى العدد الإجمالي للخلايا.
    2. احسب معدل نقل الميتوكوندريا كنسبة عدد الخلايا الموجبة للبنفسج التي تظهر مضان أخضر إلى العدد الإجمالي للخلايا الموجبة للبنفسج (التي تمثل نقل الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الجذعية إلى خلايا ARPE19) أو نسبة عدد الخلايا السالبة البنفسجية التي تظهر مضان أحمر إلى العدد الإجمالي للخلايا السالبة البنفسجية (التي تمثل نقل الميتوكوندريا من خلايا ARPE19 إلى الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية الجذعية

النتائج

تم تصوير الرسم التخطيطي الذي يوضح الزراعة المشتركة المباشرة للخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) وخلايا ARPE19 في الشكل 1. الخلايا الجذعية الجذعية ، المصممة للتعبير عن mito-GFP ، حيث تم زراعة الخلايا المانحة وخلايا ARPE19-mito-RFP ذات الأغشية السيتوبلازمية ذات العلامات البنفسجية كخلايا متلقية بنسبة 1: 1. بعد فترة زراعة مشتركة استمرت 24 ساعة ، تم تلطيخ الخلايا للفالودين وفحصها باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. تضمنت مجموعات الخلايا الناتجة خلايا MSC-mito-GFP ، وخلايا ARPE19-mito-RFP ، وخلايا ARPE19-mito-RFP التي تحتوي على mito-GFP ، وخلايا MSC-mito-GFP التي تحتوي على mito-RFP. والجدير بالذكر أن وجود mito-GFP في خلايا ARPE19 و mito-RFP في الخلايا الجذعية الجذعية يشير إلى نقل ثنائي الاتجاه للميتوكوندريا.

يتم عرض تفاصيل محددة لتشكيل TNT في الشكل 2. يمكن لهذه الهياكل إنشاء اتصالات بين الخلايا بين الخلايا من نفس النوع (الشكل 2A-C) ، وكذلك بين الخلايا من أنواع مختلفة (الشكل 2D). تعمل الأنابيب النانوية الأنفاقية (TNTs) كقنوات تربط الخلايا المجاورة ، وتظهر بنية غشاء مميزة غنية بالأكتين F مع نهايات مفتوحة تسهل استمرارية السيتوبلازم ونقل الميتوكوندريا. باستخدام تصوير المحور Z ، من الواضح أن TNTs ليست مثبتة بإحكام على المصفوفة خارج الخلية ولكنها معلقة داخل وسط الثقافة ، وبالتالي تمييزها عن النتوءات الخلوية التقليدية. يتضح نقل الميتوكوندريا في الشكل 3 ، حيث تظهر خلايا ARPE19 الموجبة البنفسجية مضان مشتتا ومنقطا باللون الأخضر يدل على الميتوكوندريا التي تنشأ من الخلايا الجذعية الجذعية (الشكل 3 أ). تمثل الخلايا الجذعية الجذعية السالبة البنفسجية التي تحتوي على مضان أحمر النقاط نقل الميتوكوندريا من خلايا ARPE19 (الشكل 3 ب). يوضح الشكل 4 تكوين مادة تي إن تي ونقل الميتوكوندريا تحت التصوير فائق الدقة ، والذي يمكننا من خلاله رؤية المزيد من التفاصيل حول نقل الميتوكوندريا عبر مادة تي إن تي. يوضح الفيديو 1 ديناميكيات نقل الميتوكوندريا من خلال مادة تي إن تي.

لمزيد من الإثبات أن الشرط الأساسي لنقل الميتوكوندريا هو الاتصال الجسدي ، مثل TNT ، بدلا من إفراز الميتوكوندريا وامتصاصها ، استخدمنا طريقة الزراعة المشتركة التي تم الإبلاغ عنهاسابقا 10. كما هو موضح في الشكل 5 أ ، تم زرع الخلايا الجذعية الجذعية والخلايا ARPE19 في الغرف العلوية والسفلية للوحة الآواز، على التوالي. تم فصلهم بواسطة مرشح به مسام 0.4 ميكرومتر ، مما منع الاتصال المباشر بين الخلايا الجذعية الجذعية وخلايا ARPE19 ولكنه سمح بمرور الميتوكوندريا. بعد 24 ساعة من الزراعة المشتركة ، تم فحص خلايا ARPE19 في الغرفة السفلية ولوحظ القليل من mito-GFP من الخلايا الجذعية الجذعية في الغرفة العلوية (الشكل 5 ب). تشير هذه النتائج إلى أن نقل الميتوكوندريا يتطلب اتصالا مباشرا بين الخلايا الجذعية الجذعية وخلايا ARPE19.

في النهاية ، تم إجراء القياس الكمي لتكوين مادة تي إن تي ونقل الميتوكوندريا ، مع النتائج المقابلة الموضحة في الشكل 6. كانت الخلايا الجذعية الجذعية أكثر قدرة على التبرع بالميتوكوندريا من خلايا ARPE19 (ص = 0.0286). تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا الجذعية الجذعية تمتلك القدرة على نقل الميتوكوندريا إلى الخلايا الظهارية الصبغية في الشبكية.

figure-results-1
الشكل 1: عرض تخطيطي للزراعة المشتركة للخلايا الجذعية الجذعية وخلايا ARPE19. يتم استزراع الخلايا الجذعية الجذعية التي تعبر عن خلايا mito-GFP و ARPE19-mito-RFP المسماة ب CellTrace Violet بشكل مشترك لمدة 24 ساعة بنسبة 1: 1. يشير Mito-GFP في الخلايا البنفسجية + إلى نقل الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الجذعية إلى خلايا ARPE19 ، بينما يشير Mito-RFP في الخلايا البنفسجية إلى نقل الميتوكوندريا من خلايا ARPE19 إلى الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية الاختصارات: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. RFP = بروتين الفلورسنت الأحمر ؛ الخلايا الجذعية الوسيطة = الخلايا الجذعية الوسيطة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تكوين مادة تي إن تي بين الخلايا الجذعية الجذعية وخلايا ARPE19. تشير رؤوس الأسهم البيضاء إلى تكوين TNT ، وتشير رؤوس الأسهم الخضراء إلى الميتوكوندريا مع mito-GFP وتشير رؤوس الأسهم الحمراء إلى الميتوكوندريا مع mito-RFP. (أ ، ب) تكوين مادة تي إن تي بين خلايا ARPE19. (ج) تكوين مادة تي إن تي بين الخلايا الجذعية الجذعية (د) تكوين مادة تي إن تي بين الخلايا الجذعية الجذعية وخلايا ARPE19. تصوير المحور Z يظهر TNTs معلقة في وسط الاستزراع. أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. الاختصارات: الخلايا الجذعية الوسيطة = الخلايا الجذعية الوسيطة. TNTs = أنابيب نانوية الأنفاق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: نقل الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الجذعية إلى خلايا ARPE19. (أ) تشير الدائرة البيضاء المتقطعة إلى نقل الميتوكوندريا (mito-GFP) من الخلايا الجذعية الجذعية إلى خلايا ARPE19 ، و (ب) تشير الدائرة الصفراء المتقطعة إلى نقل الميتوكوندريا (mito-RFP) من خلايا ARPE19 إلى الخلايا الجذعية الجذعية النطاقية. اختصار: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. RFP = بروتين الفلورسنت الأحمر ؛ الخلايا الجذعية الوسيطة = الخلايا الجذعية الوسيطة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تكوين مادة تي إن تي ونقل الميتوكوندريا بين الخلايا الجذعية الجذعية وخلايا ARPE19 عن طريق الفحص المجهري فائق الدقة. (أ و ب) نقل الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الجذعية إلى خلايا ARPE19. (ج) تفاصيل أجهزة TNT تحت التصوير فائق الاستبانة. (د) الميتوكوندريا الخضراء من الخلايا الجذعية الجذعية الموجودة في خلايا ARPE19 تحت تصوير فائق الدقة. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. الاختصارات: الخلايا الجذعية الوسيطة = الخلايا الجذعية الوسيطة. TNTs = أنابيب نانوية الأنفاق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: نقل الميتوكوندريا الذي لا يمكن اكتشافه تقريبا في الزراعة المشتركة غير المباشرة في نظام ترانسويل للخلايا الجذعية الجذعية وخلايا ARPE19. (أ) عرض تخطيطي للزراعة المشتركة للخلايا الجذعية الجذعية وخلايا ARPE19 في نظام ترانسويل. (ب) صور تمثيلية لخلايا ARPE19 في الجزء السفلي من لوحة الآبار بعد الزراعة المشتركة غير المباشرة مع الخلايا الجذعية الجذعية لمدة 24 ساعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: التقدير الكمي لتكوين TNT ونقل الميتوكوندريا. (أ) تكوين TNT ، (ب) نقل الميتوكوندريا. الاختصارات: M = الخلايا الجذعية الوسيطة = الخلايا الجذعية الوسيطة. أ = خلايا ARPE19 ؛ TNTs = أنابيب نانوية نفق ؛ M-A = تكوين TNT بين الخلايا الجذعية الجذعية وخلايا ARPE19 ؛ M-M = تكوين TNT بين الخلايا الجذعية الجذعية ؛ A-A = تكوين TNT بين خلايا ARPE19. ن = 4 ، يعني ± SD ، اختبار Mann-Whitney U ، * ص < 0.05. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: رسم خرائط البلازميد pCT-Mito-copGFP. تم شراء Mito-GFP (CYTO102-PA-1). يندمج متتبع الخلايا في الميتوكوندريا ، pCT-Mito-GFP (CMV) ، مع copGFP عبر علامة Cox8 ، مما يؤدي إلى وضع العلامات على الميتوكوندريا باستخدام copGFP. يتم تشغيل اندماج copGFP هذا بواسطة مروج CMV ، مما يتيح تعبيرا قويا في خطوط الخلايا مثل HeLa و HEK293 و HT1080. تم تعديل Mito-RFP من mito-GFP عن طريق استبدال GFP ب RFP ؛ يحمل جين مقاومة بورومايسين. يتم تغليف العدسات الفيروسية لهذا البلازميد من قبل شركات متخصصة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

فيديو 1: نقل الميتوكوندريا بوساطة TNT بين الخلايا الجذعية الجذعية وخلايا ARPE19. يتم إنشاء مادة تي إن تي من خلال الحركة ثنائية الاتجاه لخلايا MSC و ARPE19 ، مما يسهل نقل الميتوكوندريا من خلايا MSC إلى خلايا ARPE19. الاختصارات: الخلايا الجذعية الوسيطة = الخلايا الجذعية الوسيطة. TNTs = أنابيب نانوية الأنفاق. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

المناقشة

أظهرت العديد من الدراسات أن ظاهرة نقل الميتوكوندريا بوساطة مادة تي إن تي هي عملية فسيولوجية سائدة في أنواع مختلفة من خلايا الأنسجة10،11،12،13. يظهر التبرع الوظيفي بالميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الجذعية للخلايا المصابة بخلل وظيفي في الميتوكوندريا إمكانات علاجية قوية3،14،15،16،17،18.

هنا ، لتقديم نقل الميتوكوندريا ثنائي الاتجاه بوساطة TNT بين الخلايا الجذعية الجذعية وخلايا ARPE19 ، قمنا ببناء خطوط خلايا MSC-mito-GFP و ARPE19-mito-RFP. بعد ذلك ، تم زراعة نوعي الخلايا بشكل مشترك لمدة 24 ساعة ، وتم إجراء تلطيخ الهيكل الخلوي في نهاية الزراعة المشتركة. من خلال التصوير متحد البؤر ، لاحظنا وأحصينا تكوين مادة تي إن تي ومعدل نقل الميتوكوندريا. قد تتأثر نتائج هذه الملاحظات بعوامل مثل نسبة الخلايا المزروعة المشتركة وكثافة الخلايا. أثناء الزراعة المشتركة ، من الضروري خلط نوعي الخلايا جيدا والحفاظ عليهما في حالة خلية واحدة لتقليل تكوين مستعمرات الخلايا بواسطة الخلايا المتجانسة ، وبالتالي تقليل حدوث انتقال الميتوكوندريا بين نوعي الخلايا.

يمكن استخدام تحليل قياس التدفق الخلوي بالمثل لتحليل معدلات نقل الميتوكوندريا ، وهذه الطريقة أبسط من إحصائيات ما بعد التصوير. ومع ذلك ، فإن معدل نقل الميتوكوندريا المحسوب باستخدام هذه الطريقة سيكون أقل إلى حد ما من القيمة الفعلية ، لأنه قد لا يتم تسجيل كميات صغيرة من نقل الميتوكوندريا. في هذا البروتوكول ، يجب أن يتم حساب نتائج التصوير بعناية فائقة لتجنب الإغفال أو العد غير الصحيح للإشارات الزائفة الفلورية.

تعد دراسة نقل الميتوكوندريا ثنائي الاتجاه عن طريق بناء خطين خليين مع مضان الميتوكوندريا ابتكارا لهذا البروتوكول. تتجنب الطريقة تداخل الأصباغ الفلورية وتجعل النتائج التجريبية أكثر مصداقية. يستحق نقل الميتوكوندريا من خلايا الشبكية إلى الخلايا الجذعية الجذعية مزيدا من الدراسة ، على سبيل المثال ، لاستكشاف التغيرات في نسبة الميتوكوندريا المنقولة في كلا الاتجاهين في ظل ظروف مرهقة.

من خلال الالتزام بالإجراءات التجريبية الموضحة في هذا البروتوكول ، تمكنا من التأكد من أن الخلايا الجذعية الجذعية يمكنها نقل الميتوكوندريا إلى الخلايا الظهارية الصبغية في الشبكية من خلال الأنابيب النانوية النفقية. قد تكون هذه الظاهرة بمثابة آلية معقولة تكمن وراء التأثيرات المفيدة للخلايا الجذعية الجذعية على أنسجة الشبكية ، وبالتالي المساعدة في توضيح العلاجات التجديدية التي تحركها الخلايا الجذعية الجذعية لأنسجة العين.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ أنهم لا يملكون مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

نشكر شركة Guangzhou CSR Biotech Co. Ltd على التصوير باستخدام المجهر التجاري فائق الدقة (HIS-SIM) ، والحصول على البيانات ، وإعادة بناء صورة SR ، والتحليل ، والمناقشة. هذا العمل مدعوم جزئيا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82125007،92368206) ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (Z200014).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ Trypsin-EDTAGibco25200-056
4٪ بارافورمالديهايدSolarbioP1110
6 آبارلوحة NEST703001
15 مل أنبوب الطرد المركزيBD Falcon352097
24 بئراNEST702001
خلايا ARPE19خطوط الخلايا ATCCCRL-2302
ألبومين مصل الأبقار (BSA)BeyotimeST025
CellTrace البنفسجيInvitrogenC34557
شريحةالغطاء NEST801007
DMSOسيجماD2650
DPBSGibcoC141905005BT
DMEM / F-12-GlutaMAXGibco10565-042
الجنين البقر مصل (FBS)VivaCellC04002-500
كاشف FluorSaveMillipore345789
الخلايا الجذعيةNuwacellRC02003خطوط
الخلايا ncMissionShowninRP02010
Pen StrepGibco15140-122
pCT-Mito-GFPSBICYTO102-PA-1البلازميد. من  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
PuromycinMCEHY-B1743A
ماصةAxygenTF-1000-R-S
PhalloidinInvitrogenA22287
Triton X-100SolarbioT8200
Transwell لوحةCorning3470

المراجع

  1. Caprara, C., Grimm, C. From oxygen to erythropoietin: Relevance of hypoxia for retinal development, health and disease. Prog Retin Eye Res. 31 (1), 89-119 (2012).
  2. Ferrington, D. A., Fisher, C. R., Kowluru, R. A. Mitochondrial defects drive degenerative retinal diseases. Trends Mol Med. 26 (1), 105-118 (2020).
  3. Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
  4. Wei, B., et al. Mitochondrial transfer from bone mesenchymal stem cells protects against tendinopathy both in vitro and in vivo. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 104(2023).
  5. Borcherding, N., Brestoff, J. R. The power and potential of mitochondria transfer. Nature. 623 (7986), 283-291 (2023).
  6. Liu, D., et al. Intercellular mitochondrial transfer as a means of tissue revitalization. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 65(2021).
  7. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  8. Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-the path forward. Embo j. 40 (8), e105789(2021).
  9. Qin, Y., et al. The functions, methods, and mobility of mitochondrial transfer between cells. Front Oncol. 11, 672781(2021).
  10. Jiang, D., et al. Bioenergetic crosstalk between mesenchymal stem cells and various ocular cells through the intercellular trafficking of mitochondria. Theranostics. 10 (16), 7260-7272 (2020).
  11. Domhan, S., et al. Intercellular communication by exchange of cytoplasmic material via tunneling nano-tube like structures in primary human renal epithelial cells. PLoS One. 6 (6), e21283(2011).
  12. Zhang, J., Zhang, Y. Membrane nanotubes: Novel communication between distant cells. Sci China Life Sci. 56 (11), 994-999 (2013).
  13. Cheng, X. Y., et al. Human ipscs derived astrocytes rescue rotenone-induced mitochondrial dysfunction and dopaminergic neurodegeneration in vitro by donating functional mitochondria. Transl Neurodegener. 9 (1), 13(2020).
  14. Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
  15. Li, C. J., Chen, P. K., Sun, L. Y., Pang, C. Y. Enhancement of mitochondrial transfer by antioxidants in human mesenchymal stem cells. Oxid Med Cell Longev. 2017, 8510805(2017).
  16. Paliwal, S., Chaudhuri, R., Agrawal, A., Mohanty, S. Regenerative abilities of mesenchymal stem cells through mitochondrial transfer. J Biomed Sci. 25 (1), 31(2018).
  17. Lin, T. K., et al. Mitochondrial transfer of wharton's jelly mesenchymal stem cells eliminates mutation burden and rescues mitochondrial bioenergetics in rotenone-stressed melas fibroblasts. Oxid Med Cell Longev. 2019, 9537504(2019).
  18. Hu, X., Duan, T., Wu, Z., Xiong, Y., Cao, Z. Intercellular mitochondria transfer: A new perspective for the treatment of metabolic diseases. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 53 (7), 958-960 (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Mito GFP Mito RFP
نقل الميتوكوندريا عبر الأنابيب النانوية النفقية بين الخلايا الجذعية الوسيطة والظهارة الصبغية لصبغة الشبكية في المختبر
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.