يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

رؤى ميكانيكية لحماية الميتوكوندريا في ساليدروسيد عبر مسار AMPK / Sirt1 / HIF-1α في خلايا HT22 الناقصة

1.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66923

⸱

أبريل 25, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Research Service Office, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan

في هذه المقالة

ملخص

حددت الدراسة الحالية آلية فريدة يمارس بها الساليدروسيد تأثيرات وقائية للميتوكوندريا على خلايا HT22 ناقصة التأكسج ، جزئيا من خلال مسار AMPK / Sirt1 / HIF-1α.

الملخص

ساليدروسيد (سال), عنصر نشط رهوديولا كرينولاتا (هوك. و. وآخرون تومس.) H. أوهبا وقد وجد أن يمارس آثار وقائية الميتوكوندريا عن طريق تحسين التمثيل الغذائي وتعزيز إمدادات الطاقة لخلايا الدماغ في ظل ظروف نقص الأكسجة. ومع ذلك، لم يتم توضيح آلية عملها بشكل كامل. في هذه الدراسة ، تم استخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء لأول مرة لتحليل تأثيرات Sal على مستويات النيوكليوتيدات (ATP و ADP و AMP). تم اختيار مقايسة التحول الحراري الخلوي (CETSA) ، وهي طريقة تفاعل جزيئي مستخدمة على نطاق واسع للتحقق من صحة وقياس مشاركة هدف الدواء في الخلايا والأنسجة عبر الأنواع المختلفة ، لتأكيد تقارب Sal للبروتينات المرتبطة بمسار AMPK / Sirt1 / HIF-1α. كشفت النتائج أن Sal زاد من مستويات ATP و ADP في خلايا HT22 التي تعاني من نقص الأكسجين مع تقليل مستويات AMP. علاوة على ذلك ، أظهر Sal ارتباطا مستقرا ببروتينات AMPKα و p-AMPKα و Sirt1 و HIF-1α. في الختام ، قد يمارس Sal تأثيرات وقائية للميتوكوندريا عن طريق تعديل مسار AMPK / Sirt1 / HIF-1α لتنظيم محتوى النيوكليوتيدات. توفر هذه الدراسة مرجعا منهجيا لتحليل محتوى النيوكليوتيدات في عينات الخلايا وتساهم في تحديد واكتشاف أهداف المركبات المشتقة من الطب الصيني التقليدي.

المقدمة

الدماغ حساس للغاية للأكسجين بسبب متطلباته الأيضية العالية ، وقدرته المحدودة على تحلل السكر ، والاعتماد على الفسفرة المؤكسدة. نتيجة لذلك ، يمكن أن يؤدي التعرض لبيئة منخفضة الأكسجين على ارتفاعات عالية بسهولة إلى إصابة الدماغ الناجمة عن نقص الأكسجين (HHBI) 1،2. وتشير الدراسات الوبائية إلى أنه عندما يصعد الأفراد غير المتأقلمين مع الارتفاعات العالية بسرعة إلى المناطق المرتفعة، يمكن أن يصل معدل الإصابة بمرض الجبال الحاد إلى 75٪، مع معدل وفيات يبلغ حوالي 1٪ في الحالات الشديدة. علاوة على ذلك ، في حالة عدم وجود رعاية طبية ، يمكن أن تصل معدلات الوفيات الناجمة عن الوذمة الدماغية أو الرئوية على ارتفاعات عالية إلى 40٪ 3،4.

يظهر HHBI مع مجموعة واسعة من الأعراض السريرية. قد تشمل الحالات الخفيفة إلى المتوسطة الصداع والدوخة وفقدان الذاكرة5 ، بينما يمكن أن تؤدي الحالات الشديدة إلى ضعف إدراكي وتغير الوعي ونتائج مميتةمحتملة 5. أصبحت الوقاية من HHBI وعلاجه في المناطق المرتفعة محورا رئيسيا للبحث الطبي. تتضمن الاستراتيجيات الوقائية في المقام الأول التدريب التكيفي في البيئات المرتفعة ، بما في ذلك الراحة الكافية ، واتباع نظام غذائي متوازن ، والتغذية السليمة ، والتمارين البدنية المناسبة6،7. بالإضافة إلى ذلك ، تظل التدخلات الدوائية التي تهدف إلى حماية خلايا الدماغ والتخفيف من نقص الأكسجة الدماغي مركزية لأبحاث HHBI الحالية.

تعمل الميتوكوندريا كمراكز لإنتاج الطاقة الأولية داخل الخلايا ، حيث تقوم بتصنيع أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) لتلبية متطلبات الطاقة الخلوية. في ظل ظروف نقص الأكسجين ، ينخفض إنتاج طاقة الميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى انخفاض مستويات ATP وضعف وظيفة الخلية8. تؤدي إصابة نقص الأكسجين أيضا إلى تعطيل تنظيم الميتوكوندريا لتوازن Ca2+ ودرجة الحموضة ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج والنخر9،10. هناك علاقة يعزز بعضها البعض بين الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا وإصابة الدماغ الناجمة عن نقص الأكسجين. من ناحية أخرى ، يؤدي ضعف الميتوكوندريا الناجم عن نقص الأكسجة إلى تفاقم نقص الأكسجين عن طريق تقليل عملية التمثيل الغذائي للطاقة الخلوية ، مما يخلق حلقة مفرغة. من ناحية أخرى ، يرفع الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا مستويات Ca2+ داخل الخلايا ، مما ينشط شلالات موت الخلايا المبرمج ويؤدي إلى موت الخلايا11. على الرغم من أن الآليات الكامنة وراء إصابة الدماغ الناجمة عن نقص الأكسجين لا تزال معقدة وغير مفهومة تماما ، فقد حددت دراسات متعددة ضعف استقلاب طاقة الميتوكوندريا العصبية كعامل حاسم في التسبب فيالتسبب في 12،13. لذلك ، قد يوفر المزيد من الاستكشاف لوظيفة الميتوكوندريا رؤى قيمة حول الأهداف العلاجية المحتملة لإصابات الدماغ الناجمة عن نقص الأكسجين.

Salidroside (Sal) هو عنصر نشط مستخرج من نبات الهضبة Rhodiola crenulata (Hook. f. et Thoms.) H. Ohba ويستخدم على نطاق واسع في منتجات الصحة الغذائية والمستحضرات الصيدلانية14. الصيغة الجزيئية ل Sal هي C14H20O7 ، وتعرف أيضا باسم 2- (4-hydroxyphenyl) -ethyl β-D-glucopyranoside. يمتلك خصائص دوائية متنوعة ، بما في ذلك مضادات نقص الأكسجة ، ومضادات الأكسدة ، ومكافحة التعب ، ومضادة للأورام ، والمناعية ، ومضادة للالتهابات ، وتأثيرات وقائية للقلب والأوعية الدموية والأوعية الدمويةالدماغية 15،16،17. من بين هؤلاء ، يعد تأثيره المضاد لنقص الأكسجة أحد أكثر التأثيرات توثيقا جيدا. سلطت الدراسات الحديثة الضوء بشكل متزايد على التأثيرات الوقائية الكبيرة للميتوكوندريا ل Sal كآلية محتملة لآثاره الوقائية والعلاجية على إصابات الدماغ الناجمة عن الهضبة في الفئران14،18. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الدقيقة التي يؤثر بها Sal على مستويات ATP و ADP و AMP لا تزال غير مفهومة جيدا.

يعمل بروتين كيناز المنشط ب AMP (AMPK) كمستشعر رئيسي للطاقة يساعد في الحفاظ على توازن الطاقة الخلوية. يحفز تنشيط AMPK Sirtuin 1 (Sirt1) ، مما يؤدي إلى زيادة مستويات NAD + داخل الخلايا19. أظهرت الدراسات أن Sirt1 يمكن أن ينظم العامل المحفز لنقص الأكسجة 1-alpha (HIF-1α) لتنسيق الاستجابة الخلوية لنقص الأكسجة20. أظهرت الأبحاث السابقة أن Sal يمنع فتح المسام الانتقالية لنفاذية الميتوكوندريا العصبية ، وينظم عمليات طاقة الميتوكوندريا بوساطة HIF-1α ، ويخفف من موت الخلايا المبرمج العصبي ، ويحافظ على سلامة الحاجز الدموي الدماغي ، وبالتالي يحمي الفئران من إصابة الدماغ الناجمة عنالهضبة 14،21. ومع ذلك ، فإن تأثير Sal على ATP ومستقلباته ، ADP و AMP ، لا يزال غير مؤكد.

للتحقيق في ذلك ، تم استخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) لأول مرة لتحديد مستويات هذه النيوكليوتيدات الثلاثة. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام مقايسة التحول الحراري الخلوي (CETSA) ، وهي تقنية فيزيائية حيوية مستخدمة على نطاق واسع تم تقديمها في عام 2013 لدراسة تفاعلات البروتين الترابط في الخلاياالسليمة 22. يتم تطبيق هذه الطريقة بشكل شائع للتحقق من صحة وتحديد مشاركة الدواء المستهدفة في الخلايا والأنسجة عبر الأنواع المختلفة. على وجه التحديد ، بعد احتضان التحلل الخلوي المستهدف المشترك مع الدواء في درجات حرارة متفاوتة لفترة محددة ، يظهر البروتين المرتبط بالدواء ثباتا حراريا متزايدا ، مما يجعله أقل عرضة للتمسخ وهطول الأمطار. ثم تتم إزالة البروتينات غير المرتبطة المترسبة عن طريق الطرد المركزي ، ويتم تحديد التفاعلات المستهدفة للأدوية لاحقا من خلال تحليل اللطخة الغربية للطافي22. لتحديد الأهداف الجزيئية المحتملة ل Sal ، تم اختيار CETSA لتقييم تقاربها المرتبط بالبروتينات المرتبطة بمسار AMPK / Sirt1 / HIF-1α.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وترد التفاصيل التجارية للكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. إعداد الحل

  1. قم بإعداد وسط النسر المعدل (DMEM) الكامل من Dulbecco عن طريق إضافة 10٪ مصل بقري للجنين و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
  2. تحضير محلول 20 ملي Sal عن طريق إذابة 3 ملغ من Sal في 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)21.
  3. قم بتصفية 500 مل من الأسيتونيتريل النقي كروماتوجرافي (المرحلة أ المتنقلة) باستخدام غشاء عضوي 0.45 ميكرومتر.
  4. قم بإعداد 1000 مل من المرحلة المتنقلة B بإضافة 3.5 مل من الكاشف الأول إلى 1 لتر من الماء منزوع الأيونات. اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.15 باستخدام الكاشف II ، باتباع تعليمات مجموعة فحص محتوى النيوكليوتيدات (ATP و ADP و AMP) (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يتم تضمين الكاشف الأول والكاشف الثاني في مجموعة مقايسة محتوى النيوكليوتيدات (ATP وADP وAMP).
  5. تصفية المرحلة المتنقلة B باستخدام غشاء مائي 0.22 ميكرومتر.
    ملاحظة: يجب استخدام المرحلة B المتنقلة مباشرة بعد التحضير. يجب أن تكون المرحلتين المتنقلة A و B صوتنة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام لإزالة فقاعات الهواء.
  6. قم بتخفيف محلول مخزون قياسي ATP و ADP و AMP بحجم 1 ميكرومتر بالماء منزوع الأيونات للحصول على حلول قياسية من سلسلة ATP و ADP و AMP 0.5 ميكرومتر و 0.5 ميكرومتر و 0.05 ميكرومتر و 0.005 ميكرومتر.
  7. قم بتصفية سلسلة المحاليل القياسية باستخدام غشاء مرشح صغير يسهل اختراقه من نوع الإبرة 0.22 ميكرومتر.
    ملاحظة: يجب استخدام زجاجات الحقن البنية لتخزين المحاليل القياسية التسلسلية. يجب استخدام السلسلة المعدة من الحلول القياسية في أسرع وقت ممكن.

2. زراعة الخلايا

ملاحظة: تم إنشاء ثقافة خلايا HT22 ونموذج نقص الأكسجة المحفز ب CoCl2 وفقا لتقرير سابق21.

  1. استزراع خلايا HT22 عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى يتم الوصول إلى التقاء 80٪ في طبق بتري. هضم الخلايا مع 0.25٪ التربسين لمدة 1 دقيقة.
  2. البذور 2 × 105 خلايا من الخطوة 2.1 إلى ألواح 6 آبار مع DMEM كامل (مجموعة التحكم بدون علاج دوائي ) أو DMEM كامل يحتوي على الدواء (250 ميكرومتر CoCl2 ، 250 ميكرومتر CoCl2 + 10 ميكرومتر Dor ، 250 ميكرومتر CoCl2 + 20 ميكرومتر Sal ، و 250 ميكرومتر CoCl2 + 10 ميكرومتر Sal). احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    ملاحظة: تم إعداد ثلاث عينات متوازية في كل مجموعة.

3. فحص محتوى النيوكليوتيدات (ATP و ADP و AMP)

  1. أضف 1 مل من كاشف الاستخراج I إلى كل بئر في الألواح المكونة من 6 آبار من الخطوة 2.2.
    ملاحظة: يتم تضمين كاشف الاستخراج I في مجموعة فحص محتوى النيوكليوتيدات (ATP و ADP و AMP) (انظر جدول المواد).
  2. قم بتحليل الخلايا عن طريق صوتنة على حمام جليدي باستخدام جهاز تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية (الطاقة: 300 واط ، الموجات فوق الصوتية لمدة 3 ثوان ، فاصل 7 ثوان ، الوقت الإجمالي: 3 دقائق).
  3. الطرد المركزي للخلايا المحللة عند 10,304 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد عالي السرعة.
  4. انقل 0.75 مل من المادة المطفية من الخطوة 3.3 إلى أنبوب سعة 2.0 مل. أضف 0.75 مل من كاشف الاستخراج II ، ورجه واخلطه باستخدام خلاط دوامة ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 10,304 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يتم تضمين كاشف الاستخراج II في مجموعة مقايسة محتوى النيوكليوتيدات (ATP وADP وAMP).
  5. قم بتصفية المادة الطافية من الخطوة 3.4 وقم بتصفيتها باستخدام غشاء مرشح صغير يسهل اختراقه من نوع إبرة 0.22 ميكرومتر في قارورة بنية.
    ملاحظة: ATP و ADP و AMP في العينة المستخرجة غير مستقرة. يجب إجراء جميع الإجراءات التجريبية في درجات حرارة منخفضة أو على الجليد. يجب معالجة العينات واختبارها في أسرع وقت ممكن.
  6. افتح برنامج الكروماتوغرافيا وقم بتعيين المعلمات التالية: حجم الحقن: 10 ميكرولتر ؛ درجة حرارة العمود: 27 درجة مئوية ؛ معدل التدفق: 0.8 مل / دقيقة ؛ الطول الموجي للكشف: 254 نانومتر ؛ مدة الكشف: 70 دقيقة. اضبط إجراء شطف التدرج وفقا للجدول 1.
  7. انقر فوق الزر تنفيذ لحقن العينة تلقائيا واكتشاف محتوى ATP وADP وAMP في الحلول القياسية التسلسلية (الخطوة 1.7) وحلول العينة (الخطوة 3.5) وفقا للبرنامج المحدد في الخطوة 3.6.
    ملاحظة: في نهاية التجربة ، اغسل العمود الكروماتوغرافي بالمرحلة B المتنقلة بنسبة 98٪ لمنع الانسداد.
  8. ارسم المنحنيات القياسية ل ATP و ADP و AMP باستخدام برامج الرسوم البيانية والتحليل الإحصائي ، مع تركيزات قياسية تسلسلية على المحور x ومناطق الذروة على المحور y.
  9. احسب محتوى ATP وADP وAMP في العينات باستخدام معادلة المنحنى القياسية من الخطوة 3.8.

4. مقايسة التحول الحراري الخلوي (CETSA)

  1. قم بعمل لحالة خلايا HT22 الطبيعية لمدة 20 دقيقة في طبق بتري باستخدام محللات تحتوي على مثبطات البروتياز (المحللة: مثبط البروتياز = 100: 1) عن طريق سحب الخلايا بشكل متكرر.
    ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوة في حمام جليدي لمنع تدهور البروتين.
  2. اجمع محللة الخلية من الخطوة 4.1 وصوتنة على حمام جليدي باستخدام جهاز تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية (الطاقة: 300 واط ، الموجات فوق الصوتية لمدة 3 ثوان ، فاصل 7 ثوان ، الوقت الإجمالي: 3 دقائق). جهاز طرد مركزي عند 10،304 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة وجمع الطاف.
    ملاحظة: قسم المادة الطافية إلى 14 جزءا: 7 مجموعات للتكسير مع Sal و 7 مجموعات للتكعيب مع PBS كعنصر تحكم. بالنسبة للمجموعة المعالجة ب Sal ، أضف 100 ميكرولتر من المادة الطافية و 0.1 ميكرولتر من 20 ميكرومتر سالي لكل عينة. بالنسبة للمجموعة الضابطة ، أضف 100 ميكرولتر من المادة الطافية و 0.1 ميكرولتر من PBS لكل عينة.
  3. احتضان كل عينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، ثم احتضانها عند 37 درجة مئوية ، و 42 درجة مئوية ، و 47 درجة مئوية ، و 52 درجة مئوية ، و 57 درجة مئوية ، و 62 درجة مئوية ، و 67 درجة مئوية لمدة 3 دقائق باستخدام أداة التحكم في درجة حرارة تسخين المعادن.
  4. قم بالطرد المركزي للعينات من الخطوة 4.3 عند 10,304 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية وجمع المادة الطافية باستخدام ماصة.
  5. قم بقياس إجمالي تركيز البروتين للطافي من الخطوة 4.4 باستخدام مجموعة مقايسة تركيز بروتين BCA ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  6. قم بإعداد جل فصل بنسبة 10٪ باستخدام مجموعة التحضير السريع للهلام PAGE ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  7. قم بتحميل 3 ميكرولتر من علامة البروتين الملون الملطخة مسبقا و 14 ميكرولتر من العينات في آبار هلام الفصل (كمية البروتين النهائية لكل بئر: 20 ميكروغرام).
  8. قم بتشغيل الجل باستخدام المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي لمدة 1 ساعة عند 80-100 مللي فولت للحصول على بروتينات منفصلة.
  9. انقل البروتينات من الخطوة 4.8 إلى غشاء PVDF باستخدام محلول نقل الغشاء السريع وهيكل شطيرة (ورق ترشيح قطني - غشاء PVDF - هلام بروتين - ورق مرشح - قطن) عند 400 مللي أمبير لمدة 30 دقيقة.
  10. قم بسد أغشية PVDF من الخطوة 4.9 باستخدام محلول ألبومين مصل البقر (BSA) بنسبة 5٪ لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قم بإعداد محلول BSA بنسبة 5٪ عن طريق إذابة 5 مجم من مسحوق BSA في 100 مل من محلول TBST الذي يحتوي على 100 مل من محلول TBS و 0.05٪ Tween 20.
  11. احتضان أغشية PVDF من الخطوة 4.10 بجسم مضاد أولي مخفف سعة 5 مل عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: تمييع الجسم المضاد الأساسي في محلول BSA (نسبة 1: 1000).
  12. اغسل أغشية PVDF ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة 5 دقائق لكل منها لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المرتبطة.
  13. احتضان الأغشية من الخطوة 4.12 بجسم مضاد ثانوي مقترن ببيروكسيداز الفجل المخفف (HRP) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على شاكر إزالة اللون.
    ملاحظة: تمييع الجسم المضاد الثانوي المقترن ب HRP في محلول BSA (نسبة 1: 10،000).
  14. اغسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة 5 دقائق لكل منها لإزالة الأجسام المضادة الثانوية المتبقية.
  15. قم بتغطية الأغشية من الخطوة 4.14 باستخدام مطور التلألؤ الكيميائي ECL ، ثم قم بتصوير إشارة البروتين المستهدف باستخدام نظام التصوير.
    ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوة في الظلام لمنع تبريد الفلورة.
  16. تحليل وقياس القيمة الرمادية للبروتينات المستهدفة باستخدام برنامج ImageJ (انظر T able of Materials).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كانت المنحنيات القياسية ل ATP و ADP و AMP التي اكتشفها HPLC هي Y = 7006.5X - 222.99 ، Y = 5217.3X - 17.796 ، و Y = 9280.1X + 22.749 ، على التوالي (الشكل 1A-C). تم حساب محتويات النيوكليوتيدات المقاسة في كل مجموعة بواسطة HPLC باستخدام المنحنيات القياسية (الشكل 1D-I). وجد أن CoCl2 قلل بشكل كبير من مستويات ATP و ADP في خلايا HT22 مقارنة بالمجموعة الضابطة (P < 0.01 ،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الميتوكوندريا هي عضيات رئيسية تشارك في الوقاية العلاجية من HHBI23،24،25. أكدت الدراسات السابقة التي أجرتها المجموعة أن Sal ينظم تعبير بروتين AMPK و Sirt1 و HIF-1α ، مما يعزز وظيفة الميتوكوندريا العصبية ويحمي من HHBI21،24. ومع ذلك ، فإن التأثير المباشر ل Sal على النيوكليوتيدات في الخلايا الناقصة للأكسجين يتطلب مزيدا من التحقيق. بالإضافة إ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82274207 و 82474185) ، وإدارة العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (2024NSFSC1845) ، ومؤسسة العلوم لشباب إدارة العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (2023NSFSC1776) ، وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي في نينغشيا (2023BEG02012) ، ومشروع دعم المواهب الشابة التابع للجمعية الصينية للطب الصيني لعام 2024-2026 (2024-QNRC2-B07) وأبحاث Xinglin Scholar مشروع الترويج لجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (XKTD2022013 و QJJJ2024027).

مساهمة المؤلف:
صمم هذا المشروع Xiaobo Wang و Yating Zhang و Ya Huu و Rui Li و Xianli Meng. أجرى Yating Zhang و Ya Hou و Tingting Kuang التجارب وقاموا بتحليل البيانات. كتب ياتينغ تشانغ وهونغ جيانغ المخطوطة. قام شياو بو وانغ وشيانلي منغ بمراجعة المخطوطة. لقد قرأ جميع المؤلفين المخطوطة النهائية ووافقوا عليها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أسيتونيتريلعلاء الدينA104440
0.22 & ميكرو ؛ م غشاء مائيJintengJTMF0445
0.22 & micro ؛ م إبرة نوع غشاء مرشح صغير يسهل اختراقهJintengJTSFM013001
0.45 & م غشاء عضويJintengJTMF0448
برنامج Agilent OpenLab   ؛  Agilentالإصدار 2.X
الأجسام المضادة-AMPKαتقنية إشارات الخلية# 2532
الأجسام المضادة-HIF-1 & ألفا ؛تقنية إشارات الخلية# 41560
الأجسام المضادة-p-AMPK &تقنية إشارات الخلية# 50081
إشارات الخليةللأجسام المضادة-Sirt1# 2028
تقنية إشارات خليةالأجسام المضادةبيتا # 4970
مجموعة فحص تركيز البروتين BCAبوستر التكنولوجيا البيولوجية17E17B46
ألبومين مصل البقرCywin Innovation (بكين) شركة التكنولوجيا الحيوية المحدودة.SW127-02
مثبط الفوسفاتيز واسع الطيف (100 مرة)التكنولوجيا البيولوجية بوسترAR1183
العمود الكروماتوغرافيAgilentSB-C18< / sub>
CoCl2< / sub>Sigma15862
شاكر إزالة اللونKylin-BellTS-2
DorsomorphinMedChemExpress (MCE)HY-13418A
نسر Dulbecco المعدل متوسطGibco8121587
الرحلان الكهربائي عازلةNCM Biotech20230801
مصل الأبقار الجنينGibco2166090RP
الماعز المضاد للأرانب IgG H& L (TRITC)ZenBioScience Co.، Ltd.511202
برنامج GraphPad Prismبرنامج GraphPad ، LLCالإصدار 9.0.0
الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداءAgilent1260 Infinity II Prime   ؛
أجهزة طرد مركزي مبردة عالية السرعةثيرمو فيشر ScientificLegend Micro 17R
HRP مترافقة ماعز مضاد للأرانب IgG (H + L)Boster Biological Technology Co.، Ltd.خلايا BA1054
HT22قوانغتشو جينيو للتكنولوجيا الحيوية المحدودةJNO-02001
طقم تلألؤ كيميائي ECL شديد الحساسيةNCM BiotechP10300
Image J برنامجالمعاهد الوطنية للصحةv1.8.0
أداة التحكم في درجة حرارة تسخين المعادنBaiwan Electronictechnology Co.، Ltd.HG221-X3
الميثانولعلاء الدينM116118
النيوكليوتيدات (ATP و ADP و AMP) مجموعة فحص محتوىBeijing Solarbio Science & التكنولوجيا المحدودةBC5114
PAGE طقم تحضير سريع للهلامBiosharpPL566B-5
Penicillin-StreptomycinNCM BiotechC125C5
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1 مرات ؛)Gibco8120485
بروتين ملونة مسبقا (10-180 كيلو دالتون)Cywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co.، Ltd.SW176-02
عازلة تحميل البروتين (5x)البيولوجية BosterAR1112
PVDF (0.45 & mu; م)Cywin Innovation (بكين) شركة التكنولوجيا الحيوية المحدودةSW120-01
حل نقل الغشاء السريعCywin Innovation (بكين) شركة التكنولوجيا الحيوية المحدودةSW171-02
RIPA lysateBoster Biological Technology Co.، Ltd.AR0105
SalidrosideChengdu Herbpurify Co.، Ltd.RFS-H0400191102
TBS العازلةNCM Biotech23HA0102
عازلة عبر الغشاءNCM Biotech23CA2000
Trypsin (0.25٪ ، 1 & times;)HyCloneJ210045
Tween 20Shanghai Canspec Scientific Instruments Co.، Ltd.PM12012
جهاز تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتيةنينغبو Xinyi معدات الموجات فوق الصوتية المحدودةنظام التصوير JY92-IIDN
VisionworksAnalytik JenaUVP ChemStudio
خلاط دوامةKylin-BellXW-80A
تقنية علامة التكنولوجيا

المراجع

  1. Marutani, E., Ichinose, F. Sulfide catabolism ameliorates hypoxic brain injury. Nat Commun. 12 (1), 3108(2021).
  2. Chen, X., Ma, W., Li, Y. Current situation of Chinese and Western medicine research on hypoxic brain injury at high altitude. Jilin Medical J. 43 (11), 3099-3101 (2022).
  3. Huo, Y., Zhao, A., Li, X., Li, J., Wang, R. Animal models of acute plateau disease. Chinese Pharmacol Bull. 37 (01), 26-30 (2021).
  4. Netzer, N., Strohl, K., Faulhaber, M., Gatterer, H., Burtscher, M. Hypoxia-related altitude illnesses. J Travel Med. 20 (4), 247-255 (2013).
  5. Lefferts, W. K., et al. Effect of hypoxia on cerebrovascular and cognitive function during moderate intensity exercise. Physiol Behav. 165, 108-118 (2016).
  6. Burtscher, J., Mallet, R. T., Burtscher, M., Millet, G. P. Conditioning the brain: From exercise to hypoxia. Exerc Sport Sci Rev. 49 (4), 291-292 (2021).
  7. Koester-Hegmann, C., et al. High-altitude cognitive impairment is prevented by enriched environment including exercise via VEGF signaling. Front Cell Neurosci. 12, 532(2019).
  8. Coimbra-Costa, D., Alva, N., Duran, M., Carbonell, T., Rama, R. Oxidative stress and apoptosis after acute respiratory hypoxia and reoxygenation in rat brain. Redox Biol. 12, 216-225 (2017).
  9. Nair, S., et al. Neuroprotection offered by mesenchymal stem cells in perinatal brain injury: Role of mitochondria, inflammation, and reactive oxygen species. J Neurochem. 158 (1), 59-73 (2021).
  10. Rodríguez, M., Valez, V., Cimarra, C., Blasina, F., Radi, R. Hypoxic-Ischemic encephalopathy and mitochondrial dysfunction: facts, unknowns, and challenges. Antioxid Redox Sign. 33 (4), 247-262 (2020).
  11. Li, T., et al. Overexpression of apoptosis inducing factor aggravates hypoxic-ischemic brain injury in neonatal mice. Cell Death Dis. 11 (1), 77(2020).
  12. March-Diaz, R., et al. Hypoxia compromises the mitochondrial metabolism of Alzheimer's disease microglia via HIF1. Nature Aging. 1 (4), 385-399 (2021).
  13. Aabdien, A., Mallard, C., Hagberg, H. Mitochondrial dynamics, mitophagy and biogenesis in neonatal hypoxic-ischaemic brain injury. FEBS Lett. 592 (5), 812-830 (2018).
  14. Bai, X. L., Deng, X. L., Wu, G. J., Li, W. J., Jin, S. Rhodiola and salidroside in the treatment of metabolic disorders. Mini-Rev Med Chem. 19 (19), 1611-1626 (2019).
  15. Ji, R., et al. Salidroside alleviates oxidative stress and apoptosis via AMPK/Nrf2 pathway in DHT-induced human granulosa cell line KGN. Arch Biochem Biophys. 715, 109094(2022).
  16. You, L., Zhang, D., Geng, H., Sun, F., Lei, M. Salidroside protects endothelial cells against LPS-induced inflammatory injury by inhibiting NLRP3 and enhancing autophagy. BMC Complement Med. 21 (1), 146(2021).
  17. Yang, S. X., et al. Salidroside alleviates cognitive impairment by inhibiting ferroptosis via activation of the Nrf2/GPX4 axis in SAMP8 mice. Phytomedicine. 114, 154762(2023).
  18. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  19. Yang, H., et al. Black soybean peptide mediates the AMPK/SIRT1/NF-κB signaling pathway to alleviate Alzheimer's-related neuroinflammation in lead-exposed HT22 cells. Int J Biol Macromol. 286, 138404(2025).
  20. Yoon, H., Shin, S. H., Shin, D. H., Chun, Y. S., Park, J. W. Differential roles of Sirt1 in HIF-1α and HIF-2α mediated hypoxic responses. Biochem Bioph Res Co. 444 (1), 36-43 (2014).
  21. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  22. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nat Protoc. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  23. Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. Eur J Pharmacol. 912, 174617(2021).
  24. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).
  25. Kristián, T. Metabolic stages, mitochondria and calcium in hypoxic/ischemic brain damage. Cell Calcium. 36 (3-4), 221-233 (2004).
  26. Carling, D. AMPK signalling in health and disease. Curr Opin Cell Biol. 45, 31-37 (2017).
  27. Steinberg, G. R., Hardie, D. G. New insights into activation and function of the AMPK. Nat Rev. Mol Cell Bio. 24 (4), 255-272 (2023).
  28. Zhang, N., et al. Restoration of energy homeostasis under oxidative stress: Duo synergistic AMPK pathways regulating arginine kinases. PLoS Genet. 19 (8), e1010843(2023).
  29. Wang, Y., et al. Irisin ameliorates neuroinflammation and neuronal apoptosis through integrin αVβ5/AMPK signaling pathway after intracerebral hemorrhage in mice. J Neuroinflamm. 19 (1), 82(2022).
  30. Liu, H., Li, Y., Xiong, J. The role of hypoxia-inducible factor-1 alpha in renal disease. Molecules. 27 (21), 7318(2022).
  31. Wu, H., et al. Mitochondrial dysfunction promotes the transition of precursor to terminally exhausted T cells through HIF-1α-mediated glycolytic reprogramming. Nat Commun. 14 (1), 6858(2023).
  32. Joo, H. Y., et al. NADH elevation during chronic hypoxia leads to VHL-mediated HIF-1α degradation via SIRT1 inhibition. Cell Biosci. 13 (1), 182(2023).
  33. Ham, P. B., Raju, R. Mitochondrial function in hypoxic ischemic injury and influence of aging. Prog Neurobiol. 157, 92-116 (2017).
  34. Dal Cortivo, G., Barracchia, C. G., Marino, V., D'Onofrio, M., Dell'Orco, D. Alterations in calmodulin-cardiac ryanodine receptor molecular recognition in congenital arrhythmias. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 127(2022).
  35. Wang, Z. Q., et al. Cyclovirobuxine D inhibits triple-negative breast cancer via YAP/TAZ suppression and activation of the FOXO3a/PINK1-Parkin pathway-induced mitophagy. Phytomedicine. 136, 156287(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

AMPK Sirt1 HIF 1 ATP

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.