مقالة منهجية

تقنية الإعطاء داخل الأنف لمجاميع α-Synuclein

1.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66943

⸱

نوفمبر 8, 2024

 , 
1Department of Neurology, Graduate School of Medicine, Kyoto University

في هذه المقالة

ملخص

يصف البروتوكول الحالي طريقة للإعطاء داخل الأنف لمجاميع α-synuclein. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة حول انتشار α سينوكلين من الغشاء المخاطي الشمي إلى البصلة الشمية في مرض باركنسون.

الملخص

مرض باركنسون (PD) هو اضطراب تنكسي عصبي يتميز بوجود أجسام ليوي ، وهي عبارة عن مجاميع من α-سينوكلين (α-Syn). في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح تطور المرض وتطوره من خلال الانتشار الشبيه بالبريون لمجاميع α-Syn من البصلة الشمية (OB) أو النواة الظهرية للعصب المبهم. على الرغم من أن أصل مجاميع α-Syn في OB لا يزال غير واضح ، فقد تم اقتراح انتشارها من الغشاء المخاطي الشمي مؤخرا. لقد أظهرنا سابقا أن الإعطاء داخل الأنف لمجاميع α-Syn في نموذج الفأر تسبب في علم أمراض α-Syn في OB للفئران. في هذه الدراسة ، نقدم طريقة للإعطاء داخل الأنف لمجاميع α-Syn التي تسببت في علم أمراض α-Syn في OB للفئران. تعد الإدارة داخل الأنف لمجاميع α-Syn طريقة بسيطة للغاية ومباشرة ، ونعتقد أنها ستكون أداة مفيدة في البحث لتوضيح أصل علم أمراض α-Syn في OB ومسار انتشار α-Syn من خلال نظام حاسة الشم.

المقدمة

مرض باركنسون (PD) ، الذي يتميز بأعراض حركية مثل بطء الحركة ، والرعشة أثناء الراحة ، وتصلب العضلات ، هو ثاني أكثر الاضطرابات التنكسية العصبيةشيوعا 1. يظهر مرض باركنسون أيضا أعراضا غير حركية ، بما في ذلك ضعف حاسة الشم ، والضعف الإدراكي ، والاكتئاب ، والهلوسة ، والإمساك ، وانخفاض ضغط الدم الانتصابي. السمات المميزة المرضية هي موت الخلايا الدوبامينية في المادة السوداء ووجود مجاميع α-سينوكلين (α-Syn) ، تسمى أجسام ليوي2.

وتجدر الإشارة إلى أن α-Syn هو بروتين مكون من 140 حمض أميني موجود على شكل مونومر قابل للذوبان (أو رباعي) في ظل الظروف العادية. ومع ذلك ، في ظل ظروف غير طبيعية ، يتم تحويل المونومر القابل للذوبان إلى مجاميع غير قابلة للذوبان عالية الوزن الجزيئي ، بما في ذلك القلة والألياف. يقال إن انتقال α-Syn إلى أوليغومرات وألياف يشارك في السمية الخلوية3.

اقترحت الدراسات الحديثة الانتشار الشبيه بالبريون لمجاميع α-Syn بين الخلايا العصبية. بناء على العديد من فحوصات ما بعد الوفاة ، اقترح Braak et al. في عام 2003 الفرضية القائلة بأن أمراض جسم ليوي تنتشر تدريجيا في الدماغ بطريقة نمطية إلى حد ما (فرضية براك)4،5. في عام 2008 ، كشف فحص ما بعد الوفاة للمرضى الذين يعانون من مرض باركنسون الذين خضعوا لعمليات زرع الدماغ المتوسط للجنين عن أجسام ليوي في الخلايا العصبية الدوبامين المشتقة من أنسجة الجنين6،7. اقترحت هذه الدراسات أن مجاميع α-Syn يمكن أن تنتشر من الدماغ المصاب إلى الطعوم ، مما يدعم فرضية براك.

بعد هذه الملاحظات ، أعادت التجارب التي تنطوي على ثقافات الخلايا العصبية الأولية والحقن داخل المخ لمجاميع α-Syn في الفئران إنتاج انتشار مجاميع شبيهة بجسم ليوي ، مما يوفر مزيدا من الأدلة على انتشار α-Syn بطريقة تشبه البريون8،9.

براك وآخرون أظهر أن علم أمراض جسم ليوي في مرض باركنسون يبدأ في البصلة الشمية (OB) و / أو النواة الظهرية للعصب المبهم (dmX)4. بناء على فرضية براك ، أبلغت العديد من الدراسات عن إعطاء مجاميع α-Syn أو مستخلصات أجسام ليوي من أدمغة باركنسون في OB والجهاز الهضمي لحيوانات التجارب10،11،12. في عام 2018 ، أظهرت دراسة أن إعطاء مجاميع α-Syn في OB للفئران البرية أدى إلى انتشار أمراض α-Syn على طول المسار الشمي ، مما أدى إلى خلل في حاسة الشم13. لقد قمنا سابقا بتلقيح مجاميع α-Syn في OB للفئران المعدلة وراثيا α-Syn ووجدنا أن هذا أدى إلى ضمور الحصين وضعف الذاكرة14.

في عام 2022 ، قمنا بتلقيح مجاميع α-Syn في OB من marmosets ، وهي رئيسيات صغيرة غير بشرية. أدى ذلك إلى انتشار علم الأمراض α-Syn على طول المسار الشمي ، وضمور OB ، ونقص التمثيل الغذائي للجلوكوز الدماغيعلى نطاق واسع 10.

ومع ذلك ، إذا حدث انتشار مجاميع α-Syn من OB ، فإن سؤالا مهما: ما هي الآلية التي تظهر بها مجاميع α-Syn في البداية؟ أبلغ سايتو وآخرون سابقا عن وجود جثث ليوي في الغشاء المخاطي للأنف15. تم الكشف عن وجود مجاميع α-Syn في الغشاء المخاطي للأنف للمرضى الذين يعانون من مرض باركنسون وضمور الجهاز المتعدد (MSA) باستخدام تحليل التحويل الناجم عن الارتعاش في الوقت الفعلي (RT-QUIC)16. والجدير بالذكر أن تحليل عينات الغشاء المخاطي للأنف من المرضى الذين يعانون من اضطراب سلوك النوم في حركة العين السريعة (RBD) ، والذي يعتبر مرحلة بادرية من مرض باركنسون ، كشف عن زيادة في مستويات α-Syn17. اقترحت هذه الدراسة أن علم أمراض α-Syn قد يكون موجودا في الغشاء المخاطي للأنف حتى من المرحلة البادرية من مرض باركنسون.

في حين أن هذه النتائج تشير إلى مسار محتمل من الغشاء المخاطي للأنف إلى OB ، إلا أن هناك أدلة تجريبية محدودة تدعم هذا السيناريو. لمعالجة هذه الفجوة ، قمنا بإعطاء مجاميع α-Syn في تجويف أنف الفئران وحققنا في انتشار أمراض α-Syn من الغشاء المخاطي للأنف إلى OB. أظهر نهجنا التجريبي أن إعطاء جرعة واحدة داخل الأنف من مجاميع α-Syn في الفئران البرية يسببت في علم أمراض α-Syn في OB ، مما يوفر دليلا تجريبيا على مسار الانتشار من الغشاء المخاطي للأنف إلى OB.

البروتوكول

تم استخدام الفئران الذكور C57BL / 6J بعمر شهرين لهذه الدراسة. تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية. منحت لجنة أبحاث بجامعة كيوتو الموافقة الأخلاقية والإذن لهذه الدراسة (MedKyo 23،544).

1. إعطاء ألياف α-Syn مسبقة التشكيل داخل الأنف

  1. تحضير محلول ألياف الماوس α-Syn في PBS (4 مجم / مل) وفقا للطرق المبلغ عنهاسابقا 11. لف الأنبوب بغشاء شفاف لمنع التلوث.
  2. Sonicate 200 ميكرولتر من محلول الألياف α-Syn لتوليد ألياف مسبقة التشكيل α-Syn (PFFs) باستخدام سونيكاتير من نوع حمام مائي (جدول المواد). املأ الحمام بالموجات فوق الصوتية بالماء وأضف مكعبات الثلج لتبرد حتى 4 درجات مئوية للصوتنة. ألياف صوتية لما مجموعه 5 دقائق مع كل دورة تتكون من 30 ثانية من الصوتنة متبوعة بفاصل 30 ثانية (ما مجموعه خمس دورات).
    ملاحظة: استخدم معدات الحماية الشخصية مثل القفازات التي تستخدم لمرة واحدة والقناع ونظارات السلامة لمنع التعرض ل α-Syn.
  3. قم بإعداد ماصة P10 (جدول المواد) برأس ماصة سعة 10 ميكرولتر. تخدير كل فأر باستخدام مزيج من ميديتوميدين هيدروكلوريد وميدازولام وبوتورفانول (MMB) عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP). احتوى عامل التخدير المركب MMB على ميدازولام (0.3 مجم / كغ) وميديتوميدين (4 مجم / كغ) وطرطرات بوتورفانول (5 مجم / كغ). يستخدم 0.005 مل / جم عن طريق حقن المثقال الاصطناعي عند خلط الميدازولام (1 مجم / مل) 0.3 مل ، ميديتوميدين (5 مجم / مل) 0.8 مل ، طرطرات بوتورفانول (5 مجم / مل) 1 مل ، والمحلول الملحي 2.9 مل.
  4. انتظر لمدة 10 دقائق للتأكد من أن الفئران قد تم تخديرها تماما. يمكن تأكيد التخدير المناسب إذا كان الفأر في حالة استلقاء جانبي ولا يمكنه تصحيح نفسه. بمجرد التخدير ، ضعي مرهم العين باستخدام قضيب قطني معقم لمنع جفاف العينين.
    ملاحظة: بدون تخدير ، عند إعطاء جرعات الأنف ، يصعب إبقاء الفئران ضعيفة وإعطاء محلول α-Syn بشكل صحيح أثناء عطس الفئران. لهذه الأسباب ، كان التخدير ضروريا.
  5. ضع الفأر المخدر في وضع الاستلقاء. ضع منشفة ورقية أو مادة مماثلة تحت الجسم ، مما يضمن إمالة الرأس لأسفل قليلا (الشكل 1 أ ، ب). يمنع هذا الوضع محلول α-Syn المعطى من التدفق بسرعة إلى الرئتين أو المريء ، مما يسهل الاحتفاظ به في تجويف الأنف. تظهر الخياشيم في الشكل 1 ج.
  6. اسحب 1 ميكرولتر من محلول α-Syn (4 ملغ/مل) في ماصة P10 وضع طرف الماصة بالقرب من أنف الماوس. قم بتشكيل قطرة مستديرة ببطء واحتفظ بها في نهاية طرف الماصة (الشكل 1D ، السهم الأحمر). يتم إجراء الإعطاء داخل الأنف لفتحة الأنف أحادية الجانب ، واستخدام الجانب المقابل كجانب تحكم.
  7. اجعل القطرة قريبة من جانب واحد من أنف الفأر واسمح للفأر باستنشاقه بشكل طبيعي. راقب الاستنشاق وانتظر لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة (الشكل 1E).
  8. كرر الخطوات 1.6.-1.7. حتى يتم إعطاء حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر من محلول α-Syn. بعد كل الإجراءات ، تخلص من القفازات وامسح مقعدا بمنظفات تجارية إذا كان السطح ملوثا ب α-Syn
    ملاحظة: يجب إجراء الإجراء بأكمله في خزانة أمان لمنع استنشاق ألياف α-Syn من قبل الموظفين الذين يقومون بالإجراء. أظهر تقرير سابق أن حجم 25 ميكرولتر هو الأكثر كفاءة لإعطاء الأدوية من الأنف إلى الدماغ18. نستخدم حجما مشابها قدره 20 ميكرولتر في هذه الدراسة. نستخدم أيضا نفس تركيز PFFs مثل ذلك للحقن في OB في التقرير السابق10 ، وهو قريب من 400 ميكرومتر (5.6 مجم / مل) من PFFs19.
  9. يدير أتيباميزول (3 ملغ/كغ؛ جدول المواد) عن طريق حقن IPP لعكس ميديتوميدين وتسهيل الشفاء. يستخدم 0.005 مل / جم عن طريق حقن IPS عند خلط أتيبامزول (5 مجم / مل) 0.6 مل ومحلول ملحي 4.4 مل.
    ملاحظة: توفير التسكين لأنه ليس من المفهوم تماما مدى الإجهاد الذي سيكون عليه إعطاء α-Syn داخل الأنف.
  10. لا تترك الفأر دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. بعد الشفاء التام ، أعد الماوس إلى القفص.

2. إعداد العينة

  1. التضحية بالفئران المعالجة في 1 و 3 و 6 و 12 شهرا بعد إعطاء ألياف α-Syn مسبقة التشكيل داخل الأنف.
    1. ضع الفئران في صندوق الحث ، وقم بإعطاء سيفوفلوران (>6.5٪) واستمر حتى تحدث السكتة التنفسية لمدة > 60 ثانية. قم بإزالة الفئران وإجراء عملية استئصال سريعة عن طريق شق الأذين الأيمن لضمان القتل الرحيم.
  2. أدخل إبرة 25G (جدول المواد) في قمة القلب. قم ببث الماوس عند 4 مل / دقيقة مع 15 مل من PBS ثم 15 مل من 4٪ PFA في PBS.
  3. اقطع الرأس بالمقص وقم بعمل شق 2 سم في فروة الرأس بمشرط. شق عظم الجمجمة بالمقص في الجانب الجانبي من الأسفل إلى الأنف (الشكل 2 أ ، ب). للحصول على OBs ، قم بإزالة عظم الجمجمة تماما على OBs (الشكل 2 ب ، الدائرة الصفراء).
  4. اقلب الرأس ، واقطع أعصاب الدماغ ، ثم قم بإزالة الدماغ بعناية باستخدام ملقط (الشكل 2 ج ، د). احصل على الدماغ مع OBs السليمة (الشكل 2 ه). للحصول على OBs السليمة ، قم بقطع الأعصاب الشمية بعناية باستخدام ملقط حيث تلتصق OBs بعظم الجمجمة (الشكل 2D ، الدائرة الصفراء).
  5. ضع عينات الدماغ في 4٪ PFA في PBS طوال الليل عند 4 درجات مئوية. لا تترك عينات الدماغ لأكثر من 24 ساعة.
    ملاحظة: سيؤدي التثبيت المفرط إلى تقليل التلوين الكيميائي المناعي. إذا كان التخزين طويل الأجل مطلوبا ، فاحتفظ بعينات الدماغ في 70٪ من الإيثانول أو PBS الذي يحتوي على 0.1٪ أزيد الصوديوم للحفاظ على العقم.

3. تلطيخ كيميائي مناعي ل OB

  1. قم ببارافين العينات باستخدام معالج الأنسجة الأوتوماتيكي (جدول المواد) كما هو موضح أدناه.
    1. اغمر في 70٪ إيثانول لمدة 120 دقيقة ، متبوعا بالغمر في 100٪ إيثانول لمدة 8 مرات لمدة 60 دقيقة. ثم اغمر في 100٪ زيلين لمدة 3 مرات لمدة 120 دقيقة.
    2. اغمر في البارافين عند 60 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة متبوعا بالانغماس في البارافين عند 60 درجة مئوية لمدة 240 دقيقة.
  2. قم بتضمين العينات في البارافين كما هو موضح أدناه.
    1. قم بتضمين العينات في البارافين عند 60 درجة مئوية مع مركز تضمين الأنسجة المعياري (جدول المواد). قم بتبريدهم على الجليد.
  3. قطع العينات إلى أقسام بسمك 8 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم (جدول المواد)18.
  4. قم بإجراء إزالة البارافين كما هو موضح أدناه.
    1. اغمر في 100٪ زيلين لمدة 2x لمدة 5 دقائق ، متبوعا بغمر في 100٪ من الإيثانول لمدة 2x لمدة 3 دقائق.
    2. اغمر في 70٪ إيثانول لمدة 3 دقائق. يغسل في PBS لمدة 3 دقائق.
  5. إجراء استرجاع المستضد كما هو موضح أدناه.
    1. اغمر في حمض الفورميك 100٪ لمدة 15 دقيقة. اشطفه في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة دقيقتين.
    2. الأوتوكلاف عند 120 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. دعها تبرد بشكل طبيعي.
  6. اغمر في 1٪ بيروكسيد الهيدروجين في الميثانول لمدة 10 دقائق. يغسل في PBS لمدة 5 دقائق.
  7. أضف 500 ميكرولتر من الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ في PBS على الشرائح واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. ضع 500 ميكرولتر من الجسم المضاد α-Syn المضاد للفسفرة (p-α-Syn ، 1/10000) في PBS على الشرائح واحتضنها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل 2x باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  9. احتضان مع بوليمر بيروكسيداز مناعي عالمي ، مضاد للأرانب (جدول المواد) لمدة 1 ساعة عند 25 درجة مئوية. اغسل 2x باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  10. قم بالتطوير باستخدام مجموعة تلطيخ 3,3 'diaminobenzidine (DAB) (جدول المواد) لمدة 5 دقائق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  11. اغمر في محلول الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة (جدول المواد). قم بإزالة اللون في الماء الجاري لمدة 10 دقائق.
  12. قم بإجراء التركيب كما هو موضح أدناه.
    1. اغمر في 70٪ إيثانول لمدة 5 دقائق. اغمر في 100٪ من الإيثانول لمدة 2x لمدة 5 دقائق.
    2. اغمر في 100٪ زيلين لمدة 2x لمدة 5 دقائق. قم بالتركيب باستخدام وسيط تضمين (جدول المواد). ضع 100 ميكرولتر من وسط التضمين على الشرائح وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي.
  13. احصل على الصور باستخدام مجهر متعدد الإمكانات بتكبير 20x و 40x (جدول المواد).

النتائج

يوضح الشكل 3 عدة أمثلة على مجاميع α-Syn في OB. في هذه الدراسة ، قمنا بإعطاء مجاميع α-Syn في فتحة الأنف أحادية الجانب. يتم فصل تجويف الأنف عن طريق الحاجز الأنفي ، ويقوم كل OB بعرض الخلايا العصبية الحسية الشمية على كل تجويف أنفي على حدة. لذلك ، يمكن استخدام OB على الجانب المقابل كعنصر تحكم.

لم يلاحظ علم أمراض P-α-Syn في OB على الجانب المعالج بعد 1 و 3 أشهر (الشكل 3 أ ، ب). لوحظت مجاميع p-α-Syn الشبيهة بالعصبية ليوي في الكبيبات على الجانب المعالج بعد 6 و 12 شهرا. (الشكل 3 ج ، د ، و ، ز). لم يتم ملاحظة هذه المجاميع في OB على جانب التحكم (الشكل 3E).

يمكننا تقدير علم الأمراض α-Syn عن طريق عد مجاميع α-Syn أو فحص الحجم ، وما إلى ذلك ، باستخدام ImageJ (جدول المواد). على سبيل المثال، قمنا سابقا بحساب عدد مجاميع α-Syn والإبلاغ عنه في هذا النموذج20. في OB على الجانب المعالج ، زادت المجاميع الشبيهة بالنيوريت ليوي في OB بشكل ملحوظ على مدى 12 شهرا (ANOVA أحادي الاتجاه ، متبوعا باختبار Dunnett ، ص < 0.01 ؛ الشكل 3 ح). في OB على جانب التحكم ، هناك عدد قليل من مجاميع α-Syn.

أظهرت دراسة سابقة أن PFFs المحقونة في دماغ الفأر قد تحللت في غضون أسبوع ، وتم تحويل α-Syn للفأر الداخلي إلى مجاميع α-Syn19. في هذه الدراسة ، تشير الزيادة في علم أمراض α-Syn بمرور الوقت إلى أن α-Syn للفأر الداخلي قد تم تحويله إلى مجاميع α-Syn عن طريق إعطاء جرعة واحدة داخل الأنف من PFFs. أشارت هذه النتائج إلى أن علم أمراض α-Syn يمكن أن ينتشر من الغشاء المخاطي الشمي إلى OB.

figure-results-1
الشكل 1: طريقة إدارة تجويف الأنف في الفأر. (أ) يتم وضع الفأر في وضع ضعيف مع إمالة الرأس قليلا إلى الأسفل. (ب) يشار إلى فتحات الأنف من الفأر برؤوس سهام صفراء. (ج، د) يتم إسقاط محلول الألياف α-Syn في فتحة أنف الفأر (C ، السهم الأحمر) ويتم استنشاقه بسرعة (D ، الأسهم الحمراء). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مخطط خطوات الحصول على المصابيح الشمية السليمة. (أ) باستخدام المقص ، شق عظم الجمجمة سهمي وجانبيا (خط اندفاعة أصفر). (ب) قم بإزالة عظم الجمجمة على البصيلات الشمية (OBs) تماما. (ج) اقلب الرأس وأزل الدماغ بعناية. قطع أعصاب الدماغ. (د) قطع الأعصاب الشمية المرتبطة بعظم الجمجمة. (ه) الدماغ كله مع OBs السليمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: مجاميع P-α-Syn في كبيبات البصلة الشمية. (AGE) P -α-Syn (EP1536Y) الكيمياء المناعية ل OB على (A-D) الجانب المعالج 1 و 3 و 6 و 12 شهرا (1 م و 3 م و 6 م و 12 م على التوالي) بعد الإعطاء داخل الأنف و (E) الجانب الضابط بعد 12 شهرا من الإعطاء داخل الأنف. (ج، د) تظهر مجاميع α-Syn الشبيهة بالخيوط الشبيهة بالخيوط حول الكبيبات. (F ، G) الصور المكبرة هي صور عالية التكبير ل p-α-Syn الشبيهة ب Lewy neurite بعد 6 و 12 شهرا من الإعطاء داخل الأنف. (ح) مقدار ترسب p-α-Syn الشبيه ب Lewy neurite في OB على الجانبين المعالج والتحكم (ن = 4-5). تظهر الرسوم البيانية يعني ± SEM. ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Dunnett ؛ **<0.01. وقد عدل هذا الرقم من تقرير سابق20. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

في دراسة سابقة ، أدى إعطاء مجاميع α-Syn في تجويف الأنف لقرود المكاك إلى موت خلايا الدوبامين وترسب الحديد في المادة السوداء ، على الرغم من عدم ملاحظة مجاميع α-Syn21. تم الإبلاغ عن الإدارة اليومية لمجاميع A53T البشرية α-Syn في تجويف الأنف لفئران محفز البريون α-Syn المعدلة وراثيا (فئران M83) لمدة 28 يوما للحث على علم الأمراض α-Syn في الأدمغة والأعراض الحركية في الفئران19،22. في هذه الدراسة ، أظهرنا أن إعطاء جرعة واحدة من α-Syn يتجمع في تجويف الأنف للفئران البرية الناجمة عن أمراض α-Syn في OB. يمكن اعتبار هذه الطريقة البسيطة ذات قيمة للتحقيق في انتشار α-Syn من الغشاء المخاطي للأنف إلى OB.

يعد صوتنة كافية من ألياف α-Syn في هذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن التقارير السابقة أظهرت أن الحجم الصغير لمجاميع α-Syn المجزأة هو الأكثر كفاءة لتشغيل علم الأمراض α-Syn23،24. سيؤدي صوتنة غير كافية من ألياف α-Syn إلى انتشار ضئيل إلى OB. نظرا لأن أجهزة الصوتنة المختلفة لها قوة صوتنة متفاوتة ، فإن تحسين هذه العملية ضروري. كما أن وضعية الفأر المستلقية عند إعطاء محلول α-Syn في فتحتي أنف الفأر أمر بالغ الأهمية. إذا كان رأس الفأر مرتفعا ، فسوف يتدفق محلول α-Syn إلى الرئتين والمريء. يمكن أن يتسبب الموقف غير المناسب في موت غير متوقع أو عدم كفاية انتشار α-Syn.

في هذه الدراسة ، استخدم i.p. عامل مخدر مركب MMB للتخدير. تم الإبلاغ عن التخدير المركب MMB لتوفير تخدير جيد وتسكين جيد ، ويمكن عكس تأثيره بسرعة بواسطة atipamezole23. نظرا لأن التخدير الاستنشاقي يتطلب تغطية فتحتي الأنف بقناع للحفاظ على التخدير ، فمن الصعب إعطاء محلول α-Syn داخل الأنف. بالإضافة إلى ذلك ، تمت دراسة نموذج rotenone على نطاق واسع وهو نموذج مفيدللغاية 25. ومع ذلك ، فهو نموذج ناتج عن المخدرات وقد يكون له آليات مرضية مختلفة عن مرض باركنسون مجهول السبب (iPD) 25. نظرا لأن هذا النموذج تسبب في انتشار α-Syn ، فإننا نعتقد أنه أقرب إلى iPD.

اقترحت دراستنا أيضا أن مجاميع α-Syn الخارجية يمكن أن تنتقل عبر الغشاء المخاطي للأنف. لذلك ، عندما يقوم الباحثون بإجراء تجارب باستخدام مجاميع α-Syn ، يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب استنشاق مجاميع α-Syn. على سبيل المثال ، يمكن إنشاء الهباء الجوي α-Syn أثناء خطوة الصوتنة. نوصي باستخدام سونيكاتور من النوع المختوم أو صوتنة داخل خزانة الأمان. بالإضافة إلى ذلك ، قد تعطس الفئران ، مما قد ينتج عنه رذاذ α-Syn. للتخفيف من هذا الخطر ، يجب إجراء جميع العمليات داخل خزانة أمان. أيضا ، يجب على الباحثين استخدام معدات الحماية الشخصية مثل القفازات والأقنعة ونظارات السلامة التي تستخدم لمرة واحدة لمنع التعرض ل α-Syn. بعد كل الإجراءات ، يحتاج الباحثون إلى مسح مقعد بمنظفات تجارية إذا كان السطح ملوثا ب α-Syn. أظهرت التقارير السابقة أن كلا من المنظفات التجارية و SDS فصلت الركام عن الأسطح الملوثة26،27.

في هذه الدراسة ، تم استخدام أقسام البارافين لتقييم أمراض α-Syn في OB ، حيث يتم الحفاظ على الهيكل الصغير ل OB بشكل أفضل في أقسام البارافين مقارنة بتلك الموجودة في الأقسام المجمدة. أظهرت هذه الدراسة أن علم الأمراض α-Syn قد تم إحداثه في OB. ومع ذلك ، كان علم أمراض α-Syn المرصود خفيفا ومحدودا وكان ممثلا في الغالب من خلال مجاميع تشبه الخيوط تعرف باسم Lewy neurites في الكبيبات.

وتجدر الإشارة إلى أن التغيرات السلوكية الظاهرة في الفئران التجريبية لم تلاحظ في هذه الدراسة. قد يكون علم أمراض α-Syn الناجم عن هذه الطريقة غير كاف لإحداث تغييرات في النمط الظاهري للسلوك. هناك حاجة إلى مزيد من التحقيقات لتوضيح الحالات المحددة التي تؤدي إلى أمراض شديدة وتغيرات سلوكية. في المستقبل ، إذا تمكنا من إنشاء طريقة أكثر فاعلية للانتشار من الغشاء المخاطي للأنف إلى OB ، فإن هذه الطريقة البسيطة توفر طريقة بديلة لتقييم انتشار α-Syn بدون تقنية جراحية.

بالإضافة إلى ذلك ، استخدمنا OB على الجانب المقابل في الفئران المعالجة كعنصر تحكم. ومع ذلك ، يمكن أن يحدث الانتشار الرجعي من النواة الشمية الأمامية أو القشرة الكمثرية إلى OB المقابل في متابعة طويلة الأمد. في هذه الحالة ، تم استخدام الفئران غير المعالجة كعنصر تحكم.

في حين أن هذه الطريقة البسيطة توفر رؤى قيمة حول انتشار α-Syn من الغشاء المخاطي للأنف إلى OB ، إلا أن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لفهم الآليات الكامنة وراء مرض باركنسون بشكل شامل.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم جميع التجارب من قبل Rie Hikawa. نتقدم بالشكر إلى ياسوكو ماتسوزاوا على الأعمال الورقية. تم دعم هذه الدراسة من قبل JSPS KAKENHI (M.S., NO. JP19K23779 و JP20K16493 و JP20H00663).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجهر مضان الكل في واحد BZ-X710KEYENCEN / Aمجهر الكل في واحد
ملح الصوديومNacalai tesque02739-32
Bioruptor IISonicbioBR2006Aسونيكاتور نوع حمام مائي
بوتورفانول طرطراتميجي سيكا فارماWAK-52850
أنبوب السليلوزMISUMIUC20-32-100
DeepWellMaximizerTAITECMBR-022UPشاكر
DynaEfficient Cells Zip BL21 (DE3)BioDynamics Laboratory Inc.DS255خلية مختصة
EntellanSigma-Aldrich107961وسيط تركيب سريع للفحص المجهري
Graefe ملقط دقيق للغاية منحني مسننFST11152-10   ؛ملقط
مقص ناعم مقوىFST14090-09مقص
هيستوفين ماوس وصمة عار بسيط MAX-PO (R)Nichirei Bioscience414341العالمي المناعي بيروكسيداز بوليمر ، صورة مضادة للأرانب
J ver 1.52pNANA https://imagej.net/
innova4200نيو برونزويك 9105085 علميحاضنة شاكر
الأيزوبروبيل - & بيتا ؛ - D-thiogalactopyranosideNacalai tesque19742-94
مرق LB ، LennoxNacalai tesque20066-24
Leica EG 1150 HLeica14 0388 86 108مركز تضمين الأنسجة المعيارية
Leica TP 1020Leica14 0422 85108معالج الأنسجة الأوتوماتيكي  
ميديتوميدينفوجي فيلم135-17473
ميكروم HM325 الروتاري ميكروتومحراري علمي902100
ميدازولاممارويشي سياكو4987-211-76210-0
هيماتوكسيلين جديد من النوع Gموتو65-9197-38محلول هيماتوكسيلين
إبرة مجنحة عادية للوريد نوع D ، إبرة 25GTERUMONN2332R25G
Optima TLX Ultra CentrifugeBeckman Couler8043-30-1197ماصة الطرد المركزي
الفائق P10جيلسونFA10002P
البارافينلايكا39601095
بارافورمالدهايدناكالاي تيسك30525-89-4
طقم بقع البيروكسيديز DABNacalai tesque25985-50
أطقم فحص البروتين BCA PireceThermo Scientific23225BCA assay
pRK172Addgene# 134504البلازميد
Q-Sepharose Fast Flow. سيتيفا17051001راتنج التبادل الأيوني

المراجع

  1. Tysnes, O. B., Storstein, A. Epidemiology of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 124 (8), 901-905 (2017).
  2. Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nature Rev Neurosci. 2, 492-501 (2001).
  3. Conway, K. A., et al. Acceleration of oligomerization, not fibrillization, is a shared property of both alpha-synuclein mutations linked to early-onset Parkinson's disease: implications for pathogenesis and therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (2), 571-576 (2000).
  4. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
  5. Braak, H., Rüb, U., Gai, W. P., Del Tredici, K. Idiopathic Parkinson's disease: possible routes by which vulnerable neuronal types may be subject to neuroinvasion by an unknown pathogen. J Neural Transm (Vienna). 110 (5), 517-536 (2003).
  6. Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T., Olanow, C. W. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. 14 (5), 504-506 (2008).
  7. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  8. Luk, K. C., et al. Pathological α-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  9. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 13010-13015 (2009).
  10. Sawamura, M., et al. Lewy body disease primate model with α-Synuclein propagation from the olfactory bulb. Mov Disord. 37 (10), 2033-2044 (2022).
  11. Uemura, N., et al. Inoculation of α-synuclein preformed fibrils into the mouse gastrointestinal tract induces Lewy body-like aggregates in the brainstem via the vagus nerve. Mol Neurodegener. 13 (1), 21(2018).
  12. Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease. J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).
  13. Rey, N. L., et al. Spread of aggregates after olfactory bulb injection of α-synuclein fibrils is associated with early neuronal loss and is reduced long term. Acta Neuropathol. 135 (1), 65-83 (2018).
  14. Uemura, N., et al. α-Synuclein spread from olfactory bulb causes hyposmia, anxiety, and memory loss in BAC-SNCA mice. Mov Disord. 36 (9), 2036-2047 (2021).
  15. Saito, Y., et al. Lewy body pathology involves the olfactory cells in Parkinson's disease and related disorders. Mov Disord. 31 (1), 135-138 (2016).
  16. De Luca, C. M. G., et al. Efficient RT-QuIC seeding activity for α-synuclein in olfactory mucosa samples of patients with Parkinson's disease and multiple system atrophy. Transl Neurodegener. 8, 24(2019).
  17. Stefani, A., et al. Alpha-synuclein seeds in olfactory mucosa of patients with isolated REM sleep behaviour disorder. Brain. 144 (4), 1118-1126 (2021).
  18. Ucciferri, C. C., et al. Scoring central nervous system inflammation, demyelination, and axon injury in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (204), e65738(2024).
  19. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological α-synuclein in brain. Brain. 136 (Pt 4), 1128-1138 (2013).
  20. Sawamura, M., et al. Single-dose intranasal administration of α-syn PFFs induce lewy neurite-like pathology in olfactory bulbs. Parkinsonism Relat Disord. 112, 105440(2023).
  21. Guo, J. J., et al. Intranasal administration of α-synuclein preformed fibrils triggers microglial iron deposition in the substantia nigra of Macaca fascicularis. Cell Death Dis. 12 (1), 81(2021).
  22. Macdonald, J. A., et al. Assembly of α-synuclein and neurodegeneration in the central nervous system of heterozygous M83 mice following the peripheral administration of α-synuclein seeds. Acta Neuropathol Commun. 9 (1), 189(2021).
  23. Abdelmotilib, H., et al. α-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration. Neurobiol Dis. 105, 84-98 (2017).
  24. Tarutani, A., et al. The effect of fragmented pathogenic α-Synuclein seeds on prion-like propagation. J Biol Chem. 291 (36), 18675-18688 (2016).
  25. Taguchi, T., Ikuno, M., Yamakado, H., Takahashi, R. Animal model for prodromal Parkinson's disease. Int J Mol Sci. 21 (6), 1961(2020).
  26. Bousset, L., Brundin, P., Böckmann, A., Meier, B., Melki, R. An efficient procedure for removal and inactivation of alpha-Synuclein assemblies from laboratory materials. J Parkinsons Dis. 6 (1), 143-151 (2016).
  27. Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces. Sci Rep. 8, 10788(2018).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تقنية الإعطاء داخل الأنف لمجاميع α-Synuclein
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.