مقالة منهجية

تحسين جمع الدموع في الفئران لتحليل mRNA والبروتين

2.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66955

⸱

يوليو 19, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Farmacobiología, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento, CINVESTAV Sede Sur

في هذه المقالة

ملخص

إن تحديد الحمض النووي الريبي والمؤشرات الحيوية للبروتين من الدموع في نماذج الفئران يحمل وعدا كبيرا للتشخيص المبكر في الأمراض المختلفة. توفر هذه المخطوطة بروتوكولا شاملا لتحسين فعالية وكفاءة mRNA وعزل البروتين من دموع الفئران.

الملخص

الفيلم المسيل للدموع هو سائل حيوي ديناميكي للغاية قادر على عكس التغيرات الجزيئية المرتبطة بالأمراض ، ليس فقط في سطح العين ولكن أيضا في الأنسجة والأعضاء الأخرى. يوفر التحليل الجزيئي لهذا السائل الحيوي طريقة غير جراحية لتشخيص الأمراض أو مراقبتها ، وتقييم فعالية العلاج الطبي ، وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة. نظرا لحجم العينة المحدود ، يتطلب جمع عينات المسيل للدموع مهارات محددة وأدوات مناسبة لضمان الجودة العالية والكفاءة القصوى. تم وصف منهجيات مختلفة لأخذ عينات الدموع في الدراسات البشرية. في هذه المقالة ، يتم تقديم وصف شامل لبروتوكول محسن ، مصمم خصيصا لاستخراج معلومات البروتين المرتبطة بالدموع من النماذج الحيوانية التجريبية ، وخاصة الفئران. تتضمن هذه الطريقة التحفيز الدوائي لإنتاج الدموع في الفئران البالغة من العمر شهرين ، تليها جمع العينات باستخدام شرائط شيرمر وتقييم فعالية وكفاءة البروتوكول من خلال الإجراءات القياسية ، SDS-PAGE ، qPCR ، و PCR الرقمي (dPCR). يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة للتحقيق في توقيع البروتين المسيل للدموع في مجموعة متنوعة من النماذج التجريبية. من خلال إنشاء بروتوكول لأخذ عينات الدموع بأسعار معقولة وموحدة ومحسنة للنماذج الحيوانية ، كان الهدف هو سد الفجوة بين البحوث البشرية والحيوانية ، وتسهيل الدراسات الانتقالية وتسريع التقدم في مجال أبحاث أمراض العين والجهازية.

المقدمة

تعتبر الدموع ترشيحا فائقا للبلازما وقد وصفت أيضا بأنها سائل وسيط بين مصل البلازما والسائل النخاعي بسبب التداخل الكبير في الجزيئات الحيوية التي تشترك فيها1. تم الإبلاغ عن أن الدموع البشرية تحتوي على البروتينات والدهون المسيلة للدموع والمستقلبات والكهارل2. في الآونة الأخيرة ، تم تحديد جزيئات حيوية أخرى مثل mRNAs و miRNAs والحويصلات خارج الخلية3،4،5،6،7.

في البشر ، توجد الدموع القاعدية في الفيلم المسيل للدموع ، والذي يتكون من ثلاث طبقات: طبقة الدهون الخارجية ، التي تحافظ على سطح المسيل للدموع على نحو سلس للسماح لنا بالرؤية من خلاله ومنع تبخر الدموع. الطبقة المائية الوسطى ، التي تحافظ على رطوبة العين ، تصد البكتيريا ، وتحمي القرنية ، وتشكل 90 ٪ من الفيلم المسيل للدموع ؛ وأخيرا ، طبقة الميوسين ، وهي عائلة من البروتينات عالية الوزن الجزيئي التي تتلامس مع القرنية وتسمح للدموع بالالتصاق بالعين8. يبدأ توزيع الدموع عبر سطح العين بإفراز من الغدة الدمعية. ثم يتم توجيه هذا السائل عبر القنوات الدمعية ليمر فوق سطح العين ويتدفق إلى قنوات الصرف. تسمح كل طرفة للدموع بالانتشار بالتساوي على العين بأكملها ، مما يحافظ على رطوبتها9.

الفيلم المسيل للدموع هو سائل حيوي ديناميكي للغاية قادر على عكس التغيرات الجزيئية التي تحدث ليس فقط على سطح العين ولكن أيضا في الأنسجة والأعضاء الأخرى. يمثل تحليل التعبير التفاضلي في هذا السائل الحيوي نهجا واعدا لاكتشاف المؤشرات الحيوية في الأمراض البشرية10,11. تم تسهيل استخدام الفيلم المسيل للدموع كمصدر للمؤشرات الحيوية للتشخيص المبكر في مختلف الأمراض إلى حد كبير من خلال وجود طرق جمع غير جراحية. تتضمن الطريقة الأكثر شيوعا لجمع الدموع في العيادات البشرية والبيطرية الدعم القائم على الغشاء (شريط شيرمر) ، والذي يعمل على مبدأ العمل الشعري ، مما يسمح للماء في الدموع بالانتقال على طول شريط اختبار الورق أو الأنابيب الشعرية الموضوعة في كيس الملتحمة السفلي للموضوع12،13،14. على الرغم من القيود المتأصلة في الحصول على حجم عينة صغير من خلال هذه الطريقة ، فإن التحليل الكيميائي الحيوي لتكوين المسيل للدموع باستخدام تقنيات حساسة مختلفة قد سهل تحديد جزيئات العلامات الحيوية المحتملة11,15. تم توثيق بروتوكولات تحسين وتقييم شطف البروتينات المسيلة للدموع من شرائط شيرمر والشعيرات الدموية في المرضى من البشربشكل جيد 16,17. ومع ذلك ، تتوفر أوصاف كاملة للبروتوكولات المحسنة المصممة خصيصا لاستخراج المعلومات الجزيئية المتعلقة بالدموع من النماذج الحيوانية التجريبية ولكنها نادرة. الطرق الحالية ، مثل تحريض المسيل للدموع من خلال التحفيز المباشر للغدة الدمعية18 ، مع السماح بجمع كميات أكبر ، هي طرق غازية ويمكن أن تسبب إزعاجا للحيوانات. تم وصف الطرق غير الغازية ، مثل جمع الدموع من سطح العين ، كطريقة لعزل الحمض النووي و miRNAs19,21.

يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء طريقة فعالة من حيث التكلفة ومحسنة لجمع ومعالجة الدموع في الفئران. تعطي الطريقة الأولوية لعدم التدخل الجراحي مع الحصول على كميات كافية من الدموع مناسبة للتحليل الجزيئي من خلال تقنيات مثل SDS-PAGE و qPCR و dPCR. يمكن بعد ذلك استخدام معلومات محتوى البروتين المستخرج والحمض النووي الريبوزي المرسال لتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة في النماذج التجريبية الحالية للمرض.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة هنا من قبل لجنة أخلاقيات في Cinvestav (CICUAL، # 0354/23). تمت معالجة المختبر والتعامل معها بما يتفق بدقة مع إرشادات استخدام الخاصة بالمجلة ووفقا لبيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية. تم تقييم صحة العين قبل وبعد الإجراءات من خلال تقييم إفرازات العين وتورم الجفون وتشوهات العين والتغيرات السلوكية.

1. وإعداد الكاشف

  1. استخدم ثلاثة فئران ذكور C57BL / 6 تبلغ من العمر شهرين لكل نسخة مكررة لإجراء العملية ، بوزن يبدأ من ~ 25 جم (الشكل 1). قم بمعالجة كل ماوس على حدة وضعه على وسادة تدفئة للحفاظ على الدفء.
  2. للحث على إفراز الدموع ، قم بإعداد محلول مرق من بيلوكاربين عند 20 ملغ / مل باستخدام الماء المعقم.
  3. اقطع شرائط اختبار شيرمر بطول 5 مم وثني كل شريط عند الشق بزاوية 90 درجة.
  4. تحضير 250 ميكرولتر من الماء المعقم مع مثبط الأنزيم البروتيني (1 قرص لمدة 50 مل ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة).

2. تحفيز إنتاج المسيل للدموع وجمعها

  1. وزن كل فأر على حدة لحساب الجرعة المناسبة من العلاجات.
  2. لتحفيز إنتاج الدموع، يتم تطبيق 30 ملغ/كغ من بيلوكاربين داخل الصفاق بواسطة حقنة أنسولين 6 مم (الشكل 1ب). انتظر لمدة 2 دقيقة بعد حقن المخدرات حتى تظهر آثاره.
    ملاحظة: تعذر الحصول على بيانات من غير المحفزة بسبب محدودية توافر السائل المسيل للدموع.
  3. اجمع الدموع عن طريق وضع نهاية كل جزء من شريط شيرمر فوق مركز الجفن السفلي بزوج من الملقط واحتفظ به في مكانه حتى يصل المسيل للدموع إلى حد الشريط (الشكل 1 ج). ثم استبدل الشريط. ضع 2 شريط شيرمر بالتتابع في كل عين ، مع فاصل زمني مدته 2 دقيقة بين الشرائط للتجميع. تتطلب عملية جمع المسيل للدموع حوالي أربع شظايا شريطية تزيد عن 10 دقائق لكل فأر.
  4. ضع شظايا شريط شيرمر في أنابيب معقمة على الثلج لتجنب تدهور المكونات. بمجرد انتهاء المجموعة ، ابدأ معالجة المسيل للدموع.

3. عزل البروتين

  1. ضع شظايا الشريط في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 600 ميكرولتر يحتوي على 20 ميكرولتر من الماء المعقم مع مثبط الأنزيم البروتيني وأجهزة طرد مركزي لمدة 1 ساعة عند 600 × جم عند 4 درجات مئوية ، كما هو موضح سابقا17 (الشكل 1 د).
  2. قم بعمل ثقب باستخدام إبرة حاقن من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 7.5 سم عند طرف الأنبوب سعة 600 ميكرولتر الذي يحتوي على العينة (الشكل 1E). بعد ذلك ، انقل هذا الأنبوب المثقوب إلى أنبوب معقم جديد سعة 1.5 مل وطرد مركزي العينات عند 12000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، كما ورد سابقا17 ، لاستعادة حجم الدموع المخففة. سيكون حجم الفيلم المسيل للدموع (طاف) في الجزء السفلي من الأنبوب.
  3. قم بإنشاء تجمع بروتين من خلال الجمع بين المادة الطافية المستردة من جميع العينات. في هذه التجربة ، تم الحصول على حجم إجمالي يبلغ حوالي 200 ميكرولتر.
    ملاحظة: يمكن أن يستمر إنتاج المسيل للدموع لأكثر من 1 ساعة. خلال هذا الوقت ، لا يزال من الممكن جمع الدموع.
  4. حدد محتوى البروتين الكلي للتجمع المسيل للدموع باستخدام طريقة برادفورد القياسية22.

4. تحليل SDS-PAGE

  1. سخني عينات البروتين على حرارة 99 درجة مئوية لمدة 4 دقائق لتشويه البروتينات. دوامة العينات لفترة وجيزة لخلط المكونات.
  2. قم بتحميل 30 ميكروغرام من محتوى البروتين الكمي من كل عينة على هلام SDS-PAGE بنسبة 10٪ (الجدول 1) وقم بتشغيل العينات عند 90 فولت لمدة 2 ساعة باستخدام الطريقة القياسية23.
  3. بعد الرحلان الكهربائي ، قم بتغطية الجل بمحلول تلطيخ (الجدول 1) واحتضانه لمدة 30 دقيقة لتلطيخ البروتينات.
  4. شطف الجل بمحلول إزالة البقع عدة مرات حتى تصبح الخلفية واضحة وتكون أشرطة البروتين مرئية.
  5. الحصول على الصور مع نظام توثيق هلام.

5. عزل mRNA ل qPCR و PCR الرقمي

  1. ضع الشرائط في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 600 ميكرولتر يحتوي على 20 ميكرولتر من الماء المعقم. قم بعمل ثقب في طرف الأنبوب الذي يحتوي على العينة ، وضعها في أنبوب معقم جديد سعة 1.5 مل ، وأجهزة طرد مركزي ، كما ورد سابقا في دموع الإنسان3 ، لمدة 20 دقيقة عند 2000 × جم عند 4 درجات مئوية (الشكل 1E-H).
  2. إنشاء تجمع من جميع العينات. كان الحجم المستعاد لهذه التجربة حوالي 22 ميكرولتر من المادة الطافية لكل فأر ، أي 66 ميكرولتر من الحجم الكلي. ضع الأنابيب على الثلج الجاف لتجنب تدهور الجزيئات الحيوية.
  3. أضف 200 ميكرولتر من محلول أحادي الطور من الفينول وأيزوثيوسيانات الغوانيدينيوم (تم الحصول عليها تجاريا) وقم بالتجانس عن طريق الماصة. اتركه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في هذه الخطوة ، يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع أو -70 درجة مئوية لعدة أشهر.
  4. أضف 40 ميكرولتر من الكلوروفورم واخلطه في دوامة لمدة 15 ثانية. واسمحوا الوقوف لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي عند 10000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  5. انقل الطور المائي بعناية (دون أخذ الطور البيني) إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
  6. أضف 0.5 ميكرولتر من الجليكوجين (0.05 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى 100 ميكرولتر من الأيزوبروبانول واخلطه عن طريق الماصة. يتم ترسيب الجليكوجين مع الحمض النووي الريبي ولا يتداخل مع الخطوات اللاحقة.
  7. اتركه لمدة 10 دقائق عند -20 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب بسرعة طاف.
  8. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول البارد بنسبة 75٪ وأعد تعليق حبيبات الحمض النووي الريبي عن طريق الدوامة. جهاز طرد مركزي عند 8000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  9. صب الإيثانول. بدون قلب الأنبوب ، اتركه يجف في الهواء لمدة 20-30 دقيقة. أضف 20 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase وأعد التوزيع.
  10. تابع قراءة الكثافة الضوئية في مقياس الطيف الضوئي microvolume عند 260 نانومتر و 280 نانومتر لتقييم نقاء الحمض النووي الريبي. يجب أن تكون العينات على الجليد.
    ملاحظة: لا يمكن ملاحظة النطاقات الريبوسومية 28S و 18S باستخدام هلام الأغاروز بسبب طبيعة العينة. يمكن تحليل وجود الحمض النووي الريبي الآخر ، مثل miRNAs أو mRNAs ، باستخدام محلل حيوي ، كما هو موضح سابقا18.
  11. توليف cDNA من الحمض النووي الريبي الدموع باستخدام مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    1. ابدأ بإدخال الحمض النووي الريبي في نطاق من 10 نانوغرام -5000 نانوغرام ؛ وفقا للمجموعة المستخدمة ، امزجها مع 1 ميكرولتر من Oligo (dT) وما يصل إلى 12 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. قم بتدويره عند 500 × جم لمدة 30 ثانية واحتضانه عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. أضف إلى أنبوب الخلط 4 ميكرولتر من مخزن التفاعل 5x ، و 1 ميكرولتر من مثبط RNase ، و 2 ميكرولتر من مزيج dNTP ، و 1 ميكرولتر من النسخ العكسي.
    3. أدر الأنبوب عند 500 × جم لمدة 30 ثانية لسحب الخليط لأسفل. ثم احتضان الأنبوب على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. قم بإنهاء التفاعل عن طريق احتضان الأنبوب عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  12. نظرا لانخفاض تركيز mRNA في الدموع ، يوصى باستخدام cDNA غير المخفف ل qPCR24. لهذه التجربة ، تم استخدام 150 نانوغرام من cDNA. قم بإجراء qPCR باستخدام بادئات DNMT3a :
    إلى الأمام: GCCGAATTGTGTCTTGGTGGATGACA ، العكس: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA و GAPDH التمهيدي:
    إلى الأمام: ACTGGCATGGCCTTCCGTGTTCTTA ، عكس: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC باتباع التعليمات من الشركات المصنعة وإجراءات المعدات.
    1. بالنسبة لدورة qPCR ، استخدم البرنامج التالي: تمسخ أولي: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها 45 دورة من C 95 درجة مئوية - 15 ثانية ، 60 درجة مئوية - 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية - 30 ثانية ، تنتهي بتمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. قم بإجراء تحليل منحنى الذوبان لتقييم وجود دايمرات أولية أو مضخمات غير محددة في التفاعل. بدأ منحدر درجة الحرارة من 50 درجة مئوية إلى 99 درجة مئوية نهائية ، مع تعليق أولي قدره 90 ثانية للخطوة الأولى وعقد 5 ثوان بين كل خطوة.
    3. بالنسبة إلى dPCR25 ، قم بإجراء التخفيفات التسلسلية لتحسين كمية cDNA المطلوبة للكشف عن mRNA محل الاهتمام. في هذه التجربة، استخدم التخفيفات التالية من الحمض النووي المكمل (cDNA) في الماء الخالي من النيوكلياز: 150 نانوغرام، و75 نانوغرام، و37.5 نانوغرام، و18.75 نانوغرام من الحمض النووي المكمل (cDNA). تم استخدام الاشعال ل DNMT3a المذكورة سابقا. بالنسبة لدورة dPCR ، استخدم البرنامج التالي: تمسخ أولي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية - 15 ثانية و 60 درجة مئوية - 30 ثانية.

النتائج

يوفر البروتوكول الموصوف في هذه الورقة طريقة سهلة وبأسعار معقولة للحصول على المعلومات الجزيئية من السائل المسيل للدموع باستخدام التقنيات المتاحة بشكل شائع في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية. علاوة على ذلك ، يمكن توسيع نطاق البروتوكول من خلال استخدام تقنيات حساسة للغاية مثل ELISA للكشف عن النشاط الأنزيمي.

بعد هذه الإجراءات ، كان إجمالي إنتاج البروتين حوالي 3-4 ميكروغرام / ميكرولتر. يكشف تحليل صفحة SDS الملطخة بكوماسي لمستخلصات البروتين الكلية عن أنماط التعبير البروتيني في شبكية العين الكلية والدموع (الشكل 2 أ).

كان للحمض النووي الريبي المعزول نسبة امتصاص 260/280 للأشعة فوق البنفسجية بين 1.9 و 2.0. كان متوسط العائد 134.8 نانوغرام / ميكرولتر. تم إجراء qPCR باستخدام مجموعات أولية لجين التدبير المنزلي (غليسيرالدهيد 3-فوسفات ديهيدروجيناز ، GAPDH)3 وجين علامة حيوية مفترضة (DNA-methyl transferase 3a ، DNMT3a)26. تم استخدام عينة cDNA غير مخففة 1: 1 (150 نانوغرام).

تم إجراء تحليل منحنى الذوبان ، وتم حساب معدلات Ct في برنامج qPCR. تم إجراء جميع التجارب في نسختين. كشف التحليل عن قيم Ct بين 20 و 24 ، وهو نطاق مناسب لكمية البدء من mRNA المستهدف في العينة (الشكل 2B). ومع ذلك ، يشير تحليل منحنى الذوبان في الشكل 2C إلى انخفاض وجود mRNA المستهدف. ومع ذلك ، أكد هلام الأغاروز 2 ٪ وجود amplicons في الحجم المتوقع (الشكل 2D).

تم تنفيذ dPCR باستخدام نفس زوج مجموعات التمهيدي ل DNMT3a. كان تخفيف عينات cDNA المستخدمة 1: 1 (150 نانوغرام) ، 1: 2 (75 نانوغرام) ، 1: 4 (37.5 نانوغرام) ، 1: 8 (18.75 نانوغرام). تم إجراء جميع التجارب في نسختين. تمكن dPCR من الكشف من 1.33 نسخة / ميكرولتر في العينة غير المخففة ، إلى 0.45 نسخة / ميكرولتر في العينة المخففة 8 أضعاف (الشكل 3A ، 3B). وهكذا ، أظهر dPCR حساسية متزايدة ل mRNA المستهدف الموجود في الدموع مقارنة ب qPCR.

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي لبروتوكول استخراج الدموع من الفئران. (أ) جمع الدموع. تم استخدام ثلاثة فئران C57BL / 6J عمرها شهرين. (ب) تم تحفيز إنتاج الدموع دوائيا عن طريق إعطاء بيلوكاربين داخل الصفاق. صورة توضح موضع شريط شيرمر. (ج) معالجة الدموع. ثم تم جمع الدموع باستخدام شرائط شيرمر لمدة 10 دقائق ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. (د) تم طرد الدموع التي تم جمعها في شرائط شيرمر بالطرد المركزي بالماء المعقم ومثبطات الأنزيم البروتيني أو بالماء المعقم فقط. (ه، واو) تم ثقب هذه الأنابيب في القاع ثم نقلها لاحقا إلى أنبوب معقم جديد سعة 1.5 مل لتسهيل مراوغة السوائل. (ز ، ح) يتم جمع الدموع في أنبوب 1.5 مل. (I) صورة تمثيلية لإجراء جمع الدموع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: التحليل النهائي للأغشية المسيلة للدموع للتطبيقات الجزيئية. (أ) SDS-PAGE من دموع الفئران ومستخلص بروتين الشبكية. MW: علامة الوزن الجزيئي. الحارة 1: ملامح البروتين في شبكية العين (30 ميكروغرام) ؛ حارة 2: ملامح البروتين من الدموع (30 ميكروغرام). (ب) qPCR ل GAPDH و DNMT3a في دموع الفئران. يظهر متوسط CT و ΔCT في الجدول 2. (ج) تحليل منحنى الذوبان لمنتجات DNMT3a و GAPDH PCR. يمثل المحور ص معدل تغير التألق في تفاعل التضخيم (dF / dT) ، ويمثل المحور x درجة الحرارة في °C (D) تحليل amplicon PCR في 2٪ هلام الأغاروز الكهربائي الذي يحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل بروميد الإيثيديوم. الحارة M: 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النووي. المسار 1،2: GAPDH و DNMT3a PCR amplicon ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (dPCR) لتعبير DNMT3a في دموع الفئران. (أ) يتم عرض نتائج dPCR كمخطط مبعثر 1D يظهر بنقاط زرقاء نسخ نسخة DNMT3a . النقاط السوداء هي أقسام بدون نسخ نسخة DNMT3a موجودة. (ب) تم إنشاء سلسلة تخفيف من cDNA لتحديد التركيز الأمثل لقياس نسخ نسخة DNMT3a . تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم المادةوصف
10٪ جل SDSلهلام فصل واحد: 3.8 مل H2O المقطر ؛ 2.6 مل تريس ؛ درجة الحموضة 8.8 ؛ 1.5 م 3.4 مل مادة الأكريلاميد ؛ 100 ميكرولتر 10٪ SDS ؛ 100 ميكرولتر 10٪ APS ؛ 4 ميكرولتر تائب.
لواحد جمع هلام: 2.72 مل H2O المقطر ، 0.52 مل تريس ؛ درجة الحموضة 6.8 ؛ 1.5 م 0.68 مل أكريلاميد ، 40 ميكرولتر 10٪ SDS ، 40 ميكرولتر 10٪ APS 4 ميكرولتر TEMED.
الكهربائي العازلة250 مللي متر قاعدة تريس ، 2 متر جليكاين ، 1٪ SDS
حل تلطيخقم بإذابة الكواشف التالية في 43 مل من الماء (تخزينها في درجة حرارة الغرفة في زجاجة كهرماني): كوماسي 0.25 جم ؛ حمض الخليك 7 مل ؛ الميثانول 50 مل
حل إزالة البقعقم بإذابة الكواشف التالية في 63 مل من الماء (تخزينها في درجة حرارة الغرفة): حمض الخليك 7 مل ؛ الإيثانول 30 مل

الجدول 1. الإعداد لصفحة SDS.

اسم الجينسي تي 1سي تي 2متوسط مع SDΔCT
جابد20.1420.7320.44±0.17
DNMT3a24.5924.9724.78±0.074.35

الجدول 2. قيم Ct ل DNMT3a و GAPDH في دموع الفئران.

المناقشة

يمكن الوصول بسهولة إلى السائل المسيل للدموع ، ويمكن استخدام تحديد المؤشرات الحيوية في الدموع كتقنية تكميلية ناجحة للتشخيص المبكر لمختلف الأمراض البشرية27. في حين أن التحليل الكيميائي الحيوي لتكوين الدموع في النماذج الحيوانية التجريبية يكمل هذا النهج ويعد بتقدم كبير في فهم الأساس الجزيئي للأمراض ، هناك ندرة في البيانات والبروتوكولات المتاحة ، مما دفعنا إلى تطوير واحد. الطريقة الموصوفة في هذا التقرير بسيطة من الناحية الفنية وتسمح بالتحديد الأولي للتعبير التفاضلي لمختلف الجزيئات المرشحة المرتبطة بالمرض.

يمكن تحقيق جمع الدموع من خلال طرق مختلفة مثل الأنابيب الشعرية وشرائط شيرمر16,17 والمسحات28والإسفنج29. تم تفضيل طريقة شريط شيرمر نظرا لسهولة الوصول إليها ، وقدراتها الكمية ، والقدرة على التكيف أثناء جمع العينات ، والتكلفة ، والبساطة في استخراج مكونات المسيل للدموع للمعالجة المختبرية. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة ، وطفيفة التوغل ، ولا تشكل أي خطر للإصابة أو تلف القرنية ، وذلك بفضل تكوين شريط مرشح الورق16,17. تشمل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول الحاجة إلى التحفيز الدوائي لإنتاج الدموع باستخدام بيلوكاربين واختيار مخزن مؤقت مناسب للشفط.

بيلوكاربين هو ناهض كوليني يرتبط بمستقبلات M3 المسكارينية ويمكن أن يسبب التحفيز الدوائي للغدد الخارجية الإفراز ، مما يعزز إنتاج الدموع وإفراز اللعاب والتبول. على الرغم من أن الدراسات التي أجريت على البشر أظهرت أن تحفيز المسيل للدموع لا يغير الأسمولية للسائل الذي تم جمعه30 ، إلا أنه يؤثر بوضوح على ملامح البروتين31. تم الإبلاغ بنجاح عن استخدام بيلوكاربين كمحفز دوائي كوليني للغدد الخارجية الإفراز ومحسن إفراز المسيل للدموع في الأرانب والفئران19،32،33 ، ولكن لم يتم تقييم تأثير التحفيز على محتوى البروتين. لتجنب هذا القيد والسماح بإجراء مقارنة دقيقة لملامح الدموع بين الظروف التجريبية ، من الأهمية بمكان مراعاة إعدادات المجموعة المحددة. وبالمثل ، فإن إدخال خطوة الشطف قبل جمع الدموع يمكن أن يكون مفيدا لتجنب التلوث المسبق لسطح العين. في هذا البروتوكول ، تم استخدام تركيز 30 مغ / كغ من بيلوكاربين13. نظرا لأن الفئران ظلت غير متحركة وهادئة بعد حقن هذا الدواء ، فقد تم جمع الدموع دون أي تخدير ، مما يجعل جمع العينات أمرا سهلا.

يرتبط اختيار المخزن المؤقت للشطف المناسب ارتباطا وثيقا بالطريقة المختارة لتحليل التركيب الكيميائي الحيوي لعينة المسيل للدموع ومعدل استرداد المواد البيولوجية من الشريط. على سبيل المثال ، في دراسة مقارنة تركز على احتباس البروتين من شرائط شيرمر في المرضى ، ثبت أن المخزن المؤقت الذي يتكون من 100 mM بيكربونات الأمونيوم جنبا إلى جنب مع 0.25٪ Nonidet P40 (NP40) أسفر عن نتائج متفوقة للبروتينات أو تطبيقات تحليل ELISA المتعددة17. في أيدينا ، أثبت استخدام الماء المعقم أنه كاف لتصور مستخلصات البروتين الكلية في SDS-PAGE وللكشف عن mRNA للجينات ذات الأهمية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل.

لتقييم وجود DNMT3a و GAPDH mRNA في دموع الفئران ، قارنا أداء qPCR و dPCR. يعزى وجود دايمرات التمهيدي التي لوحظت في منحنى ذوبان qPCR إلى انخفاض وفرة نسخة DNMT3a . كما هو موضح ، يتمتع dPCR بحساسية وفعالية أكبر بكثير في اكتشاف mRNA المستهدف في هذه العينات في العينات غير المخففة والمخففة. هذه القدرة على الكشف الدقيق تجعل dPCR الطريقة المفضلة لتحليل الدموع في الفئران ، مما يوفر للباحثين والأطباء أداة موثوقة للدراسات المستقبلية والتطبيقات السريرية المحتملة.

يمثل تطوير بروتوكول موحد لجمع عينات الدموع في النماذج الحيوانية تقدما كبيرا في البحث. لا يسهل هذا البروتوكول الجمع المنهجي والدقيق لعينات الدموع فحسب ، بل يفتح أيضا مجموعة واسعة من الاحتمالات لتطبيقها في مختلف مجالات الدراسة. تسمح القدرة على الحصول على عينات من الدموع من النماذج الحيوانية بالتحقيق في مجموعة واسعة من الأمراض والحالات ، فضلا عن استكشاف مؤشرات حيوية جديدة وعلاجات محتملة. علاوة على ذلك ، من خلال إنشاء بروتوكول موحد ، يتم تعزيز استنساخ النتائج عبر الدراسات والمختبرات المختلفة ، مما يساهم في صحة وموثوقية البحوث. في نهاية المطاف ، فإن هذا التقدم في منهجية جمع عينات الدموع في النماذج الحيوانية لديه القدرة على دفع الاكتشافات المهمة وتحسين فهم الفيزيولوجيا المرضية للأمراض المختلفة ، وفتح طرق جديدة للتشخيص والعلاج والوقاية.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل VELUX STIFTUNG [مشروع 1852] إلى ML ومنح زمالة الدراسات العليا من CONAHCYT إلى M.B. (836810) و E.J.M.C. (802436) و A.M.F (CVU 1317418). خالص الامتنان لجميع أعضاء المختبر، ومركز البحوث في المستقبل، وقسم الفارماكوبيولوجيا (Cinvestav) لمساهماتهم في المناقشات المحفزة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-ميركابتوإيثانولجيبكو1985023
2x عازلة Laemmliبيو راد16-0737
حمض الخليككيميكا ماير64-19-7
أكريلاميدسيجما ألدريتشأ4058
كاشف برادفوردسيجما ألدريتشب6916
كلوروفورمسيجما ألدريتش1003045143
كوماسي بلو R 250الولايات المتحدة البيولوجية6104-59-2
ايثانولكيميكا ريكي64-17-5
GeneRuler 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النوويThermofisher العلميس1331
الجلسرينالولايات المتحدة البيولوجيةجي 8145
الجلايسينسانتا كروزSC- 29096
الجليكوجينروش10901393001
حمض الهيدروكلوريككيميكا ريكي7647-01-0
كحول الأيزوبروبيلكيميكا ريكي67-63-0
ميثانولكيميكا ماير67-56-1
أنابيب صغيرة 1.5 ملأكسيجنMCT-150-C
أنابيب صغيرة 600 µ ؛ lأكسيجنMCT-060-C
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتشط3014
أنابيب PCR و شرائطنوفاسبيوPCR 0104
بيلوكاربينسيجما ألدريتشP6503-10 جرام
مثبطات البروتيازروش11873580001
كياكيوتي ايفاجرين PCR كيت (5 مل)كياجين250112
QIAcuity Nanoplate 26k 24 بئر (10)كياجين250001
ريال كيو بلس 2x ماستر ميكس أخضرأمبليكونA323402
طقم تخليق RevertAid First Strad (كدنا)Thermofisher العلميك 1622
شرائط اختبار شيرمرمختبر سانتغارSANT1553
الحزب الديمقراطي الصربيسيجما ألدريتشL3771
TEMEDسيجما ألدريتش102560430
كاشف TRIسيجما ألدريتشتي 9424-200 ملمحلول أحادي الطور من الفينول والجوانيدينيوم إيزوثيوسيانات
تريسالولايات المتحدة البيولوجيةتي 8650
قاعدة تريسكيم كروزSC-3715A

المراجع

  1. Ravishankar, P., Daily, A. Tears as the next diagnostic biofluid: A comparative study between ocular fluid and blood. Appl Sci. 12 (6), 2884(2022).
  2. Masoudi, S. Biochemistry of human tear film: A review. Exp Eye Res. 220, 109101(2022).
  3. Dara, M., et al. Novel RNA extraction method from human tears. Mol Biol Res Commun. 11 (4), 167-172 (2022).
  4. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483(2022).
  5. Arslan, M. A., et al. Expanded biochemical analyses of human tear fluid: Polyvalent faces of the Schirmer strip. Exp Eye Res. 237, 109679(2023).
  6. Liu, R., et al. Analysis of th17-associated cytokines and clinical correlations in patients with dry eye disease. PloS one. 12 (4), e0173301(2017).
  7. Cross, T., et al. Rna profiles of tear fluid extracellular vesicles in patients with dry eye-related symptoms. Int J Mol Sci. 24 (20), 15390(2023).
  8. Paranjpe, V., Phung, L., Galor, A. The tear film: Anatomy and physiology. Ocular Fluid Dyn: Anat, Physiol, Imaging Tech, and Math Model. , 329-345 (2019).
  9. Jung, J. H., et al. Proteomic analysis of human lacrimal and tear fluid in dry eye disease. Sci Rep. 7 (1), 13363(2017).
  10. Di Zazzo, A., Micera, A., De Piano, M., Cortes, M., Bonini, S. Tears and ocular surface disorders: Usefulness of biomarkers. J Cell Physiol. 234 (7), 9982-9993 (2019).
  11. Von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. 117, 126-137 (2013).
  12. Pieczynski, J., Szulc, U., Harazna, J., Szulc, A., Kiewisz, J. Tear fluid collection methods: Review of current techniques. Eur J Ophthalmol. 31 (5), 2245-2251 (2021).
  13. Shiraki, T., Shigeta, M., Tahara, N., Furukawa, H., Ohtsuka, H. A tear production assessment by using Schirmer tear test strips in mice, rats and dogs. Animal Eye Res. 24 (1-2), 1-5 (2005).
  14. Zhao, J., Nagasaki, T. Lacrimal gland as the major source of mouse tear factors that are cytotoxic to corneal keratocytes. Exp Eye Res. 77 (3), 297-304 (2003).
  15. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  16. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).
  17. Koduri, M. A., et al. Optimization and evaluation of tear protein elution from Schirmer's strips in dry eye disease. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1413-1419 (2023).
  18. Kakan, S. S., et al. Tear miRNAs identified in a murine model of sjogren's syndrome as potential diagnostic biomarkers and indicators of disease mechanism. Front Immunol. 13, 833254(2022).
  19. Moore, M., Ma, T., Yang, B., Verkman, A. Tear secretion by lacrimal glands in transgenic mice lacking water channels aqp1, aqp3, aqp4 and aqp5. Exp Eye Res. 70 (5), 557-562 (2000).
  20. Balafas, E., et al. A noninvasive ocular (tear) sampling method for genetic ascertainment of transgenic mice and research ethics innovation. OMICS. 23 (6), 312-317 (2019).
  21. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals mir-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377(2021).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  23. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  24. RealQPlus2x Master Mix Green without ROX. Ampliqon. , Available from: https://ampliqon.com/en/pcr-enzymes/pcr-enzymes/real-time-pcr/realq-plus-2x-master-mix-green (2023).
  25. Qiagen. Quick-Start Protocol QIAcuity EG PCR Kit. Qiagen. , (2023).
  26. Anier, K., Malinovskaja, K., Aonurm-Helm, A., Zharkovsky, A., Kalda, A. DNA methylation regulates cocaine-induced behavioral sensitization in mice. Neuropsychopharmacology. 35 (12), 2450-2461 (2010).
  27. Hagan, S., Martin, E., Enriquez-De-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: Potential use for predictive, preventive, and personalized medicine. EPMA J. 7 (1), 15(2016).
  28. Gasparini, M. S., et al. Identification of sars-cov-2 on the ocular surface in a cohort of covid-19 patients from Brazil. Exp Biol Med. 246 (23), Maywood. 2495-2501 (2021).
  29. Sebbag, L., Harrington, D. M., Mochel, J. P. Tear fluid collection in dogs and cats using ophthalmic sponges. Vet Ophthalmol. 21, 249-254 (2018).
  30. Abusharha, A. A., et al. Analysis of basal and reflex human tear osmolarity in normal subjects: assessment of tear osmolarity. Ther Adv Ophthal. 10, 2515841418794886(2018).
  31. Fullard, R. J., Snyder, C. Protein levels in nonstimulated and stimulated tears of normal human subjects. Inves Opht Vis Sci. 31 (6), 1119-1126 (1990).
  32. Longwell, A., Birss, S., Keller, N., Moore, D. Effect of topically applied pilocarpine on tear film pH. J Pharm Sci. 65 (11), 1654-1657 (1976).
  33. Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Prog Ret Eye Res. 28 (3), 155-177 (2009).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

mRNA SDS

مقالات ذات صلة