مقالة منهجية

عزل الشعيرات الدموية في شبكية الفأر والمصفوفة تحت البطانية لقياس الصلابة باستخدام مجهر القوة الذرية

DOI:

10.3791/66922

⸱

يوليو 12, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of California, Los Angeles, 2Doheny Eye Institute, 3Molecular, Cellular, and Integrative Physiology Interdepartmental PhD Program, University of California, Los Angeles, 4Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد حددنا مؤخرا تصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين كنموذج جديد لضعف الشبكية المرتبط بمرض السكري. يوضح هذا البروتوكول خطوات عزل الشعيرات الدموية في شبكية الفأر والمصفوفة تحت البطانية من مزارع بطانة الشبكية ، متبوعا بوصف لتقنية قياس الصلابة باستخدام مجهر القوة الذرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التنكس الشعري الشبكي هو السمة المميزة السريرية للمراحل المبكرة من اعتلال الشبكية السكري (DR). كشفت دراساتنا الحديثة أن تصلب الشعيرات الدموية في الشبكية الناجم عن مرض السكري يلعب دورا سببيا حاسما وغير معترف به سابقا في تنكس الشعيرات الدموية في الشبكية بوساطة الالتهاب. تنتج الزيادة في تصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين عن الإفراط في التعبير عن أوكسيديز الليسيل ، وهو إنزيم يتشابك ويقوي المصفوفة تحت البطانية. نظرا لأنه من المتوقع أن يؤدي التعامل مع DR في المرحلة المبكرة إلى منع أو إبطاء تقدم DR وفقدان البصر المرتبط به ، فإن المصفوفة تحت البطانية ، وتصلب الشعيرات الدموية تمثل أهدافا علاجية ذات صلة وجديدة لإدارة DR المبكرة. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون القياس المباشر لتصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين بمثابة خطوة حاسمة للتحقق قبل السريري لتطوير تقنيات تصوير جديدة للتقييم غير الجراحي لتصلب الشعيرات الدموية في الشبكية في والبشر. مع وضع هذا الرأي في الاعتبار ، نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لقياس عزل وصلابة الشعيرات الدموية في شبكية الفأر والمصفوفة تحت البطانية باستخدام مجهر القوة الذرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشعيرات الدموية في الشبكية ضرورية للحفاظ على توازن الشبكية والوظيفة البصرية. في الواقع ، فإن انحطاطهم في مرض السكري المبكر متورط بقوة في تطور المضاعفات التي تهدد الرؤية لاعتلال الشبكية السكري (DR) ، وهي حالة الأوعية الدموية الدقيقة التي تؤثر على ما يقرب من 40 ٪ من جميع الأفراد المصابين بداء السكري1. يساهم التهاب الأوعية الدموية بشكل كبير في تنكس الشعيرات الدموية في الشبكية في DR. أظهرت الدراسات السابقة دورا مهما للإشارات الجزيئية والكيميائية الحيوية الشاذة في التهاب الأوعية الدموية في الشبكية الناجم عن مرض السكري 2,3. ومع ذلك ، فقد قدم العمل الأخير نموذجا جديدا لتسبب DR الذي يحدد تصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين كمحدد حاسم ولكن لم يتم التعرف عليه سابقا لالتهاب الأوعية الدموية في شبكية العين وانحطاطها4،5،6.

على وجه التحديد ، تحدث الزيادة الناجمة عن مرض السكري في تصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين بسبب تنظيم إنزيم الليزيل أوكسيديز المتشابك للكولاجين (LOX) في الخلايا البطانية للشبكية (ECs) ، مما يؤدي إلى تصلب المصفوفة تحت البطانية (الغشاء القاعدي)4،5،6. تصلب المصفوفة ، بدوره ، يقوي ECs الشبكية العلوية (بسبب المعاملة بالمثل الميكانيكية) ، مما يؤدي إلى الزيادة الإجمالية في تصلب الشعيرات الدموية في شبكيةالعين 4. بشكل حاسم ، يمكن لهذا التصلب الشعري للشبكية الناجم عن مرض السكري وحده أن يعزز تنشيط EC في الشبكية وموت EC بوساطة الالتهاب. يمكن أن يعزى هذا التنظيم الميكانيكي لعيوب EC في شبكية العين إلى النقل الميكانيكي البطاني المتغير ، وهي العملية التي يتم من خلالها تحويل الإشارات الميكانيكية إلى إشارات كيميائية حيوية لإنتاج استجابة بيولوجية7،8،9. الأهم من ذلك ، أن الإشارات الميكانيكية المتغيرة EC وبنية المصفوفة تحت البطانية متورطة أيضا في تنكس الأوعية الدموية المشيمية المرتبط بالتنكس البقعي المرتبط بالعمر المبكر (AMD) 10،11،12 ، والذي يشهد على الآثار الأوسع لعلم الأحياء الميكانيكية الوعائية في أمراض الشبكية التنكسية.

والجدير بالذكر أن تصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين يحدث في وقت مبكر من مرض السكري ، والذي يتزامن مع بداية التهاب الشبكية. وبالتالي ، فإن الزيادة في تصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين قد تكون بمثابة هدف علاجي وعلامة تشخيصية مبكرة ل DR. تحقيقا لهذه الغاية ، من المهم الحصول على قياسات تصلب موثوقة ومباشرة للشعيرات الدموية في شبكية العين والمصفوفة تحت البطانية. يمكن تحقيق ذلك باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM) ، والذي يوفر تقنية فريدة وحساسة ودقيقة وموثوقة لقياس صلابة الخلايا والمصفوفة خارج الخلية والأنسجة بشكل مباشر13. يطبق AFM قوة المسافة البادئة الدقيقة (على مستوى نانو نيوتن) على العينة التي تحدد صلابتها مدى انحناء ناتئ AFM البادئة - كلما كانت العينة أكثر صلابة ، زاد انحناء الكابولي ، والعكس صحيح. لقد استخدمنا AFM على نطاق واسع لقياس صلابة الخلايا البطانية المستزرعة ، والمصفوفات تحت البطانية ، والشعيرات الدموية المعزولة في شبكية الفأر4،5،6،11،12. ساعدت قياسات صلابة AFM هذه في تحديد البيولوجيا الميكانيكية البطانية كمحدد رئيسي لإمراض DR و AMD. للمساعدة في توسيع نطاق علم الأحياء الميكانيكي في أبحاث الرؤية ، نقدم هنا دليلا تفصيليا حول استخدام AFM لقياسات تصلب الشعيرات الدموية الشبكية للفأر المعزولة والمصفوفة تحت البطانية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لبيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية وتمت الموافقة عليه من قبل اللجان المؤسسية لاستخدام والرعاية (IACUC ؛ رقم البروتوكول ARC-2020-030) في جامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس (رقم ضمان رعاية لمؤسسة OLAW A3196-01). تم تنفيذ البروتوكول التالي باستخدام الشعيرات الدموية الشبكية المعزولة من الفئران البالغة (البالغة من العمر 20 أسبوعا) C57BL / 6J التي تزن ~ 25 جم (الفئران المصابة بالسكري) و ~ 32 جم (الفئران غير المصابة بالسكري. مختبر جاكسون).

1. عزل الشعيرات الدموية في شبكية الفأر لقياس صلابة AFM (الأيام 1-4)

ملاحظة: هذا البروتوكول ، الذي تم الإبلاغ عنه في دراسة حديثة4 ، يفصل الاستئصال والتثبيت الخفيف لعين الفأر ، وعزل الشبكية ، وهضم التربسين ، والتركيب اللاحق للأوعية الدموية الشبكية الناتجة على شرائح الفحص المجهري لقياس تصلب AFM.

  1. الاستئصال والتثبيت الخفيف (اليوم 1)
    1. بعد القتل الرحيم للفأر مع التعرض لثاني أكسيد الكربون متبوعا بخلع عنق الرحم ، أدخل ملقط دقيق خلف مقلة العين ، وتمسك بالمرفق العضلي ، واسحب العين بعناية دون الضغط على الملقط الدقيق بإحكام شديد ، مما قد يقطع العصب البصري.
    2. ضع العين المنزوعة النواة في 5٪ (v / v) فورمالين في PBS لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية للتثبيت الخفيف.
      ملاحظة: بناء على الخبرة4 ، تنتج العيون غير الثابتة أو الثابتة بشكل معتدل الشعيرات الدموية الهشة التي تصبح مجزأة أثناء تحضير عينة AFM وقياس الصلابة.
  2. عزل الشبكية (اليوم 2)
    1. ضع العين الثابتة على قطعة من ورق الشمع تحت مجهر تشريح. بعد ذلك ، باستخدام ملقط دقيق ، أمسك بقايا العضلات والعصب البصري المتصل بالجزء الخارجي من العين الخلفية وقم بتوجيه العين بحيث تواجه القرنية جانبا واحدا (الشكل 1).
    2. باستخدام شفرة جراحية ، قم بعمل شق 1-2 مم خلف ومواز للطرف (تقاطع القرنية الصلبة). بعد ذلك ، أثناء تثبيت العين في مكانها بالملقط الدقيق ، قم بتطبيق قوة لأسفل بالشفرة واستمر في الضغط حتى يتم فصل الجزء الأمامي من العين تماما عن الطرف الخلفي (الشكل 1). تخلص من الجزء الأمامي والعدسة. لا ترى ذهابا وإيابا لأن ذلك قد يسبب تلف الشبكية.
    3. انقل الجزء الخلفي (الصلبة والمشيمية والشبكية) إلى طبق 6 سم مملوء ب PBS (درجة الحموضة 7.4).
    4. باستخدام ملعقة صغيرة وفي نفس الوقت إمساك العصب البصري بلطف بالملقط الدقيق ، استخرج شبكية العين. قم بتخزين شبكية العين في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل يحتوي على برنامج تلفزيوني عند 4 درجات مئوية حتى عزل الشعيرات الدموية.
       
  3. شطف الشبكية
    1. لشطف شبكية واحدة ، املأ ستة آبار من صفيحة مكونة من 12 بئرا ب 1 مل من H2O المقطر المزدوج (ddH2O). بعد ذلك ، باستخدام ماصة باستور المقلوبة ، انقل شبكية العين من أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل إلى البئر الأول.
    2. شطف شبكية العين على شاكر المداري عند 120 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. باستخدام ماصة P1000 ، تسقي الماصة بعناية لأعلى ولأسفل بجوار الشبكية ، وتنفخ المياه في شبكية العين لإحداث إثارة لطيفة.
    4. باستخدام الماصة الزجاجية المقلوبة ، انقل شبكية العين إلى البئر الثاني وكرر الخطوتين 1.3.2 و 1.3.3 4 مرات ، مع كل شطف يتم في بئر جديدة (تحتوي على ddH2O).
    5. أخيرا ، قم بنقل الشبكية إلى البئر السادس وشطفها طوال الليل (O / N) في RT على شاكر المداري المحدد عند 100 دورة في الدقيقة لتسهيل فصل الغراء العصبي الشبكي عن الأوعية الدموية أثناء هضم التربسين.
  4. هضم التربسين الشبكي (اليوم 3)
    1. تحضير محلول التربسين 10٪ (وزن / حجم) عن طريق إذابة مسحوق التربسين 1: 250 في محلول تريس (درجة الحموضة 8 ؛ 0.1 م). امزج برفق عن طريق قلب الأنبوب المخروطي عدة مرات لتقليل تكوين الفقاعة ، مما يجعل من الصعب تأكيد قابلية ذوبان التربسين.
    2. وازن محلول التربسين 10٪ في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. بمجرد أن يذوب مسحوق التربسين تماما ، قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر.
    3. في طبق من 12 بئرا ، أضف 2 مل / بئر / شبكية من محلول التربسين المصفى بنسبة 10٪. أضف بعض محلول التربسين الإضافي في البئر المجاورة (لموازنة جدران الماصة الزجاجية للخطوات اللاحقة).
    4. أضف 3 مل من ddH2O في ثلاثة آبار من صفيحة 6 آبار (خصص هذه الآبار الثلاثة لشبكية واحدة).
    5. في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، أدخل طرف P200 قبل إضافة 4 مل من محلول التربسين المصفى بنسبة 10٪. انقل هذا الأنبوب المخروطي إلى حمام 37 درجة مئوية للسماح بنقع الطرف في التربسين لمدة 2-3 دقائق ، حيث يساعد ذلك على منع شبكية العين من الالتصاق بجدران الطرف في الخطوات الأخيرة.
    6. بعد شطف الشبكية O / N (من الخطوة 1.3.5) ، استخدم ماصة P1000 لتسخين الماء بعناية لأعلى ولأسفل بجوار الشبكية ، وتدفق الماء على الشبكية لإحداث إثارة لطيفة.
    7. باستخدام ماصة زجاجية مقلوبة ، انقل شبكية العين المغسولة إلى البئر المحتوي على التربسين في اللوحة المكونة من 12 بئرا (من الخطوة 1.4.3). تأكد من نقل شبكية العين بأقل قدر ممكن من ddH2O المتبقي حتى لا تخفف محلول التربسين بشكل كبير. احتضان لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية.
    8. توسيط طرف P200 المنقوع بالتريبسين (من الخطوة 1.4.5) على منطقة العصب البصري ، ماصة بلطف شبكة الأوعية الدموية بأكملها لأعلى ولأسفل لفصل الأنسجة غير الوعائية14.
    9. باستخدام ماصة زجاجية مقلوبة مغسولة مسبقا في التربسين (عن طريق سحب التربسين لأعلى ولأسفل 5 مرات) ، انقل الأوعية الدموية في شبكية العين إلى أول بئر يحتوي على ddH2O من الصفيحة المكونة من 6 آبار (من الخطوة 1.4.4).
    10. قم بتدوير اللوحة والماصة الوعائية لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة زجاجية مغسولة بالتربسين المقلوبة لإزالة أي أنسجة غير وعائية متبقية.
    11. باستخدام الماصة الزجاجية ، انقل الأوعية الدموية في شبكية العين إلى البئر الثاني المحتوي على ddH2O للوحة 6 آبار وقم بتخزينها عند 4 درجات مئوية حتى يتم تركيبها على الشريحة لقياس صلابة AFM.
      ملاحظة: الأوعية الدموية الشبكية المائية (في برنامج تلفزيوني) سليمة هيكليا عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. ومع ذلك ، يجب إجراء قياسات الصلابة الروتينية من الشعيرات الدموية المعزولة حديثا.
  5. تركيب الأوعية الدموية في شبكية العين لقياس تصلب AFM (اليوم 4)
    1. باستخدام ماصة زجاجية مغسولة بالتربسين المقلوب ، انقل الأوعية الدموية في شبكية العين إلى البئر الثالث المحتوي على ddH2O من اللوحة المكونة من 6 آبار لإزالة أي محلول تربسين متبقي.
    2. نظف تماما (باستخدام ddH2O وأنسجة المساحات) شريحة مجهرية سطحية مشحونة سيتم استخدامها لتركيب شبكة الأوعية الدموية لقياس صلابة AFM.
      ملاحظة: يوفر السطح المشحون للشريحة ربطا قويا لشبكة الأوعية الدموية أثناء قياس AFM.
    3. قم بتسمية الشريحة وارسم منطقة دائرية 4-5 سم حول المركز بقلم كاره للماء لتجنب انسكاب الماء أثناء الخطوات اللاحقة.
    4. باستخدام ماصة زجاجية مغسولة بالتربسين المقلوبة ، انقل الأوعية الدموية في شبكية العين بعناية إلى مركز المنطقة المحددة.
    5. باستخدام ماصة P200 ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الماء الزائد بعناية من حافة واحدة دون استنشاق الأوعية الدموية عن طريق الخطأ في الحافة.
    6. ضع الشريحة في خزانة السلامة الحيوية (غطاء BSL-2) بالقرب من الجانب الأمامي (شبكة مفلترة) واترك الماء المتبقي يتبخر.
    7. بمجرد أن تجف الأوعية الدموية تقريبا ، تحت مجهر تباين الطور (تكبير 4x) ، أعد ترطيب الأوعية الدموية بعناية عن طريق إضافة ddH2O ببطء مع ماصة P200 على جانب واحد من المنطقة المحددة. تؤدي إضافة ddH2O مباشرة على الأوعية الدموية إلى انفصالها.
    8. التقط صورا متباينة الطور للأوعية الدموية المعاد ترطيبها عند تكبير 4x و 20x للتأكد من أنها تتمتع بسلامة هيكلية جيدة وتنتشر بشكل صحيح (لا تطوى على نفسها) وتعلق على شريحة زجاجية ، وهي معايير أساسية لقياس صلابة AFM الموثوق.

2. الحصول على مصفوفة تحت البطانية من مزارع الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في شبكية العين (REC) (الأيام 1-17)

ملاحظة: هذا البروتوكول مقتبس من Beacham et al.15 وأبلغ في الدراسات الحديثة4،5،6 ، يصف ثقافة REC على أغطية زجاجية معدلة ، تليها إزالة الخلايا للحصول على مصفوفة تحت البطانية لقياس صلابة AFM اللاحقة.

  1. تحضير أغطية زجاجية مطلية بالجيلاتين وطلاء الخلايا (اليوم 1)
    ملاحظة: قم بإجراء طلاء الجيلاتين وخطوات شطف PBS ++ اللاحقة في غطاء زراعة الأنسجة قبل الانتقال إلى غطاء دخان كيميائي لخطوات معالجة الجلوتارالدهيد والإيثانولامين اللاحقة.
    1. ضع غطاء زجاجي دائري معقم بقطر 12 مم لكل بئر من صفيحة معقمة مكونة من 24 بئرا وأضف 500 ميكرولتر من الجيلاتين المعقم مسبقا بنسبة 0.2٪ (وزن / حجم) (مخفف في برنامج تلفزيوني يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم ؛ PBS ++) لكل بئر يحتوي على غطاء الغطاء. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. قم بنضح محلول الجيلاتين ، واشطف أغطية الغطاء مرة واحدة باستخدام PBS ++ المعقم ، وقم بربط الجيلاتين المطلي بإضافة 500 ميكرولتر من 1٪ (v / v) glutaraldehyde لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. اجمع محلول الجلوتارالدهيد وتخلص منه بشكل صحيح (وفقا للإرشادات المؤسسية) قبل شطف أغطية الغطاء باستخدام PBS ++ لمدة 5 دقائق على شاكر مداري عند 100 دورة في الدقيقة في RT. كرر خطوة الشطف هذه 5 مرات. خلال عمليات الشطف الثلاثة الأولى ، ارفع أغطية الغطاء باستخدام ملقط معقم للسماح بالشطف الشامل للجلوتارالدهيد. أي كمية متبقية يمكن أن تقلل من صلاحية الخلية.
    4. أضف 800 ميكرولتر من 1 M إيثانولامين إلى غطاء الجيلاتين المتشابك لمدة 30 دقيقة في RT لإخماد أي آثار متبقية من الجلوتارالدهيد في البئر.
    5. اجمع محلول الإيثانولامين وتخلص منه بشكل صحيح (وفقا للإرشادات المؤسسية) واشطف أغطية الغطاء 5 مرات باستخدام PBS ++ لمدة 5 دقائق على شاكر مداري عند 100 دورة في الدقيقة في RT. خلال عمليات الشطف الثلاثة الأولى ، ارفع أغطية الغطاء باستخدام ملقط معقم للسماح بالشطف الشامل للإيثانولامين. أي كمية متبقية يمكن أن تقلل من صلاحية الخلية.
    6. أغطية الأغطية المتشابكة جاهزة الآن للطلاء الخلوي.
      ملاحظة: على الرغم من أننا نقوم بشكل روتيني بطلاء الخلايا مباشرة بعد تحضير الغطاء ، فقد يكون من المفيد مقارنة طلاء الخلايا على أغطية الجيلاتين المتشابكة المخزنة في PBS ++ عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أيام.
    7. في ظل ظروف معقمة في غطاء زراعة الأنسجة ، تقوم الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للشبكية (RECs) بقياس 500 ميكرولتر متوسط / بئر بكثافة تحقق التقاء بنسبة 100٪ خلال 24 ساعة ، كما أكد الفحص المجهري لتباين الطور.
      ملاحظة: يعد الوصول إلى نقطة التقاء في غضون 24 ساعة أمرا مهما لأن هدوء REC الناتج سيزيد من قدرة الخلايا على إفراز المصفوفة (راجع الخطوة التالية). في تجربتنا مع المجموعات الاقتصادية الإقليمية البشرية ، فإن كثافة الطلاء 4 × 104 خلايا / سم2 كافية للوصول إلى التقاء في غضون 24 ساعة. ومع ذلك ، نظرا لأن حجم REC يختلف باختلاف الأنواع (على سبيل المثال ، تكون المجموعات الاقتصادية الإقليمية للفأر أصغر بكثير) ، فقد يلزم تحسين كثافة الطلاء الأولية.
  2. إنتاج المصفوفة تحت البطانية بواسطة ثقافة REC (اليوم 2-16)
    1. بعد أن تصل الخلايا إلى نقطة التقاء (~ 24 ساعة) ، استبدل وسط الاستزراع بوسط جديد مكمل بحمض الأسكوربيك المصفى المعقم (التركيز النهائي 200 ميكروغرام / مل).
      ملاحظة: يمكن أن يبدأ الآن أي علاج REC بعوامل خطر الإصابة بالأمراض (مثل ارتفاع الجلوكوز ، والمنتجات النهائية المتقدمة للجلوكوز ، وما إلى ذلك) أو العوامل الدوائية ، جنبا إلى جنب مع علاج حمض الأسكوربيك.
    2. قم بتغيير وسط الاستزراع المكمل بحمض الأسكوربيك كل يوم لمدة 15 يوما.
      ملاحظة: حمض الأسكوربيك غير مستقر في المحلول. قم بإعداد محلول مخزون 100X طازج كل يوم للمكملات المتوسطة.
  3. إزالة الخلايا من مزارع REC للحصول على المصفوفة تحت البطانية (اليوم 16)
    1. بعد 15 يوما من العلاج بحمض الأسكوربيك ، قم بإزالة الوسط وشطف الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني خال من الكالسيوم / المغنيسيوم.
    2. إزالة الخلايا من ثقافات REC عن طريق إضافة 250 ميكرولتر / لكل بئر من المخزن المؤقت لإزالة الخلايا الدافئ (20 mM هيدروكسيد الأمونيوم و 0.5٪ Triton X-100 في PBS) لمدة ~ 2-3 دقائق. تأكد من إزالة الخلايا تحت مجهر تباين الطور (تكبير 10x).
    3. قم بإزالة المخزن المؤقت لإزالة الخلايا برفق دون إزعاج المصفوفة تحت البطانية التي تفرزها REC وأضف 0.5 مل من PBS إلى كل بئر.
      ملاحظة: لضمان عدم انفصال المصفوفة تحت البطانية أثناء هذه الخطوة وخطوات الشطف اللاحقة ، قم بإجراء شطف لطيف فقط باستخدام ماصة P1000. لا تقم بإجراء شفط الفراغ.
    4. قم بتخزين الألواح في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل لتثبيت المصفوفة المفرزة REC.
  4. دمعالجة المصفوفة تحت البطانية لإزالة الحطام الخلوي (اليوم 17)
    1. شطف المصفوفة تحت البطانية من الخطوة 2.3.4 مع 800 ميكرولتر من PBS / جيدا.
    2. قم بإزالة PBS برفق واحتضان المصفوفة ب 200 ميكرولتر من DNase I الخالي من RNase (وحدات 30 K) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة جميع آثار الحطام الخلوي. تحقق من كفاءة معالجة DNase من خلال البحث بعناية عن حطام الخلايا تحت مجهر تباين الطور.
    3. قم بإزالة محلول DNase I برفق وشطف المصفوفة تحت البطانية مرتين باستخدام 800 ميكرولتر من PBS / جيدا.
    4. تأكد من أن المصفوفة تحت البطانية الليفية الكبيرة مرئية تحت مجهر تباين الطور (تكبير 10x). يتطلب تصور ألياف المصفوفة النانوية الدقيقة مسحا طبوغرافيا AFM أو تصويرا متحد البؤر عالي الدقة لبروتينات المصفوفة ذات العلامات المناعية عند تكبير 100x.
    5. استخدم على الفور المصفوفة تحت البطانية الجديدة (غير الثابتة) لقياس صلابة AFM.
    6. بعد قياس AFM ، قم بتثبيت عينات المصفوفة بنسبة 1٪ (v / v) بارافورمالدهيد (15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) وتخزينها عند 4 درجات مئوية لوضع العلامات المناعية بالأجسام المضادة ضد بروتينات المصفوفة تحت البطانية و / أو الإنزيمات المتشابكة.

3. قياس صلابة AFM

ملاحظة: هذا البروتوكول ، المقتبس من دليل مستخدم AFM القياسي والمبلغ عنه في الدراسات الحديثة4،5 ، يفصل الحصول على بيانات الصلابة وتحليلها من الشعيرات الدموية في شبكية العين والمصفوفة تحت البطانية باستخدام AFM وبرنامج تحليل البيانات. على الرغم من أن الخطوات الموضحة أدناه تستند إلى نموذج محدد من AFM (انظر جدول المواد) ، فإن المبادئ الأساسية تنطبق بشكل عام على جميع نماذج AFM.

  1. اختيار مسبار ناتئ
    ملاحظة: تتطلب العينات البيولوجية اللينة ناتئات ناعمة يمكن أن تنحني عند المسافة البادئة للعينة بينما يتم اختيار أبعاد المسبار لتتناسب مع أبعاد العينة.
    1. لقياس صلابة أوعية شبكية الفأر بقطر 5-8 ميكرومتر ، استخدم مسبارا ناتئا نصف قطره 1 ميكرومتر مع ثابت زنبركي (k) من 0.2-0.3 نيوتن / م. لقياس صلابة مصفوفة تحت البطانية مكونة من ألياف نانوية ، استخدم مسبارا ناتئا نصف قطره 70 نانومتر مع ثابت زنبركي (k) من 0.06-0.1 نيوتن / م.
  2. تركيب ناتئ
    1. على كمبيوتر AFM ، افتح البرنامج الذي يتحكم في وحدة AFM والكاميرا المتصلة بمجهر تباين الطور المستخدم لتصور الكابولي والعينة.
    2. ثبت حامل الكابولي على حامل تغيير الكابولي وقم بتركيب الكابولي المحدد على الحامل باستخدام ملقط صانع الساعات تحت منظار مجسم دون إتلاف الكابولي ماديا. أحكم ربط المسمار على الحامل لتأمين الكابولي.
    3. ضع وقفل حامل الكابولي على رأس AFM الموجود على الحامل.
    4. باستخدام وظيفة محرك الخطوة في برنامج AFM ، اسحب رأس AFM إلى أعلى نقطة وقم بتعيين هذا الموضع كنقطة صفر في البرنامج. تمنع هذه الخطوة ناتئ AFM من الوصول إلى مرحلة العينة عن طريق الخطأ أثناء تركيب رأس AFM (الخطوة التالية).
    5. ارفع رأس AFM بعناية من حامله وقم بتثبيته على مرحلة عينة AFM عن طريق وضع الأرجل في الفتحات الخاصة بها.
  3. محاذاة الليزر
    ملاحظة: يتم إجراء محاذاة الليزر الأولية بدون أي عينة (أي في وضع الهواء) لأنها تضمن محاذاة أكثر دقة لشعاع الليزر على طرف الكابولي (عن طريق منع انكسار الليزر في السائل). ومع ذلك ، نظرا لأن العينات البيولوجية مغمورة في وسط له معامل انكسار مختلف عن الهواء ، فمن المهم إعادة محاذاة الليزر في الوسط قبل قياس الصلابة.
    1. لمحاذاة الليزر في الهواء ، ضع رأس AFM على مرحلة العينة واستخدم الهدف 10x والكاميرا المرفقة لتصور الكابولي على الشاشة في الوضع المباشر. ليزر الأشعة تحت الحمراء مخفي عن نظر المستخدم ولكنه مرئي بكاميرا CCD.
    2. حدد وظيفة التحليل الطيفي لقوة وضع الاتصال على البرنامج وافتح النافذة بعنوان محاذاة الليزر.
    3. باستخدام المسمارين المميزين بالليزر الجانبي على رأس AFM ، ركز شعاع الليزر على الكابولي بحيث تكون قيمة SUM في نافذة محاذاة الليزر هي الأعلى. لتحقيق ذلك ، ركز الليزر على مركز الكابولي أو حوله.
    4. باستخدام مسامير ضبط الكاشف ، اضبط الكاشف الضوئي بحيث تكون بقعة الليزر في وسط نافذة محاذاة الليزر.
    5. باستخدام برغي ضبط المرآة ، اضبط المرآة للتأكد من أن قيمة SUM عند أعلى قيمة ممكنة.
      ملاحظة: تضمن قيمة SUM العالية تقييما حساسا ودقيقا لصلابة العينة. وبالتالي ، يجب إجراء كل من خطوات محاذاة الليزر وضبط المرآة للحصول على أعلى قيمة SUM.
    6. بعد ذلك ، لمحاذاة الليزر في السائل ، أضف وسيط الاستزراع المطلوب في طبق وقم بتثبيته بإحكام على خشبة المسرح لمنع أي اهتزاز أو انحراف ، مما يؤدي إلى إنشاء قطع أثرية للقياس أثناء المسافة البادئة للعينة.
    7. أثناء النظر إلى تغذية الكاميرا الحية التي تركز على الكابولي ، قم بخفضها في السائل باستخدام وظيفة المحرك التدريجي.
    8. كرر الخطوتين 3.3.4 و 3.3.5 للتأكد من أن قيمة SUM تظل هي الأعلى وأن بقعة الليزر في مركز نافذة محاذاة الليزر.
  4. معايرة ثابت الربيع الكابولي
    ملاحظة: على الرغم من أن مجسات الكابولي تأتي مع ثابت زنبركي معاير من قبل الشركة المصنعة (k) ، فمن الممارسات الجيدة التحقق بشكل مستقل من قيمته (في السائل) قبل بدء القياس. استخدم سطحا زجاجيا نظيفا يقلل من التفاعلات بين مسبار الكابولي والسطح الزجاجي.
    1. تحدد قوة نقطة الضبط التي يطبقها الكابولي أقصى انحراف ليزر عن الكابولي المسموح به لمسافة بادئة للقوة. اضبطه مبدئيا على 1.5 فولت. إذا فشل الكابولي في الاقتراب من قوة نقطة الضبط المحددة هذه ، فقم بزيادتها بشكل تدريجي حتى تضع مسافة بادئة للعينة وتولد منحنى المسافة البادئة للقوة.
    2. يشير طول Z إلى أقصى مسافة ينسحب بها z-piezo بعد وصول الكابولي إلى نقطة الضبط أثناء المسافة البادئة للعينة. يجب أن يكون طول Z كافيا على الأقل لضمان فصل المسبار الكابولي بشكل نظيف عن العينة. لمعايرة ثابت الزنبرك على سطح زجاجي ، اضبط Z Length على 1 ميكرومتر.
    3. تشير سرعة Z إلى السرعة التي يحرك بها z-piezo الكابولي رأسيا لأسفل نحو العينة أثناء المسافة البادئة للقوة. يجب تحسينه لأن السرعة المنخفضة جدا ستلتقط بشكل أساسي السلوك اللزج للعينة ، بينما ستلتقط السرعة العالية جدا السلوك المرن بشكل أساسي. من المتوقع أن تلتقط السرعة المثلى الطبيعة اللزجة المرنة الحقيقية للعينات البيولوجية. اضبط سرعة Z على 2 ميكرومتر / ثانية للعينات البيولوجية اللزجة المرنة.
    4. يشير ارتفاع الهدف على النطاق Z إلى المسافة التقريبية من العينة التي يستقر عندها z-piezo بعد قياس منحنى القوة وقبل الانتقال إلى موقع مختلف في العينة. يجب أن يكون ارتفاع هدف النطاق Z أكبر من ارتفاع معالم العينة. اضبط الارتفاع المستهدف على النطاق Z عند 7.5 ميكرومتر.
    5. باستخدام وظيفة Step Motor ، اجعل الكابولي قريبا إلى حد ما من سطح العينة (بناء على التركيز في صورة تباين الطور عند تكبير 10x) قبل تحديد وظيفة Approach في نافذة التحليل الطيفي لقوة وضع التلامس لإسقاط الكابولي بزيادات أصغر تبلغ 15 ميكرومتر.
    6. انقر فوق اكتساب لالتقاط منحنى قوة.
    7. حدد منحنى القوة ، وافتحه في نافذة مدير المعايرة ، وحدد الوضع المستند إلى جهة الاتصال في قسم الطريقة.
    8. باستخدام وظيفة تحديد نطاق الملاءمة ، حدد منحنى سحب الكابولي لملاءمة المنحنى الخطي. بعد ذلك ، حدد خانة الاختيار الحساسية لتحويل وحدة القوة من V إلى N.
    9. ارفع الكابولي بمقدار 100-200 ميكرومتر في السائل وحدد وظيفة الضوضاء الحرارية . مرة أخرى ، باستخدام Select Fit Range ، قم بتركيب منحنى جرس الضوضاء الحرارية مع منحنى Lorentz. بعد تركيب المنحنى، حدد مربع ثابت الزنبرك (k ). تأكد من أن ثابت الزنبرك (k) قريب من قيمة الشركة المصنعة وقم بتدوينه للرجوع إليه في المستقبل. بعد المعايرة ، ستتغير وحدة نقطة الضبط من mV إلى nN.
      ملاحظة: الضوضاء الحرارية هي التردد الطبيعي للناتئ عند درجة حرارة معينة. مطلوب تصحيح للضوضاء الحرارية لقياس ثابت زنبركي دقيق.
  5. اكتساب منحنيات مسافة القوة
    1. ضع العينة المثبتة على الشريحة (الأوعية الشبكية أو المصفوفة تحت البطانية) على مرحلة AFM وحدد التحليل الطيفي لقوة وضع الاتصال في قسم تجربة البرنامج.
    2. اضبط قوة نقطة الضبط على 0.5 nN وانقر فوق النهج ، وهو أعلى بكثير من الانحراف الحراري لكل من مجسات الكابولي SAA-SPH 1 μm و PFQNM-LC-A 70 نانومتر ، مما يضمن اقتراب ناتئ سلس تجاه العينة.
    3. بعد أن يكتشف الكابولي السطح ويعود إلى ارتفاعه المستهدف أثناء الراحة ، اضبط نقطة الضبط على 0.2 nN لمسبار الكابولي SAA-SPH 1 μm الأكثر صلابة أو 0.1 nN لمسبار الكابولي PFQNM-LC-A 70 نانومتر الأكثر ليونة. يضمن ضبط نقطة الضبط هذا أن كلا من الكابوليات الصلبة واللينة تنحني بسهولة أثناء المسافة البادئة للعينة (راجع القسم 3.1).
    4. اضبط Z Length عند ~ 2.5 ميكرومتر لضمان الفصل النظيف لمسبار الكابولي عن العينات البيولوجية أثناء التراجع (راجع الخطوة 3.4.2) وسرعة Z عند 2 ميكرومتر / ثانية (راجع الخطوة 3.4.3).
    5. باستخدام مسامير المرحلة الموجودة على مرحلة AFM ، ضع مسبار الكابولي بعناية في الموقع المطلوب على العينة.
      ملاحظة: نظرا لأن الشعيرات الدموية لا تنتشر دائما بشكل مسطح على الشريحة ، فمن الآمن سحب الكابولي 10-20 ميكرومتر إضافي من ارتفاعه المستهدف قبل تحريك المرحلة.
    6. انقر فوق نهج لتقريب الكابولي أولا من العينة ثم انقر فوق اكتساب لالتقاط منحنيات القوة للمواقع المطلوبة. احفظ جميع منحنيات القوة للتحليل.
  6. تحليل البيانات
    1. افتح منحنى القوة في برنامج معالجة البيانات.
    2. حدد منحنى قوة التراجع لتحليل البيانات (على غرار الخطوة 3.4.8).
    3. باستخدام وظيفة تجانس البيانات ، قم بتنعيم منحنى القوة باستخدام مرشح Gaussian لإزالة الضوضاء غير المرغوب فيها في البيانات المكتسبة.
    4. باستخدام دالة الطرح الأساسية، اضبط قيمة ميل ومقدار جزء خط الأساس (غير التلامسي) من منحنى القوة إلى الصفر.
    5. انقر فوق وظيفة نقطة الاتصال لإحضار نقطة الاتصال لمنحنى القوة تلقائيا إلى الإحداثيات (0,0) على المحورين X و Y.
    6. باستخدام وظيفة موضع الطرف الرأسي ، احسب الموضع الرأسي الفعلي للناتئ على المحور Y عن طريق تصحيح أي مسافة بادئة للعينة.
    7. على منحنى القوة المعالج ، قم بتطبيق وظيفة Elasticity Fit عن طريق تحديد شكل الطرف ونصف القطر أولا (بناء على مسبار الكابولي المحدد) ، متبوعا بتركيب منحنى القوة باستخدام نموذج Hertz / Sneddon.
      1. إذا تجاوزت المسافة البادئة للمصفوفة بواسطة مسبار نصف قطر 70 نانومتر 70 نانومتر ، وهو ما يحدث عادة ، فحدد شكل طرف Paraboloid . لقياس صلابة الشعيرات الدموية ، لا تتجاوز المسافة البادئة للعينة بواسطة مسبار نصف قطر 1 ميكرومتر أبدا 1 ميكرومتر ، لذا حدد شكل طرف الكرة . علاوة على ذلك، إذا كانت نقطة التلامس الخاصة بالمنحنى المجهز لا تتطابق مع نقطة التلامس لمنحنى التراجع الفعلي، فحدد خانة الاختيار منحنى الإزاحة .
    8. لاحظ واحفظ قيمة معامل يونغ (الصلابة).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشعيرات الدموية الشبكية للفأر
يتضمن قياس صلابة AFM للشعيرات الدموية الشبكية المعزولة خطوات معالجة العينات التي يمكن أن تلحق الضرر بسلامتها الميكانيكية الهيكلية. لمنع ذلك وبالتالي ضمان جدوى وموثوقية وقابلية استنساخ قياسات AFM ، يتم تثبيت العيون المنزوعة النواة في 5٪ فورمالين طوال الليل عند 4 درجات مئوية قبل عزل الوعاء. تم تطوير بروتوكول التثبيت المعتدل هذا مع انخفاض تركيز الفورمالين ، وانخفاض درجة حرارة التثبيت ، ووقت التثبيت المحدود ، ونقص ثقب القرنية لتقليل أي قطع أثرية متشابكة / صلبة محتملة ناتجة عن التثبيت الكيميائي. كما هو موضح في الشكل 2B ، C ، يضمن هذا التثبيت المعتدل نسبيا أن الأوعية الدموية الشبكية المعزولة قوية من الناحية الهيكلية ومتينة بما يكفي لقياس AFM. في المقابل ، تصبح الأوعية الشبكية المعزولة من العيون غير الثابتة (باستخدام طريقة انخفاض التوتر)4 أو العيون الثابتة لفترة وجيزة (لمدة 8 ساعات) مجزأة أو تنهار ، مما يجعلها غير مناسبة لقياس AFM (الشكل 2B).

مصفوفة تحت بطانة الشبكية
يعكس تصلب الأوعية الدموية الصلابة المشتركة للخلايا الوعائية والغشاء القاعدي (المصفوفة تحت البطانية)4. نظرا لأن الخلايا تتكيف مع صلابة المصفوفة من خلال الخضوع لتغيير مماثل في صلابتها ، فإن عملية تسمى المعاملة بالمثلالميكانيكية 9 ، تصلب المصفوفة تحت البطانية ، تصبح محددا مهما لتصلب الأوعية الدموية الكلي. لقياس صلابة المصفوفة ، من المهم الحصول على مصفوفة تحت البطانية كثيفة متجانسة. بالنسبة لشبكية العين البشرية ECs المزروعة في وسط استزراع مكمل بحمض الأسكوربيك ، يستغرق هذا عادة من 10 إلى 15 يوما (الشكل 3 أ) 4،5،6. قد ينشأ هذا الاختلاف في فترة الاستزراع من الاختلافات بين الكثير في ECs الشبكية الأولية المتاحة تجاريا. علاوة على ذلك ، نجد عموما أن ECs الشبكية المتاحة تجاريا من الفئران C57BL / 6 تودع مصفوفة أكثر كثافة عند مقارنتها بثقافة EC الشبكية البشرية الأولية ، مما يشير إلى الاختلافات الخاصة بالأنواع. كما هو موضح في الشكل 3 أ ، توفر صور تباين الطور فقط عرضا إجماليا للمصفوفة على مقياس ماكرو. ومع ذلك ، فإن البنية الليفية الدقيقة من النانو إلى الجزئي تصبح واضحة في صور مضان متحدة البؤر عالية الدقة للمصفوفة الموسومة بالأجسام المضادة ضد البروتينات الهيكلية للمصفوفة الكولاجين الرابع والفبرونيكتين (الشكل 3 ب). وتجدر الإشارة إلى أن بروتينات المصفوفة هذه توفر أيضا إشارات إرشادية للخلايا البطانية عن طريق الارتباط بمستقبلات إنتغرين محددة9.

قياس صلابة AFM
يعد اختيار الصلابة الكابولية المناسبة (ثابت الزنبرك ، k) وبعد المسبار أمرا ضروريا لإجراء قياسات موثوقة وحساسة. يجب اختيار هذه المعلمات لتتناسب مع صلابة وأبعاد العينة البيولوجية. بعد تركيب الكابولي المحدد على AFM ، يجب تركيز شعاع الليزر بالأشعة تحت الحمراء على طرف الكابولي ، ويجب توسيط بقعة الليزر المنعكسة على الكاشف الضوئي. تضمن محاذاة الليزر هذه الكشف الدقيق والحساس عن انحراف الكابولي ، وبالتالي قياس الصلابة. يبدأ قياس صلابة AFM بتحريك z-piezo الكابولي عموديا لأسفل نحو العينة. لا يوجد انحراف ناتئ في هذا الوقت ، مما ينتج عنه خط أساس مسطح لمنحنى الاقتراب (الشكل 4 أ). عندما يتصل مسبار الكابولي بالعينة ويضع مسافة بادئة لها ، ينحني الكابولي ، مما يتسبب في انحراف الليزر على الكاشف الضوئي ، والذي يصوره الانحراف الرأسي لمنحنى الاقتراب. بعد تطبيق قوة المسافة البادئة المحددة مسبقا (قوة نقطة الضبط) على العينة ، يتراجع الكابولي إلى موضع البداية (ارتفاع الهدف Z) بعيدا عن العينة. ثم يتم تركيب منحنى التراجع المنحرف على نموذج Hertz / Sneddon لحساب معامل يونغ (الصلابة) للعينة.

من قياس المسافة البادئة للقوة التمثيلية الموضح في الشكل 4 ، من الواضح أن منحنيات الاقتراب والتراجع التي تم الحصول عليها من الشعيرات الدموية الشبكية المعزولة من فأر مصاب بالسكري (الشكل 4 ب) أكثر حدة بكثير من تلك التي تم الحصول عليها من فأر غير مصاب بالسكري (الشكل 4 أ). يشير المنحدر الأكثر انحدارا لمنحنيات المسافة البادئة للقوة إلى انحراف ناتئ أكبر ناتج عن مقاومة أعلى للعينة للمسافة البادئة للقوة ، مما يعكس صلابة أعلى للعينة13. في الواقع ، كشف تحليل البيانات اللاحق لمنحنيات المسافة البادئة متعددة القوة أن الشعيرات الدموية في شبكية الفأر تصبح أكثر صلابة بشكل ملحوظ في مرض السكري4. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن الاتصال بين مسبار الكابولي والعينات البيولوجية غالبا ما يتسبب في التصاق سطح غير محدد ، مما يؤدي إلى انحراف ناتئ سلبي أثناء التراجع ، كما يتضح من امتداد منحنى التراجع إلى ما وراء خط الأساس (الشكل 4 ب). علاوة على ذلك ، فإن العينات البيولوجية مثل الخلايا والمصفوفة والأوعية الدموية لزجة مرنة بطبيعتها ، وبالتالي قد تخضع لبعض التشوه الدائم و / أو التغيير في الصلابة الظاهرة بعد المسافة البادئة للقوة. إذا كان الأمر كذلك ، فسوف ينعكس ذلك في اختلال منحنيات النهج والتراجع (التباطؤ). في الواقع ، تؤكد مقارنة الشكل 4A والشكل 4B الاتجاه المتوقع حيث ينتج عن المسافة البادئة للشعيرات الدموية الأكثر ليونة في الفئران غير المصابة بالسكري تباطؤا أكبر من ذلك الذي يظهر في نظيراتها الأكثر صلابة. كما تم الإبلاغ عنه سابقا 5,6 ، يتم أيضا حساب الصلابة (معامل يونغ) للمصفوفات تحت البطانية التي تم الحصول عليها من مزارع EC في شبكية العين بالطريقة المذكورة أعلاه.

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي للشق المقطوع الذي تم إجراؤه على عين الفأر لعزل الشبكية. باستخدام ملاقط لتثبيت العصب البصري ، يتم استخدام مشرط لعمل شق كامل خلف الحافة لفصل شبكية العين عن العدسة والغرفة الأمامية. يوضح الخط المتقطع الأرجواني موقع الشق الرأسي. تم رسم هذا المخطط باستخدام صورة علمية وبرنامج توضيحي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تحسين البروتوكول لعزل أوعية شبكية الفأر السليمة لقياس AFM. (أ) تظهر صورة المجسمة شبكية سليمة معزولة من عين فأر ثابتة بشكل معتدل قبل خطوات عزل الشعيرات الدموية. شريط المقياس: 2 مم. (B) تظهر صور تباين الطور التمثيلية عند التكبير 4x أوعية شبكية الفأر التي تم الحصول عليها باستخدام طرق العزل المختلفة. بمقارنة السلامة الهيكلية والمتانة للأوعية المعزولة ، وجد أن هضم التربسين لشبكية العين من العيون المنزوعة النواة المثبت في 5٪ فورمالين لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية (الصندوق الأحمر) ينتج عنه الأوعية الدموية الشبكية الأكثر ملاءمة لقياس تصلب AFM. أظهرت الأوعية الشبكية المعزولة باستخدام هذه الطريقة شبكة وعائية واضحة تنتشر بشكل موحد على طول السطح الزجاجي. شريط المقياس: 500 ميكرومتر. (ج) يؤكد التكبير العالي (20x) لشبكة شعرية شبكية سليمة ، على غرار تلك الموضحة في (B) ، السلامة الهيكلية العالية للشعيرات الدموية التي تم الحصول عليها من عيون ثابتة بشكل معتدل. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: المصفوفات غير الخلوية التي تم الحصول عليها من ثقافات REC البشرية والفأر الأولية. (أ) صور تباين الطور التمثيلية عند تكبير 20x تظهر مجاميع مصفوفة تحت البطانية على أغطية زجاجية بعد إزالة الخلوية من مزارع 10 أيام (10 d) أو 15 يوما (15 d) للمجموعات الاقتصادية الإقليمية البشرية أو الفئران. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. (ب) صور مضان تمثيلية عالية التكبير (100x) متحدة البؤر للمصفوفات منزوعة الخلايا التي تم الحصول عليها من 15 د مزارع REC البشرية والموسومة بأجسام مضادة للكولاجين الوريدي ومضاد للفيبرونيكتين تكشف عن كولاجين ليفي نانوي كثيف IV ومصفوفة الفبرونيكتين. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: منحنيات مسافة القوة من قياس صلابة AFM للشعيرات الدموية في شبكية الفأر. تشير الرسوم البيانية الخطية إلى نهج تمثيلي (لون فاتح) ومنحنى تراجع (لون غامق) من قياس المسافة البادئة لقوة واحدة في موقع واحد من شعرية شبكية الفأر المعزولة من فأر (A) غير مصاب بالسكري أو (B) مصاب بالسكري. منحنيات القوة التي تم الحصول عليها باستخدام مسبار ناتئ نصف كروي نصف قطره SAA-SPH 1 ميكرومتر ، ترسم العلاقة بين مسافة عينة الكابولي (التي يتحكم فيها z-piezo) والقوة الرأسية المطبقة التي تسبب انحراف الكابولي. (A) يشير السهم الأصفر إلى اقتراب الكابولي الذي يحركه z-piezo نحو العينة ، ويشير السهم الأبيض إلى نقطة الاتصال حيث يتلامس مسبار الكابولي مع العينة ، ويشير السهم الأخضر إلى انحراف الكابولي لأعلى إلى نقطة ضبط (ذروة) قوة المسافة البادئة (*). (ب) تظهر منحنيات الاقتراب والتراجع التي تم الحصول عليها من الشعيرات الدموية الشبكية المعزولة من الفئران المصابة بالسكري منحدرا أكثر انحدارا بشكل ملحوظ من نظيراتها غير المصابة بالسكري (كما هو موضح في A) ، مما يشير إلى تصلب شعري أعلى في الفئران المصابة بالسكري. يشير رأس السهم إلى انخفاض في منحنى التراجع أسفل خط الأساس ، مما يعكس الانحراف السلبي لمسبار الكابولي الناجم عن الالتصاق بين المسبار والعينة أثناء المسافة البادئة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام AFM على نطاق واسع لقياس التغيرات المرتبطة بالمرض في تصلب الأوعية الكبيرة ، مثل الشريان الأورطي والشرايين16. وقد ساعدت هذه النتائج في تحديد دور البيولوجيا الميكانيكية البطانية في مضاعفات القلب والأوعية الدموية مثل تصلب الشرايين17. بناء على هذه النتائج ، بدأنا في التحقيق في الدور غير المعترف به سابقا لعلم الأحياء الميكانيكية البطانية في تطور آفات الأوعية الدموية الدقيقة في شبكية العين في أوائل DR. ومع ذلك ، يعتمد النجاح في هذا المسعى على القياس الدقيق للتغيرات التي يسببها مرض السكري في تصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين. كشفت الدراسات الحديثة أنه على غرار الأوعية الكبيرة ، يمكن أيضا قياس تصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين والمصفوفة تحت البطانية التي تفرزها الشبكية EC بشكل مباشر ودقيق وموثوق باستخدام AFM4،5،6.

يتضمن هذا النهج عزل الشعيرات الدموية في شبكية الفأر عن العيون الثابتة بشكل معتدل باستخدام هضم التربسين. بناء على الخبرة ، تعد خطوة التثبيت الخفيفة هذه ضرورية لأن الشعيرات الدموية المعزولة من العيون غير الثابتة (باستخدام طريقة انخفاض التوتر) هشة وتصبح مجزأة ، مما يجعلها غير مناسبة لقياس صلابة AFM4. وعلى العكس من ذلك ، فإن التثبيت الأقوى والحاجة اللاحقة لهضم التربسين على نطاق واسع ، والذي تم الإبلاغ عنه في بروتوكول هضم التربسينالشبكي الآخر 18 ، قد يضر أيضا بالسلامة الهيكلية الشعرية ، كما يحكم عليه من خلال تعطيل الوصلات الضيقة. وبالتالي ، فإن التثبيت الشعري المعتدل وهضم التربسين اللطيف المستخدم هنا يساعدان في تقليل القطع الأثرية المتصلبة الناشئة عن التشابك المفرط الناجم عن الفورمالين وضمان السلامة الهيكلية للشعيرات الدموية لقياس صلابة AFM بشكل موثوق.

كنهج بديل ، أبلغت دراسة حديثة عن قياس تصلب AFM للشعيرات الدموية في شبكية العين من حوامل شبكية مسطحة ثابتة قليلا19. من خلال إجراء المسافات البادئة لقوة AFM على الشعيرات الدموية في شبكية العين داخل الشبكية السليمة ، يتيح هذا النهج قياس الصلابة في الموقع . ومع ذلك ، من المحتمل أن تتضمن قياسات تصلب الشعيرات الدموية هذه صلابة الغشاء المحدد الداخلي. علاوة على ذلك ، يقتصر هذا النهج على قياس الشعيرات الدموية السطحية فقط التي يمكن الوصول إليها على حامل مسطح للشبكية مع ترك الضفيرة الشعرية الأعمق التي تتأثر بشكل خاص في أوائل DR20. يمكن معالجة هذه المشكلات باستخدام هذا النهج ، الذي يستخرج الأوعية بشكل نظيف (خالية من أنسجة الشبكية المتبقية) من جميع طبقات الشبكية. نقوم حاليا بتحسين هذا البروتوكول لعزل الأوعية المشيمية عن النماذج الحيوانية ل AMD المبكر. ومع ذلك ، فإننا ندرك أن تثبيت الفورمالين المعتدل المستخدم في البروتوكول قد يتسبب في حدوث قطعة أثرية صلبة مرتبطة بالتشابك في قياسات AFM. لذلك ، سيكون من الحكمة تفسير قيم تصلب الأوعية الدموية التي تم الحصول عليها باستخدام هذا النهج أكثر من حيث التغيرات النسبية في التصلب (بين المجموعات التجريبية المختلفة) بدلا من الصلابة المطلقة.

على عكس الشعيرات الدموية في شبكية العين التي تتطلب تثبيتا خفيفا ، يمكن تقييم المصفوفة تحت البطانية التي تم الحصول عليها من مزارع EC في شبكية العين دون أي تعديل. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى متانة المصفوفة المودعة ، والتي تنتج عن مجموعة من عدة عوامل ، بما في ذلك إضافة حمض الأسكوربيك في وسط الاستزراع (الذي يعزز تخليق الكولاجين15) ، والتعديل الكيميائي للأغطية الزجاجية التي تمنع انفصال المصفوفة أثناء إزالة الخلايا ، ومدة طويلة من الثقافة (10-15 يوما). الأهم من ذلك ، لقد أظهرنا أن الزيادة الناجمة عن ارتفاع السكر في الدم في تصلب المصفوفة تحت البطانية في المختبر تتفق مع الزيادة الناجمة عن مرض السكري في تصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين التي شوهدت في الجسم الحي4. هذا ليس مفاجئا حيث من المتوقع أن تؤدي الزيادة في صلابة المصفوفة إلى زيادة صلابة ECs الشبكية العلوية (بسبب المعاملة بالمثل الميكانيكية) التي تزيد معا من تصلب الشعيرات الدموية بشكل عام. في الواقع ، أظهرنا مؤخرا أن ECs في شبكية العين تصبح أكثر صلابة عندما تنمو في ظل ظروف مرض السكري4 ، على الأرجح عن طريق زيادة التوتر الخلوي الهيكلي للأكتين المعتمد على Rho / ROCK21. تشير هذه النتائج أيضا إلى أن تصلب EC المشيمي الذي شوهد في نموذج الريسوس في AMD المبكر يعكس الصلابة المتزايدة للمصفوفة تحت البطانية المشيمية والأوعيةالسليمة 12 ، وهي فكرة يتم اختبارها في الدراسات الجارية. بشكل عام ، فإن حقيقة أن تغيرات التصلب في مصفوفة الشبكية تحت البطانية غير الثابتة و ECs تعكس الاتجاه الذي شوهد في الأوعية الشبكية السليمة الثابتة بشكل معتدل تشهد على صحة نهج التثبيت المعتدل.

لا يساعد قياس الصلابة المباشرة للشعيرات الدموية في شبكية العين من النماذج الحيوانية ل DR على تأسيس البيولوجيا الميكانيكية البطانية كهدف علاجي جديد لإدارة DR فحسب ، بل يوفر أيضا أساسا منطقيا قويا لتطوير تقنيات تصوير حساسة جديدة للتقييم غير الجراحي لتصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين في مرضى DR في المستقبل. يمكن لمثل هذه التقنيات غير الباضعة اكتشاف التغيرات الطفيفة في تدفق الدم التي من المتوقع أن تنشأ عن تصلب الشعيرات الدموية ، على غرار التغيرات في سرعة موجة النبض الشرياني التي يتم اكتشافها بشكل شائع في أمراض القلب والأوعية الدموية التي يسببها مرض السكري. ستوفر قياسات تصلب AFM للشعيرات الدموية في شبكية العين المعزولة من عيون البشر بعد الوفاة من المتبرعين المصابين بالسكري دليلا مهما على المفهوم في هذا الصدد. بالنظر إلى أن تصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين يزداد في وقت مبكر في نموذج الفأر (الستربتوزوتوسين) لمرض السكري من النوع 14 ، فإن الاستخدام الناجح ل AFM في التحقق من صحة طرق التصوير لقياس الصلابة قد يؤدي إلى تحديد تصلب الشعيرات الدموية في شبكية العين كعلامة حيوية سريرية لتسبب DR المبكر.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعيون / المعاهد الوطنية للصحة منحة R01EY028242 (إلى KG) ، وجائزة محفز البحث للوقاية من العمى / المؤسسة الدولية لأبحاث الشبكية لمناهج البحث المبتكرة ل AMD (إلى KG) ، ومبادرة ستيفن ريان لأبحاث البقعة الصفراء (RIMR) منحة خاصة من مؤسسة W.M. Keck (إلى معهد Doheny Eye) ، وزمالة أورسولا ماندل وزمالة التنوع في مجلس الدراسات العليا بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (إلى I.S.T.). تم دعم هذا العمل أيضا من خلال منحة غير مقيدة من Research to Prevention Blindness، Inc. إلى قسم طب العيون في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس. المحتوى الوارد في هذه المقالة هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > عزل الشعيرات الدموية للشبكية < / قوي >
0.22 & مرشح حقنة م PVDFميرك ميليبورSLGVM33RSمنخفض البروتين ملزمة Durapore
10X Dulbecco's محلول ملحي مخزن بدون كالسيوم٪ المغنيسيومCorning20-031-CVالتركيز النهائي 1X ، درجة الحموضة 7.4
لوحة 12 بئرFalconCorning 353043
15 مل أنبوب الطرد المركزيCorning430791خالي من Rnase-Dnase ، غير حراري
20 مل حقنة Luer-Lok TIPBD302830
5 3/4 بوصة زجاج البورسليكات القابل للتصرف / ماصة باستور غير معقمةFisherBrand13-678-20A
60x15 مم طبق زراعة الأنسجةFalcon Corning353002
لوحة 6 آبارFalcon Corning353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 مل مختبرالأجهزة العلمية9804-02
حامل الشفرةX-ACTO
الكربون الصلب الشفرة الجراحية # 10Bard-Parker371110
شمع الأسنانعلوم المجهر الإلكتروني50-949-027
تشريح المجهرAm-scope
محلول الفورمالين ، محايد مخزن ، 10٪Millipore SigmaHT501128-4Lالتركيز النهائي 5٪ (حجم / حجم)
Kimwipes - مناديل ممسحةKimtech Science34133
ملعقة صغيرةأدوات العلوم الدقيقة10089-11
مختبر شاكرالمداري عبقريةSK-O180
PELCO الاقتصاد # 7 الفولاذ المقاوم للصدأ 115mm  الملقطتيد بيلا ، إنك.5667
مجهر تباين المرحلةنيكون TS2
لتنقية الهواء منطق + الفئة الثانية ، خزانة السلامة الحيوية من النوع A2Labconco302380001
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات القفل الآمن 2 ملEppendorf22363352
StereoscopeAmScopeSM-3 Series Zoom Tricular Stereoscope 3.5X-90X
شريحة الفحص المجهري Superfrost Plus - علامة تبويب بيضاء - منظف مسبقا - 25 × 75 × 1.0 ممFisherBrand1255015
Tris Buffer ، محلول 0.1 متر ، درجة الحموضة 7.4 - درجة التكنولوجيا الحيويةVWRE553-500MLدرجة الحموضة 8 لمحلول التربسين
مسحوق 1: 250 مسحوق زراعة الأنسجةدرجة VWRVWRV0458-25G10٪ (وزن / حجم) محلول التربسين
البيولوجيا الجزيئية للمياهCorning46-000-CM
<قوية > مصفوفة تحت البطانة < / قوية >
10X PBSCorning20-031-CV
1X PBS مع الكالسيوم والمغنيسيومثيرمو فيشر Scientific14040-117درجة الحموضة 7.4
هيدروكسيد الأمونيومسيجما ألدريتش338818
حمض الأسكوربيكسيجما ألدريتشA4034
كولاجين IV الأجسام المضادةNovus BiologicalsNBP1-26549
DNase IQiagen79254
الإيثانولامينسيجما ألدريتش398136
الفيبرونيكتين الجسم المضادسيجما ألدريتشF6140
فلوروماونتإنفيتروجين-ثيرمو فيشر ساينتيك00-4958-02
الجيلاتينسيجما ألدريتشG1890
أغطية زجاجية (12 مم)فيشر12-541-000
علوم المجهر الإلكترونيللجلوتارالديهايد16220
الخلايا البطانية للشبكية البشرية (HREC)Cell Systems CorpACBRI 181
MCDB131 متوسطCorning15-100-CV
خلايا بطانة الشبكية للفأر (mREC)Cell BiologicsC57-6065
تريتون X-100ثيرمو فيشر العلمية  BP151-100
التربسينجيبكو ثيرمو فيشر العلمي25200-056
< قوي > قياس AFM < / قوي >
1 & م مسبارBrukerSAA-SPH-1UMمسبار نصف كروي طويل القامة 19 ميكرون بنصف قطر نهاية 1
ميكرون ، ثابت زنبركي 0.25N / m
70 نانومتر مسبار LCBrukerPFQNM-LC-V2مسبار نصف كروي طويل القامة 19 ميكرون بنصف قطر نهاية 70 نانومتر ،
  ؛ ثابت الربيع 0.1N/m
  كاميراXCAM الأسرةToupcam1080P HDMI
سطح المكتب لتشغيل الكاميراآسوسسطح المكتبIntel i5 - 6600 وحدة المعالجة المركزية , 8GB ذاكرة الوصول العشوائي
حامل طبق للغطاءCellvisD29-14-1.5-N29mm الزجاج القاع الطبق مع
& nbsp; 14 مم بئر صغير
Nanowizard 4BrukerNanowizard 4مجهر القوة الذرية مثبت على مجهر بصري للقياس الحساس للخصائص الميكانيكية (الصلابة والتضاريس) للعينات البيولوجية الناعمة
تباين الطورZeissAxiovert 200مجهر مقلوب بهدف 10X
للقلم درجة Bioscience مجهر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), e93751(2017).
  2. Roy, S., Kern, T. S., Song, B., Stuebe, C. Mechanistic insights into pathological changes in the diabetic retina: Implications for targeting diabetic retinopathy. Am J Pathol. 187 (1), 9-19 (2017).
  3. Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
  4. Chandrakumar, S., et al. Mechanical regulation of retinal vascular inflammation and degeneration in diabetes. Diabetes. 73 (2), 280-291 (2024).
  5. Chandrakumar, S., et al. Subendothelial matrix stiffening by lysyl oxidase enhances RAGE-mediated retinal endothelial activation in diabetes. Diabetes. 72 (7), 973-985 (2023).
  6. Yang, X., et al. Basement membrane stiffening promotes retinal endothelial activation associated with diabetes. FASEB J. 30 (2), 601-611 (2016).
  7. Wolfenson, H., Yang, B., Sheetz, M. P. Steps in Mechanotransduction pathways that control cell morphology. Annu Rev Physiol. 81, 585-605 (2019).
  8. Pan, Z., Ghosh, K., Liu, Y., Clark, R. A., Rafailovich, M. H. Traction stresses and translational distortion of the nucleus during fibroblast migration on a physiologically relevant ECM mimic. Biophys J. 96 (10), 4286-4298 (2009).
  9. Ghosh, K., Ingber, D. E. Micromechanical control of cell and tissue development: implications for tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59 (13), 1306-1318 (2007).
  10. Yang, X., et al. Aberrant cell and basement membrane architecture contribute to sidestream smoke-induced choroidal endothelial dysfunction. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (5), 3140-3147 (2014).
  11. Cabrera, A. P., et al. Senescence increases choroidal endothelial stiffness and susceptibility to complement injury: Implications for choriocapillaris loss in AMD. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (14), 5910-5918 (2016).
  12. Cabrera, A. P., et al. Increased cell stiffness contributes to complement-mediated injury of choroidal endothelial cells in a monkey model of early age-related macular degeneration. J Pathol. 257 (3), 314-326 (2022).
  13. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nat Rev Phys. 1, 41-57 (2019).
  14. Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. J Vis Exp. (76), e50489(2013).
  15. Beacham, D. A., et al. Preparation of extracellular matrices produced by cultured and primary fibroblasts. Current protocols in cell biology. , vol. Chapter 10 (2007): Unit 10.9 (2007).
  16. Bae, Y. H., Liu, S. L., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. Measuring the stiffness of ex vivo mouse aortas using atomic force microscopy. J Vis Exp. (116), e54630(2016).
  17. Huynh, J., et al. Age-related intimal stiffening enhances endothelial permeability and leukocyte transmigration. Sci Transl Med. 3 (112), 112(2011).
  18. Sharma, A., Gupta, D. K., Bisen, S., Singh, N. K. Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature. Microvasc Res. 154, 104682(2024).
  19. Chaqour, B., et al. Atomic force microscopy-based measurements of retinal microvessel stiffness in mice with endothelial-specific deletion of CCN1. Methods Mol Biol. 2582, 323-334 (2023).
  20. Ashraf, M., et al. Vascular density of deep, intermediate and superficial vascular plexuses are differentially affected by diabetic retinopathy severity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (10), 53(2020).
  21. Monickaraj, F., McGuire, P. G., Nitta, C. F., Ghosh, K., Das, A. Cathepsin D: an Macrophage-derived factor mediating increased endothelial cell permeability with implications for alteration of the blood-retinal barrier in diabetic retinopathy. FASEB J. 30 (4), 1670-1682 (2016).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

4

مقالات ذات صلة