هنا ، نقدم طريقة محسنة لإزالة جزء من مجمعات البويضات الركامية على الفور بعد استرجاع البويضات لتسريع عملية مراقبة التلقيح الاصطناعي ، وتقليل الوقت اللازم لإزالة الخلايا الحبيبية ، وتقليل تعرض البويضات للعناصر الخارجية ، ولا يعيق نمو الجنين ، مما يؤدي في النهاية إلى تحسين كفاءة الإجراءات المختبرية لأطفال الأنابيب.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الإزالة الجزئية الفورية لمجمعات الركام والبويضات: نهج مكرر للمراقبة السريعة للتخصيب في المختبر
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
على الرغم من التقدم السريع في التقنيات السريرية والمخبرية للتخصيب في المختبر (IVF) ، لا تزال نسبة كبيرة (10٪ -15٪) من المرضى يعانون من اضطرابات الإخصاب ، مما يؤدي إلى انخفاض معدلات الإخصاب وإنتاج أجنة غير قابلة للحياة. يتضمن الإخصاب قصير المدى الإزالة المبكرة للخلايا الحبيبية لمراقبة بثق الجسم القطبي الثاني ، مما يتيح تقييم الإخصاب والتدابير العلاجية المبكرة لمعالجة معدلات الإخصاب المنخفضة وفشل الإخصاب الكامل. ومع ذلك ، فإن ملاحظة الإخصاب قصير المدى في التلقيح الاصطناعي تعيقها تحديات مثل المجموعات الكبيرة غير المعالجة من مجمعات البويضات الركامية والالتصاق بين البويضات ، مما يستلزم إجراءات خارجية معقدة لإزالة الخلايا الحبيبية ، ومدة المراقبة الطويلة. لمعالجة هذه المشكلة ، تقترح هذه الدراسة طريقة للإزالة الجزئية الفورية للخلايا الحبيبية بعد استرجاع البويضات. يعمل هذا النهج على تبسيط المراحل اللاحقة من الإخصاب قصير المدى ومراقبة الإخصاب التقليدية ، ويقلل من الوقت اللازم لبثق البويضات ، ويقلل من احتمالية حدوث تأثيرات بيئية خارجية على البويضات ، ويقلل من خطر فقدان نافذة مراقبة الإخصاب الحرجة. وبالتالي ، فإن الدراسة تسفر عن أدلة سريرية جديدة تهدف إلى تعزيز الكفاءة التشغيلية للمختبرات الجنينية في التلقيح الاصطناعي.
المقدمة
في مجال الإخصاب في المختبر - نقل الأجنة (IVF-ET) ، يقع معدل الإخصاب النموذجي في حدود 60٪ إلى 80٪ 1. ومع ذلك ، فإن ما يقرب من 4٪ إلى 16٪ من الحالات تواجه إما فشلا كاملا في الإخصاب أو معدلات إخصاب منخفضة ، مما يمثل تحديات في التنبؤ2،3. لتحسين نتائج الحمل السريري وتقليل حالات عدم الإخصاب الكامل والإخصاب المنخفض ، فإن استخدام الإخصاب قصير المدى في إجراءات التلقيح الاصطناعي آخذ في الازدياد4. يستلزم هذا النهج الإزالة الفورية للخلايا الحبيبية لمراقبة بثق الجسم القطبي الثاني ، وتقييم حالة الإخصاب ، وربما إجراء حقن علاجي للحيوانات المنوية داخل الهيولى (ICSI). تكون الرابطة بين مركب الخلايا الركامية للبويضة (OCCC) والبويضة أقوى أثناء الإخصاب قصير المدى مقارنة بالتخصيب التقليدي بين عشية وضحاها ، مما يزيد من التحدي المتمثل في إزالة OCCC5. يمكن أن تؤدي عوامل مثل زيادة أعداد البويضات ، أو مجمعات OCCC الكبيرة ، أو الالتصاقات بين البويضات إلى أوقات إزالة الخلايا الحبيبية لفترات طويلة أثناء الإخصاب قصير المدى ، وبالتالي إطالة فترة بقاء البيض خارج الحاضنة4. لتحسين فترة مراقبة الإخصاب ، تم ابتكار نهج معدل بعد استرجاع البويضات ، يتضمن استئصالا جزئيا للخلايا الحبيبية من البويضات ذات مجمعات OCCC الكبيرة. تساعد هذه التقنية في الاحتفاظ بالخلايا الحبيبية المحيطة بالبويضات ، والحفاظ على سلامة بنية البويضةالمبكرة 6 ، والسماح لهذه الخلايا بالاستمرار في توفير العوامل الحيوية لنضج البويضات وربط الأجنة الإخصاباللاحق 7.
وبالتالي ، تركز هذه الدراسة على المرضى الذين يخضعون لعلاج أطفال الأنابيب في مركز الطب التناسلي كمشاركين في البحث ، بهدف التحقيق في تأثير طريقة الاستئصال الميكانيكي للخلايا الحبيبية الجزئية الفورية على مدة إجراءات كل من الإخصاب قصير المدى ومراقبة الإخصاب طوال الليل مع تقييم نتائج الإخصاب الطبيعي والتطور في المرحلة المتأخرة. يهدف هذا البحث إلى تقديم رؤى قيمة لتعزيز إجراءات مختبر الأجنة في أطفال الأنابيب.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع الإجراءات وفقا لإجراءات التشغيل القياسية لقسم الطب التناسلي في مستشفى ميتشو الشعبي وخضعت للمراجعة من قبل لجنة الأخلاقيات في نفس القسم. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من كل زوجين مشاركين. تضمنت الدراسة مشاركين يخضعون لدورة التلقيح الاصطناعي الأولى مع الانقسام أو نقل الأجنة في مرحلة الكيسة الأريمية ، بالإضافة إلى الإناث بين 20 و 45 عاما. تضمنت معايير الاستبعاد استخدام بويضات / منوية من المتبرع بها وحالات محددة مثل تشوهات الرحم الخلقية أو الثانوية (مثل الرحم الحاجز ، الرحم وحيد القرنية ، ثنائي الرحم) ، العضال الغدي ، الأورام الليفية تحت المخاطية الرحمية ، أو سمك بطانة الرحم أقل من 7 مم في يوم نقل الجنين. تم تقسيم ما مجموعه 115 مريضا تم تسجيلهم بين ديسمبر 2023 وفبراير 2024 إلى مجموعتين بناء على ما إذا كان قد تم إجراء الإزالة الجزئية الفورية ل OCCC.
1. التحضير قبل استرجاع البويضات
- ضع أطباق التقاط البويضات (جدول المواد) في الحاضنة عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
- احتضان 12 مل من وسيط معالجة البصيلات (جدول المواد) في أنابيب اختبار قاعية مستديرة سعة 14 مل عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. انقل الأنابيب إلى رف أنبوب الاختبار المسخن مسبقا قبل 30 دقيقة من استرجاع البويضات.
- تحضير وسط معالجة البصيلات: أضف 9 مل من وسيط معالجة البصيلات إلى أنبوب اختبار دائري القاع سعة 14 مل (جدول المواد) واحتضانه عند 37 درجة مئوية طوال الليل. في يوم استرجاع البويضات ، انقل 4.5 مل من الوسط إلى طبق التقاط البويضات المحتضن مسبقا (جدول المواد) مغطى ب 2 مل من زيت البارافين بنسبة 100٪.
- تحضير محلول تنظيف OCCC: أضف 4.5 مل من وسط التسميد (جدول المواد) إلى طبق التقاط البويضات واحتضانه عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
- تحضير وسط التسميد: أضف 1 مل من وسط التسميد إلى طبق 6 سم مغطى بزيت البارافين بنسبة 100٪ (جدول المواد) واحتضنه عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
- تحضير ماصات باستور الزجاجية (جدول المواد): قم بتخفيف حدة الأطراف وتدويرها برفق عن طريق حرقها على مصباح كحول لمدة 5 ثوان تقريبا (الشكل 1). قم بتوصيل رأس شفط بطرف ماصات باستور، مع التأكد من قدرتها على لمس قاع الطبق دون خدش. اشطف ماصات باستور الزجاجية وأطباق 10 سم بوسط معالجة البصيلات.
2. استرجاع البويضات والإزالة الجزئية الفورية ل OCCC
ملاحظة: استخدم المجهر المجسم أثناء إجراءات عزل البويضات وإزالة OCCC. للحصول على أفضل النتائج ، يجب تنفيذ جميع الإجراءات على طاولة تسخين مع التحكم في درجة الحرارة (37 درجة مئوية) ، ويجب تسخين جميع المعدات مسبقا قبل 30 دقيقة من استرجاع البويضات.
- جمع السائل الجريبي قبل الإباضة أثناء استرجاع البويضات وفقا لتوصيات ESHRE8.
- باختصار ، استخدم إبرة 17 جم لاستعادة البويضات تحت توجيه الموجات فوق الصوتية عبر المهبل. يتراوح الضغط السلبي المناسب من 120-140 مم زئبق.
- صب السائل الجريبي الذي تم جمعه في أنبوب اختبار دائري القاع سعة 14 مل في طبق 10 سم (جدول المواد) ، مع الحفاظ على عمق سائل أقل من 0.5 سم. ضع الطبق على منصة درجة حرارة ثابتة (37 درجة مئوية).
- راقب OCCC تحت مجهر مجسم لتأكيد وجود البويضات وتقييم نضجها.
ملاحظة: يتم تقييم نضج OOOC بناء على مورفولوجيا الخلايا الركامية ورؤية بعض هياكل البويضات9. - قم بشفط OCCC باستخدام ماصة باستور غير حادة. قم بإمالة الطبق مقاس 10 سم حوالي 15 درجة وافرد كل OCCC الكبير. تجنب شفط البويضة والخلايا الحبيبية المحيطة بها داخل دائرة نصف قطرها 2500 ميكرومتر. قم بقطع الخلايا الحبيبية الزائدة باستخدام ماصة باستور على طول المحور الطولي (الشكل 2). الخطوات التفصيلية هي كما يلي:
- راقب بالعين المجردة لمعرفة ما إذا كانت هناك كتلة مخاطية شفافة رمادية في السائل الجريبي. إذا لم يتم العثور عليها ، فابحث بسرعة عن الكتلة المخاطية الشفافة الرمادية عن طريق الدوران في اتجاه عقارب الساعة من الخارج إلى الداخل تحت مجهر مجسمة ، OCCC.
- تأكد مما إذا كانت هناك بويضات في OCCC وقم بإجراء تقييم أولي لنضج البويضات.
- بعد ذلك، قم مسبقا بإعداد ماصة شفط من السيليكون باستخدام ماصة باستور مستديرة مصقولة باللهب، واستنشق OCCC، وفي الوقت نفسه، ارفع طبق الاستزراع برفق في موضع الساعة 9-10 باستخدام إصبع الخاتم الأيسر لليد الذي يمسك الطبق مقاس 10 سم، مع إمالة طبق الاستزراع بحوالي 15 درجة إلى اليسار (وضع إصبع البنصر أسفل الطبق هو الزاوية المطلوبة تقريبا).
- أثناء بصق OCCC المستنشق في موضع الساعة 11 للطبق ، قم بإطالة الطبق برفق أفقيا إلى اليمين. بعد ذلك ، لاحظ حجم الخلايا الحبيبية حول OCCC الموسع. بعد ذلك، في الموضع المناسب ل OCCC الممدود أفقيا، استخدم ماصة باستور لعمل قطع تنازلي سريع ولطيف على الخلايا الحبيبية الزائدة من أعلى إلى أسفل.
- انقل OCCC المقطوع إلى طبق تجميع يحتوي على محلول تنظيف OCCC. صب السائل الجريبي المتبقي في حاوية عينة معقمة (جدول المواد). كرر هذه الخطوات حتى يتم جمع جميع المجمعات.
3. تحضير السائل المنوي والتلقيح في المختبر
- اجمع عينات السائل المنوي عن طريق القذف في صباح يوم استرجاع البويضات. تقييم تركيز المنوية وحركتها ومورفولوجيتها تحت مجهر ضوئي وفقا لمعايير منظمة الصحة العالمية (منظمة الصحة العالمية ، 2010)10. بعد ذلك ، انقل حبيبات المنوية إلى أنبوب طرد مركزي جديد واغسلها مرتين في وسط الإخصاب11. احتضنها عند 6٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 37 درجة مئوية لحين الحاجة.
- تلقيح OCCCs مع 1 × 105 إلى 3 × 105 منوية متحركة لكل مليلتر في قطرة واحدة بعد حوالي 2-3 ساعات من الاسترجاع في طبق الإخصاب (جدول المواد). أضف 6-8 OCCC و 1 مل من وسط التسميد إلى طبق التسميد.
ملاحظة: بعد غسل OCCC اللزج ، يتم نقلها إلى طبق التسميد باستخدام ماصة باستور. حرر OCCC واحدا في كل مرة، وارفع الماصة برفق عن سطح السائل قبل إطلاق الماصة التالية، مع التأكد من وضع كل OCCC على حدة في الطبق لمنع التكتل.
4. إزالة الخلايا الركامية
- للتخصيب قصير المدى ، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
- احتضان OCCCs مع المنوية لمدة 4-6 ساعات. بعد الحضانة ، قم بإزالة الخلايا الركامية المحيطة بالبويضات ميكانيكيا.
- استنشق البويضات باستخدام ماصة بقطر داخلي أصغر قليلا من البويضات لضمان الإزالة الكاملة للخلايا الركامية.
- تأكد من الإخصاب من خلال ملاحظة وجود جسمين قطبين. تعتبر البويضات التي تظهر جسما قطبيا ثانيا مخصبة.
- تحديد الحالات التي لا تظهر الجسم القطبي الثاني على أنها فشل في الإخصاب ، مما يستلزم إنقاذ الحقن المجهري.
- للتخصيب المنتظم ، بعد 18-20 ساعة من الحضانة المشتركة ، قم بإزالة الخلايا الركامية باستخدام الماصات لتقييم الإخصاب.
5. زراعة الأجنة
- زراعة ومراقبة البويضات المخصبة لمدة 3-5 أيام بعد استرجاع البويضات. تقييم الإخصاب بعد 20 ساعة من التلقيح لتحديد عدد النوى. بعد ذلك ، قم بزراعة كل زيجوت على حدة في قطرة متوسطة ونقل الأجنة بعد الإخصاب إلى وسط الانقسام.
ملاحظة: يجب أن يتكون الجنين المثالي بحلول اليوم الثالث من ستة أو أكثر من الأريمات المتساوية في الحجم ويظهر معدل تجزئة أقل من أو يساوي 10٪ 12. - يعتمد قرار المضي قدما في زراعة الكيسة الأريمية على تفضيلات المريض والظروف المحددة ، مثل كمية ونوعية الأجنة التي تم الحصول عليها في اليوم الثالث. انقل أجنة اليوم 3 إلى وسط الكيسة الأريمية وقم بتقييمها في اليوم 5. استخدم نظام تسجيل غاردنر لتقييم الأكياس الأريمية ، مع درجات الأكياس الأريمية عالية الجودة ≥ 4 BB13.
6. قياسات النتائج والتحليل الإحصائي
- أبلغ عن البيانات المستمرة كمتوسط ± الانحراف المعياري وعبر عن البيانات الترتيبية كنسب. قم بإجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t للطالب أو اختبار مربع كاي في برنامج تحليل البيانات المناسب (هنا ، IBM SPSS Statistics). اعتبر مستوى الدلالة P < 0.05 ذا دلالة إحصائية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في المجموعة التي خضعت لإجراءات حضانة قصيرة ، تم استبعاد المرضى الذين تلقوا الإنقاذ. من بين 47 مريضا تلقوا التلقيح قصير الأمد ، لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية من حيث عمر المرضى وعدد البويضات المستخرجة (الجدول 1). أدت الإزالة الجزئية الفورية ل OCCC إلى تخفيف OCCC المتبقي حول البويضات (الشكل 3) ، مما يسهل اكتشاف جسم قطبي ثان. كان متوسط وقت الإجراء أقصر بشكل ملحوظ في الإزالة الجزئية لمجموعة OCCC (4.42 ± 1.68 دقيقة مقابل 9.29 ± 5.04 دقيقة ، P < 0.001) مقارنة بالمجموع...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن أن تؤدي الإزالة الجزئية الفورية للخلايا الحبيبية إلى تسريع عملية التفكك المبكرة للتخصيب قصير المدى ، وتقليل وقت المراقبة للجسم القطبي الثاني في كل من الإخصاب قصير المدى والتلقيح الاصطناعي التقليدي ولا يضر بنمو الجنين اللاحق. حاليا ، تستخدم المختبرات على مستوى العالم استراتيجيات مختلفة للتخفيف من اضطرابات الإخصاب ومعدلات النجاح المنخفضة. تتضمن الطريقة المفضلة إزالة الخلايا الحبيبية لمراقبة الجسم القطبي الثاني بعد 4-6 ساعات من الإخصاب قصيرالمدى 14. تنشأ التحديا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.
شكر وتقدير
يعرب المؤلفون عن امتنانهم لموظفي قسم الطب التناسلي في مستشفى ميتشو الشعبي في قوانغدونغ ، الصين ، لمشاركتهم النشطة في هذه الدراسة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| جي آي في فوت بلس | فيترولايف | 10136 | |
| أوفويل | فيترولافيف | 10029 | |
| جي مماسوبس بلس | فيترولايف | 10130 | |
| فالكون 3003 طبق | كورنينج | 353003 | |
| فالكون 3001 طبق | كورنينج | 353001 | |
| فالكون 2001 أنبوب | كورنينج | 352001 | |
| فالكون 4013 كوب | كورنينج | 354013 | |
| فالكون 3037 طبق | كورنينج | 351058 | |
| باستور ماصة | داروين | D1150-5P |
المراجع
- Chen, C., Kattera, S. Rescue ICSI of oocytes that failed to extrude the second polar body 6 h post-insemination in conventional IVF. Hum Reprod. 18 (10), 2118-2121 (2003).
- Barlow, P., et al. Fertilization failure in IVF: why and what next. Hum Reprod. 5 (4), 451-456 (1990).
- Kuczyński, W., et al. Rescue ICSI of unfertilized oocytes after IVF. Hum Reprod. 17 (9), 2423-2427 (2002).
- He, Y., et al. Effect of early cumulus cells removal and early rescue ICSI on pregnancy outcomes in high-risk patients of fertilization failure. Gynecol Endocrinol. 34 (8), 689-693 (2018).
- Turathum, B., Gao, E. M., Chian, R. C. The function of cumulus cells in oocyte growth and maturation and in subsequent ovulation and fertilization. Cells. 10 (9), 2292(2021).
- Bárcena, P., Rodríguez, M., Obradors, A., Vernaeve, V., Vassena, R. Should we worry about the clock? Relationship between time to ICSI and reproductive outcomes in cycles with fresh and vitrified oocytes. Hum Reprod. 31 (6), 1182-1191 (2016).
- Telfer, E. E., Grosbois, J., Odey, Y. L., Rosario, R., Anderson, R. A. Making a good egg: human oocyte health, aging, and in vitro development. Physiol Rev. 103 (4), 2623-2677 (2023).
- D'Angelo, A., et al. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up. Hum Reprod Open. 2019 (4), hoz025(2019).
- Hu, Y., et al. Transcriptomic profiles reveal the characteristics of oocytes and cumulus cells at GV, MI, and MII in follicles before ovulation. J Ovarian Res. 16 (1), 225(2023).
- Lu, W. H., Gu, Y. Q. Insights into semen analysis: a Chinese perspective on the fifth edition of the WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. Asian J Androl. 12 (4), 605-606 (2010).
- Delos Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Hum Reprod. 31 (2015), 685-686 (2016).
- Nagy, Z. P., et al. Pronuclear morphology evaluation with subsequent evaluation of embryo morphology significantly increases implantation rates. Fertil Steril. 80 (1), 67-74 (2003).
- Gardner, D. K., Lane, M., Stevens, J., Schlenker, T., Schoolcraft, W. B. Reprint of: Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome: towards a single blastocyst transfer. Fertil Steril. 112 (4), Suppl1 e81-e84 (2019).
- Esfandiari, N., Claessens, E. A., Burjaq, H., Gotlieb, L., Casper, R. F. Ongoing twin pregnancy after rescue intracytoplasmic sperm injection of unfertilized abnormal oocytes. Fertil Steril. 90 (1), e5-e7 (2008).
- Wetzels, A. M., et al. The effects of co-culture with human fibroblasts on human embryo development in vitro and implantation. Hum Reprod. 13 (5), 1325-1330 (1998).
- Kattera, S., Chen, C. Short coincubation of gametes in in vitro fertilization improves implantation and pregnancy rates: a prospective, randomized, controlled study. Fertil Steril. 80 (4), 1017-1021 (2003).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
