التثقيب الكهربائي القائم على الركيزة المسامية مع مراقبة المعاوقة الكهربائية عبر الظهارة

Sawyer R. Lorenzen; Justin R. Brooks; Tyler C. Heiman; Ruiguo Yang

doi:10.3791/66971

مقالة منهجية

التثقيب الكهربائي القائم على الركيزة المسامية مع مراقبة المعاوقة الكهربائية عبر الظهارة

DOI:

10.3791/66971

⸱

سبتمبر 27, 2024

Sawyer R. Lorenzen¹^,² , Justin R. Brooks¹ , Tyler C. Heiman¹ , Ruiguo Yang¹^,²^,³

¹Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, ²Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, ³Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أزواج التثقيب الكهربائي للركيزة المسامية (PSEP) توصيل متسق وعالي الإنتاجية مع قابلية عالية للخلية. يوفر إدخال قياسات المعاوقة الكهربائية عبر الظهارة (TEEI) نظرة ثاقبة للعمليات الوسيطة ل PSEP ويسمح بالتسليم بدون ملصقات. تتناول هذه المقالة طريقة لإجراء تجارب تسليم PSEP وتحليل قياس TEEI في وقت واحد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التثقيب الكهربائي للركيزة المسامية (PSEP) هو طريقة ناشئة للتثقيب الكهربائي توفر إنتاجية عالية وتسليما متسقا. مثل العديد من الأنواع الأخرى من التسليم داخل الخلايا ، يعتمد PSEP بشكل كبير على علامات الفلورسنت والفحص المجهري الفلوري لتحديد التسليم الناجح. لاكتساب نظرة ثاقبة على الخطوات الوسيطة لعملية التثقيب الكهربائي ، تم تطوير منصة PSEP مع مراقبة متكاملة للمقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEEI). يتم استزراع الخلايا في إدخالات متاحة تجاريا مع أغشية مسامية. بعد فترة حضانة مدتها 12 ساعة للسماح بتكوين طبقة أحادية الخلية متقاربة بالكامل ، يتم وضع الإدخالات في وسائط النقل الموجودة في آبار جهاز PSEP. ثم تخضع الطبقة الأحادية للخلية لشكل موجي محدد من قبل المستخدم ، ويتم تأكيد كفاءة التوصيل من خلال الفحص المجهري الفلوري. يمكن تحسين سير العمل هذا بشكل كبير باستخدام قياسات TEEI بين الفحص المجهري النابض والفلوري لجمع بيانات إضافية حول عملية PSEP ، وترتبط بيانات TEEI الإضافية هذه بمقاييس التسليم مثل كفاءة التسليم والجدوى. توضح هذه المقالة بروتوكولا لإجراء PSEP مع قياسات TEEI.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التثقيب الكهربائي هو تقنية تتعرض فيها الخلايا لمجال كهربائي ، مما يخلق مسام مؤقتة في غشاء الخلية يمكن من خلالها للشحنات ، بما في ذلك البروتينات والحمض النووي الريبي والحمض النووي ، تمرير ^1,2. الإصدار الأكثر استخداما هو التثقيب الكهربائي السائب (BEP). يتم تنفيذ أفضل الممارسات البيئية عن طريق ملء كوفيت بإلكتروليت يحتوي على ملايين الخلايا ، وتعريض المنحل بالكهرباء للجهد العالي ، والسماح للبضائع بدخول الخلايا من خلال الانتشار أو البطانة¹. هناك العديد من المزايا لأفضل الممارسات البيئية ، بما في ذلك الإنتاجية العالية والعديد من الأنظمة المتاحة تجاريا. ومع ذلك ، هناك قيود على تسليم أفضل الممارسات البيئية. يؤدي وضع الخلايا غير المتسق بالنسبة للأقطاب الكهربائية وحماية المجال الكهربائي من الخلايا المجاورة إلى تباين كبير في التعرض للمجال الكهربائي خلال أفضل الممارسات البيئية ^3,4. الجهد العالي المطلوب ل BEP له أيضا تأثير سلبي كبير على صلاحية الخلية⁵. منذ إنشائها في عام 2011⁶ ، كان هناك اهتمام متزايد بطريقة التثقيب الكهربائي تسمى التثقيب الكهربائي للركيزة المسامية (PSEP) ، على الرغم من أنه يشار إليها أحيانا بأسماء أخرى ، بما في ذلك التثقيب الكهربائي الموضعي والتثقيب الكهربائي النانوي أو الجزئي¹^،⁷^،⁸. على عكس تعليق الخلايا من أفضل الممارسات البيئية ، يتم إجراء PSEP على الخلايا الملتصقة بالركيزة المسامية. لا يقتصر الأمر على تفضيل الحالة الملتصقة لغالبية خطوط الخلايا البشرية⁹ ، ولكن المسام الموجودة في الركيزة تركز أيضا على التيار الكهربائي ، مما يؤدي إلى توطين الجهد الكهربائي عبر الغشاء (TMP) إلى مناطق محددة من غشاء الخلية^10,11. يسمح هذا التوطين بانخفاض كبير في الجهد المطبق وتقليل الضرر وزيادة صلاحية الخلية. يساعد هذا المزيج من التأثيرات على التحكم في تطور مسام غشاء الخلية ، مما يؤدي إلى توصيل أكثر اتساقا وكفاءة¹^،⁵^،¹².

قدمت دراسة حديثة جهاز PSEP مع مجموعة أقطاب كهربائية مطلية بالذهب من ستة آبار لعقد إدخالات الغشاء المسامي المتاحة تجاريا¹³ (الشكل 1A ، B) ، وهي ممارسة تم تقديمها لأول مرة بواسطة Vindis et al.14. يمكن للجهاز تطبيق النبضات وقياس المعاوقة الكهربائية عبر الطبقة الأحادية للخلية ، والمعروفة باسم المعاوقة الكهربائية عبر الظهارة (TEEI) ، في الوقت الفعلي¹³. تسمح واجهة المستخدم الخاصة بالجهاز بالتحكم الكامل في شكل موجة التثقيب الكهربائي والقطبية. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام قياسات المعاوقة في الوقت الفعلي للتنبؤ بنتائج التسليم دون الحاجة إلى كواشف باهظة الثمن أو علامات فلورية ، وهو مفهوم يعرف باسم التسليم بدون ملصق¹⁵.

تتكون منصة PSEP من مكونين كهربائيين مخصصين رئيسيين: الجسم الرئيسي للجهاز ، الذي يضم مولد النبض ومعدات قياس TEEI ، ومجموعة الأقطاب الكهربائية ، حيث يتم إدخال الركائز المسامية ، ويحدث التثقيب الكهربائي. يمكن العثور على الرسوم البيانية لجميع الإلكترونيات المخصصة والمكونات المطبوعة 3D في GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI. بالإضافة إلى الإلكترونيات المخصصة ، يلزم أيضا وجود جهاز كمبيوتر حتى تعمل المنصة بشكل صحيح. يتطلب البرنامج المخصص تشغيل MATLAB (الإصدار 2021a أو أحدث) ، و Microsoft Excel لتخزين البيانات والوصول إليها للتحليل. يتحكم البرنامج في الإلكترونيات المخصصة ويوفر واجهة المستخدم الرسومية (GUI) لضبط الإعدادات. تم توفير هذه البرامج أيضا في GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI.

تشير البيانات الأولية إلى أن هذه العملية ممكنة لأنواع مختلفة من الخلايا الملتصقة (الشكل 1C) ، لكن هذه المقالة ستناقش فقط تحضير خلايا A431 باستخدام المعلمات التي وجد أنها مثالية لخط الخلية هذا بواسطة Brooks et ^al.13. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن شحنة يوديد البروبيديوم (PI) سامة للخلايا ، يتم إجراء تجربتين ، الأولى مع وسائط نقل PI عالية التركيز لتحديد كفاءة التسليم ، والثانية مع وسائط زراعة الخلايا فقط لقياس TEEI على مدى فترات زمنية أطول. تستخدم هذه التجارب أشكالا موجية متطابقة للتثقيب الكهربائي ، مما يسمح بربط النتائج (الشكل 1 د).

figure-introduction-1
الشكل 1: مخطط تجميع صفيف الأقطاب الكهربائية والبيانات الأساسية. (أ) نموذج CAD لإدراج داخل بئر من صفيف الأقطاب الكهربائية. (ب) نموذج CAD لمصفوفة الأقطاب الكهربائية. (ج) زيادة المعاوقة بسبب PSEP لخطوط الخلايا المحددة ، n = 3 لكل خط خلية. شريط الخطأ: خطأ قياسي للمتوسط. (د) كفاءة التسليم مقابل TEEI زيادة بيانات الارتباط. تم حساب كفاءة التسليم بقسمة عدد الخلايا الموسومة في كل من صور PI و calcein من تجارب التسليم على العدد الإجمالي للخلايا المحددة مع Hoechst. تم تحديد عدد الخلايا باستخدام خط أنابيب CellProfiler مخصص ، n = 6 لكل جهد. شريط الخطأ: (المحور س و ص) خطأ قياسي للمتوسط. هذا الرقم مستنسخ من Brooks et ^al.13 بإذن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. إعداد الكواشف وزراعة الخلايا

قم بإعداد وسائط زراعة الخلايا عن طريق إضافة 50 مل من مصل الجنين البقري (FBS) و 5 مل من البنسلين والستربتومايسين إلى حاوية سعة 500 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM). أنتج أحد عشر حصة سعة 50 مل لتقليل مخاطر التلوث وقم بالتبريد عند 4 درجات مئوية.
قم بإنشاء 1 مل من 25 ميكروغرام / مل من فبرونيكتين البلازما البشرية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
قم بإنشاء 15 مل من يوديد البروبيديوم 0.1 مجم / مل في محلول مخزون DMEM للسماح بإجراء تجارب بتركيزات مختلفة من البضائع.
زراعة خلايا A431 في دورق T75 يحتوي على 12 مل من وسائط زراعة الخلايا المحضرة. تم تمرير الخلايا كل 1-2 أيام للحفاظ على التقاء 50٪.

2. إعداد عينة

طلاء الفبرونيكتين
1. حدد اثني عشر إدراج ولوحين من 24 بئرا. ضع الإدخالات في لوحة بئر واحدة ، مما أدى إلى إنشاء صفين من ستة. ضع لوحة البئر الثانية جانبا حتى وقت لاحق.
2. قم بإنشاء 1,300 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / مل من محلول الفبرونيكتين عن طريق خلط 52 ميكرولتر من محلول مخزون الفبرونيكتين و 1,248 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب 1.5 مل.
3. توزيع 100 ميكرولتر من محلول الفبرونيكتين في كل إدراج. احتضان الحشوات في لوحة البئر عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
ضبط تركيز الخلية لتحسين كثافة الخلية
1. حوالي 1 ساعة قبل اكتمال حضانة الفبرونيكتين ، قم بإزالة قارورة T75 من خلايا A431 من الحاضنة لاستخراج الخلايا.
2. قم بإزالة الوسائط في القارورة باستخدام شفاط واغسلها ب 5 مل من PBS. إزالة برنامج تلفزيوني بنفس الطريقة وإضافة 3 مل من التربسين. احتضن لمدة 3-4 دقائق قبل النقر على جانب القارورة لفصل الخلايا تماما.
3. أضف 6 مل من وسائط زراعة الخلايا إلى القارورة ، واخلطها بقوة مع ماصة لفصل أي خلايا متبقية ، ونقل المحتويات إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. أجهزة الطرد المركزي عند 100 × جم و 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
4. قم بإزالة وسائط زراعة الخلايا والتربسين من أنبوب الطرد المركزي باستخدام شفاط ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الخلية. أضف 1 مل من الوسائط إلى أنبوب الطرد المركزي والماصة ذهابا وإيابا (دون إنتاج فقاعات) لتفتيت حبيبات الخلية وإعادة تعليق الخلايا.
5. ماصة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية ، و 40 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا ، و 50 ميكرولتر من صبغة التريبان الزرقاء في أنبوب 200 ميكرولتر ، باستخدام ماصة للخلط جيدا.
6. إزالة 10 ميكرولتر من خليط الصبغة وحقنه في مقياس الدم. عد الخلايا باستخدام تخفيف 10٪ من خليط الصبغة لتقدير إجمالي عدد الخلايا في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
  ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، افترض تركيز 5,000,000 خلية / مل.
7. اضرب كثافة البذر المطلوبة في مساحة سطح غشاء الإدخال ، واقسمها على الخلايا المحسوبة / مل في التعليق ، واضرب في 1,000 لحساب الميكرولتر المطلوب من تعليق الخلية لكل إدخال.
  1. للعثور على الكمية الإجمالية لتعليق الخلية المطلوبة ، اضرب هذا الرقم في 10 (لضمان خلايا كافية ل 9 عينات ، حيث أن 3 من 12 إدراجا ستكون عناصر تحكم خالية من الخلايا) ، وقم بالتقريب إلى أقرب عدد صحيح. في هذه الحالة ، يلزم ما مجموعه 135 ميكرولتر من تعليق الخلية لهذه التجربة.
8. قم بإنشاء 2000 ميكرولتر من محلول الخلية المعدل عن طريق خلط 135 ميكرولتر المحسوبة مسبقا من معلق الخلية مع 1865 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا في أنبوب طرد مركزي منفصل سعة 15 مل.
خلايا البذر
1. قم بإزالة الفبرونيكتين الزائد من كل ملحق بمجرد اكتمال حضانة الفبرونيكتين.
2. اغسل الحشوات مرتين بإضافة 100 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم إلى كل ملحق. قم بإزالة الماء باتباع نفس الترتيب الذي تمت إضافته به لضمان وقت غسيل ثابت بين الإدخالات.
3. اغسل الملحق مرة أخرى بإضافة وسائط زراعة خلايا 100 ميكرولتر إلى كل ملحق. قم بإزالة الوسائط باتباع نفس الترتيب الذي تمت إضافته لضمان وقت غسيل ثابت بين الإدخالات.
4. إدراج عينة الخلية
  1. خلايا البذور عن طريق سحب 200 ميكرولتر من محلول الخلية المعدل في كل إدخال. لضمان التقاء متسق بين الإدخالات ، امزج محلول الخلية في أنبوب الطرد المركزي قبل التوزيع واخلطه مرة أخرى داخل كل ملحق بعد التوزيع.
5. إدراج السيطرة السلبية
  1. ماصة 200 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا في كل إدراج. للحفاظ على الاتساق مع إدخالات عينة الخلية ، استخدم الماصة لخلط وسائط زراعة الخلايا داخل كل إدخال.
وضع العلامات والحضانة
1. ارسم خطا يقسم صفيحة البئر الثانية إلى عمودين بعرض ثلاثة آبار (للظروف التي تعمل في ثلاث نسخ) باستخدام علامة دائمة. افصل كل عمود إلى صفوف. قم بتسمية كل منطقة في الشبكة بالمعلمات ذات الصلة.
2. أضف 1 مل من وسائط زراعة الخلايا إلى كل بئر لتلقي ملحق للتجربة. نقل الحشوات من لوحة بئر التحضير إلى موقعها المناسب في لوحة بئر التجربة المسمى واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل.

3. الإجراء التجريبي

تجربة التسليم
1. ماصة 1.5 مل من محلول PI 0.1 مجم / مل في كل بئر في مجموعة الأقطاب الكهربائية. ضع ملحقا في كل بئر في صفيف الأقطاب الكهربائية ، وقم بتركيب أقدام الإدخال في أخاديد المحاذاة بحيث يكون الملحق متدفقا مع السطح العلوي للبئر (الشكل 1 أ ، ب).
2. قم بربط لوحة الدوائر المطبوعة بالقطب العلوي (PCB) بأعلى آبار صفيف الأقطاب الكهربائية وقم بتوصيل صفيف القطب بجهاز PSEP.
3. ضع مجموعة الأقطاب الكهربائية في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل للسماح بتوازن درجة الحرارة.
4. انقر فوق القائمة المنسدلة بجوار "الغشاء" في الزاوية العلوية اليسرى من واجهة المستخدم الرسومية وانقر فوق 400 نانومتر GBO. كرر هذه الخطوة مع "المنحل بالكهرباء" و "الخلايا" و "كثافة بذر الخلية" و "مدة الخلية" ، مع تحديد DMEM و A431 و 200 و 12 على التوالي.
  ملاحظة: هذه القيم هي لأغراض حفظ السجلات فقط، ولا تؤثر على وظيفة الجهاز. يرجى التأكد من ضبط هذه القيم حسب الضرورة لتتبع البيانات بشكل صحيح.
5. اكتب 1 في حقل تحرير مدة ما بعد النبض (دقيقة) على الجانب الأيمن من واجهة المستخدم الرسومية لتغيير وقت القياس الافتراضي بعد النبض إلى دقيقة واحدة. اترك جميع الإعدادات الأخرى في الحالة الافتراضية.
  ملاحظة: تقوم معلمات النبضة الافتراضية بإنشاء شكل موجي مربع بجهد 30 فولت و 20 هرتز ومدة 1 مللي ثانية و 200 نبضة. معلمات قياس TEEI الافتراضية هي 0.5 فولت و 100 هرتز و 1,000 هرتز و 10,000 هرتز و 100,000 هرتز.
6. انقر فوق الزر "تشغيل " وأدخل الأسماء المناسبة للآبار 1-3 و 4-6 عندما يطلب منك ذلك. انقر فوق "موافق " لبدء التجربة.
7. قم بإزالة مصفوفة الأقطاب الكهربائية من الحاضنة ونقل الإدخالات مرة أخرى إلى المواقع الأصلية في لوحة بئر التجربة عند انتهاء البرنامج من التنفيذ.
8. امزج 2 ميكرولتر من Hoechst 33342 و 5 ميكرولتر من الكالسيين AM مع 123 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا في أنبوب 200 ميكرولتر.
9. ماصة بلطف 10 ميكرولتر من محلول البقع في كل ملحق بعد النبض ووضع الحشوات مرة أخرى في الحاضنة لمدة 5 دقائق.
10. انقل لوحة البئر إلى حامل لوحة مجهر الفلورسنت بهدف تكبير 5x. صورة باستخدام برايتفيلد ومضان كل بقعة. قم بتوسيط الملحق فوق الهدف قبل تشغيل الكاميرا.
  ملاحظة: الأطوال الموجية للإثارة ل PI و calcein AM و Hoechst 33342 هي 558 نانومتر و 495 نانومتر و 353 نانومتر على التوالي. الأطوال الموجية للانبعاث هي 575 نانومتر و 519 نانومتر و 465 نانومتر على التوالي.
تجربة قياس TEEI
1. ماصة 1.5 مل من وسائط زراعة الخلايا في كل بئر في مجموعة الأقطاب الكهربائية. ضع عينة الخلية في الآبار 1-3 وإدراج التحكم في الآبار 4-6 ، مع تركيب أقدام الإدخال في أخاديد المحاذاة بحيث يكون الإدخال متدفقا مع السطح العلوي للبئر.
2. قم بربط ثنائي الفينيل متعدد الكلور بالقطب العلوي بأعلى آبار صفيف الأقطاب الكهربائية وقم بتوصيل صفيف القطب بجهاز PSEP.
3. ضع مجموعة الأقطاب الكهربائية في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل للسماح بتوازن درجة الحرارة.
4. انقر فوق القائمة المنسدلة بجوار "الغشاء" في الزاوية العلوية اليسرى من واجهة المستخدم الرسومية وانقر فوق 400 نانومتر GBO. كرر هذه الخطوة مع "المنحل بالكهرباء" و "الخلايا" و "كثافة بذر الخلية" و "مدة الخلية" ، مع تحديد DMEM و A431 و 200 و 12 على التوالي.
  ملاحظة: هذه القيم هي لأغراض حفظ السجلات فقط، ولا تؤثر على وظيفة الجهاز. يرجى التأكد من ضبط هذه القيم حسب الضرورة لتتبع البيانات بشكل صحيح.
5. اترك جميع الإعدادات المتبقية في حالتها الافتراضية.
  ملاحظة: تقوم معلمات النبضة الافتراضية بإنشاء شكل موجي مربع بجهد 30 فولت و 20 هرتز ومدة 1 مللي ثانية و 200 نبضة. معلمات قياس TEEI الافتراضية هي 0.5 فولت و 100 هرتز و 1,000 هرتز و 10,000 هرتز و 100,000 هرتز.
6. انقر فوق الزر "تشغيل " وأدخل الأسماء المناسبة للآبار 1-3 و 4-6 عندما يطلب منك ذلك. انقر فوق "موافق " لبدء التجربة.
7. قم بإزالة مصفوفة الأقطاب الكهربائية من الحاضنة ونقل الإدخالات مرة أخرى إلى المواقع الأصلية في لوحة بئر التجربة عند انتهاء البرنامج من التنفيذ.
8. امزج 2 ميكرولتر من Hoechst 33342 ، و 5 ميكرولتر من الكالسيين AM ، و 10 ميكرولتر من PI مع 113 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا في أنبوب تفاعل 200 ميكرولتر.
9. ماصة 10 ميكرولتر من محلول البقع في كل ملحق بعد النبض ووضع الحشوات مرة أخرى في الحاضنة لمدة 5 دقائق.
10. انقل لوحة البئر إلى حامل لوحة مجهر التصوير الفلوري بعدسة موضوعية 5x. صورة باستخدام برايتفيلد ومضان كل بقعة. ضع الحشوة في المنتصف فوق العدسة قبل تشغيل الكاميرا.
  ملاحظة: الأطوال الموجية للإثارة ل PI و calcein AM و Hoechst 33342 هي 558 نانومتر و 495 نانومتر و 353 نانومتر على التوالي. الأطوال الموجية للانبعاث هي 575 نانومتر و 519 نانومتر و 465 نانومتر على التوالي.

4. تحليل البيانات

تحليل بيانات الصورة باستخدام خط أنابيب CellProfiler
1. استخدم سير عمل CellProfiler المخصص الذي يتم توفيره في GitHub:https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI لمعالجة التسليم وصور تجربة قياس TEEI.
تحليل TEEI
1. انقر فوق علامة التبويب تحليل في واجهة المستخدم الرسومية.
2. قم بتبديل مؤشر نوع المعاوقة إلى TEEI في الجزء السفلي من واجهة المستخدم الرسومية.
3. انقر على السهم في المربع العلوي الأيمن لعرض جميع أسماء التجارب في ملف البيانات. حدد جميع بيانات عينة الخلية من تجربة قياس TEEI.
4. انقر على السهم في المربع التالي إلى اليسار لعرض جميع أسماء التجارب في ملف البيانات. حدد جميع بيانات إدراج عنصر التحكم من قياس TEEI.
5. انقر فوق تشغيل. سيظهر شكل أساسي يحتوي على بيانات عينة الخلية المحددة بأقل تردد قياس.
6. في مربع خيارات العينة على الجانب الأيمن من واجهة المستخدم الرسومية ، انقر فوق السهم لإظهار جميع بيانات الإدراج المحددة. يمكن إزالة القيم المتطرفة عن طريق تحديد البيانات المناسبة والنقر فوق إزالة أدناه.
  ملاحظة: يمكن استرداد أي بيانات تمت إزالتها من التحليل عن طريق النقرة الأخيرة على الزر إزالة بواسطة الزر تراجع .
7. انقر فوق تم للانتقال إلى الشكل التالي عندما تظهر البيانات المطلوبة في الشكل.
8. كرر الخطوتين 4.2.6 و4.2.7 لبيانات عينة الخلية المتبقية وبيانات التحكم. عندما يتم تأكيد مجموعة البيانات النهائية بالنقر فوق "تم" ، سيظهر رقم التحليل الكامل.
9. احفظ رقم التحليل.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد البروتوكول المعطى طريقة لاستخدام قياسات TEEI لفحص العمليات الوسيطة للتثقيب الكهربائي وإجراء تنبؤات التسليم ، وتحديدا لخط خلية A431 وشحنة PI. وفي حين أن تعديل هذا البروتوكول يناقش بمزيد من التفصيل في المادة، فمن المهم أن نلاحظ الآن أنه في حين أن القيم المحددة قد تتغير، فإن الاتجاهات العامة في الاستجابة تظل متسقة. على سبيل المثال ، تتوافق بيانات TEEI التي تنخفض إلى ما دون خط الأساس الأولي مع موت الخلايا ، في حين أن الزيادة القصوى في قيمة TEEI فوق الحد الأدنى تتوافق مع كفاءة التسليم¹³. ويرد أدناه استكشاف لهذه الاتجاهات العامة وآثارها.

كما هو موضح في الشكل 2 أ ، يمكن أن تنشأ مجموعة من اتجاهات قياس TEEI والتصوير الخلوي أثناء استخدام منصة PSEP. النتيجة المثالية لهذا البروتوكول هي إنتاج منحنى مشابه للبيانات الصحية المحسنة الموضحة في الشكل 2Ai. يتميز هذا بأنه النتيجة المثالية ، حيث لا يوجد انخفاض تحت خط الأساس ، مما يشير إلى القليل جدا من موت الخلايا ، إن وجد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المنحنى الصحي المحسن لديه أكبر زيادة في TEEI من الحد الأدنى ، مما يشير إلى درجة عالية من كفاءة التسليم¹³. يتم دعم هذه الاستدلالات من خلال تصوير ما بعد PSEP للطبقة الأحادية للخلية ، والذي يكشف عن موت خلية ضئيل وطبقة أحادية الخلية صحية وملتقاة تماما (الشكل 2Aiii). علاوة على ذلك ، يمكن تمييز تجربة التسليم الناجحة باستخدام أشكال موجية PSEP متطابقة بالصور الموضحة في الشكل 2B. يؤدي التطبيق الموجي السليم للتثقيب الكهربائي وتركيز البضائع إلى درجة عالية من اتساق التسليم وصلاحية الخلية.

تعد صحة والتقاء الطبقة الأحادية للخلية أمرا بالغ الأهمية للتطبيق الناجح لتنبؤات التسليم المستندة إلى TEEI^16,17. حتى مع وجود شكل موجي محسن ، تؤدي الطبقة الأحادية للخلية غير الصحية أو غير المكتملة إلى تضاؤل استجابة TEEI ، كما هو موضح في البيانات غير الصحية المحسنة في الشكل 2Aii. ومع ذلك ، لاحظ أن الصور الخاصة بهذه النتيجة (الشكل 2Avi) لا تزال تتوافق مع تفسير استجابة TEEI التي قدمها Brooks et ^al.13. لا يوجد انخفاض تحت خط الأساس ، مما يشير إلى موت الخلايا بالقرب من الصفر (الشكل 2C ، D). بالإضافة إلى ذلك ، فإن الزيادة المخفضة عن الحد الأدنى تتوافق مع تأثير سلبي على كفاءة التسليم ، حيث أن عددا أقل من الخلايا في الطبقة الأحادية يقلل من إجمالي تسليم PI (الشكل 2C ، D).

إذا تم تطبيق شكل موجي غير محسن ، فمن الممكن رؤية انخفاضات أكثر أهمية في استجابة TEEI. اعتمادا على إجمالي الطاقة والإطار الزمني الذي يتم تطبيقه فيه ، يمكن أن تنتج الأشكال الموجية غير المحسنة نتائج تتراوح من انخفاض الكفاءة إلى الإبادة شبه الكاملة للطبقة الأحادية للخلية (الشكل 2Ai ، III ، v). يظهر كل من المنحنيات غير المحسنة وغير المحسنة انخفاضا كبيرا عن خط الأساس ، مما يشير إلى موت كبير للخلايا. ومع ذلك ، فإن الأشكال الموجية غير المحسنة بشكل متزايد تعيق استعادة الخلايا ، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة التسليم.

تم حساب كفاءة التسليم بقسمة عدد الخلايا الموسومة في كل من صور PI و calcein من تجارب التسليم على العدد الإجمالي للخلايا المحددة مع Hoechst. تم حساب الموت عن طريق أخذ الخلايا المميزة ب PI في تجارب قياس TEEI والقسمة على العدد الإجمالي للخلايا التي تم تحديدها مع Hoechst. تم تحديد عدد الخلايا باستخدام خط أنابيب CellProfiler مخصص لكلا المقياسين.

figure-results-1
الشكل 2: منحنيات استجابة TEEI والتصوير للحالات الشائعة. (أ) (ط) بيانات استجابة TEEI التي توضح النسبة المئوية لتغير TEEI للظروف المحسنة وغير المحسنة. (ii) مقارنة استجابة TEEI بين الطبقات الأحادية الصحية وغير الصحية في ظل ظروف الشكل الموجي الأمثل. (ثالثا-خامسا) تصوير تمثيلي للنتائج المحتملة لظروف الشكل الموجي المحسنة وغير المحسنة التي تظهر موت الخلايا (أحمر) والخلايا الحية (خضراء). (vi) التصوير التمثيلي للطبقة الأحادية غير الصحية بعد تطبيق ظروف الشكل الموجي الأمثل التي تظهر موت الخلايا (الحمراء) الخلايا الحية (الخضراء). (B) صور توضح تسليم مؤشر الأداء بنجاح (أحمر) والخلايا الحية (أخضر) ومواقع النوى (أزرق). جميع الصور سطع من أجل الوضوح. قضبان المقياس: 1000 ميكرومتر. (ج) انخفاض TEEI من خط الأساس قبل PSEP إلى الحد الأدنى بعد PSEP وزيادة من الحد الأدنى بعد PSEP إلى ذروة ما بعد PSEP لجهد معين. د: كفاءة التوصيل ونسب موت الخلايا لجهد معين. تمثل أشرطة الخطأ SEM (n = 6). (C,D) مستنسخة من Brooks et ^al.13 بإذن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 2C أن زيادات TEEI من الحد الأدنى والانخفاضات من خط الأساس يتم رسمها لكل جهد شكل موجة PSEP. تخلق زيادة TEEI قوسا مكافئا ، يبلغ ذروته حوالي 20 فولت قبل التقليل ، بينما يزداد انخفاض TEEI من خط الأساس بشكل كبير مع زيادة الجهد. تعكس كفاءة التوصيل ونسب الوفيات في الشكل 2D هذه الاتجاهات ، مع تقوس كفاءة التوصيل بشكل مكافئ ، وبلغت ذروتها حوالي 30 فولت ، ويزداد الموت أضعافا مضاعفة مع زيادة الجهد الموجي.

إحدى الفرضيات للآلية الأساسية التي تسبب زيادة TEEI هي التناضح الكهربائي من خلال القنوات الدقيقة للركيزة سالبة الشحنة ، وهي ظاهرة ناجمة عن تطبيق مجال كهربائي^18,19. سواء كانت استجابة TEEI ناتجة عن التحفيز الميكانيكي من تورم الخلايا بسبب تدفق السائل التناضحي الكهربائي ، وهو عامل معروف أنه يحدث مع التثقيب الكهربائي²⁰ ، أو بسبب التحفيز الكهربائي لشكل الموجة نفسه ، فمن الواضح أن صحة واكتمال الطبقة الأحادية أمر بالغ الأهمية لتحقيق انخفاض الجهد المناسب عبر غشاء الخلية المطلوب للتثقيب الكهربائي. لهذا السبب ، فإن أهم الخطوات في هذه الطريقة هي تلك المتعلقة ببذر الخلايا وضمان التكوين السليم للخلية أحادية الطبقة. يمكن تأكيد ذلك عن طريق تصوير الطبقة الأحادية للخلية وقيمة TEEI الأساسية. بالنسبة لخلايا A431 ، يبلغ متوسط TEEI حوالي 7 Ω سم² ، في حين أن متوسط الخلايا HEK293T أقل قليلا 5 Ω · سم² (الشكل 2Aii) ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى الاختلافات المورفولوجية التي تسبب اختلافات في منطقة تقاطع الخلية والخلية.

بسبب المجال الكهربائي المطلوب للتثقيب الكهربائي للركيزة المسامية ، سيحدث التحليل الكهربائي ، مما يتسبب في تآكل الأقطاب الكهربائية^12,21. كان هذا واضحا بشكل خاص بالنسبة للقطب السفلي ، حيث تم شحنه إيجابيا في هذه التجربة لتقديم PI موجب الشحنة. من خلال التجريب ، تم تحديد أنه يمكن استخدام ثنائي الفينيل متعدد الكلور السفلي حوالي 20 مرة قبل أن تتطلب الآثار السلبية الكبيرة الاستبدال¹³. لتنظيف مجموعة الأقطاب الكهربائية لإعادة استخدامها، قم بإزالة ما تبقى من زراعة الخلايا أو وسائط النقل من الحجرات باستخدام شفاط. املأ كل غرفة ثلاثة أرباع الطريق مليئة بالإيثانول بنسبة 70٪ وضع القطب العلوي ثنائي الفينيل متعدد الكلور على مجموعة الأقطاب الكهربائية بحيث يتم غمر الأقطاب الكهربائية العلوية. اترك الإيثانول في مجموعة الأقطاب الكهربائية لمدة 10 دقائق على الأقل قبل إزالة الإيثانول ووضع مجموعة الأقطاب الكهربائية جانبا حتى تجف.

من الممكن إعادة استخدام الإدخالات المشتراة عن طريق إزالة الركائز وتعقيم الإدخال واستبدال الركيزة بأخرى مأخوذة من مصدر آخر. تتوفر حشوات 6 آبار بنفس كثافة المسام والقطر تجاريا ويمكن استخدامها لحصاد أربع ركائز بديلة بحجم 24 بئرا. بمجرد تعقيم الحشوات المستخدمة سابقا ، أضف 10 ميكرولتر من الإيبوكسي المعالج بالأشعة فوق البنفسجية إلى طبق بتري طازج. اغمس جانب الركيزة من الملحق في بركة الإيبوكسي لطلاء السطح السفلي ، وضع ركيزة جديدة بعناية فوق الفتحة الموجودة في الملحق. تحقق بصريا من أن الإيبوكسي يصنع حلقة كاملة لضمان عدم وجود فجوات في الاتصال. عالج تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 ثانية وقم بتخزين الحشوات المجددة في لوحة نظيفة من 24 بئرا لتجنب إتلاف الركائز الجديدة قبل إعادة استخدامها.

كما ذكرنا سابقا ، بينما يفترض أن الزيادة المرصودة في TEEI ستحدث في أنواع متعددة من الخلايا ، فقد تم إثباتها فقط مع خطوط الخلايا A431 و HEK293T¹³ (الشكل 1C) ، وكلاهما خلايا ملتصقة. يمكن تعديل الطريقة عن طريق اختيار خطوط خلايا مختلفة عن طريق اختيار أغشية ذات خصائص مسامية مختلفة ، أو استبدال طلاء الفبرونيكتين ببروتين مصفوفة آخر خارج الخلية عن طريق ضبط التركيز ، أو عن طريق تغيير الحمولة. ومع ذلك ، إذا تم إجراء أي تغييرات على إعداد التجربة ، فقد يكون من الضروري إعادة تحسين شكل الموجة. لتحسين شكل الموجة ، يمكن إجراء تجربة قياس TEEI حيث يتم تغيير معلمة شكل موجة واحدة فقط ، مثل الجهد ، بين كل مجموعة من ثلاث عينات. حدد الجهد الأمثل من خلال تحديد أكبر زيادة في TEEI على تسع عينات صحية على الأقل. كرر هذه العملية لكل معلمة شكل موجي ، باستخدام القيم المحسنة حديثا عند الانتقال إلى المعلمة التالية. تذكر أنه قد يكون هناك العديد من الأمثل المحلي لمعلمات شكل الموجة (على سبيل المثال ، قد لا يكون الجهد الأمثل لمدة نبضة واحدة هو الجهد الأمثل لمدة نبضة أخرى ، وهكذا دواليك).

فوائد التثقيب الكهربائي للركيزة المسامية واسعة النطاق. في حين أن الطرق الأخرى للتوصيل داخل الخلايا موجودة منذ فترة طويلة ، إلا أن القليل منها يجمع بين الإنتاجية العالية ودرجة عالية من التحكم التي يمتلكها PSEP ^1,13. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر استخدام المنصة لقياسات TEEI لمحة عن الخطوات الوسيطة لعملية التثقيب الكهربائي. تخبر قراءات TEEI حالة الخلايا ، وتوجه اختيار معلمات التثقيب الكهربائي ، وتسمح بمزيد من التبصر في سلوكيات وآليات الخلية^{المحددة 13,17}. من خلال قياسات TEEI ، فإن المنصة قادرة أيضا على التسليم بدون ملصق¹³ ، مما يسمح بالتحسين السريع مع تضاؤل الحاجة إلى المؤشرات الحيوية والكواشف باهظة الثمن في كل مرة يتم فيها إجراء تجربة. هذه المساهمات في مجال التسليم داخل الخلايا تجعل هذا مرشحا رئيسيا كمنصة تسليم للبحوث البيولوجية الأساسية والتطبيقات الطبية الحيوية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نعترف بدعم التمويل من NSF (جوائز 1826135 ، 1936065 ، 2143997) ، والمعاهد الوطنية للصحة للعلوم الطبية العامة P20GM113126 (مركز نبراسكا للاتصالات الجزيئية الحيوية المتكاملة) و P30GM127200 (مركز نبراسكا للطب النانوي) ، ومبادرة نبراسكا التعاونية ودعم الهندسة الحيوية Voelte-Keegan. تم تصنيع الجهاز في المرفق الأساسي لأبحاث هندسة النانو (NERCF) ، والذي يتم تمويله جزئيا من قبل مبادرة أبحاث نبراسكا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
15 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطي	الحراري العلمي	339651
2 رقاقة مقياس الدم القابل للتصرف	بولدوغ Bio	DHC-N01
75 سم ^{2< / sup> قارورة ثقافة الأنسجة}	Fisherbrand	FB012937
خلايا A431	ATCC	CRL-1555
Calcein AM	Invitrogen	C3099
خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية من النوع A2	Labgard	NU-543-600
مكونات مخصصة	YangLab		https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
أنبوب الطرد المركزي القابل للتصرف (50 مل)	فيشربراند	05-539-6
DMEM	Gibco	11965092
مصل الأبقار	الجنين جيبكو	نظام شفط السوائل A5670401
	فراغ	20727403
HERACELL 240i	51026331		الحراري العلمي
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
البلازما البشرية فيبرونيكتين	سيجما ألدريتش	FIBRP-RO
مجهر الفلورسنت المقلوب	Zeiss	491916-0001-000
المجهر المقلوب	Labomed	TCM 400
PBS	cytiva	SH30256.02
PCR أنبوب 200 & مايكرو ؛ L	Sarstedt	72.737
Penicillin / Streptomycin	Gibco	15140148
Pipette (0.2-2 & micro; L)	فيشربراند النخبة	FBE00002
ماصة (100-1000 & مايكرو; L)	فيشربراند إيليت	FBE01000
ماصة (20-200 & مايكرو; L)	فيشربراند إيليت	FBE00200
ماصة (2-20 ومايكرو ؛ L)	فيشربراند إيليت	FBE00020
بروبيديوم يوديد	إنفيتروجين	P1304MP
أنبوب التفاعل 1.5 مل	Sarstedt	72.690.300
Sorvall ST 16R أجهزة الطرد المركزي	الحرارية العلمية	75004240
Thincert (24 بئر)	Greiner Bio-One	662 641	0.4 وميكرو ؛ قطر المسام م ، 2 × 10 < سوب > 6 < / سوب> سم < سوب > -2 < / سوب> كثافة المسام ، لوحة
ثقافة الأنسجة الشفافة PET (24 بئر)	فيشربراند	FB012929
تريبان بلو سولوشن	سيجما ألدريتش	T8154-20 مل
تريبسين	جيبكو	15090046

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brooks, J., et al. High throughput and highly controllable methods for in vitro intracellular delivery. Small. 16 (51), e2004917(2020).
Stewart, M. P., Langer, R., Jensen, K. F. Intracellular delivery by membrane disruption: Mechanisms, strategies, and concepts. Chem Rev. 118 (16), 7409-7531 (2018).
Canatella, P. J., Karr, J. F., Petros, J. A., Prausnitz, M. R. Quantitative study of electroporation-mediated molecular uptake and cell viability. Biophys J. 80 (2), 755-764 (2001).
Pliquett, U., Gift, E. A., Weaver, J. C. Determination of the electric field and anomalous heating caused by exponential pulses with aluminum electrodes in electroporation experiments. Bioelectrochem Bioenerg. 39 (1), 39-53 (1996).
Pan, J., et al. Cell membrane damage and cargo delivery in nano-electroporation. Nanoscale. 15 (8), 4080-4089 (2023).
Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6 (11), 747-754 (2011).
Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
Patino, C. A., et al. Multiplexed high-throughput localized electroporation workflow with deep learning-based analysis for cell engineering. Sci Adv. 8 (29), 7637(2022).
Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 471-476 (1999).
Ishibashi, T., Takoh, K., Kaji, H., Abe, T., Nishizawa, M. A porous membrane-based culture substrate for localized in situ electroporation of adherent mammalian cells. Sensors Actuators B: Chem. 128 (1), 5-11 (2007).
Mukherjee, P., Nathamgari, S. S. P., Kessler, J. A., Espinosa, H. D. Combined numerical and experimental investigation of localized electroporation-based cell transfection and sampling. ACS Nano. 12 (12), 12118-12128 (2018).
Brooks, J. R., et al. An equivalent circuit model for localized electroporation on porous substrates. Biosens Bioelectron. 199, 113862(2022).
Brooks, J. R., et al. Transepithelial electrical impedance increase following porous substrate electroporation enables label-free delivery. Small. 20 (25), 2310221(2023).
Vindiš, T., et al. Gene electrotransfer into mammalian cells using commercial cell culture inserts with porous substrate. Pharmaceutics. 14 (9), 1959(2022).
Ye, Y., et al. Single-cell electroporation with real-time impedance assessment using a constriction microchannel. Micromachines. 11 (9), 856(2020).
Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods Protoc. 5 (1), 17(2022).
Harhaj, N. S., Antonetti, D. A. Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology. Int J Biochem Cell Biol. 36 (7), 1206-1237 (2004).
Hunter, R. J. Zeta potential in colloid science: Principles and applications. 2, Academic Press. (2013).
Wong, P. K., Wang, T. -H., Deval, J. H., Ho, C. -M. Electrokinetics in microdevices for biotechnology applications. IEEE/ASME Trans Mechatron. 9 (2), 366-376 (2004).
Qian, K., Wang, Y., Lei, Y., Yang, Q., Yao, C. An experimental and theoretical study on cell swelling for osmotic imbalance induced by electroporation. Bioelectrochemistry. 157, 108637(2024).
Fox, M. B., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: A review. Anal Bioanal Chem. 385 (3), 474-485 (2006).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Porous Substrate Electroporation Electroporation Monitoring Fluorescent Microscopy Cell Monolayer Delivery Efficiency Cell Viability Waveform Parameters Electrode Array Cell Culture Inserts

التثقيب الكهربائي القائم على الركيزة المسامية مع مراقبة المعاوقة الكهربائية عبر الظهارة

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة