يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استهداف الجينات بوساطة CRISPR / Cas9 للفيروسات القهقرية لدراسة تمايز Th17 في المختبر

1.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66966

⸱

نوفمبر 15, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Immune Therapy Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Zhejiang University-University of Edinburgh Institute (ZJU-UoE Institute), Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang University, 3Institute of Immunology and Department of Rheumatology, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكولا لنقل الفيروسات القهقرية للحمض النووي الريبي الموجه إلى الخلايا التائية الأولية من الفئران المعدلة وراثيا Cas9 ، مما يوفر بديلا فعالا لتحرير الجينات في دراسة تمايز Th17.

الملخص

تلعب الخلايا التائية المساعدة التي تنتج IL-17A ، والمعروفة باسم خلايا Th17 ، دورا مهما في الدفاع المناعي وتتورط في اضطرابات المناعة الذاتية. يمكن تحفيز الخلايا التائية CD4 بالمستضدات وكوكتيلات السيتوكين المحددة جيدا في المختبر لتقليد تمايز خلايا Th17 في الجسم الحي. تم إجراء بحث على نطاق واسع حول آليات تنظيم التمايز Th17 باستخدام مقايسة الاستقطاب Th17 في المختبر .

عادة ما تتضمن طرق الاستقطاب التقليدية Th17 الحصول على خلايا CD4 T الساذجة من الفئران المعدلة وراثيا لدراسة تأثيرات جينات معينة على تمايز Th17 ووظيفته. يمكن أن تستغرق هذه الأساليب وقتا طويلا ومكلفة وقد تتأثر بالعوامل الخارجية الخلوية من بالضربة القاضية. وبالتالي ، فإن البروتوكول الذي يستخدم نقل الفيروسات القهقرية للحمض النووي الريبي الإرشادي لإدخال خروج المغلوب الجيني في خلايا الفأر التائية الأولية CRISPR / Cas9 بمثابة نهج بديل مفيد للغاية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا للتمييز بين الخلايا التائية الأولية الساذجة إلى خلايا Th17 بعد استهداف الجينات بوساطة الفيروسات القهقرية ، بالإضافة إلى طرق تحليل قياس التدفق الخلوي اللاحقة لفحص كفاءة العدوى والتمايز.

المقدمة

تعتبر خلايا Th17 ، وهي مجموعة فرعية فريدة من الخلايا المساعدة CD4 + T ، حيوية للقضاء على البكتيريا والفطريات خارج الخلية وتلعب دورا مهما في أمراض المناعة الذاتية المختلفة1،2،3. تشير الأدلة الناشئة إلى أن خلايا Th17 تظهر عدم تجانس ، وتعمل في كل من الظروف المسببة للأمراض وغير المسببة للأمراض ، وتتأثر بالعوامل البيئية والجينية. يعد توضيح العمليات التنظيمية التي تتحكم في تمايز خلايا Th17 واللدونة وعدم التجانس أمرا بالغ الأهمية للنهوض باستراتيجيات علاج مناعي أكثر فعالية.

تم استخدام المعدلة وراثيا على نطاق واسع للكشف عن المنظمين الرئيسيين لتمايز خلايا Th17 ووظائفها. يتضمن استخدام المعدلة وراثيا التلاعب الكامل في الجسم الحي ، مما يوفر الأصالة والدراسة المنهجية لدورها في الظروف الفسيولوجية أو نماذج الأمراض. ومع ذلك ، فإن الفحص عالي الإنتاجية باستخدام هذا النهج غير عملي إلى حد كبير. توفر فحوصات الاستقطاب في المختبر بديلا لدراسة تمايز خلايا Th17. ثبت أن إنترلوكين 6 (IL-6) بالاشتراك مع عامل النمو المحول β1 (TGFβ1) يعزز تطور خلايا Th17 غير المسببة للأمراض ، بينما تشارك IL-6 و IL-1β و IL-23 في دفع تمايز خلايا Th17 المسببة للأمراض (pTh17) 4،5.

أدى ظهور تقنية CRISPR / Cas9 إلى تسهيل التحرير الدقيق للجينوم على أسس محددة. عند دمجه مع نقل الفيروسات القهقرية ، يوفر هذا النهج طريقة وراثية قوية وفعالة واقتصادية لفحص ودراسة المنظمين المحتملين وظيفيا في خلايا Th176،7. في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين إجراء نقل الفيروسات القهقرية داخل نظام الاستقطاب Th17. باستخدام نظام فيروسات قهقرية ، قمنا بإصابة الخلايا التائية الساذجة المنشطة مسبقا التي تعبر عن Cas9 من الفئران. تم نقل الخلايا باستخدام تركيبات الحمض النووي الريبي التوجيهي (gRNA) التي يقودها محفز U6 ، جنبا إلى جنب مع الجينات التي تشفر بروتينات مراسل الفلورسنت تحت سيطرة محفز EF1a لتسهيل الضربة القاضية للجين المستهدف. بعد ذلك ، تم زراعة الخلايا التائية المنقولة في ظل ظروف محددة من السيتوكين للحث على التمايز في خلايا Th17. والجدير بالذكر أن التخلص من RoRγt قلل بشكل كبير من إنتاج IL-17A مقارنة بالمجموعة الضابطة. تعتمد فعالية هذا النظام على إنتاج الفيروسات القهقرية المحسنة وظروف النقل للخلايا التائية الأولية المنشطة ، مما يوفر نهجا سريعا وعمليا لدراسة جينات معينة في تمايز Th17 ووظيفته.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة أخلاقيات رعاية التجريبية ، مستشفى رينجي ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ وهي متوافقة مع المبادئ التوجيهية المؤسسية.

1. إنتاج الفيروسات القهقرية

  1. تحضير بناء الفيروسات القهقرية
    1. استخدم أداة CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) لتصميم sgRNA ل RORγt بالضربةالقاضية 8. حدد الجينوم المرجعي ك Mouse GRCm38 ، واختر تسلسل PAM ك NGG (ل SpyoCas9 ، Hsu (2013) tracrRNA) بناء على نظام التوجيه CRISPRko. تحقق من صحة اسم الجين المستهدف أو تنسيقات الجينات المستهدفة الأخرى وإرسال المدخلات الصالحة للحصول على مرشحي sgRNA. عند تعيين المعلمات الأخرى على القيم الافتراضية ، قم بتعيين هدف sgRNA إلى RORγt (Rorc ، معرف الجين: 19885) لإزعاج تمايز Th17 وتحديد sgRNA غير المستهدف (اختصار sgNT ، التسلسل: GCGAGGTATTCGGCTCCGGG) من مكتبات GeCKO v2 للماوس.
      ملاحظة: توفر هذه الأداة مجموعة من الخيارات القابلة للنقر لتصميم الحمض النووي الريبي الإرشادي ، مما يسمح بالتخصيص المريح لتلبية متطلبات محددة.
      1. أدخل اسم الجين الهدف في مربع البحث أسفل عمود البحث السريع عن الجينات. سيعرض النظام معرف الجين والاسم الكامل للجين المستهدف لضمان الاختيار الدقيق.
        ملاحظة: تتوفر خيارات إضافية للتحقق من صحة تنسيقات الجينات المستهدفة المختلفة.
    2. اختر واحدا sgRNA مستهدفا على تسلسل Rorc (اختصار sgRorc) وفقا للرتبة المجمعة العالية وترتيب الاختيار لتجنب التطابقات خارج الهدف وزيادة الفعالية على الهدف (تسلسل sgRorc: GTCATCTGGGATCCACTACG). قم بتجميع اثنين من قليل النوكليوتيدات ل sgRorc و sgNT: بالنسبة للأوليجو الأمامي ، قم بإلحاق التسلسل "gttttagagctagaaatagcaagttaaaat" بنهاية 5 'من كل تسلسل دليل. بالنسبة للأوليغو العكسي ، قم بإلحاق التسلسل "tttcgtcctttccacaagatatataaagc" بنهاية 3 من كل تسلسل دليل.
      ملاحظة: عادة ما توجد خيارات متعددة لتسلسلات sgRNA. من الضروري تحديد 2 أو 3 تسلسلات sgRNA تستهدف نفس النمط الجيني لتقييم كفاءتها بالضربة القاضية. في تجاربنا الأولية ، تم اختيار اثنين من gRNAs المستهدفين ل Rorc للمقارنة (تسلسل sgRNA 1: GTCATCTGGGATCCACTACG ؛ تسلسل sgRNA 2: CTTGAGTATAGTCCAGAACG). أشارت النتائج التجريبية إلى أن الحمض النووي الريبي المرسال المقدم في الطريقة الحالية (تسلسل sgRNA 1) يظهر كفاءة أعلى بالضربة القاضية بين الاثنين.
    3. قم بتضخيم تسلسل ترميز sgRorc و sgNT باستخدام بوليميراز الحمض النووي في تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات المذكورة أعلاه واستنساخها في متجه pMX-U6-MCS (بين مناطق محفز U6 وسقالة gRNA) في إطار باستخدام بروتين الفلورسنت mCherry ، على التوالي9. قم بإعداد نظام التفاعل (50 ميكرولتر) كما هو الحال في الجدول 1. تتكون هذه الاشعال من تسلسل sgRNA (3 ') ، والذي يمكنه إدخال sgRNA في المتجه ، وجزء من تسلسل المتجه (5 ') ، والذي يمكن أن يضخم جزء المتجه كامل الطول. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتصميم الاشعال الأمامية والخلفية بتداخل حوالي 18 نقطة أساس داخل منطقة sgRNA (ولكن ليس متداخلة تماما) ، مما يسهل تجميع ناقل الاستنساخ الخطي أثناء عملية الربط.
      ملاحظة: يجب الحصول على جزء متجه خطي في موقع تسلسل sgRNA مع بادئات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل يبلغ حوالي 5,551 كيلو دالتون.
    4. قم بتنقية البناء باستخدام مجموعة استخراج الجل وقم بتدويرها باستخدام مجموعة الاستنساخ. استخدم منتجات إعادة التركيب لمقايسات التحويل.
    5. اختر المستنسخة المفردة من اللوحات وتحقق من تسلسلات ترميز sgRorc أو sgNT عبر تسلسل الجيل الأول ، باستخدام تمهيدي المروج U6 (التسلسل: ATGGACTATCATATGCTTACCGTA).
    6. حدد الاستنساخ الفردي المطلوب للتضخيم في مرق LB. استخرج الحمض النووي البلازميد عالي الجودة من الخلايا البكتيرية باستخدام مجموعة البلازميد الخالية من السموم الداخلية.
      ملاحظة: تأكد من أن محلول البلازميد ذو جودة عالية. نوصي بأن يكون تركيز محلول البلازميد 1 ميكروغرام / ميكرولتر على الأقل.
  2. تحضير خلايا التعبئة والتغليف
    1. تحضير خلايا Platinum-E (Plat-E) باستخدام الإجراء التالي: زراعة خلايا Plat-E مع Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 100 وحدة / مل بنسلين ، و 0.1 مجم / مل ستربتومايسين في طبق مزرعة 10 سم. سيشار إليه باسم وسيط زراعة الخلايا في ما يلي.
      ملاحظة: للحصول على كفاءة التعداء المناسبة ، نوصي باستخدام الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمي بأقل من 15 رقم مقطع.
    2. قم بتقسيم صفيحة كاملة من خلايا Plat-E مقاس 10 سم (~ 2.6 × 107 خلايا) بنسبة مناسبة إلى طبق جديد مقاس 10 سم قبل يوم واحد من التعداء لتحقيق التقاء خلية بنسبة 80٪ تقريبا في اليوم التالي ، وهو الشرط الأمثل للتعدين. قم بإجراء مرور الخلية لطبق جديد مقاس 10 سم بنسبة 1: 3 (البذور ~ 8 × 106 خلايا في طبق جديد مقاس 10 سم في اليوم السابق للتعداد).
      ملاحظة: تعتمد نسبة الانقسام على حالة نمو الخلايا ، مع كفاءة تعداء أعلى يمكن تحقيقها في الخلايا التي تظهر نموا قويا. نقوم بتمرير الخلية لطبق 10 سم بنسبة 1: 3. بالنسبة لأطباق زراعة الخلايا المختلفة ، مثل طبق 6 سم ، نوصي بزرع 1.5 × 10 6 خلايا Plat-E في اليوم السابق للتعداد.
  3. تعداء
    1. قبل ساعة واحدة من التعدي ، استبدل وسط زراعة الخلايا ب 8 مل من وسط المصل المختزل بدون الفينول الأحمر مع 5٪ FBS ، ولكن بدون البنسلين - الستربتومايسين ، لأنه قد يتداخل مع كاشف التعداد. قم بتسخين وسط السيروم المخفف إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    2. تحضير خليط التعدي الذي يحتوي على المزيج 1 والمزيج 2: يحتوي المزيج 1 على 18 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميدي (pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry / pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry) و 6 ميكروغرام من pCL-ecotropic retroviral Vector (pCL-Eco) في 1,000 ميكرولتر من وسط المصل المختزل. يحتوي المزيج 2 على 48 ميكرولتر من كاشف التعدي في 1,000 ميكرولتر من وسط المصل المختزل. أضف المزيج 2 قطرة قطرة في المزيج 1 واخلطه برفق وجيدا. احتضان المجمع لمدة 15-20 دقيقة عند 20-25 درجة مئوية.
    3. قم بتقطير الخليط بحذر في خلايا Plat-E ، مع تحريك اللوحة برفق لضمان التوزيع المتساوي. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 6-12 ساعة.
    4. استبدل الوسط ب 10 مل من وسط زراعة الخلايا الطازجة واستمر في احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 48 ساعة.
    5. قم بتقييم كفاءة التعدي في خلايا Plat-E عن طريق الكشف عن علامة ناقل الفيروسات القهقرية ، التي تعمل كوكيل ، عبر المجهر الفلوري أو قياس التدفق الخلوي.
      ملاحظة: تم اكتشاف إشارة مضان mCherry قوية (تتجاوز إيجابية التألق 80٪) في نسبة كبيرة من خلايا Plat-E التي تم نقلها باستخدام متجه pMX-U6-MCS ، مما يشير إلى تعداء ناجح.
    6. احصد المستزرعة الطافية المحتوية على الفيروس وأجهزة الطرد المركزي عند 1,500 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة شظايا الخلايا. يتناول المادة الطافية للفيروس 1 مل لكل قارورة ويخزن في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: الترشيح هو طريقة بديلة لإزالة بقايا الخلايا. نوصي باستخدام مرشح حقنة بحجم مسام 0.45 ميكرومتر وغشاء بولي إيثر سلفون (PES) لتقليل احتباس الجسيمات الفيروسية على غشاء المرشح.

2. عدوى الفيروسات القهقرية لخلايا CD4 + T المنشطة وتمايز Th17

  1. تحضير وتنشيط خلايا CD4+ T الساذجة الأولية
    1. قم بتغطية كل بئر من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا ب 2 ميكروغرام / مل من مضاد CD3e و 4 ميكروغرام / مل من مضاد CD28 في 500 ميكرولتر PBS معقم ، ولف اللوحة في بارافيلم لمنع التبخر والتلوث ، ثم احتضان اللوحة عند 4 درجات مئوية طوال الليل (أو 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة قبل طلاء خلايا CD4 + T) في اليوم السابق لعزل خلايا CD4 + T الساذجة.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لإجراء تحفيز مرتبط بلوحة لخلايا الفأر التائية قبل إجراء التنبيغ الفيروسي.
    2. في اليوم التالي ، قم بالقتل الرحيم للفئران التي تعبر عن Cas9 البالغة من العمر 6-8 أسابيع (الفئران R26-CAG-Cas9) عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون2 وتعقيمها بنسبة 70٪ من الإيثانول.
    3. احصد طحال الفأر وضعه في PBS مع 2٪ FBS و 100 ميكرومتر EDTA (FACS BUFFER).
    4. قم بطحن الطحال بزجاج أرضي معقم (جانب غير لامع) في مخزن FACS ، وقم بتجانس الأنسجة في معلق أحادي الخلية ، وقم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل.
      ملاحظة: تأكد من طحن الأنسجة برفق ومتسق للحفاظ على رطوبة الأنسجة. يمكن أن يؤثر طحن الأنسجة بعنف على بقاء الخلية بشكل كبير.
    5. قم بتدوير معلق خلية الطحال عند 800 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا الحمراء. اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، ثم أضف مخزن FACS للوصول إلى الحجم الإجمالي 15 مل. جهاز الطرد المركزي لخلايا الطحال عند 800 × جم لمدة 5 دقائق.
    6. أعد تعليق خلايا الطحال وقم بتصفيتها من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. اضبط مستوى الصوت النهائي على 1 مل لعزل الخلايا التائية CD4+ .
    7. عزل خلايا CD4+ T باستخدام مجموعات الكاشف التجارية باتباع الإرشادات الواردة في الدليل.
    8. قم بتسمية خلايا CD4 + T بخليط الأجسام المضادة الفلورية (CD4 و CD25 و CD44 و CD62L) عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة ، واغسل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت FACS ، وعزل خلايا CD4 + T الساذجة باستخدام فارز خلايا التدفق. سيؤدي ذلك إلى الحصول على خلايا تائيةساذجة CD4 + CD25-CD62LعاليةCD44.
    9. قم بإزالة المادة الطافية للتحفيز المرتبط باللوحة من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا (المحضرة في الخطوة 2.1.1) واشطف كل بئر مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من PBS. لوحة 1 × 106 خلايا CD4 + T ساذجة في 1 مل من وسط زراعة الخلايا الليمفاوية في بئر من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا. احتضان الخلايا في حاضنة الخلية.
      ملاحظة: يحتوي وسط زراعة الخلايا الليمفاوية على 10٪ FBS ، و 100 وحدة / مل بنسلين ، و 0.1 مجم / مل من الستربتومايسين ، و 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 10 ملي مولار HEPES ، و 50 ميكرومتر β-ME في وسط RPMI 1640.
  2. عدوى الفيروسات القهقرية
    1. بعد 18-24 ساعة ، اجمع كل بئر من الخلايا المنشطة في أنبوب 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
    2. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من خليط العدوى (10 ميكروغرام / مل سداسي ديميثرين بروميد ، 10 ملي مولار HEPES في طافي الفيروس) وأضف 1 مل من الخليط إلى بئر جديد من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 48 بئر. في غضون ذلك ، احفظ ما يكفي من الخلايا كتحكم سلبي (غير محول).
      ملاحظة: من الممكن أن يكون لديك أقل من 1 × 106 خلايا CD4 + T ساذجة نشطة لكل بئر ، ولكن لا ينصح باستخدام أقل من 0.5 × 106 خلايا لكل بئر. بالإضافة إلى ذلك ، لا ينبغي زرع أي خلايا في الآبار الطرفية للوحة الاستزراع المكونة من 48 بئرا.
    3. لف اللوحة بالبارافيلم وجهاز الطرد المركزي على حرارة 800 × جم لمدة 90 دقيقة عند 32 درجة مئوية. اضبط التسريع والتباطؤ عند 3. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة البارافيلم ، واحتضان الخلايا في الحاضنة لمدة 4 ساعات ، واستمر في خطوات التمايز.
  3. تمايز الخلايا المصابة إلى خلايا Th17
    1. تحضير الخلايا العارضة للمستضد (APC) أثناء عدوى الفيروسات القهقرية. أولا ، احصل على خلايا الطحال من الفئران البرية باتباع التعليمات الواردة في الخطوات 2.1.2 إلى 2.1.4. أعد تعليق خلايا الطحال ب 1 مل من وسط زراعة الخلايا الليمفاوية مع 50 ميكروغرام / مل ميتومايسين في أنبوب 15 مل. احتضان خلايا الطحال عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 1 ساعة.
    2. بعد ساعة واحدة ، أضف PBS حتى علامة 15 مل لغسل خلايا الطحال ، وجهاز الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق خلايا الطحال ب 1 مل من وسط زراعة الخلايا الليمفاوية ، واحسب رقم الخلية. تم إعداد خلايا APC بنجاح.
    3. بعد 4 ساعات من حضانة الخلية (كما في الخطوة 2.2.3) ، اجمع خلايا CD4 + T المنقولة في أنابيب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية الخلايا المصابة في 600 ميكرولتر من PBS لغسلها. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
    4. ضع 0.5 × 106 خلايا CD4 + T المنقولة في 1 مل من وسط زراعة الخلايا الليمفاوية مع 1.5 × 106 خلايا APC في بئر من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا. مكمل مع 2 ميكروغرام / مل من مضاد CD3e ، و 2 ميكروغرام / مل من كوكتيل تمايز الخلايا المضاد ل CD28 ، و Th17 ، والذي يحتوي على 10 ميكروغرام / مل مضاد ل IFNγ ، و 10 ميكروغرام / مل مضاد ل IL-12 / IL23 p40 ، و 10 ميكروغرام / مل مضاد ل IL4 ، و 2.5-3 نانوغرام / مل hTGF-β ، و 20-30 نانوغرام / مل IL-6. خلايا الثقافة لمدة 2 أيام.
    5. اجمع كل بئر من الخلايا في أنابيب سعة 1.5 مل ، وجهاز الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية. قم بتحديث 1 مل جديد من وسط زراعة الخلايا الليمفاوية فقط باستخدام 3 نانوغرام / مل TGF-β و 30 نانوغرام / مل IL-6. ضع الخلايا في بئر جديد من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا لفترة زراعة طويلة. تحليل الخلايا بعد يومين من التغيير المتوسط.

3. تقييم كفاءة التحويل ونتائج التمايز

  1. بعد يومين من التغيير المتوسط ، اجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. عالج الخلايا المتمايزة ب 50 نانوغرام / مل فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA) و 500 نانوغرام / مل أيونومايسين و 5 ميكروغرام / مل بريفيلدين أ في 500 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الليمفاوية في بئر جديد من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا عند حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. احصد نصف الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي وقم بتحلل النصف الآخر من الخلايا باستخدام المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي الريبي لتحليل qPCR.
  2. لتحليل قياس التدفق الخلوي
    1. اجمع الخلايا في أنابيب سعة 1.5 مل. أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS إلى الأنابيب وجهاز الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق لغسل الخلايا.
    2. أعد تعليق حبيبات الخلية بخليط الأجسام المضادة الفلورية (CD4 وصبغة البقاء القابلة للإصلاح في 100 ميكرولتر من PBS) وصمة عار الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. اغسل الخلايا ب 300 ميكرولتر من PBS وثبتها ب 300 ميكرولتر من الفورمالديهايد المخزن بالفوسفات بنسبة 2٪ (FA) عند 4 درجات مئوية لمدة 60 دقيقة على الأقل.
    4. بعد ساعة واحدة ، اغسل الخلايا باستخدام PBS ، وأعد تعليقها ب 600 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت للنفاذية ، وجهاز الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق.
    5. تخلص من المادة الطافية والبقع باستخدام مضاد IL-17A في 100 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت للنفاذية لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية طوال الليل.
    6. في اليوم التالي ، اغسل الخلايا بمخزن مؤقت نفاذية 1x وأعد تعليقها في 200 ميكرولتر من PBS. تحليل الخلايا عن طريق قياس التدفقالخلوي 10. انظر قسم النتائج التمثيلية.
  3. لتحليل qPCR ، استخرج الحمض النووي الريبي باتباع تعليمات مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي. قم بنسخ الحمض النووي الريبي إلى (كدنا) للتخزين أو تحليل qPCR اللاحق. يجب أن يلتزم تصميم هذه البادئات بمبادئ تصميم التمهيدي qPCR العامة مع استهداف المنطقة التي تمتد على وجه التحديد على موقع indel المتوقع ، حيث حدث انقسام بوساطة gRNA. قد يكون أي انخفاض في كفاءة التضخيم أو فقدان الإشارة في هذا الموقع مؤشرا على الضربة القاضية الناجحة. بادئات qPCR هي كما يلي:
    Rorc F: TCCACTACGGGGTTATCACCT; R: AGTAGGCCACATTACACTGCT.
    IL17a F: TCAGCGTGTCCAAACACTGAG; R: CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في الدراسة ، قمنا باستنساخ هدف sgRNA إلى تسلسلات الترميز غير المستهدفة Rorc و sgRNA في متجه pMX-U6-MCS باستخدام بروتين الفلورسنت mCherry (الشكل 1 أ ، ب). تم إنتاج الفيروسات القهقرية وفقا للبروتوكول الموضح في الشكل 2. بدأ التعدي في اليوم 0 ، وحدث حصاد الفيروسات القهقرية في اليوم 2. يمكن اختبار كفاءة التعدي من خلال شدة مضان mCherry (الشكل 1 ج). قبل حصاد الفيروس ، تم فرز خلايا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد تحرير الجينوم CRISPR / Cas9 عبر توصيل الفيروسات القهقرية طريقة قوية لاستكشاف أدوار الخلايا التائية المساعدة. يقدم هذا البروتوكول نهجا سريعا وفعالا لفحص جينات معينة تشارك في تمايز Th17 ووظيفته. يجب اتباع العديد من الخطوات الحاسمة بعناية لتحقيق أفضل النتائج. أولا ، من أجل تحسين كفاءة الضربة القاضية للجينات ، يجب اختيار gRNAs بعناية. نظرا لخطر التأثيرات غير المستهدفة في تحرير الجينات CRISPR / Cas9 ، فمن الحكمة اختيار 2-3 gRNAs ذات درجات عالية ، كما هو محدد في قسم البروتوكول 1.1.1 ، لمزي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يذكر المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نعرب عن تقديرنا ل Dou Liu و Dongliang Xu و Pinpin Hou من المنشأة الأساسية لمعهد شنغهاي للعلاج المناعي لدعمهم في استخدام الأدوات. تم دعم هذا العمل من قبل منح المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين 31930038 و U21A20199 و 32100718 و 32350007 (إلى Linrong Lu) ؛ 32100718 (إلى Xuexiao Jin) ؛ فريق بحث مبتكر من الجامعات المحلية رفيعة المستوى في شنغهاي SHSMU-ZLCX 20211600 (إلى Linrong Lu) ؛ برنامج الحضانة الداخلية RJTJ24-QN-076 (إلى Zejin Cui). تم إعداد الشكل 2 باستخدام Figdraw.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 م EDTA (درجة الحموضة 8.0)SolarbioE1170
100 مم صحن زراعة الخلايا والأنسجةBIOFILTCD010100
1 M Hepes (حمض خال ، معقم)SolarbioH1090
لوحة زراعة الخلايا والأنسجة ذات 24 بئراNEST702002
48 بئرا لزراعة الخلايا والأنسجةNEST748002
Brefeldin محلول (1,000x)BioLegend420601
Brilliant Violet 650 الجسم المضاد CD4 المضاد للفأر (RM4-5)BioLegend100546
CD3e الجسم المضاد أحادي النسيلة (145-2C11) ، الدرجة الوظيفية ، eBioscienceInvitrogen16-0031-82
CD44 الجسم المضاد أحادي النسيلة (IM7) ، PE ، eBioscienceInvitrogen12-0441-83
CD62L (L-Selectin) الجسم المضاد أحادي النسيلة (MEL-14) ، APC ، eBioscienceInvitrogen17-0621-82   ؛
عداد الخليةNexcelom BioscienceCellometer Auto 2000
Cell Strainer (40 & mu; م)biosharpBS-40-CS
(70 مو ؛ م)biosharpBS-70-CS
الطرد المركزي Eppendorf5425   R
أجهزة الطرد المركزي eppendorf5810 R
ChamQ SYBR Color qPCR Master MixVazymeQ411-02
ClonExpress II طقم استنساخ خطوةواحدة VazymeC112
DH5 & alpha ؛ الخلايا المختصةSangon BiotechB528413
Direct-zol RNA MiniprepZYMO RESEARCHR2050
DMEM MediumBasalMediaL110KJ
EasySep Mouse CD4 + T Cell Cell19852
eBioscience Fixable Vivability Dye eFluor 660Invitrogen65-0864-18
EndoFree Mini Plasmid Kit IITIANGENDP118-02
ExFect كاشف التعداءVazymeT101-01
مصل الأبقار الجنين ، Premium PlusGibcoA5669701
FITC المضاد للفأر IL-17A الأجسام المضادة (TC11-18H10.1)BioLegend506907
محلول الفورمالديهايدMacklinF864792
HiScript IV RT SuperMix ل qPCR؟ + ممسحة gDNA؟VazymeR423-01
IonomycinBeyotimeS1672
Mitomycin CMaokang Biotechnology7/7/1950
Mouse GRCm38NCBIRefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM مصل منخفض متوسطGibco31985070مصل منخفض متوسط
المحيط الهادئ الأزرق CD4 الأجسام المضادة للفأر (RM4-5)BioLegend100531
PE / Cyanine7 الأجسام المضادة CD25 المضادة للفأر (PC61)BioLegend102015
PE / Cyanine7 الأجسام المضادة CD4 المضادة للفأر (GK1.5) BioLegend100422
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) Gibco15140122
PMA / TPA   ؛BeyotimeS1819
R26-CAG-Cas9 الفئران مركز شنغهاي النموذجي للكائناتالحية Cat. رقم NM-KI-00120
TGF-beta البشري المؤتلف 1 (CHO-Expressed) ، CFR & D Systems11409-BH
المؤتلف الفئران IL-6PeproTech216-16
محلل الخلايا البحثيةBD BiosciencesBD LSR فارز
الخلايا البحثيةSONYMA900
RPMI 1640 MediumBasalMediaL210KJ
SimpliAmp نظام PCRCycler الأنظمة الحيويةالتطبيقية A24811
محلول بيروفات الصوديوم (100 ملم)Sigma-AldrichS8636
Ultra-LEAF منقى الأجسام المضادة CD28 المضادة للفأر (37.51)BioLegend102121
Ultra-LEAF منقى مضاد للفأر IFN-& جاما; الأجسام المضادة (XMG1.2)BioLegend505847
Ultra-LEAF منقى الأجسام المضادة IL-4 المضادة للفأر (11B11)BioLegend504135
Ultra-LEAF منقى المضاد للفأر IL-12 / IL-23 p40 الأجسام المضادة (C17.8)BioLegend505309
& beta ؛ -Mercaptoethanol (50 ملم)SolarbioM8211
مصفاة خلية بروتين الحراري

المراجع

  1. Wu, B., Wan, Y. Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).
  2. Dong, C. Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
  3. Patel, D. D., Kuchroo, V. K. Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions. Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).
  4. Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling. Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).
  5. Lee, Y., et al. Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells. Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).
  6. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  7. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  8. Doench, J. G., et al. Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  9. Holst, J., et al. Generation of t-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).
  10. Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells. J Vis Exp. (172), (2021).
  11. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  12. Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  13. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function. J Vis Exp. (117), e54698(2016).
  14. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  15. Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters. BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).
  16. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J Vis Exp. (44), 2307(2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نقل الجينات بالرتيروفيروسخلايا T CD4قياس التدفق الخلويالاستقطاب في المختبرROR Gamma Tحمض نووي ريبوزي موجه أحاديالتنظيم المناعي
استهداف الجينات بوساطة CRISPR / Cas9 للفيروسات القهقرية لدراسة تمايز Th17 في المختبر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.