مقالة منهجية

استخدام قليل النيوكليوتيدات الاصطناعية المعدلة لفحص إنزيمات استقلاب الحمض النووي

DOI:

10.3791/66930

⸱

يوليو 5, 2024

 ,  ,  ,  , 
1University of Waikato, 2ArcticZymes Technologies ASA

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لفحص إنزيمات استقلاب الحمض النووي ، باستخدام أمثلة على إنزيمات ligase و nuclease و polymerase. يستخدم الفحص قليل النيوكليوتيدات الموسومة بالفلورسنت وغير المسماة والتي يمكن دمجها لتشكيل دوبلكس تحاكي أضرار الحمض النووي الريبي و / أو الحمض النووي أو وسيطة المسار ، مما يسمح بتوصيف سلوك الإنزيم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سمح توفر مجموعة من قليل النيوكليوتيدات الاصطناعية المعدلة من البائعين التجاريين بتطوير مقايسات متطورة لتوصيف الخصائص المتنوعة لإنزيمات استقلاب الحمض النووي التي يمكن تشغيلها في أي مختبر بيولوجيا جزيئية قياسي. جعل استخدام الملصقات الفلورية هذه الطرق في متناول الباحثين الذين لديهم معدات PAGE الكهربائية القياسية وجهاز تصوير يدعم الفلورسنت ، دون استخدام مواد مشعة أو الحاجة إلى مختبر مصمم لتخزين وإعداد المواد المشعة ، أي مختبر ساخن. يمكن أن تؤدي الإضافة الاختيارية للتعديلات القياسية مثل الفسفرة إلى تبسيط إعداد الفحص ، في حين يمكن استخدام الدمج المحدد للنيوكليوتيدات المعدلة التي تحاكي تلف الحمض النووي أو المواد الوسيطة لاستكشاف جوانب محددة من سلوك الإنزيم. هنا ، يتم عرض تصميم وتنفيذ المقايسات لاستجواب العديد من جوانب معالجة الحمض النووي بواسطة الإنزيمات باستخدام oligonucleotides الاصطناعية المتاحة تجاريا. وتشمل هذه قدرة الأربطة على الانضمام أو النيوكليازات على تحلل الهياكل الهجينة المختلفة للحمض النووي والحمض النووي الريبي ، واستخدام العامل المساعد التفاضلي بواسطة إنزيم ربط الحمض النووي ، وتقييم قدرة ربط الحمض النووي للإنزيمات. تتم مناقشة العوامل التي يجب مراعاتها عند تصميم ركائز النوكليوتيدات الاصطناعية ، ويتم توفير مجموعة أساسية من oligonucleotides التي يمكن استخدامها لمجموعة من فحوصات إنزيم الحمض النووي ، والبلمرة ، ومقايسات إنزيم النيوكلياز.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتطلب جميع أشكال الحياة إنزيمات معالجة الحمض النووي لتنفيذ العمليات الحيوية الأساسية، بما في ذلك التضاعف والنسخ وإصلاح الحمض النووي (DNA). الوظائف الأنزيمية الرئيسية لهذه المسارات هي البلمرة ، التي تولد نسخا من جزيئات الحمض النووي الريبي / الحمض النووي ، والأربطة التي تنضم إلى ركائز عديد النوكليوتيد ، والنيوكليازات التي تحللها ، واللوليكات و topoisomerases ، التي تذوب دوبلكس الحمض النووي أو تغير طوبولوجيتها1،2،3،4،5،6،7،8،9،10. بالإضافة إلى ذلك ، توفر العديد من هذه الإنزيمات أدوات جزيئية أساسية لتطبيقات مثل الاستنساخ والتشخيص والتسلسل عالي الإنتاجية11،12،13،14،15.

يمكن تحديد الخصائص الوظيفية والحركية وخصائص الركيزة لهذه الإنزيمات باستخدام ركائز الحمض النووي / الحمض النووي الريبي المسماة التي تنتجها قلة النيوكليوتيدات التلدين. تم تحقيق ركائز التتبع والمنتجات تقليديا من خلال إدخال ملصق مشع (32P) إما في نهاية الشريط 5 بوصات ، والذي يمكن اكتشافه بعد ذلك بواسطة فيلم فوتوغرافي أو باستخدام نظام تصوير الفوسفور16,17. في حين أن الركائز ذات العلامات الإشعاعية توفر ميزة زيادة الحساسية التجريبية ولا تغير الخواص الكيميائية للنيوكليوتيد ، فإن المخاطر الصحية المحتملة من العمل مع النظائر المشعة شجعت على تطوير وسم الحمض النووي غير المشع لتوفير بديل أكثر أمانا للكشف عن الحمض النووي والحمض النووي الريبي18،19،20. من بين هؤلاء ، يبرز الكشف عن التألق ، بما في ذلك الكشف المباشر عن التألق ، والتألق الذي تم حله بمرور الوقت ، ومقايسات التبريد لنقل الطاقة / التألق باعتباره الأكثر تنوعا21،22،23،24. تتيح المجموعة الواسعة من الفلوروفورات تصميمات مختلفة لركائز الحمض النووي / الحمض النووي الريبي التي تتميز بمراسلين فريدين على كل قليل النوكليوتيد25. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استقرار الفلوروفورات ، عند مقارنته بالنظائر المشعة ، يسمح للمستخدمين بإنتاج والحفاظ على كميات كبيرة من ركائز الحمض النووي الموسومة بالفلورسنت19. يمكن تحضين هذه الركائز ذات العلامات الفلوروفور بالبروتين محل الاهتمام ، جنبا إلى جنب مع مجموعات مختلفة من العوامل المساعدة للمعادن والنيوكليوتيدات ، لتحليل نشاط الارتباط و / أو الإنزيم. يمكن ملاحظة تصور الارتباط أو النشاط باستخدام قنوات صبغة الفلوروفور المختلفة مع نظام تصوير هلام. نظرا لأن قليل النيوكليوتيدات المسمى بالفلورسنت فقط سيكون مرئيا باستخدام هذه التقنية ، فإن أي زيادة أو نقصان في حجم قليل النوكليوتيد المسمى سيكون من السهل متابعته. يمكن أيضا تلطيخ المواد الهلامية بعد ذلك ، باستخدام أصباغ تلطيخ الحمض النووي لتصور جميع أشرطة الحمض النووي الموجودة على الجل.

أربطة الحمض النووي المتعددة هي إنزيمات تنضم إلى شظايا الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، وتحفز ختم الفواصل عن طريق تكوين رابطة فوسفاتية ثنائية الإستر بين ترميني الحمض النووي المفسفر 5 بوصات و 3 'OH من الحمض النووي. يمكن تقسيمها إلى مجموعتين وفقا لمتطلبات ركيزة النوكليوتيدات. تم العثور على الأربطة المعتمدة على NAD المحفوظة بشكل كبير في جميع البكتيريا26 بينما يمكن تحديد الإنزيمات المتنوعة هيكليا المعتمدة على ATP من خلال جميع مجالات الحياة 8,27. تلعب أربطة الحمض النووي دورا مهما في معالجة شظايا أوكازاكي أثناء النسخ المتماثل بالإضافة إلى مشاركتها في مسارات إصلاح الحمض النووي المختلفة ، مثل إصلاح النوكليوتيدات واستئصال القاعدة ، من خلال ختم النكات والخدوش التلقائية التي تترك بعد الإصلاح 8,10. تظهر أربطة الحمض النووي المختلفة قدرات متفاوتة على الانضمام إلى المطابقات المختلفة لفواصل الحمض النووي ، بما في ذلك الشقوق في دوبلكس ، وفواصل مزدوجة تقطعت بهم السبل ، وعدم تطابق ، وفجوات ، بالإضافة إلى هجين الحمض النووي الريبيوالحمض النووي 28،29،30. يمكن تجميع مجموعة متنوعة من الركائز القابلة للربط عن طريق تلدين قليل النوكليوتيدات مع فوسفات 5 'لتوليد 5' و 3' تيرميني جنبا إلى جنب في حمض نووي مزدوج31،32،33. الطريقة الأكثر شيوعا للتحليل هي الدقة بواسطة urea PAGE في تنسيق فحص نقطة النهاية. ومع ذلك ، فقد تضمنت الابتكارات الحديثة استخدام الرحلان الكهربائي للهلام الشعري ، والذي يسمح بإنتاجية عالية34 ، والتنميط الطيفيالكتلي 35 ، بالإضافة إلى مقايسة منارة جزيئية متجانسة ، والتي تسمح بالمراقبة التي تم حلهابمرور الوقت 36.

الخطوة الأولى في تفاعل الربط هي أدينيل إنزيم الليجاز بواسطة أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) أو نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NAD) ، مما ينتج عنه إنزيم تساهمي وسيط. الخطوة الثانية في التفاعل هي أدينيل ركيزة الحمض النووي على الطرف 5' من موقع النيك ، والذي يتبعه ربط خيوط الحمض النووي. يتم تنقية العديد من إنزيمات الليغاز التي يتم التعبير عنها بشكل مؤتلف في الإشريكية القولونية في شكل الأدينيل ، وبالتالي ، فهي قادرة على ربط الأحماض النووية بنجاح دون إضافة عامل مساعد نيوكليوتيد. وهذا يجعل من الصعب تحديد نوع العامل المساعد للنيوكليوتيدات الذي تحتاجه لربط الأحماض النووية. بالإضافة إلى وصف المقايسات لتقييم نشاط ربط الحمض النووي ، يتم أيضا تقديم طريقة لتحديد استخدام العامل المساعد بشكل موثوق عن طريق إزالة أدينيل الإنزيم باستخدام ركائز غير مصنفة.

النيوكليازات هي مجموعة كبيرة ومتنوعة من الإنزيمات المعدلة للحمض النووي / الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي التحفيزي الذي يشق روابط الفوسفاتيستر بين الأحماض النووية37. وظائف إنزيم النيوكلياز مطلوبة في تكرار الحمض النووي وإصلاحه ومعالجة الحمض النووي الريبي ويمكن تصنيفها حسب خصوصية السكر للحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو كليهما. تحلل النوكليازات الداخلية روابط ثنائي الإستر الفوسفاتية داخل شريط الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، بينما تحلل إكسونوكلياز الحمض النووي / الحمض النووي الريبي نيوكليوتيد واحد في كل مرة من الطرف 3 'أو 5' وقد تفعل ذلك إما من 3' إلى 5' أو 5' إلى 3' نهاية الحمض النووي38.

في حين أن العديد من بروتينات النيوكلياز غير محددة وقد تشارك في عمليات متعددة ، فإن البعض الآخر محدد للغاية لتسلسل معين أو تلف الحمض النووي6،39،40. تستخدم النيوكليازات الخاصة بالتسلسل في مجموعة واسعة من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية ، مثل الاستنساخ ، والطفرات ، وتحرير الجينوم. النيوكليازات الشائعة لهذه التطبيقات هي نيوكليازات التقييد41 ، نيوكليازات إصبع الزنك42 ، نيوكليازات المستجيب الشبيهة بالمنشط النسخي ، ومؤخرا ، نيوكليازات كريسبر43 الموجهة بالحمض النووي الريبي. تم تحديد النيوكليازات الخاصة بالضرر مؤخرا ، مثل EndoMS nuclease ، والتي تتميز بخصوصية عدم التطابق في الحمض النووي من خلال مجال النيوكلياز الشبيه ب RecB الخاص بعدم التطابق 5,44. تم إجراء فحوصات نشاط النيوكلياز ، تاريخيا ، كمقايسات متقطعة مع ركائز مشعة. ومع ذلك ، بالإضافة إلى عيوبها الأخرى ، لا تسمح هذه بتحديد الموقع الذي يتم قطعه بواسطة بروتين nuclease ، وهو أمر ممكن عند استخدام ركائز تحمل علامة الفلورسنت45,46. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير مقايسات النيوكلياز المستمرة التي تعمل باستخدام أصباغ الحمض النووي المختلفة التي تتفاعل مع الحمض النووي في حالات مختلفة. على سبيل المثال ، إصدار إشارة فلورية أعلى عند التفاعل مع dsDNA مقارنة بحالته غير المنضمة ، أو الارتباط على وجه التحديد بالحمض النووي الريبي القصير47. تستخدم فحوصات النيوكلياز المستمرة الأخرى دبابيس شعر الحمض النووي مع مجموعة الفلوروفور على 5 'وإخماد في الطرف 3' بحيث يزداد التألق مع تحلل قليل النوكليوتيد بسبب فصل الفلوروفور والمروي48. في حين أن هذه المقايسات تسمح للمرء بتوصيف حركية البروتينات المهينة للحمض النووي ، فإنها تتطلب معرفة سابقة بوظيفة الإنزيم والركيزة وتقتصر أيضا على الإنزيمات التي تغير شكل الحمض النووي لإحداث اختلاف في ارتباط الصبغة. لهذا السبب ، لا تزال فحوصات نقطة النهاية التي تحل منتجات النيوكلياز الفردية مرغوبة لتوفير نظرة ثاقبة لتعديلات الحمض النووي الناتجة عن نشاط البروتين.

هنا ، يتم تقديم إجراء مفصل لتصميم قليل النيوكليوتيدات ذات العلامات الفلورية DNA / RNA والتي يمكن خلطها ومطابقتها لتوليد ركائز لاختبار نشاط إنزيمات النيوكلياز والبلمرة والليجاز الجديدة. إن التحقق من صحة هذه المجموعة الأساسية من تسلسل قليل النوكليوتيد يبسط التصميم التجريبي ويسهل التنميط الاقتصادي لمجموعة واسعة من الوظائف الأنزيمية دون الحاجة إلى شراء عدد كبير من الركائز المخصصة. يتم توفير إجراء مفصل لتشغيل مقايسة إنزيم معالجة الحمض النووي القياسية مع هذه الركائز ، باستخدام مثال نشاط ربط الحمض النووي والتعديلات لفحص وتحليل إنزيمات النيوكلياز والبلمرة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إعطاء اختبار معدل لتحديد خصوصية العامل المساعد لإنزيم ربط الحمض النووي بدقة عالية ، وتستخدم مجسات مزدوجة العلامات لتقييم تجميع الروابط متعددة المكونات. أخيرا ، تتم مناقشة التعديلات على تنسيق الفحص الأساسي للسماح باستخدامه لتحديد تفاعلات البروتين والحمض النووي مع نفس الركائز بواسطة مقايسة تحول الحركة الكهربية (EMSA).

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصميم وشراء قليل النوكليوتيدات

ملاحظة: صمم قليل النيوكليوتيدات أحادية الشريط ليتم تجميعها وتلدينها في الدوبلكس المطلوب. يجب أن يحمل واحد أو أكثر من الخيوط في دوبلكس جزءا من الفلورسنت لتتبع معالجة قليل النوكليوتيد بواسطة الإنزيم محل الاهتمام. وترد في الجدول 1 مجموعة أساسية من التسلسلات المفردة التي يمكن تجميعها لمجموعة من الأنشطة.

  1. قم بدمج التعديلات المحددة اللازمة للإنزيم محل الاهتمام كما هو موضح أدناه.
    1. بالنسبة لركائز إنزيم ربط الحمض النووي (الشكل 1): قم بتجميع أبسط ركيزة من ثلاثة قليل النيوكليوتيدات: حبلا مانحا مفسفرا 5 بوصات (NL2) ، وشريط متقبل يحمل علامة FAM مقاس 5 بوصات (NL1) ، ومكمل يربط بين الاثنين (NL3).
      1. تأكد من فسفرة الخيوط التي توفر نهاية 5 بوصات من الشق القابل للشفط قبل تجميع المزيج الرئيسي للركيزة في الخطوة 2. اطلب هذا كتعديل على NL2 (كما هو موضح في الجدول 1) أو استخدم الفسفرة الأنزيمية مع كيناز متعدد النوكليوتيد T4 بعد تعليق قليل النيوكليوتيدات.
      2. قم بتضمين الفسفرة الطرفية 5 'ل NL6 و NL8 ، والتي تشتمل على تكملة الفواصل المزدوجة التي تقطعت بها السبل الموضحة في الشكل 1A (NL6 / NL7 و NL8 / NL9) لأن هذا يشبه إلى حد كبير الركيزة الطبيعية المنتجة من نوكلياز داخلي مقيد. استخدم ركيزة مزدوجة التسمية لتحديد النطاقات النسبية للربط للتجميعات متعددة الأجزاء (انظر الخطوة 6).
      3. قم بتغيير الشريط المكمل لإنتاج عدم تطابق (NL10) وفجوات (NL11).
        ملاحظة: يتم تصوير الاختلافات على الركيزة البسيطة في الشكل 1A. من الممكن استخدام تسلسلات أخرى لإنتاج نطاق أوسع من عدم التطابق أو فجوات أطول عن طريق تغيير الموضع الذي تحته خط.
      4. استبدل قليل النيوكليوتيدات في الحمض النووي (DNA) بقليل النيوكليوتيدات في الحمض النووي الريبي.
        ملاحظة: يتم تصوير الاختلافات على الركيزة البسيطة في الشكل 1B. يمكن إنشاء نطاق أوسع من دوبلكس الحمض النووي / الحمض النووي الريبي من خلال مجموعات إضافية من مجموعة الأساس المعطاة هنا لتوليد ، على سبيل المثال ، فواصل مزدوجة الشريط تحتوي على كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي. ويرد مثال على هذا الاختلاف في الخطوة 6 أدناه، حيث يتم استخدام استراتيجية التسمية المزدوجة.
    2. بالنسبة لركائز بوليميراز الحمض النووي: قم بتجميع قليل النيوكليوتيدات NL1 و NL3 المدرجة في الجدول 1 لإعطاء اختبار بسيط لتمديد التمهيدي. تحقق من الجوانب الإضافية لنشاط البلمرة عن طريق إدخال تعديلات على خيوط NL1 (التمهيدي) أو NL3 (القالب).
      1. دمج نظائر القاعدة التالفة في قليل النوكليوتيد NL3 قبل الموضع 20 لتحديد القدرة على تجاوز الآفات التالفة على حبلا القالب.
      2. دمج نظائر القاعدة التالفة في قليل النوكليوتيد NL1 في الموضع 20 لتحديد القدرة على تمديد التمهيدي التالف.
      3. استخدم إما RNL1 أو RNL3 في الطباعة على الوجهين للتحقيق في امتداد التمهيدي للحمض النووي الريبي أو استخدام قالب الحمض النووي الريبي.
    3. بالنسبة لركائز النيوكلياز (الشكل 2): قم بتجميع قليل النيوكليوتيدات لإعطاء مجموعة غير شاملة من الركائز المزدوجة والمفردة التي تقطعت بها السبل (الشكل 2Ai) بالإضافة إلى مجموعة من التقاطعات المرفرفة والمفلطحة (الشكل 2Aii) والركائز التالفة (الشكل 2B).
      1. للتحقق من أنشطة الريبونوكلياز ، استبدل بشكل متكرر NL1 و NL2 و NL3 ب RNL1 و RNL2 و RNL3. استخدم إصدارات RNA إضافية من HJ5 و HJ6 لتوسيع هذه المجموعة بشكل أكبر.
      2. استخدم قليل النيوكليوتيدات MD5 و MD6 و MD9 التي تحتوي على تعديل مركزي يحاكي الضرر التأكسدي أو وسيط إصلاح غير أساسي أو منتج نزع الأمين (الشكل 2 ب). ستكتشف الركائز انشقاق الخيط في هذا الموضع. قم بتسمية الشريط المكمل NL3 بفلوروفور متعامد مثل TAMRA للكشف عن الانقسام المزدوج (انظر الخطوة 6).
      3. استخدم الملصقات المتعامدة للمكمل للكشف عن القطع المزدوج الذي تقطعت به السبل في المواقع غير المتطابقة على كل من المسبار (NL5 و ND9) والخيوط المتممة (MD10 و NL10).
  2. اطلب قليل النيوكليوتيدات الاصطناعية التي تتضمن الفلوروفورات ذات الصلة والتعديلات الأخرى من بائع تجاري.
    ملاحظة: مقياس توليف 100 نانومتر وتنقية HPLC بعد التوليف مناسبان للفحوصات الموصوفة.

2. تجميع وتلدين دوبلكس الحمض النووي

  1. إعادة تعليق وتخفيف قليل النوكليوتيدات
    1. قبل الفتح ، يقوم جهاز الطرد المركزي بقليل النيوكليوتيدات المجففة بالتجميد في أنابيب 2 مل بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي على الطاولة لمدة 2-5 دقائق لضمان وجود الحمض النووي في قاع الأنبوب.
    2. قم بإعداد مخزون رئيسي يبلغ 100 ميكرومتر عن طريق إعادة تعليق قليل النوكليوتيدات في المخزن المؤقت TE (10 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) ، 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)). تأكد من إعادة تعليق قليل النوكليوتيدات تماما عن طريق الدوامة اللطيفة المتكررة والطرد المركزي القصير بأقصى سرعة.
    3. قم بإعداد مخزون 10 ميكرومتر عن طريق تخفيف حصة المخزون الرئيسي باستخدام مخزن TE المؤقت. قم بتخفيف مخزون 10 ميكرومتر بماء فائق النقاء (ماء MQ) لإعداد مخزون عامل بتركيزات 0.5 ميكرومتر أو 0.7 ميكرومتر أو 2.5 ميكرومتر كما هو موضح في الجدول 2.
  2. تجميع وتلدين الخلطات الرئيسية للتفاعل
    1. استخدم مخزون العمل لتكوين الخلطات الرئيسية للتفاعل باستخدام المجموعات الواردة في الجدول 2 والأحجام الواردة في الجدول 3. بالنسبة لمقايسة ربط الحمض النووي القياسية ومعظم المقايسات الأخرى الموصوفة هنا ، فإن التركيب العازل النهائي هو 50 mM Tris pH 8.0 ، 50 mM NaCl ، 10 mM Dithiothreitol (DTT) مع 10 mM Mg ككاتيون ثنائي التكافؤ.
    2. قم بتلدين قليل النيوكليوتيدات في أنبوب PCR أو أنبوب طرد مركزي دقيق عن طريق التسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق باستخدام كتلة تسخين أو جهاز تدوير حراري. اتركيه ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة (الأحجام <1 مل) إلى 1 ساعة (الأحجام >1 مل). للحصول على قليل النيوكليوتيدات الأطول (>40 nt) ، قم بإجراء تبريد أبطأ باستخدام جهاز تدوير حراري مع منحدر سفلي من 95 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية على مدار 45 دقيقة ، أو قم بتعويم الأنبوب الذي يحتوي على خليط التلدين في دورق سعة 1 لتر من الماء المغلي واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
    3. أضف العوامل المساعدة للنيوكليوتيدات والمكونات العازلة الأخرى الحساسة للحرارة إلى المزيج الرئيسي بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة. استخدم خليط التفاعل النهائي مباشرة للفحص عن طريق إضافة الإنزيم (انظر الخطوة 3 أدناه) أو خزنه في -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

3. إعداد الفحص القياسي

  1. تجميع وبدء رد فعل الفحص
    1. اجمع بين 22.5 ميكرولتر من مزيج الركيزة الرئيسي المثير للاهتمام مع 2.5 ميكرولتر من إنزيم ربط الحمض النووي أو أي إنزيم آخر مهم في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل. قم بتشغيل التفاعلات في نسختين أو ثلاث نسخ ، خاصة إذا كانت النتائج سيتم قياسها كميا.
    2. قم بتضمين عنصر تحكم خال من البروتين (مخزن مؤقت فقط) في عينات الفحص. لا تقم بتضمين عناصر تحكم العامل المساعد في هذه المرحلة ، إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: يمكن تخزين الإنزيمات عند -20 درجة مئوية في 50٪ v / v glycerol ، مما يسمح بسحبها مباشرة من المحلول. تأكد من خلط محاليل الإنزيم مع الجلسرين جيدا قبل الإضافة ، إما عن طريق السحب للخلط أو عن طريق الدوامة اللطيفة.
  2. نقل ردود الفعل على الفور إلى جهاز PCR على حرارة 25 درجة مئوية واحتضانها لمدة 30 دقيقة. تختلف درجة الحرارة والمدة حسب الظروف المثلى لنشاط الإنزيم.
  3. إخماد التفاعلات عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من صبغة التحميل (95٪ فورماميد ، 0.5 متر حمض إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، بروموفينول أزرق) واحتضانها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

4. تحليل نتائج الفحص

  1. تحضير المواد الهلامية Tris-Borate-EDTA (TBE)-Urea PAGE كما هو موضح أدناه.
    1. تحضير مخزون من 20 ٪ مادة الأكريلاميد ، 7 M اليوريا ، و 1x TBE الحل. بالنسبة لمجموعة قليل النوكليوتيد الموصوفة هنا ، استخدم محلول الأكريلاميد / مكرر بنسبة 29: 1 للحصول على الدقة المثلى.
    2. بالنسبة لهلام واحد ، امزج 10 مل من 20٪ أكريلاميد و 7 M محلول يوريا مع 100 ميكرولتر من APS (10٪) و 3 ميكرولتر من رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TMED) وصب في عجلة هلام.
  2. بعد أن يصلب الجل ، قم بتشغيل العينات على جل اليوريا TBE عند 45 - 55 درجة مئوية.
    1. قم بتشغيل الجل مسبقا في مخزن مؤقت 1x TBE لمدة 30 دقيقة عند 10 مللي أمبير لكل هلام مع تسخين خارجي.
    2. قم بإزالة اليوريا الزائدة في آبار الجل عن طريق التنظيف باستخدام 1x TBE باستخدام ماصة المراعي.
    3. قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل تفاعل وقم بتشغيله عند 10 مللي أمبير لمدة 1.0-1.5 ساعة مع التسخين الخارجي.
  3. تصور الجل على جهاز التصوير بالإعدادات الصحيحة للفلوروفور المختار. بالنسبة إلى FAM ، استخدم مجموعة مرشح تعطي إثارة / انبعاثا عند 495/519 نانومتر ، والتي يتم تخزينها كإعداد مسبق في معظم أجهزة التصوير.
  4. حدد شدة النطاق للمنتج والركيزة باستخدام برنامج معالجة الصور مع جهاز التصوير ، أو برنامج خارجي مثل ImageJ49,50 واحسب النسبة المئوية للمنتج باستخدام الصيغة
    صيغة النسبة، P/(P+S)×100، تستخدم لحساب النسبة المئوية في تحليل البيانات.
    حيث P هي القيمة المتكاملة لنطاق المنتج ، و S هي المنطقة المتكاملة لنطاق الركيزة. في حالة مثال تفاعل إنزيم الربط DNA ، يعمل شريط الناتج عند 40 نيوكليوتيدات (nt) وشريط الركيزة عند 20 nt.

5. إزالة أدينيل من إنزيم الحمض النووي لاختبار خصوصية العامل المساعد

  1. تحضير خلطات التفاعل الرئيسية
    1. قم بإعداد مجموعة واحدة من المزيج الرئيسي الذي يحتوي على قليل النوكليوتيد NL1 المسمى FAM كما هو موضح في الجدول 4. قم بإعداد مجموعة ثانية تحتوي على قليل النوكليوتيد NL1 بدون ملصق FAM ، كما هو موضح في الجدول 4.
    2. بشكل منفصل ، سخني كلا من DNA duplexs إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وابرد لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة عند 25 درجة مئوية. لا تقم بإضافة عامل مساعد النوكليوتيدات إلى أي من المزيج الرئيسي.
  2. تجميع وبدء تفاعل إزالة الأدينيل
    1. قم بإعداد تفاعل واحد لإزالة الأدينيل لكل نوع / تركيز عامل مساعد ليتم اختباره من خلال الجمع بين 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي غير المسمى مع 2.5 ميكرولتر من إنزيم الليجاز.
    2. قم بإعداد أنابيب إضافية كتحكم بدون عامل مساعد ولا تحكم في البروتين (2.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت المضاف بدلا من الإنزيم).
    3. احتضان التفاعلات عند درجة حرارة محددة للنشاط الأمثل للإنزيم ، لمدة 1-2 ساعة. يمكن زيادة وقت الحضانة إذا كان الإنزيم لا يزال أدينيل.
  3. قم بتشغيل تفاعل الربط مع العامل المساعد.
    1. أضف 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي المسمى و 2.5 ميكرولتر من العوامل المساعدة للنيوكليوتيدات المرغوبة (على سبيل المثال ، ATP أو NAD أو ADP أو GTP) مباشرة إلى تفاعل إزالة الأدينيل (0.1-1 mM التركيز النهائي).
    2. أضف 2.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل إلى عنصر التحكم في العامل المساعد بدون نيوكليوتيدات.
    3. احتضان التفاعلات لنفس الفترة الزمنية ودرجة الحرارة المستخدمة سابقا. إخماد وتصور كما هو موضح في الخطوة 4.

6. استخدام ركائز مزدوجة التسمية لربط الجبيرة أو التجميع متعدد الأجزاء

  1. تصميم وشراء قليل النوكليوتيد مع جزء فلورسنت له طيف إثارة / انبعاث مختلف عن الفلوروفور المستخدم بالفعل.
    1. في الإعداد الموصوف هنا ، استخدم قليل النوكليوتيد NL2 (TAMRA) الذي يحتوي على 5-كربوكسي تترا ميثيل رودامين (TAMRA) في نهاية 3 '(الجدول 1).
  2. قم بتجميع المزيج الرئيسي كما هو موضح أدناه.
    1. اجمع بين مكونات التفاعل الموصوف في الخطوة 2 ، بما في ذلك النسب المتساوية لجميع oligonucleotides المستخدمة في التجميع ، وكذلك الكاتيونات العازلة وثنائية التكافؤ.
    2. يصلب عن طريق التسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والتبريد عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة - 1 ساعة. أضف العامل المساعد والإنزيم واحتضانه كما هو موضح في الخطوة 3.
  3. قم بتشغيل وتصوير العينات كما هو موضح في الخطوة 4 باستخدام القنوات المناسبة لزوج الفلوروفور في الركيزة. في حالة FAM و TMRA ، هذه هي قنوات Fluorescein (FITC) و Tetramethyl rhodamine (TRITC) الموجودة في معظم أجهزة التصوير.

7. تقييم ارتباط الحمض النووي بواسطة مقايسة تحول الحركة الكهربائية (EMSA) على الجل الأصلي

  1. قم بإعداد جل TBE PAGE الأصلي بنسبة 10٪ كما هو موضح أدناه.
    1. الجمع بين 2.5 مل من 40 ٪ مادة الأكريلاميد ، 1 مل من 10x TBE ، 100 ميكرولتر من 10 ٪ APS ، 3 ميكرولتر من TMED ، و 6.5 مل من الماء MQ ويلقي في عجلة هلام.
  2. قم بتجميع تفاعل الربط كما هو موضح أدناه.
    1. قم بتجميع ركيزة EMSA وفقا للجدول 5 بحيث يتم تضمين EDTA (10 mM) وحذف أيونات المعادن.
    2. اجمع بين 20 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للركيزة EMSA مع 5 ميكرولتر من البروتين في أنبوب PCR. قم بتضمين عينة خالية من البروتين. احتضان لمدة 30 دقيقة على 25 درجة مئوية.
  3. تحليل بواسطة الكهربائي الأصلي كما هو موضح أدناه.
    1. أضف 5 ميكرولتر من صبغة التحميل الأصلية 5x (100 mM EDTA ، 0.25٪ بروموفينول أزرق ، 25٪ v / v جلسرين ، وماء MQ حتى 1 مل) إلى العينات.
    2. قم بالتحميل على الجل المحضر وقم بتشغيله عند 60 فولت لمدة 2-3 ساعات مع التبريد عن طريق دوران الماء حتى تصبح واجهة الصبغة على ارتفاع بضعة سنتيمترات فوق نهاية الجل.
    3. تصور وتحليل المواد الهلامية كما هو موضح في الخطوة 4.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الربط بواسطة إنزيم ربط الحمض النووي
سيؤدي النشاط الأنزيمي لإنزيم ربط الحمض النووي إلى زيادة في حجم قليل النوكليوتيد المسمى بالفلورسنت عند تصوره على هلام اليوريا PAGE. في حالة الركائز لكل من ربط الحمض النووي والحمض النووي الريبي المدرجة في الجدول 2 ، فإن هذا يتوافق مع مضاعفة الحجم من 20 nt إلى 40 nt (الشكل 3A). يمكن تحديد النشاط الأمثل للإنزيم عن طريق تغيير الظروف مثل درجة الحرارة أو تركيز البروتين أو وقت الحضانة (الشكل 3 ب) العوامل المساعدة للنيوكليوتيدات والعوامل المساعدة المعدنية (الشكل 3C). يمكن مقارنة الأنشطة النسبية للربط على ركائز مختلفة بالتوازي (الشكل 3D).

يتم التعبير عن القياس الكمي لنطاقات المنتج والركيزة كنسبة مئوية من إجمالي الركيزة المربوطة ، وكما هو موضح في الشكل 3 ، يمكن استخدامها لتقييم النشاط المحدد للإنزيم أو لتحديد النشاط الأمثل مثل تفضيل الكاتيون ثنائي التكافؤ أو درجة الحرارة أو الرقم الهيدروجيني.

إن رابط الحمض النووي البكتيري DV-1-1-Lig (الشكل 3) قادر على ربط ركائز الحمض النووي وعدم تطابق النيك ويمكنه استخدام كل من المغنيسيوم والمنغنيز لنشاط الربط ، مع تفضيل المغنيسيوم. يتم توفير مزيد من التفاصيل عن هذا الإنزيم في51.

تمديد التمهيدي بواسطة بوليميراز الحمض النووي
سيؤدي نشاط بوليميراز الحمض النووي من خلال تمديد التمهيدي المسمى بالفلورسنت 20 nt إلى زيادة في الحجم تصل إلى 40 nt عند استخدام مجموعة oligonucleotide المعروضة هنا (الشكل 4A). ستظهر المنتجات الموسعة جزئيا كسلم من المنتجات حتى حجم القالب (الشكل 4B والشكل 4C). أدى اختبار تمديد التمهيدي الموضح هنا (الشكل 4C) إلى التوليف الكامل لشريط التمهيدي.

التحلل بواسطة النيوكلياز
ينتج عن نشاط النيوكلياز انخفاض في حجم قليل النوكليوتيد المسمى بالفلورسنت عند تصوره على هلام اليوريا PAGE. قد ينتج عن النيوكليازات ذات النشاط الداخلي المحدد منتج واحد 20 nt (الشكل 5A-C). سينتج عن النيوكليازات ذات نشاط exonuclease قليل النيوكليوتيدات المسمى بالفلورسنت بأحجام مختلفة (الشكل 5D-F). هنا ، يتم عرض نتائج بروتين نوكلياز metagenome البكتيري في أنتاركتيكا ، والذي يظهر نشاطا محددا للنوكلياز الداخلي على ركيزة الموقع غير القاعدية المزدوجة التي تقطعت بها السبل ونشاط exonuclease غير المحدد على الركيزة أحادية الشريط (الشكل 5C والشكل 5F ، على التوالي).

إزالة الأدينيل من Ligase ومقايسة استخدام العامل المساعد للنيوكليوتيدات
يتم تنقية العديد من إنزيمات الليغاز المعبر عنها بشكل مؤتلف في حالة أدينيل بالفعل من ATP أو NAD الكاسحة من مضيفها51،52،53،54،55. تعد إزالة وسيط AMP التساهمي هذا ضروريا لتحديد دقيق لنطاق العوامل المساعدة للنيوكليوتيدات التي يمكن أن يستخدمها الإنزيم لربط ركائز الحمض النووي51. إن دوران إنزيم ligase adenylated مع الركيزة غير المسمى في حالة عدم وجود عامل مساعد النوكليوتيدات الخارجية سوف يستنفد وسيط adenylation. باستخدام ركائز الحمض النووي الموسومة بالفلورسنت وإضافة عامل مساعد للنيوكليوتيدات في الخطوة الثانية فقط ، فإن أي منتج ربط مرئي عند استخدام قناة فلورية (Fluorescein-FITC) على جهاز تصوير الهلام هو نتيجة الأدينيل مع العامل المساعد للنيوكليوتيدات المضاف في هذه الخطوة.

تظهر فحوصات النشاط التي تم إنشاؤها باستخدام إنزيم ربط الحمض النووي البكتيري المعبر عنه في نظام الإشريكية القولونية أنه تم تنقيته في شكل ما قبل الأدينيل وأظهر قدرة خلفية على ربط الحمض النووي المشقوق بدون عامل مساعد إضافي (الشكل 6Ai-ii). تؤدي إضافة ATP إلى الرباط الأدينيلي إلى زيادة كمية الناتج المرتبط المتكون في التفاعل ، لكن هذا لا يمكن الاعتماد عليه دائما لأن هذا النشاط القاعدي قد يعطي انطباعا غير صحيح عن استخدام العامل المساعد واسع الطيف أو يمكن أن تؤدي الإضافات الإضافية للعوامل المساعدة للنيوكليوتيدات إلى التفاعل إلى تثبيط ربط الركيزة. من خلال احتضان الرباط أولا بنسخة غير موسومة من ركيزة الحمض النووي المشقوقة ، يتم قلب AMP ، ولا يلاحظ أي ربط على ركيزة DNA المسمى ما لم تتم إضافة ATP إلى التفاعل. يوضح اختبار النشاط الثاني (الشكل 6 ب) أن إنزيم ربط الحمض النووي منزوع الأدينيل قد حسن نشاط الربط على ركيزة الحمض النووي النيكي مع إضافة ATP و ADP. هناك أيضا بعض التحسن في الربط مع إضافة GTP ، وهو أكبر من ربط الخلفية الذي شوهد في عنصر التحكم بدون عامل مساعد. الربط الذي لوحظ في التفاعلات مع NAD مشابه للربط الذي يظهر في تفاعلات التحكم في عدم وجود عامل مساعد ، والذي يستبعد NAD كعامل مساعد للربط.

نتائج الفحص المزدوج المسمى
يمكن استخدام الفلوروفورات المتعامدة لإنشاء نشاط في أجزاء مختلفة من الركيزة المعقدة. يوضح المثال في الشكل 7 نشاط إنزيم ربط الحمض النووي R2D56 الموصوف مؤخرا مقارنة بإنزيم ربط الحمض النووي T4 على ازدواج الحمض النووي / الحمض النووي الريبوزي المتجبير. تم الكشف عن ربط مستقبل الحمض النووي بقسم مانح الحمض النووي الريبي من الركيزة باستخدام 6-FAM ، بينما تم الكشف عن ربط مستقبل الحمض النووي الريبي بمتبرع الحمض النووي باستخدام 5-TAMRA (الشكل 7 أ). يمكن تقييم المدى النسبي لربط الحمض النووي بطرفي ركيزة الحمض النووي الريبي من خلال وجود شريط منتج مع مضان في كل من قناتي 6-FAM و 5-TAMRA ، والذي يظهر باللون الأصفر في الصورة المركبة ، في حين أن 6-FAM و 5-TAMRA الفرديين أخضر وأصفر ، على التوالي (الشكل 7B). كما هو مفصل في منشور سابق56 ، كان R2D ligase فقط قادرا على ربط الحمض النووي إلى 5'end من الحمض النووي الريبي ، بينما كان كلا الرباطين قادرين على ربط الحمض النووي إلى 3'end من الحمض النووي الريبي. عند ربط جزيئي الحمض النووي بالحمض النووي الريبي في مخاليط تفاعل واحد ، يمكن ل R2D ligase ربط oligos DNA بطرفي الحمض النووي الريبي ، حيث يتحول الشريط لأعلى ويلاحظ تغير اللون إلى اللون الأصفر (الشكل 7C).

يستخدم المثال الثاني في الشكل 8 طريقة وضع العلامات المزدوجة لتوضيح ارتباط نيوكليوتيدات قليلة النيوكليوتيدات المتعددة عند أس هيدروجيني مختلف. تم استخدام الركيزة ، التي تم تجميعها من خليط من سبعة oligonucleotides ، لإظهار قدرة ligase R2D على تجميع شظايا قصيرة. يحتوي الشريط 5 بوصات على حبلا 14 nt المسمى بالفلوروفور FAM ، بينما يحتوي الشريط المكمل على فلوروفور TAMRA في الطرف 3 'من قليل النوكليوتيد 16 nt. يمكن رؤية الربط الناجح من خلال نطاقات أعلى إضافية ل FAM (الأخضر) oligo و TAMRA (الأحمر). يعطي تداخل كلا الفلوروفورين شريط النيوكليوتيدات باللون الأصفر كخيوط مربوطة تماما من نفس الحجم.

نتائج ارتباط الحمض النووي من إنزيم ربط الحمض النووي باستخدام EMSA
ينتج عن ارتباط إنزيم ربط الحمض النووي بالحمض النووي المشقوق المفسفر معقد مركب يعمل بوزن جزيئي أعلى من قليل النوكليوتيد وحده (الشكل 9 أ). يوضح هنا ارتباط إنزيم الربط البكتيري المعتمد على جزيء ATP بركيزة الحمض النووي (DNA). عند تركيزات البروتين العالية ، ترتبط غالبية ركيزة الحمض النووي المسمى وترى في نطاقات الوزن الجزيئي الأعلى. عند تركيزات البروتين المنخفضة ، تسود ركيزة الحمض النووي الحرة (الشكل 9 ب).

مخطط ركائز الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ليغازي ؛ ، صريح ، متماسك ، عدم تطابق ، فجوة. خيوط هجينة من الحمض النووي الريبي.
الشكل 1: مخططات ركائز الحمض النووي المختلفة المصممة لاختبار النشاط الأنزيمي للإنزيم . تمثل النجوم وضع العلامات مع 6- كربوكسي فلوريسئين في النهاية 5 '(5' FAM). يشار إلى الخيوط الموسومة بخط أسود أو أزرق داكن / أحمر (في حالة دوبلكس DNA / RNA) ، بينما يشار إلى الأجزاء غير المسماة من دوبلكس الركيزة بخط رمادي أو أزرق فاتح / أحمر (في حالة ازدواج DNA / RNA). الخيوط الموسومة هي 20 nt ، وإذا تم ربط الخيوط ، فإنها تشكل منتجا 40 nt. يشار إلى المواقع المفسفرة 5 بوصات بواسطة P في دائرة. يتم تسمية خيوط قليل النوكليوتيد ، ويشار إلى الأسماء في الجدول 1 والجدول 2. أ: تصميم ركائز DNA مزدوجة الشريط مع أنواع مختلفة من الفواصل، وتستخدم لاختبار النشاط الأنزيمي لأربطة الحمض النووي (DNA). (ب) تصميم ركائز مزدوجة الشريط من الحمض النووي الريبوزي (RNA) والحمض النووي الريبوزي (RNA)/الحمض النووي (DNA) تتضمن قليل النيوكليوتيدات في الحمض النووي (DNA) والحمض النووي الريبوزي (RNA). تحتوي الركائز على موقع واحد وتستخدم لاختبار قدرة الأربطة على إغلاق فواصل دوبلكس الحمض النووي الريبي / الحمض النووي. يمثل الخط الأحمر قليل النيوكليوتيدات في الحمض النووي الريبي، ويمثل الخطان الأزرقان قليل النيوكليوتيدات في الحمض النووي (DNA). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخطط ركيزة الحمض النووي: نوكلياز ، معدل ، تالف. الأنواع: Ds ، Ss ، الذيل ، الرفرف ، البديل. عدم التطابق الأساسي.
الشكل 2: مخططات ركائز الحمض النووي المختلفة المصممة لاختبار النشاط الأنزيمي للنيوكلياز. تمثل النجوم وضع العلامات مع 6- كربوكسي فلوريسئين في محطة 5 '(5' FAM). يشار إلى الخيوط الموسومة بخط أسود ، بينما يشار إلى الأجزاء غير المسماة من دوبلكس الركيزة بخط رمادي. يشار إلى المواقع المفسفرة 5 بوصات بواسطة P في دائرة. يتم تسمية خيوط قليل النوكليوتيد ، ويشار إلى الأسماء في الجدول 1 والجدول 2. (أ) تصميم ركائز ذات أجزاء مزدوجة ومفردة تقطعت بها السبل. (ب) تم تعديل تصميم ركائز الحمض النووي المزدوجة الشريطين لتوليد اللوحات التي تقطعت بها السبل في نهاية 3 أو 5 (رفرفة 3 '، رفرفة 5' ، أو رفرفة كلا الطرفين (مفلطحة)). (ج) تصميم ركائز مزدوجة الشريط تتضمن قواعد تالفة أو عدم تطابق في موضع مركزي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عملية ربط الحمض النووي ، تحليل هلام PAGE. تفاعل الإنزيم والركيزة ، نتائج الرحلان الكهربائي.
الشكل 3: اختبار نشاط الربط لإنزيم الربط البكتيري المعتمد على الأدينوسين الثلاثي الفوسفات DV-1-1-Lig. (أ) رسم تخطيطي لمقايسات الإنزيم لنشاط الليجاز على ركائز الحمض النووي (DNA) مع تحليل النتائج على هلام TBE urea PAGE . تمثل النجوم وضع العلامات مع 6-كربوكسي فلوريسئين في محطة 5 '(5' FAM). يشار إلى الخيوط الموسومة بخط أسود ، بينما يشار إلى الأجزاء غير المسماة من دوبلكس الركيزة غير المرئية أثناء التحليل بخطوط رمادية. (ب) التحديد الكمي للربط بواسطة DV-1-1-Lig على الحمض النووي المشقوق في نقاط زمنية مختلفة. تم تنفيذ النشاط ضد كل ركيزة في نسختين. تم تحضين التفاعلات لفترات زمنية مختلفة (0.5 ساعة ، 1 ساعة ، 2 ساعة ، 3 ساعات ، و 4 ساعات) عند 25 درجة مئوية ، مع تركيز بروتين نهائي 4 ميكرومتر ، وتركيز ATP نهائي 1 mM ، وتركيز 10 mM النهائي لأيون المغنيسيوم. ج: ربط ركيزة الحمض النووي المشقوقة بالمغنيسيوم (Mg) أو المنغنيز (Mn). أجريت التفاعلات لمدة 3 ساعات ، عند 25 درجة مئوية ، مع تركيز ATP النهائي 1 mM وتركيزات 10 mM النهائية لأيون الفلز. د: نتائج الربط على ركائز الحمض النووي المختلفة. أجريت التفاعلات لمدة 8 ساعات ، عند 20 درجة مئوية ، مع تركيز البروتين النهائي 2 ميكرومتر ، والتركيز النهائي 1 mM من ATP ، والتركيز النهائي 10 mM للمغنيسيوم. يشار إلى إضافة البروتين إلى التفاعل برمز زائد (+). يشار إلى تفاعلات التحكم بواسطة C ، ويشار إلى عدم وجود البروتين الموجود برمز ناقص (-). يشار إلى المنتج (40 nt) والركيزة (20 nt) بأسهم حمراء. تم تصور نتائج فحوصات النشاط باستخدام نظام تصوير. تم تحديد النطاقات من خلال تكامل الكثافة باستخدام برنامج ImageJ49 وتم إنشاء الرسوم البيانية باستخدام برنامج الرسوم البيانية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخطط تفاعل بوليميراز الحمض النووي. تغيير طبيعة هلام PAGE. تحليل المنتج ، عملية تمديد الحمض النووي.
الشكل 4: مقايسة إنزيم بلمرة الحمض النووي (DNA). أ: رسم تخطيطي لمقايسة تمديد التمهيدي على ركيزة الحمض النووي (DNA). تمثل النجوم وضع العلامات مع 6-كربوكسي فلوريسئين في محطة 5 '(5' FAM). يشار إلى الخيوط الموسومة بخط أسود ، بينما يشار إلى الأجزاء غير المسماة من دوبلكس الركيزة غير المرئية أثناء التحليل بخطوط رمادية. (ب) رسم تخطيطي لنتائج هلام TBE Urea PAGE المتوقعة تظهر زيادة في طول التمهيدي المسمى مع إضافة النيوكليوتيدات. (ج) مثال على التمديد التمهيدي مع إنزيم بوليميراز الحمض النووي (DNA) لجزء من الإشريكية القولونية Klenow. يشار إلى إضافة البروتين إلى التفاعل برمز زائد (+). حارة 1 ، 12.5 ش ؛ حارة 2 ، 2.5 ش ؛ حارة 3 ، 1.25U. يشار إلى تفاعلات التحكم بواسطة C ، ويشار إلى عدم وجود البروتين الموجود برمز ناقص (-). تم إجراء التفاعلات لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية واحتوت على 5 mM MgCl2 و 50 mM Tris pH 8.0 و 50 mM NaCl2 و 1 mM DTT و 0.25 mM dNTPs. يشار إلى المنتج (40 nt) والركيزة (20 nt) بأسهم حمراء. تم تصور نتائج فحوصات النشاط باستخدام نظام تصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحليل انقسام الحمض النووي ، مخطط هلام PAGE ؛ تأثير درجة الحرارة ، تأثير الأيونات. تصور نشاط الإنزيم.
الشكل 5: اختبار نشاط نيوكلياز ميتاجينوم ميتاجنينوم البكتيري في أنتاركتيكا باستخدام ركائز ومعادن ودرجات حرارة حضانة مختلفة. أ: نشاط نوكلياز داخلي تخطيطي محدد لبروتين نيوكلياز على الركيزة القاعدية (المشار إليها بالرمز x). تمثل النجوم وضع العلامات مع 6-كربوكسي فلوريسئين في محطة 5 '(5' FAM). تمثل الخطوط السوداء الشرائط المسماة، وتمثل الخطوط الرمادية شرائط الحمض النووي غير المسماة. يظهر القطع المحدد بواسطة النيوكلياز على الجانب الأيمن من الموقع غير القاعدي ولكنه قد يحدث أيضا على الجانب الأيسر. (ب) رسم تخطيطي لهلام اليوريا PAGE الذي يغير طبيعته يظهر ركيزة غير مقطوعة (40 nt) في حالة عدم وجود بروتين يشار إليه برمز ناقص (-) والمنتج المقطوع (20 nt) ، في وجود نيوكلياز يشار إليه برمز زائد (+). (ج) مثال على هلام TBE urea PAGE يوضح نتائج نشاط نوكلياز نوكلياز داخلي محدد على ركيزة DNA مزدوجة الشريط ذات موقع غير قاعدي. تم إجراء الفحص بتركيز بروتين 1.0 ميكرومتر و 1 مللي متر MgCl2. تم إجراء تفاعلين للتحكم عند 20 درجة مئوية ، أحدهما بدون بروتين (بئر 1) والآخر بدون معدن (بئر 2). تم تحضين التفاعلات لمدة 5 ساعات عند زيادة درجات الحرارة من 1 درجة مئوية إلى 50 درجة مئوية ، كما هو موضح أعلاه صورة هلام. يشار إلى إضافة البروتين برمز زائد (+) ، ويشار إلى غياب البروتين برمز ناقص (-). يشار إلى الركيزة والمنتج بأسهم حمراء. د: رسم تخطيطي يوضح نشاط إكسونوكلياز غير متخصص لبروتين نيوكلياز على ركيزة أحادية الشريط. تمثل النجوم وضع العلامات مع 6-carboxyfluorescein في المحطة النهائية 5 '(5'FAM). تمثل الخطوط السوداء الخيوط المسماة. ينتج عن القطع غير النوعي للنيوكلياز خيوط موسومة بأطوال متفاوتة (<39 nt). (ه) رسم تخطيطي يمثل هلام PAGE لليوريا الذي يغير طبيعته يظهر الركيزة غير المصقولة (40 nt) ، حيث لم تتم إضافة بروتين (-) ، ويظهر الركيزة المقطوعة بأطوال متفاوتة ، حيث تمت إضافة البروتين (+) التي قد تنتج عن نشاط إكسونوكلياز غير محدد. (F) تظهر المواد الهلامية TBE urea PAGE مثالا على نشاط إكسونوكلياز غير محدد لنفس نيوكلياز الميتاجينوم في أنتاركتيكا مع ركيزة مفردة تقطعت بها السبل. تم إجراء الفحص عند 20 درجة مئوية لمدة 4 ساعات مع البروتين بتركيز نهائي قدره 1.5 ميكرومتر وتركيز نهائي لأيون المعدن عند 10 مللي مول. يشار إلى أيون الفلز المستخدم أعلى الصورة. يشار إلى إضافة البروتين برمز زائد (+) ، ويشار إلى غياب البروتين برمز ناقص (-). يشار إلى الركيزة (40 nt) بالسهم الأحمر ، ويشار إلى المنتجات ذات الأطوال المختلفة بواسطة المشبك الأحمر. تم تصور نتائج جميع تفاعلات النيوكلياز باستخدام نظام التصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخطط كفاءة الربط وتحليل الهلام ، تأثير ATP والعوامل المساعدة ، نتائج نشاط DNA ligase.
الشكل 6: نتائج ربط ركيزة الحمض النووي المشقوقة بواسطة نسخ من إنزيم الربط البكتيري بالأدينيل ومنزوع الأدينيل. (أ) تحديد كمية الربط بواسطة إنزيم إنزيم إنزيم الليجاز الأدينيل ومنزوع الأدينيل، مع جزيء ATP أو بدونه. تمثل النقاط على التمثيل البياني متوسطات كل تفاعل يتضاعف. يتم تضمين أشرطة الخطأ القياسية. ب) جل TBE urea PAGE يظهر نتائج الربط على ركيزة الحمض النووي بواسطة إنزيم ligase adenylated و de-adenylated ، مع وبدون ATP. تم إجراء ردود الفعل في ثلاث نسخ. تم تحضين الإنزيم منزوع الأدينيل مسبقا لمدة 2 ساعة عند 25 درجة مئوية مع ركيزة الحمض النووي غير المسماة وإنزيم 0.1 ميكرومتر ، تليها حضانة 1 ساعة مع ركيزة الحمض النووي الموسومة. لم يتم تحضين إنزيم الأدينيل مسبقا مع الركيزة غير الموصوفة. أضيف جزيء ATP (1 mM) إلى التفاعلات إلى جانب إضافة ركيزة الحمض النووي (DNA) الموصوفة. (ب) ط: القياس الكمي للربط بواسطة الرباط منزوع الأدينيل على الحمض النووي النيكي مع عوامل مساعدة مختلفة (ATP و NAD و ADP و GTP). تمثل النقاط على التمثيل البياني متوسطات كل تركيز. يتم تضمين أشرطة خطأ الانحراف المعياري. ب) صفحة اليوريا TBE تظهر نتائج الربط بواسطة الرباط ، مع وبدون إضافة عوامل مساعدة مختلفة. تم تنفيذ النشاط ضد كل ركيزة في نسختين. تم تحضين التفاعلات مسبقا لمدة 2 ساعة عند 25 درجة مئوية مع ركيزة الحمض النووي غير المسماة ، وبروتين 4 ميكرومتر ، وأيون المغنيسيوم 5 مللي مول ، تليها حضانة لمدة 4 ساعات مع إضافة ركيزة الحمض النووي الموسومة ، و 5 mM من المغنيسيوم ، وعوامل مساعدة مختلفة عند التركيز النهائي 1 mM. يشار إلى إضافة البروتين إلى التفاعل برمز زائد (+). تم استخدام تفاعلات التحكم التي لا تحتوي على البروتين (الضوابط ، C) أو العامل المساعد (لا يوجد عامل مساعد). يشار إلى المنتج (40 nt) والركيزة (20 nt) بأسهم حمراء. تم تصور نتائج فحوصات النشاط باستخدام نظام تصوير. تم قياس النطاقات من خلال تكامل الكثافة باستخدام برنامج ImageJ49. تم إنشاء الرسوم البيانية باستخدام برنامج الرسوم البيانية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحليل ربط الحمض النووي باستخدام ملصقات FAM / TAMRA: رسم تخطيطي ، نتائج هلام ، مخطط هلام PAGE ، نشاط ليغازي.
الشكل 7: ربط قليل النيوكليوتيدات قصيرة النورسنت ذات العلامات الفلورية بأحد طرفي أوليغو الحمض النووي الريبوزي المفسفر 5 بوصات ، ويتم وضعه بواسطة قوالب الحمض النووي. (أ) رسم تخطيطي لربط الحمض النووي الريبوزي (DNA-RNA) يوضح كيف يمكن تصور نواتج الربط الممكنة باستخدام استراتيجية وضع العلامات المزدوجة. (ب) رسم تخطيطي للمنتجات المحتملة المتوقع رؤيتها على هلام Urea-PAGE مصور في قناتين. ج: النتائج التجريبية من الربط الفلوري المزدوج. تم اختبار تفاعلات الربط باستخدام T4 DNA Ligase و R2D ligase ، سواء في تفاعلات معزولة حيث تم ربط الحمض النووي إما بنهاية 5 '(حارة 2-4) أو 3'end (حارة 5-7) من الحمض النووي الريبي أو في تفاعل واحد حيث تم ربط كل من oligonucleotides الحمض النووي في نفس خليط التفاعل (حارة 8-10). لم يكن هناك أي إنزيم مضاد للبروتين (NPC). ظروف التفاعل وقليل النيوكليوتيدات المحددة المستخدمة في هذا المثال هي نفسها المعطاة في56. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخطط ربط الحمض النووي مع نتائج الرحلان الكهربائي التي توضح كفاءة الربط عبر مستويات الأس الهيدروجيني.
الشكل 8: ربط عدة شرائح قليلة النوكليوتيد القصيرة مع ثلاثة متغيرات R2D عند درجة حموضة مختلفة. (أ) رسم تخطيطي لاستراتيجية الربط متعدد الأجزاء. (ب) هلام تمثيلي يوضح اعتماد الأس الهيدروجيني لتجميع متعدد الأجزاء ، تم تصويره مع كل من قنوات FAM و TAMRA. الحارة C لا تتحكم في الإنزيم ، الممرات 1-3 درجة الحموضة 6.0 ، الحارة 4-6 درجة الحموضة 6.5 ، الحارة 7-9 درجة الحموضة 7 ، والحارة 10-12 درجة الحموضة 7.5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخطط الرحلان الكهربائي ونتيجة الهلام التي توضح تباين ربط البروتين والركيزة مع انخفاض تركيز البروتين.
الشكل 9: نتائج EMSA. جل TBE PAGE التخطيطي والأصلي لمقايسة تحول الحركة الكهربائية (EMSA) التي تصور نشاط الربط لربط الحمض النووي المعتمد على ATP (مصدره بيانات metagenome من McMurdo Dry Valleys ، أنتاركتيكا) على ركيزة الحمض النووي. (أ) رسم تخطيطي لنشاط ربط EMSAs / DNA بواسطة إنزيم ربط الحمض النووي على ركيزة الحمض النووي النيكية. يتم تصور نتائج الربط على جل TBE PAGE غير متغير الطبيعة. تهاجر ركائز الحمض النووي المرتبطة بإنزيم ligase بشكل أبطأ عبر الجل ، بينما تهاجر الركائز الخالية من الإنزيم بشكل أسرع ، مما يؤدي إلى تحول حجم الشريط (الصناديق الصفراء) المصورة على الجل. نظرا لأن الركائز يتم تصورها على هلام غير مسخ ، ستبقى oligonucleotides ملدنة ، مما يسمح للشريط المسمى FAM (النجم الأصفر) بالتواجد على كل من الركائز الحرة والمقيدة. يمكن استخدام تدرج تركيز البروتين لتحديد تركيز البروتين من أجل الارتباط الأمثل. (ب) تصور EMSA على هلام TBE PAGE أصلي ، يوضح قدرة ربط إنزيم الحمض النووي المعتمد على ATP بركيزة الحمض النووي بتركيزات مختلفة من البروتين. تم تحضين الإنزيم بركيزة الحمض النووي المشقوقة لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية ، مع تركيز ATP النهائي 1 mM و 40 mM EDTA. تم استخدام ثلاثة تركيزات مختلفة من البروتين (5.5 ميكرومتر ، 2.3 ميكرومتر ، و 1.5 ميكرومتر). نفدت التفاعلات على جل TBE الأصلي بنسبة 10٪ ، مع صبغة تحميل أصلية في التفاعلات. تم نفاد العينات التي تحتوي على البروتين في ثلاث نسخ لتركيزات البروتين المختلفة. تحتوي ممرات التحكم على ركيزة DNA مشقوقة مع 1 mM ، ATP النهائي ، و EDTA ولكن بدون بروتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تسلسلات قليل النوكليوتيدات لركيزة الحمض النووي المستخدمة لبناء ركائز الفحص. يشار إلى الأضرار بالخط العريض وتحتها خط. تم وضع خط تحت مواضع عدم التطابق والفجوات في الازدواج النهائي. الاختصارات: 5 '6-كربوكسي فلوريسين (5' FAM) ، 8-أوكسو-ديوكسيجوانوزين (8OxodG) ، رباعي هيدروفوران أساسي (dSpacer). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: توليفات قليل النيوكليوتيدات المستخدمة لتجميع الخلطات الرئيسية لمقايسات الإنزيم المختلفة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: إعداد مزيج الفحص الرئيسي مع ما يصل إلى أربعة قليل النيوكليوتيدات. انظر الجدول 2 لتركيبات قليل النوكليوتيدات لاستخدامها في ركائز الفحص المختلفة والنص للحصول على تفاصيل ظروف التفاعل. كحد أدنى ، مطلوب قليل النوكليوتيد المسمى - يشار إلى أجزاء إضافية من الازدواج بين قوسين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: مكونات المزيج الرئيسي المسمى وغير المسمى لصنع الحمض النووي المزدوج. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 5: إعداد الخلطات الرئيسية EMSA لمجموعات مختلفة من الدوبلكس. انظر الجدول 3 لتركيبات قليل النوكليوتيد لاستخدامها في ركائز EMSA المختلفة والنص للحصول على تفاصيل ظروف التفاعل. تم تصميم ركائز EMSA باستخدام نفس قليل النيوكليوتيدات مثل تلك الخاصة بمقايسات النشاط. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
تصميم وشراء قليل النوكليوتيد: عند شراء قليل النوكليوتيدات لتشكيل مزدوج ، من الضروري مراعاة تصميم التسلسل. يوصى باستخدام أداة محلل oligo للتنبؤ بخصائص تسلسل النوكليوتيدات ، مثل محتوى GC ، ودرجة حرارة الانصهار ، والبنية الثانوية ، وإمكانية dimerization ، قبل طلب57.

تجميع وتلدين دوبلكس الحمض النووي: عند تحضير دوبلكس RNA / RNA-DNA ، يجب توخي الحذر لمنع تلوث RNase باستخدام الكواشف والمياه الخالية من RNase أو إضافة مثبط RNAse (طالما أن الإنزيم قيد التحقيق ليس هو نفسه RNAse). يجب معالجة المعدات والقفازات ومساحة مقاعد البدلاء بمحلول إزالة التلوث RNase قبل تجميع الخلطات الرئيسية لتجنب تدهور قليل النوكليوتيدات58. يمكن تكوين المخزونات الرئيسية من oligonucleotides الحمض النووي الريبي على دفعات أصغر في حالة التلوث.

تتطلب أربطة الحمض النووي (DNA) دائما عاملا مساعدا للنيوكليوتيدات، إما ATP أو NAD، بتركيز نهائي يتراوح بين 0.1 و1 mM. تتطلب بوليميراز الحمض النووي dNTPs لتخليق الشريط ، وعادة ما تضاف بنسب متساوية المولية عند 50 ميكرومتر من كل منها. عند تحضير الخلطات الرئيسية لدوبلكس الليجاز والبلمرة ، يجب إضافة العوامل المساعدة للنيوكليوتيدات ، مثل ATP و NAD و dNTPs ، إلى المزيج الرئيسي بعد تسخين الخليط وتبريده إلى درجة حرارة الغرفة ، لأنها حساسة للحرارة.

يتطلب المخزن المؤقت 10x لتلدين قليل النوكليوتيدات إضافة DTT ، الذي له عمر نصف قصير ويحتاج بشكل مثالي إلى تحضيره طازجا أو مجمدا قبل الاستخدام. يمكن تحضير حصص أصغر من المخزن المؤقت 10x مسبقا وتخزينها عند 4 درجات مئوية ، مع إضافة DTT قبل الاستخدام.

يجب تخزين مخزون قليل النوكليوتيد والخلطات الرئيسية عند -20 درجة مئوية للاستخدام على المدى الطويل ، وقليل النوكليوتيدات أو الخلطات ذات العلامات الفلورية الملفوفة بورق القصدير لمنع التبييض الضوئي للفلوروفور. لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة التي يمكن أن تضر بسلامة قليل النوكليوتيد ، ينصح بإعداد واستخدام أحجام أصغر (>1 مل).

إعداد الفحص وتحليل النتائج: يعد تضمين الضوابط أمرا ضروريا للتفسير الصحيح لنتائج الفحص. يجب استخدام عنصر تحكم خال من البروتين (ركيزة الحمض النووي مع محلول عازل) للتأكد من أن النشاط الظاهر على الركيزة هو نتيجة الإنزيم. في حالة النيوكلياز ، سيؤدي تدهور الركيزة الخارجية إلى انخفاض نطاقات الوزن الجزيئي أو السلم في التحكم ، بينما في حالة الليغاز أو البلمرة ، سيؤدي تمسخ الازدواج غير الكامل إلى نطاق تحكم عالي الوزن الجزيئي. يتم توفير تحكم إيجابي في حجم المنتج المتوقع في الجدول 2 ويجب تضمينه للتحقق من حجم المنتج الصحيح.

تم وصف المعلمات المهمة في الرحلان الكهربائي الناجح لمنتج الفحص في بروتوكول سابق59. وتشمل هذه التأكد من أن النسبة المئوية للأكريلاميد مناسبة لحجم الركيزة واستخدام صبغة تحميل مناسبة اعتمادا على حجم الركيزة ونوع الجل المطلوب لتصور النتائج. تعمل صبغة التتبع بروموفينول الأزرق بالحجم التقريبي لقليل النوكليوتيد المكون من 10 قواعد ، وبالتالي فهي مناسبة لمجموعة قليل النوكليوتيد الموصوفة هنا ؛ ومع ذلك ، إذا كان هناك شريط من الصبغة متداخل مع منتج الفلورسنت أو نطاقات الركيزة عند استخدام نيوكليوتيدات أقصر ، فيمكن استبدال صبغة التتبع ب Xylene cyanol ، والتي تعمل بشكل أبطأ60.

لضمان دقة جيدة لنطاقات الركيزة / المنتج ، يجب تسخين خزان الهلام خارجيا باستخدام حمام مائي أو عن طريق تشغيل جهد عالي (على سبيل المثال ، 180 فولت). يعد تشغيل جل اليوريا PAGE قبل التشغيل لمدة 30 دقيقة على الأقل وشطف الآبار باستخدام ماصة لإزالة اليوريا الزائدة أمرا ضروريا للحصول على أشرطة حادة ومستقيمة مناسبة للقياس الكمي.

للقياس الكمي للركائز والمنتجات ، يجب تحويل مجموعة من 20٪ -80٪ من إجمالي المواد إلى منتج للسماح بالتكامل الدقيق لأشرطة هلام الفلورسنت. في حالة اختبار إنزيم جديد ، يوصى بتشغيل تدرج تركيزات البروتين للسماح بإجراء قياسات لاحقة في هذا النطاق. تحتوي العديد من أجهزة التصوير الفلورية على ميزات تكامل النطاق المضمنة التي يمكن استخدامها لهذا الغرض. إذا كنت تستخدم برنامجا خارجيا مثل ImageJ49 ، فتأكد من تصدير صورة الهلام بجودة عالية بتنسيق tiff.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذه التقنية
تصميم وشراء قليل النوكليوتيدات: تعتبر قليل النوكليوتيدات الواردة في هذا البروتوكول نقاط انطلاق مفيدة ويمكن توسيعها ، كما هو مقترح في قسم الطرق ، عن طريق تغيير تسلسلات قليل النوكليوتيد ودمج التعديلات.

إعداد الفحص القياسي وتحليل النتائج: التجارب التجريبية ضرورية عند اختبار نشاط إنزيم جديد لأن ظروف التفاعل المثلى ستختلف بين البروتينات المختلفة. تهدف المعلمات الواردة في هذا البروتوكول إلى أن تكون نقطة انطلاق فقط. قد تختلف عوامل مثل تركيز الإنزيم ودرجة حرارة التفاعل ومدة الحضانة والعامل المساعد وتكوين المخزن المؤقت / الأس الهيدروجيني أثناء المزيج الرئيسي وتجميع تفاعل الفحص. تركيزات العامل المساعد مهمة بشكل خاص لأن زيادة العوامل المساعدة للنيوكليوتيدات أو أيونات المعادن يمكن أن تكون مثبطة ، وينصح باختبار مجموعة من تركيزات كل منها. بالنسبة لبوليميراز الحمض النووي ، تتراوح تركيزات dNTP الموصى بها من 20 إلى 200 ميكرومتر إجمالا ، ومع ذلك ، فإن تركيزات dNTP العالية تقلل من الدقة61. وبالمثل ، عادة ما يتم فحص أربطة النوكليوتيدات المتعددة بعامل مساعد نيوكليوتيد 0.1-1.0 mM ، لكن التركيزات المفرطة تتسبب في تراكم الحمض النووي إلى أدينيلات وتثبيط التفاعل62.

يستخدم البروتوكول القياسي هنا Mg ككاتيون ثنائي التكافؤ. ومع ذلك ، فإن بعض الإنزيمات أكثر نشاطا مع المنغنيز (Mn) أو الزنك (Zn). يجب تحضير الخلطات الرئيسية التي تحتوي على Mn أو Zn بمخزن مؤقت منخفض الأس الهيدروجيني (<7.5) ، ويجب إضافة المعادن بعد التسخين. يجب استخدام الخلطات الرئيسية في نفس اليوم لتجنب هطول الأمطار وتثبيط نشاط الإنزيم.

يمكن استخدام المواد المضافة ، بما في ذلك عوامل الازدحام مثل البولي إيثيلين جلايكول (PEG) أو المثبتات مثل ألبومين مصل الأبقار ، لزيادة نشاط بعض الإنزيمات63,64. يجب إضافتها بعد خطوة التلدين بسبب قابليتها للحرارة. يجب أن تكون جميع الكواشف المشتقة بيولوجيا من درجة البيولوجيا الجزيئية لتجنب إدخال النيوكليازات الملوثة.

حجم المخزن المؤقت لإخماد الفورماميد المستخدم في هذا البروتوكول مناسب للمجموعة الأساسية من قليل النيوكليوتيدات. ومع ذلك ، بالنسبة لقليل النيوكليوتيدات الأطول ، يجب زيادة حجم الفورماميد إلى ما بين 10 ميكرولتر و 20 ميكرولتر لضمان الفصل الكامل للشريط ، ويمكن تبريد التفاعلات المروية على الجليد وتخزينها عند 4 درجات مئوية حتى الرحلان الكهربائي.

مع بعض الإنزيمات ، قد يمنع الارتباط المحكم للبروتين بالركيزة / المنتج هجرة قليل النوكليوتيدات إلى الهلام أثناء الرحلان الكهربائي ، خاصة عند استخدام الإنزيم بتركيزات عالية. سيظهر هذا على شكل نقص في أشرطة المنتج / الركيزة على الجل وغالبا ما يكون تراكم المواد الفلورية (المنتج و / أو الركيزة المعقدة مع البروتين) في الآبار. لتعطيل هذه المجمعات ، يمكن معالجة خليط الفحص باستخدام Proteinase K قبل إضافة مخزن مؤقت للتبريد ، أو يمكن إضافة كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) أثناء التبريد.

ينتج نشاط إنزيم الربط بالحمض النووي شريطين منفصلين، يسهل قياسهما كميا. من الممكن استخدام نفس الطريقة لتحديد نشاط النوكلياز الداخلي على ركيزة تلف الحمض النووي حيث يتوقع وجود منتج واحد من 20 نيوكليوتيد أو مقايسات EMSA حيث يتم تمييز الحالات المقيدة / غير المنضمة بوضوح. من الصعب تحديد كمية دقيقة لنشاط البلمرة والنيوكلياز العلاجي من خلال تكامل النطاق ، وبشكل عام ، يوصى باستخدام الفحص في الوقت الفعلي مع المجسات أو المنارات ، كما هو موضح في المقدمة.

إزالة الأدينيل وخصوصية العامل المساعد لربط الحمض النووي: قد تكون هناك حاجة إلى بعض التحسين لهذا البروتوكول لإزالة كل نشاط الخلفية ، والذي سيتم استعادته بعد ذلك عن طريق إضافة عامل (عوامل) النوكليوتيدات. إذا بقي نشاط الرباط في الخلفية بعد إزالة الأدينيل (ينظر إليه على أنه ربط في عنصر التحكم بدون عامل مساعد) ، فيمكن زيادة وقت حضانة خطوة إزالة الأدينيل ، أو تقليل تركيز الربط. تأكد من أن الحمض النووي المزدوج بدون ملصق أكثر تركيزا من البروتين (> 4: 1::الركيزة: البروتين). إذا لم تؤد إضافة عامل مساعد في وجود الحمض النووي المسمى إلى استعادة الربط لأي من العوامل المساعدة التي تم اختبارها ، فمن المحتمل أن يكون الإنزيم قد تغير طبيعته ، ويجب تقصير خطوة إزالة الأدينيل. بالنسبة إلى ligase جديد أو دفعة جديدة من الإنزيم المؤتلف ، من المفيد تحديد مدى ربط الخلفية مع إنزيم adenylated في حالة عدم وجود عوامل مساعدة نيوكليوتيدات إضافية. يتضمن ذلك إعداد تفاعل آخر حيث يتم تحضين 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي غير المسمى ، و 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي المسمى ، و 2.5 ميكرولتر من إنزيم جديد لم يتم إزالة الأدينيل منه في وقت واحد.

استخدم ركائز مزدوجة التسمية: يتطلب هذا البروتوكول تصميم وشراء قليل النوكليوتيد مع جزء فلورسنت له طيف إثارة / انبعاث مختلف عن الفلوروفور المستخدم في الأصل ثم تجميعه في دوبلكس بحيث يقوم الفلوروفوران المتعامدان بتسمية أجزاء مختلفة من الركيزة. إذا كنت في شك ، يتوفر عدد من العارضات الطيفية عبر الإنترنت للتحقق من أطياف الإثارة والانبعاث ، على سبيل المثال ، FPbase Spectra Viewer و BD Spectrum Viewer ، والتي يمكن استخدامها للتحقق من توافق كل من زوج الفلوروفور وإعدادات التصوير الأكثر ملاءمة. تعتمد الإعدادات المحددة المستخدمة لتصور الجل على طراز جهاز التصوير والفلوروفور (الفلوروفور) المستخدم. ستسجل الصورة المركبة الإشارة من كلتا القناتين على هلام واحد ، وسيظهر الشريط الذي يتم فيه توصيل كل من الفلوروفورات بنفس المنتج كلون وسيط. يمكن تحليل الصور المنفصلة من القنوات الفردية لتحديد مدى الارتباط أو التدهور على الخيوط ذات العلامات التفاضلية.

حدود التقنية
في حين أن العمل مع الركائز ذات العلامات الفلورية له العديد من المزايا ، مثل المخاطر الصحية المنخفضة ، هناك بعض القيود التي يجب على المرء مراعاتها عند العمل مع هذه الأنواع من الركائز المصنفة. أحدها هو التكلفة العالية نسبيا لطلب هذه النيوكليوتيدات قليلة النوكليوتيدات مع ملصقات أو تعديلات الفلوروفور ، مثل إضافة قواعد تالفة ، مقارنة بوضع العلامات الإشعاعية الداخلية. آخر هو أن معدات وبرامج التخيل المتخصصة مطلوبة للكشف عن الخيوط الملصقة. ومع ذلك ، يتم تضمين هذه الميزات الآن في معظم أنظمة تخيل الهلام الجديدة. ينبغي للمرء أيضا النظر في إمكانية الفلوروفورات لتغيير خصائص الربط لبروتينات التفاعل المستهدفة. يشيع استخدام الفلوريسئين ومشتقه FAM لتسمية قليل النوكليوتيدات وهما حساسان للتغيرات في الأس الهيدروجيني وتبريد القواعد النووية65. يجب مراعاة هذه القيود بعناية عند تحديد نوع ووضع الفلوروفورات على قليل النوكليوتيد للتصميم المزدوج.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SEG و UR موظفان في ArcticZymes Technologies AS التي توزع R2D ligase. ليس لدى AW و ER-S و RS مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم AW من قبل زمالة رذرفورد ديسكفري (20-UOW-004). RS هو المستفيد من منحة نيوزيلندا بعد القطب الجنوبي. تعترف SG و UR بالمعهد الكيميائي في جامعة ترومسو - جامعة القطب الشمالي النرويجية للدعم الفني.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
30٪ محلول أكريلاميد / مكرر (29: 1)BioRad1610156
أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) العديدمن الموردين
بيرسلفات الأمونيوم (APS)العديد من الموردين
أجهزة الطرد المركزي Benchtopالعديد من الموردين
بوراتالعديد من الموردين
بروموفينول الأزرق الموردين
Dithiothreitol (DTT)العديد من الموردين
نظام الرحلان الكهربائي مع حمام مائي متداولالعديد من الموردين
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)العديد من الموردين
تصوير الفلور ، على سبيل المثال iBright FL1000Thermo Fisher ScientificA32752
FormamideMany الموردين
نظام صب الهلامالعديد من الموردين
كتلة التدفئةالعديد من الموردين
كلوريد المغنيسيومالعديد من الموردينيفضل أيونات معدنية أخرى اعتمادا على البروتين الذي تمت دراسة
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (1.5 مل)العديد من الموردين
الماصات الدقيقة ونصائحالعديد من الموردين1 مل ، 0.2 مل ، 0.02 مل ، 0.002 مل
نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NAD +)العديد من الموردين
قليل النوكليوتيداتتقنيات الحمض النووي المتكاملةNAThermo Fisher و Sigma-Aldrich و   ؛ Genscript وغيرها أيضا توريد
ماصة المراعيهذه العديد من الموردين
PCR thermocyclerالعديد من الموردين
أنابيب PCRالعديد من الموردين
RNAse بعيداThermoFisher7002PKمطلوب فقط عند العمل مع RNA oligos
RNase AWAYMerck83931-250MLخافض للتوتر السطحي لإزالة الحمض النووي الريبي التلوث على الأسطح المياه
الخالية من الحمض النووينيو إنجلاند بيولابيسB1500Lمطلوبة فقط عند العمل مع الحمض النووي الريبي oligos
كلوريد الصوديومالعديد من الموردين
مثبطات SUPERase IN RNaseثيرمو فيشر ScientificAM2694مثبط RNAse واسع الطيف (قائم على البروتين)
SYBR GoldThermo Fisher ScientificS11494يمكن استخدام هذا للمواد الهلامية بعد البقع وتصور قليل النوكليوتيدات غير المسمى
تتراميثيل إيثيلين ديامين (TMED)العديد من الموردين
تريس ، أو تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثانالعديد من الموردين
المياه عالية النقاء (Milli-Q)ميرك
اليورياالعديد من الموردين
دوامةالعديد من الموردين
قد الريبي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363 (6429), 7003(2019).
  2. Yang, W., Gao, Y. Translesion and repair DNA polymerases: Diverse structure and mechanism. Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).
  3. Lohman, T. M., Fazio, N. T. How does a helicase unwind DNA? Insights from RecBCD Helicase. Bioessays. 40 (6), e1800009(2018).
  4. Ahdash, Z., et al. Mechanistic insight into the assembly of the HerA-NurA helicase-nuclease DNA end resection complex. Nucleic Acids Res. 45 (20), 12025-12038 (2017).
  5. Wozniak, K. J., Simmons, L. A. Bacterial DNA excision repair pathways. Nat Rev Microbiol. 20 (8), 465-477 (2022).
  6. Zhang, L., Jiang, D., Wu, M., Yang, Z., Oger, P. M. New insights into DNA repair revealed by NucS endonucleases from hyperthermophilic Archaea. Front Microbiol. 11, 1263(2020).
  7. Saathoff, J. H., Kashammer, L., Lammens, K., Byrne, R. T., Hopfner, K. P. The bacterial Mre11-Rad50 homolog SbcCD cleaves opposing strands of DNA by two chemically distinct nuclease reactions. Nucleic Acids Res. 46 (21), 11303-11314 (2018).
  8. Williamson, A., Leiros, H. S. Structural insight into DNA joining: from conserved mechanisms to diverse scaffolds. Nucleic Acids Res. 48 (15), 8225-8242 (2020).
  9. Caglayan, M. Interplay between DNA polymerases and DNA ligases: Influence on substrate channeling and the fidelity of DNA ligation. J Mol Biol. 431 (11), 2068-2081 (2019).
  10. Shuman, S. DNA ligases: Progress and prospects. J Biol Chem. 284 (26), 17365-17369 (2009).
  11. Lohman, G. J., Tabor, S., Nichols, N. M. DNA ligases. Curr Prot Mol Biol. , Chapter 3, Unit 3.14 (2011).
  12. Rittié, L., Perbal, B. Enzymes used in molecular biology: a useful guide. J Cell Commun Signal. 2 (1-2), 25-45 (2008).
  13. Chandrasegaran, S., Carroll, D. Origins of programmable nucleases for genome engineering. J Mol Biol. 428 (5), Part b 963-989 (2016).
  14. Aschenbrenner, J., Marx, A. DNA polymerases and biotechnological applications. Curr Opin Biotechnol. 48, 187-195 (2017).
  15. Loenen, W. A. M., Dryden, D. T. F., Raleigh, E. A., Wilson, G. G., Murray, N. E. Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction enzymes. Nucleic Acids Res. 42 (1), 3-19 (2013).
  16. Voytas, D., Ke, N. Detection and quantitation of radiolabeled proteins and DNA in gels and blots. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3 (A) (2002).
  17. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  18. Huang, C., Yu, Y. T. Synthesis and labeling of RNA in vitro. Curr Prot Mol Biol. , Chapter 4, Unit 4.15 (2013).
  19. Ballal, R., Cheema, A., Ahmad, W., Rosen, E. M., Saha, T. Fluorescent oligonucleotides can serve as suitable alternatives to radiolabeled oligonucleotides. J Biomol Tech. 20 (4), 190-194 (2009).
  20. Anderson, B. J., Larkin, C., Guja, K., Schildbach, J. F. Using fluorophore-labeled oligonucleotides to measure affinities of protein-DNA interactions. Meth Enzymol. 450, 253-272 (2008).
  21. Liu, W., et al. Establishment of an accurate and fast detection method using molecular beacons in loop-mediated isothermal amplification assay. Sci Rep. 7 (1), 40125(2017).
  22. Ma, C., et al. Simultaneous detection of kinase and phosphatase activities of polynucleotide kinase using molecular beacon probes. Anal Biochem. 443 (2), 166-168 (2013).
  23. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Meth Mol Biol. 429, 209-224 (2008).
  24. Yang, C. J., Li, J. J., Tan, W. Using molecular beacons for sensitive fluorescence assays of the enzymatic cleavage of nucleic acids. Meth Mol Biol. 335, 71-81 (2006).
  25. Nikiforov, T. T., Roman, S. Fluorogenic DNA ligase and base excision repair enzyme assays using substrates labeled with single fluorophores. Anal Biochem. 477, 69-77 (2015).
  26. Pergolizzi, G., Wagner, G. K., Bowater, R. P. Biochemical and structural characterisation of DNA ligases from bacteria and Archaea. Biosci Rep. 36 (5), 00391(2016).
  27. Martin, I. V., MacNeill, S. A. ATP-dependent DNA ligases. Genome Biol. 3 (4), REVIEWS3005 (2002).
  28. Bilotti, K., et al. Mismatch discrimination and sequence bias during end-joining by DNA ligases. Nucleic Acids Res. 50 (8), 4647-4658 (2022).
  29. Bauer, R. J., et al. Comparative analysis of the end-joining activity of several DNA ligases. PLoS One. 12 (12), e0190062(2017).
  30. Lohman, G. J. S., Zhang, Y., Zhelkovsky, A. M., Cantor, E. J., Evans, T. C. Efficient DNA ligation in DNA-RNA hybrid helices by Chlorella virus DNA ligase. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1831-1844 (2014).
  31. Bullard, D. R., Bowater, R. P. Direct comparison of nick-joining activity of the nucleic acid ligases from bacteriophage T4. Biochem J. 398 (1), 135-144 (2006).
  32. Magnet, S., Blanchard, J. S. Mechanistic and kinetic study of the ATP-dependent DNA ligase of Neisseria meningitidis. Biochemistry. 43 (3), 710-717 (2004).
  33. Williamson, A., Grgic, M., Leiros, H. S. DNA binding with a minimal scaffold: structure-function analysis of Lig E DNA ligases. Nucleic Acids Res. 46 (16), 8616-8629 (2018).
  34. Lohman, G. J., et al. A high-throughput assay for the comprehensive profiling of DNA ligase fidelity. Nucleic Acids Res. 44 (2), e14(2016).
  35. Kim, J., Mrksich, M. Profiling the selectivity of DNA ligases in an array format with mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 38 (1), e2(2010).
  36. Tang, Z. W., et al. Real-time monitoring of nucleic acid ligation in homogenous solutions using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (23), e148(2003).
  37. Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Q Rev Biophys. 44 (1), 1-93 (2011).
  38. Marti, T. M., Fleck, O. DNA repair nucleases. Cell Mol Life Sci. 61 (3), 336-354 (2004).
  39. Wang, B. B., et al. Review of DNA repair enzymes in bacteria: With a major focus on AddAB and RecBCD. DNA Repair. 118, 103389(2022).
  40. Pidugu, L. S., et al. Structural insights into the mechanism of base excision by MBD4. J Mol Biol. 433 (15), 167097(2021).
  41. Roberts, R. J. How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 5905-5908 (2005).
  42. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  43. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  44. Takemoto, N., Numata, I., Su'etsugu, M., Miyoshi-Akiyama, T. Bacterial EndoMS/NucS acts as a clamp-mediated mismatch endonuclease to prevent asymmetric accumulation of replication errors. Nucleic Acids Res. 46 (12), 6152-6165 (2018).
  45. Reardon, J. T., Sancar, A. Molecular anatomy of the human excision nuclease assembled at sites of DNA damage. Mol Cell Biol. 22 (16), 5938-5945 (2002).
  46. Kunkel, T. A., Soni, A. Exonucleolytic proofreading enhances the fidelity of DNA synthesis by chick embryo DNA polymerase-gamma. J Biol Chem. 263 (9), 4450-4459 (1988).
  47. Sheppard, E. C., Rogers, S., Harmer, N. J., Chahwan, R. A universal fluorescence-based toolkit for real-time quantification of DNA and RNA nuclease activity. Sci Rep. 9 (1), 8853(2019).
  48. Li, J. J., Geyer, R., Tan, W. Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA. Nucleic Acids Res. 28 (11), e52(2000).
  49. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Meth. 9 (7), 671-675 (2012).
  50. Sharma, J. K., et al. Methods for competitive enrichment and evaluation of superior DNA ligases. Meth Enzymol. 644, 209-225 (2020).
  51. Rzoska-Smith, E., Stelzer, R., Monterio, M., Cary, S. C., Williamson, A. DNA repair enzymes of the Antarctic Dry Valley metagenome. Front Microbiol. 14, 1156817(2023).
  52. Williamson, A., Pedersen, H. Recombinant expression and purification of an ATP-dependent DNA ligase from Aliivibrio salmonicida. Protein Expres Purif. 97 (0), 29-36 (2014).
  53. Akey, D., et al. Crystal structure and nonhomologous end-joining function of the ligase component of Mycobacterium DNA ligase D. J Biol Chem. 281 (19), 13412-13423 (2006).
  54. Kim, D. J., et al. ATP-dependent DNA ligase from Archaeoglobus fulgidus displays a tightly closed conformation. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 65, Pt 6 544-550 (2009).
  55. Nishida, H., Kiyonari, S., Ishino, Y., Morikawa, K. The closed structure of an archaeal DNA ligase from Pyrococcus furiosus. J Mol Biol. 360 (5), 956-967 (2006).
  56. Gundesø, S., et al. R2D ligase: Unveiling a novel DNA ligase with surprising DNA-to-RNA ligation activity. Biotechnol J. 19 (3), e2300711(2024).
  57. Hendling, M., Barišić, I. In silico design of DNA oligonucleotides: Challenges and approaches. Comput Struct Biotechnol J. 17, 1056-1065 (2019).
  58. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harb Prot. 2019 (2), 10.1101/pdb.top101857 (2019).
  59. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. (32), e1485(2009).
  60. Smith, D. R. Gel Electrophoresis of DNA. Mol Biometh Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-33 (1998).
  61. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  62. Rousseau, M., et al. Characterisation and engineering of a thermophilic RNA ligase from Palaeococcus pacificus. Nucleic Acids Res. 52 (7), 3924-3937 (2024).
  63. Kestemont, D., Herdewijn, P., Renders, M. Enzymatic synthesis of backbone-modified oligonucleotides using T4 DNA ligase. Curr Prot Chem Biol. 11 (2), e62(2019).
  64. Farell, E. M., Alexandre, G. Bovine serum albumin further enhances the effects of organic solvents on increased yield of polymerase chain reaction of GC-rich templates. BMC Res Notes. 5, 257(2012).
  65. Nazarenko, I., Pires, R., Lowe, B., Obaidy, M., Rashtchian, A. Effect of primary and secondary structure of oligodeoxyribonucleotides on the fluorescent properties of conjugated dyes. Nucleic Acids Res. 30 (9), 2089-2195 (2002).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة