بروتوكول محسن للرولز السويسرية المعوية وتلطيخ الفلورسنت المناعي للأنسجة المدمجة في البارافين

ملخص

الأمعاء أمر حيوي للهضم والامتصاص. كل منطقة - الاثني عشر ، الصائم ، الدقاق ، القولون - تخدم وظائف مميزة بسبب الهياكل الخلوية الفريدة. تتطلب دراسة فسيولوجيا الأمعاء تحليلا دقيقا للأنسجة. يحدد هذا البروتوكول تثبيت الأنسجة ومعالجتها باستخدام تقنية Swiss roll ، مما يضمن تلطيخا مناعيا دقيقا من خلال الحفاظ على الأنسجة وتوجيهها بشكل صحيح.

الملخص

الأمعاء هي عضو معقد يتكون من الأمعاء الدقيقة والأمعاء. يمكن تقسيم الأمعاء الدقيقة إلى اثني عشر والصائم والدقاقي. كل منطقة تشريحية من الأمعاء لها وظيفة فريدة تنعكس من خلال الاختلافات في البنية الخلوية. يتطلب التحقيق في التغيرات في الأمعاء تحليلا متعمقا لمناطق الأنسجة المختلفة والتغيرات الخلوية. لدراسة الأمعاء وتصور قطع كبيرة من الأنسجة ، يستخدم الباحثون عادة تقنية تعرف باسم القوائم السويسرية المعوية. في هذه التقنية ، تنقسم الأمعاء إلى كل منطقة تشريحية وثابتة في اتجاه مسطح. بعد ذلك ، يتم لف الأنسجة بعناية ومعالجتها لتضمين البارافين. يعد التثبيت والتوجيه المناسبين للأنسجة تقنية مختبرية غالبا ما يتم تجاهلها ولكنها مهمة للغاية للتحليل النهائي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي التدحرج السويسري غير السليم للأنسجة المعوية إلى إتلاف ظهارة الأمعاء الهشة ، مما يؤدي إلى ضعف جودة الأنسجة للتلطيخ المناعي. يعد ضمان الأنسجة الثابتة جيدا والموجهة بشكل صحيح مع الهياكل الخلوية السليمة خطوة حاسمة تضمن التصور الأمثل للخلايا المعوية. نقدم طريقة فعالة من حيث التكلفة وبسيطة لصنع لفائف سويسرية لتشمل جميع أقسام الأمعاء في كتلة واحدة مدمجة بالبارافين. كما وصفنا تلطيخ الأنسجة المعوية بالإشعاع المناعي الأمثل لدراسة الجوانب المختلفة لظهارة الأمعاء. يوفر البروتوكول التالي للباحثين دليلا شاملا للحصول على صور مضان مناعي عالية الجودة من خلال تثبيت الأنسجة المعوية وتقنية Swiss-roll و immunostaining. إن استخدام هذه الأساليب المكررة يحافظ على التشكل المعقد لظهارة الأمعاء ويعزز فهما أعمق لفسيولوجيا الأمعاء وعلم الأمراض المرضي.

المقدمة

تشكل البنية الخلوية للأمعاء تحديا فريدا في الحفاظ على سلامتها الهيكلية عندما يتم الحفاظ على الأنسجة المعوية للتلطيخ المناعي. تتكون الأمعاء الدقيقة من تراكيب ممدودة تشبه الأصابع تعرف باسم الزغابات¹. غالبا ما تصبح هذه الزغابات مشوهة أثناء عمليات التضمين. إن التأكد من أن الباحثين لديهم تقنيات لتضمين الأمعاء بشكل صحيح لتحقيق المقاطع العرضية ، مما يسمح بتصور جميع مناطق الأمعاء ، وكذلك الطبقات التي تشكل الأمعاء (أي البروبريا العضلية ، والغشاء المخاطي ، والمصل) ، أمر بالغ الأهمية للتحليل التجريبي القوي². سيؤدي التثبيت غير الكافي والتثبيت المفرط والتعامل غير السليم مع الأنسجة إلى الإضرار بسلامة الأنسجة ، مما يؤدي إلى تلف غير مقصود لظهارة الأمعاء ^3,4. يمكن أن يؤدي إتلاف ظهارة الأمعاء خلال هذه الخطوات إلى تقليل جودة التحليلات اللاحقة بشكل كبير ، مثل التألق المناعي ، بغض النظر عن فعالية بروتوكولات الكيمياء الهيستولوجية المناعية والأجسام المضادة المستخدمة.

يعد التلوين المناعي ، مثل التثبيت المناسب للأنسجة ، جزءا مهما من البحوث الطبية الحيوية. عندما يتم ذلك بشكل جيد ، يمكن أن يضيء التلوين المناعي جوانب غير معروفة سابقا من البنية الخلوية والوظيفة. يمكن أن يكون تلطيخ التألق المناعي لأقسام البارافين أمرا صعبا بسبب التعديلات الفيزيائية والكيميائية الناتجة عن عملية التثبيت وتضمين البارافين⁵. يؤدي التثبيت وتضمين البارافين إلى إخفاء المستضد الذي يمكن أن يتداخل مع الكشف عن التألق المناعي للحواتم ذات الأهمية⁶. يمكن أن يؤدي التثبيت المتأخر إلى تدهور التحلل البروتيني ، مما يؤدي إلى ضعف أو غياب تلطيخ الحواتم الحرجة⁷. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تكون الأجسام المضادة غير دقيقة مع مستويات عالية من الخلفية. يمكن أن توفر بروتوكولات التلوين المناعي التي تعزز ارتباط الأجسام المضادة المتسق والمحدد ونسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية معلومات قيمة للباحثين.

هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا مصمما للحصول على صور مضان مناعي عالية الجودة من خلال تثبيت الأنسجة المعوية ، وإعداد اللفة^{السويسرية 8} ، والتلوين المناعي. مع التأكيد على المبادئ التوجيهية للحفاظ على سلامة الأمعاء ، يهدف البروتوكول إلى تزويد الباحثين بمنهجية قوية لتعزيز جودة وموثوقية دراسات التصوير المناعي. لقد سعينا أيضا إلى استخدام موارد فعالة من حيث التكلفة ، بما في ذلك ورق الترشيح واسترجاع المستضد محلي الصنع ، وحلول الحظر ، ومخففات الأجسام المضادة لجعل البروتوكول في متناول المختبرات التي قد تكون مقيدة الأموال. بالنسبة لجميع البروتوكولات التجريبية ، يجب على الباحثين تحسين البروتوكول الحالي بناء على نهجهم التجريبي ومجالات اهتمامهم.

البروتوكول

وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة ساوث كارولينا الطبية على جميع رعاية وصيانتها وعلاجها. تم جمع الأنسجة المعوية من الفئران البالغة C57BL / 6J (الذكور والإناث من 3-5 أشهر ، ويزن حوالي 30 جم) لاستخدامها في الدراسة الحالية.

1. تثبيت الأنسجة المعوية

1. قم بتشريح الأمعاء بأكملها بعناية من فأر القتل الرحيم وضعه في وعاء وزن أو طبق بتري يحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
2. قم بإزالة الأمعاء من برنامج تلفزيوني واستخدم المقص لإزالة الدهون الزائدة والأنسجة الضامة برفق. يساعد قطع النسيج الضام الأنسجة على الاستلقاء أثناء الخطوات اللاحقة.
3. قسم الأمعاء إلى شرائح فردية باستخدام المقص (أي الاثني عشر ، الصائم ، الدقاق ، الأعور ، والقولون). قسم الأجزاء بناء على السمات التشريحية و / أو الطول ، حيث يكون ما يقرب من 13٪ من طول الأمعاء اثني عشر ، و 58٪ هو الصائم ، و 8٪ هو الدقاق ، و 6٪ الأعور ، والقولون 15٪ ⁹. يتبع الاثني عشر المعدة ، والدقاق هو الجزء الطرفي من الأمعاء الدقيقة قبل الأعور مباشرة.
4. حرر القولون عن طريق قطع حيث ينضم إلى الأعور باستخدام المقص. ضع الاثني عشر والصائم والدقاق والقولون في وعاء الوزن أو طبق بتري من برنامج تلفزيوني. تجاهل الأعور أو إصلاحه وفقا للطرق المنشورة الأخرى¹⁰.
5. قم بتوصيل طرف ماصة P200 بحقنة سعة 10 مل عن طريق قطع الطرف الكبير من الطرف بشفرة حلاقة. ملء حقنة مع برنامج تلفزيوني.
6. أدخل طرف المحقنة في فتحة شريحة معوية باستخدام ملقط. استخدم الملقط لتثبيت الجزء المعوي على المحقنة واغسله برفق بمعدل ~ 50 ميكرولتر / ثانية لإزالة محتويات الأمعاء. اجمع محتويات الأمعاء في وعاء وزن فارغ أو طبق بتري.
7. ضع الجزء المعوي الرطب في خط مستقيم على شريط من ورق ترشيح السليلوز الجاف المسمى (انظر جدول المواد). تأكد من أن الجزء المعوي مبلل بدرجة كافية للالتصاق بشكل صحيح بورق الترشيح الجاف. قم بتسمية ورقة الترشيح بمعلومات رقم الماوس والنمط الجيني والمجموعة التجريبية وما إلى ذلك باستخدام قلم رصاص.
   ملاحظة: قد يؤدي استخدام قلم لتسمية ورق الترشيح إلى فقدان الملصقات أثناء التثبيت.
8. استخدم مقص التشريح لقطع الأمعاء مفتوحة طوليا على طول خط المساريق. قص ~ 5 مم في المرة الواحدة ، باستخدام الحافة السفلية للمقص أو زوج من الملقط لوضع الأنسجة المقطوعة بشكل مسطح على ورق الترشيح. استمر حتى يتم قطع الجزء بأكمله من الأمعاء ووضعه بشكل مسطح على ورق الترشيح. احرص على قطع الأمعاء المفتوحة في خط مستقيم قدر الإمكان ، لأن هذا سيجعل من السهل لف الأنسجة.
   ملاحظة: يمكن استخدام مقص رأس الكرة خلال هذه الخطوة لتجنب تلف الأنسجة.
9. ضع قطعة أخرى من ورق الترشيح أعلى الجزء المعوي. تأكد من أن ورق الترشيح يقوم بشطائر الجزء المعوي ، مما يمنع الأمعاء من التجعيد أو فقدان شكلها المسطح أثناء التثبيت.
10. قم بتدبيس حواف ورق الترشيح لتثبيت الأنسجة في مكانها. لا تدبيس المنديل. ضع ما يكفي من الدبابيس حول المنديل لمنع انفصال الأنسجة عن ورق الترشيح أثناء التثبيت.
11. كرر الخطوات 1.5-1.10 لكل جزء من أجزاء الأمعاء (الاثني عشر ، الصائم ، الدقاق ، والقولون).
12. اغمر الأنسجة في 10٪ فورمالين مخزن طبيعي (أو مثبت من اختيارك مثل 4٪ بارافورمالدهيد ، مثبت كارنوي ، إلخ) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    تنبيه: تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية الصحيحة لأن المثبتات مثل الفورمالين سامة.

2. لف الأنسجة المعوية ومعالجتها

تنبيه: نفذ الخطوات من 2.1 إلى 2.6 في غطاء محرك السيارة جيد التهوية.

1. قم بإزالة القطعة العلوية من ورق الترشيح برفق (تلك التي تلامس الجانب اللمعي من الأمعاء). استخدم الملقط لتقشير الأمعاء بعناية من القطعة السفلية من ورق الترشيح. تخلص من ورق الترشيح.
2. املأ ثلاثة قوارب وزن ب PBS. اغسل المناديل في برنامج تلفزيوني 3x لإزالة الفورمالين من الأنسجة.
3. باستخدام ملقط الحركة العكسية (انظر جدول المواد) ، التقط قطعة من الأمعاء على طول الحافة القصيرة مع توجيه الجانب اللمعي لأعلى. أدر الملقط للف الأنسجة. استخدم زوجا من الملقط العادي للمساعدة في توجيه الأنسجة أثناء لفها. إذا تم طي المنديل ، فقم بفكه وحاول مرة أخرى.
4. ضع المنديل في وعاء وزن جاف أو طبق بتري. امسك المنديل في مكانه باستخدام ملقط في يد واحدة. افتح ملقط الحركة العكسية بعناية وحرر الأنسجة ، باستخدام الملقط الآخر لإزاحة الأنسجة من ملقط الحركة العكسية.
5. أدخل دبوس تشريح بحجم 00 أو دبوس دقيق في الأنسجة (انظر جدول المواد). استخدم قواطع الأسلاك لإزالة الطرف الحاد للدبوس. ضع المنديل في كاسيت كبير ثم ضع الكاسيت في وعاء يحتوي على 70٪ من الإيثانول حتى يصبح جاهزا للمعالجة.
6. كرر الخطوات 2.1-2.5 مع جميع الأجزاء المعوية (الاثني عشر ، الصائم ، الدقاق ، والقولون) ، مع وضع جميع لفائف الأنسجة الأربعة في نفس الكاسيت الكبير (انظر جدول المواد). تأكد من أن الدرج مكتوب عليه بقلم رصاص لمنع الملصق من الغسل في محاليل الإيثانول والزيلين (انظر جدول المواد).
7. بمجرد لف جميع العينات ، ضع العينات في معالج الأنسجة. استخدم الإعدادات التالية للأنسجة المعوية: 70٪ إيثانول لمدة 35 دقيقة ؛ 90٪ إيثانول لمدة 35 دقيقة ؛ 95٪ إيثانول لمدة 35 دقيقة ؛ 100٪ إيثانول لمدة 35 دقيقة ، 3x ؛ زيلين لمدة 35 دقيقة ، 3x ؛ البارافين لمدة 60 دقيقة ، 3x. يمكن ترك الكاسيتات في شمع البارافين المذاب لفترات زمنية طويلة.
   تنبيه: تأكد من ارتداء معدات الحماية المناسبة لأن الزيلين مادة كيميائية سامة.

3. تضمين الأنسجة المعوية

1. سخن قوالب التضمين الكبيرة للحفاظ على ذوبان البارافين.
2. أخرج الكاسيتات من معالج الأنسجة وضعها في كأس من البارافين المذاب.
3. في محطة التضمين ، ضع كمية صغيرة من البارافين في قالب. قم بإزالة اللفائف السويسرية الأربعة من الكاسيت وضعها جميعا في قالب واحد ، وضعها بشكل مسطح قدر الإمكان. أضف المزيد من البارافين لملء القالب.
4. انقل القالب إلى اللوحة الباردة وتأكد من أن جميع اللفائف السويسرية مسطحة في الجزء السفلي من القالب. ضع سطح كاسيت صغير مكتوب عليه (انظر جدول المواد) على القالب وأضف المزيد من البارافين إذا لزم الأمر.
5. بمجرد أن يصلب الشمع ، قم بإزالة الكتلة من القالب. الأنسجة جاهزة الآن للتقطيع إلى شرائح 5 ميكرومتر وتطفو على شرائح زجاجية مشحونة للتلطيخ المناعي¹¹.

4. التصاق الأنسجة وإعداد الشرائح

1. لضمان التصاق قسم مناديل البارافين المحضر 5 ميكرومتر بالشريحة ، ينزلق الزجاج الحراري على جهاز تسخين منزلق أو كتلة حرارية مضبوطة على 60 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة. يمكن أيضا ترك الشرائح ساخنة لفترة أطول ؛ هذه الخطوة ليست حساسة للوقت.
2. دع الشرائح تبرد إلى درجة حرارة الغرفة (~ 15 دقيقة).

5. إزالة البارافين

1. عند البدء في إزالة البارافين من الشرائح ، تأكد من بقاء الأنسجة في محلول ولا تجف طوال فترة التلوين المناعي.
2. استخدم رفا منزلقا (انظر جدول المواد) لتثبيت الشرائح الزجاجية ووضعها داخل طبق مقاوم للمذيبات (انظر جدول المواد) مملوء بكاشف إزالة / إزالة البارافين (انظر جدول المواد). تأكد من أن الكاشف يغطي الأنسجة بالكامل على كل شريحة. قبل غمر الشرائح تماما في كاشف المقاصة ، اغمس أو ادفع الرف المنزلق عدة مرات في محلول المقاصة. اترك الشرائح مغمورة لمدة 10 دقائق أو أكثر.
   ملاحظة: قد يلزم تنفيذ هذه الخطوة في غطاء جيد التهوية بسبب الأبخرة الخطرة ، اعتمادا على عامل التطهير المختار. إزالة البارافين من الأنسجة في هذه الخطوة ليست حساسة للوقت ، إذا كنت تستخدم عامل تطهير غير سام.
3. قم بإزالة وتحريك الرف المنزلق لإزالة كاشف الإزالة الزائد. في طبق جديد مقاوم للمذيبات ، كرر الخطوة 5.2.
4. في طبق جديد مقاوم للمذيبات ، كرر الخطوة 5.3. اترك الشرائح مغمورة لمدة 15 دقيقة أو أكثر. هذه الخطوة ليست حساسة للوقت.

6. الإماهة

1. قم بإزالة وتحريك الرف المنزلق لإزالة كاشف الإزالة الزائد. في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء بالإيثانول بنسبة 100٪ ، اغمس أو ادفع رف الشرائح عدة مرات واترك الشرائح مغمورة لمدة 5 دقائق. هذه الخطوة حساسة للوقت. كرر 2x.
2. قم بإزالة وتحريك الرف المنزلق لإزالة الإيثانول الزائد بنسبة 100٪. في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء بنسبة 95٪ من الإيثانول ، اغمس أو ادفع الرف المنزلق عدة مرات واترك الشرائح مغمورة لمدة 5 دقائق. هذه الخطوة حساسة للوقت. كرر 1x.
3. قم بإزالة وتحريك الرف المنزلق لإزالة الإيثانول الزائد بنسبة 95٪. في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء بنسبة 70٪ من الإيثانول ، اغمس أو ادفع رف الشرائح عدة مرات واترك الشرائح مغمورة لمدة 5 دقائق. هذه الخطوة حساسة للوقت.
4. قم بإزالة وتحريك الرف المنزلق لإزالة الإيثانول الزائد بنسبة 70٪. في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء بنسبة 50٪ من الإيثانول ، اغمس أو ادفع الرف المنزلق عدة مرات واترك الشرائح مغمورة لمدة 5 دقائق. هذه الخطوة حساسة للوقت.
5. قم بإزالة وتحريك الرف المنزلق لإزالة الإيثانول الزائد بنسبة 50٪. في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء بالماء منزوع الأيونات (DI) ، اغمس أو ادفع الرف المنزلق عدة مرات واترك الشرائح مغمورة لمدة 5 دقائق. هذه الخطوة حساسة للوقت.
   1. للتوقف هنا ، ضع الشرائح في وعاء به برنامج تلفزيوني حتى يمكن استئناف التلوين المناعي بعد خطوة الإماهة المائية لمدة 5 دقائق.

7. استرجاع المستضد

1. املأ طبقا جديدا مقاوما للمذيبات بمخزن مؤقت مناسب لاسترجاع المستضد. انقل رف الشرائح مباشرة إلى هذا الحل. تأكد من أن الشرائح مغمورة بالكامل في محلول استرجاع المستضد ، وتغطي الأنسجة بالكامل.
   ملاحظة: يمكن أن تختلف حلول استرجاع المستضد المثلى اعتمادا على الجسم المضاد المعين المستخدم. قد يحتاج الباحث إلى تحديد استرجاع المستضد المطلوب للأجسام المضادة الفردية.
   1. لعمل 1x مخزن مؤقت لاسترجاع مستضد السيترات ، أضف 2.94 جم من ثنائي هيدرات سترات الصوديوم (انظر جدول المواد) لكل 1 لتر من الماء منزوع الأيونات. بمجرد إذابة ثنائي هيدرات سترات الصوديوم ، أضف كلوريد الهيدروجين (انظر جدول المواد) حتى يصل المحلول إلى درجة حموضة 6. أخيرا ، أضف 500 ميكرولتر من Tween20 (انظر جدول المواد) لكل 1 لتر من الماء منزوع الأيونات.
   2. لعمل 1x Tris-EDTA مخزن مؤقت لاسترجاع المستضد ، أضف 1.211 جم قاعدة Tris و 0.292 جم EDTA في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات. بمجرد إذابته ، اضبط على الرقم الهيدروجيني 9.
2. قم بتغطية الطبق المقاوم للمذيبات الذي يحتوي على محلول استرجاع المستضد والشرائح بغطاء وثبت الغطاء بأشرطة مطاطية.
3. ضع الطبق الآمن المقاوم للمذيبات في قدر الضغط (انظر جدول المواد) أعلى الرف المعدني أو الحامل الثلاثي. تأكد من وجود كمية كافية من الماء في قدر الضغط للوصول إلى الرف المعدني أو الحامل حتى يتراكم الضغط.
4. ضع الغطاء على قدر الضغط وقم بلفه في اتجاه عقارب الساعة لتثبيت الغطاء في مكانه. قم بلف صمام حد الضغط الموجود على الغطاء إلى إعداد الضغط.
5. ضمن إعداد القائمة ، حدد الضغط العالي على قدر الضغط ، ثم ضمن إعداد الوقت ، اضبط قدر الضغط على 30 دقيقة. حدد ابدأ.
6. بعد 30 دقيقة ، سيصدر قدر الضغط صوتا ويتم ضبطه تلقائيا على إعداد الاحتفاظ بالدفء. انتظر حتى يتحرر الضغط بشكل طبيعي ويتم فك الغطاء بحرية.
7. استخدم قفازات مقاومة للحرارة (انظر جدول المواد) لإزالة الطبق المقاوم للمذيبات من قدر الضغط وإزالة الشريط المطاطي والغطاء. ضع الطبق في حمام جليدي لمدة ~ 30 دقيقة للسماح للشرائح بالتبريد إلى درجة حرارة الغرفة. هذه الخطوة ليست حساسة للوقت.
8. بمجرد تبريده إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة الرف المنزلق من الطبق المقاوم للمذيبات وضعه في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء بماء DI لإزالة محلول استرجاع المستضد المتبقي. تأكد من أن الشرائح مغمورة بالكامل.
9. أخرج الرف المنزلق من ماء DI وضعه في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء ب PBS لمدة 5 دقائق. تأكد من أن الشرائح مغمورة بالكامل. هذه الخطوة ليست حساسة للوقت.

8. منع تلطيخ الخلفية غير المحددة

1. قم بإعداد غرفة مرطبة عن طريق أخذ صندوق منزلق كبير وإزالة غطاء الكرتون الملتصق بالغطاء. في قاعدة صندوق الشرائح ، ضع مناشف ورقية مبللة عموديا لأسفل. تأكد من وضع المناشف الورقية الرطبة بشكل مسطح.
2. قم بإزالة شريحة واحدة تلو الأخرى من حامل الشرائح المغمور في PBS. امسح بعناية PBS الزائد على الشريحة الزجاجية ، وتجنب الأنسجة.
3. باستخدام قلم كاره للماء (انظر جدول المواد) ، قم بتشكيل حاجز يحيط بالأنسجة عن طريق رسم مربع حول الأنسجة باستخدام القلم الكارهة للماء. احرص على تجنب الأنسجة وعدم استخدام القلم الكارهة للماء بالقرب من الأنسجة.
4. ضع الشريحة المحددة أفقيا فوق المناشف الورقية المبللة. أضف عازلة مانعة لتغطية الأنسجة (~ 100 ميكرولتر).
   1. لعمل عازل مانع ، أضف 100 ميكرولتر من جيلاتين جلد أسماك الماء البارد (Teleostein Gelatin ؛ انظر جدول المواد) إلى 9.85 مل من PBS. أخيرا ، أضف 50 ميكرولتر من 20٪ Triton X-100 (انظر جدول المواد) واخلطها حتى تذوب.
5. كرر الخطوات من 8.2 إلى 8.4 لكل شريحة. أغلق الغرفة الرطبة واحتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة.

9. الماوس على حجب الماوس

1. عند استخدام جسم مضاد أساسي للفأر لأنسجة الفئران المناعية ، قم بإجراء خطوة حظر إضافية. الكواشف المانعة للفأر (كتلة الماوس على الماوس ؛ انظر جدول المواد) متاحة تجاريا ؛ اتبع التعليمات التجارية عند إعداد كتلة الماوس على الماوس.
2. اضغط برفق على محلول الحظر وأضف على الفور كتلة الماوس على الماوس المعدة لتغطية الأنسجة (~ 100 ميكرولتر). كرر لكل شريحة تحتوي على أنسجة الفأر ، والتي سيتم تلطيخها باستخدام جسم مضاد أولي أثير في الفئران.
3. احتضان أقسام الأنسجة في صندوق الغرفة المرطب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
4. قم بإزالة الشرائح من الغرفة المرطب وضعها مباشرة في رف منزلق مغمور في PBS. اترك الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لغسل كتلة الماوس على الماوس.

10. الأجسام المضادة الأولية

1. لكل شريحة ، حدد الأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية التي يتم تربيتها في أنواع مختلفة. تمييع الأجسام المضادة الأولية في مخفف الأجسام المضادة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: E-CADHERIN (1: 100) ، MUC2 (1: 200) ، PCNA (1: 500) ، LAMININ (1: 200) ، β-CATENIN (1: 200) ، و LAMP1 (1:50).
   ملاحظة: إذا لم تقدم الشركة المصنعة التخفيفات الموصى بها ، فإن التخفيف 1: 100 هو نقطة انطلاق جيدة. إذا كان الجسم المضاد الأساسي محل الاهتمام مقترنا بالفلوروفور ، فراجع الخطوة 12.2.
   1. لجعل مخفف الجسم المضاد ، أضف المخزن المؤقت المانع 1:20 إلى PBS ، في حالة استخدام المخزن المؤقت لحجب جيلاتين السمك الموصوف أعلاه.
2. قم بإزالة الشرائح من PBS أو من الغرفة المرطبة، واضغط برفق على محلول الحجب الزائد أو PBS، وضعها أفقيا مرة أخرى في الغرفة المرطبة. تأكد من بقاء الحاجز الذي تم إنشاؤه باستخدام القلم الكارهة للماء في الخطوة 8.3 ؛ حدد الخطوط العريضة للأنسجة مرة أخرى إذا لزم الأمر.
3. أضف الأجسام المضادة الأولية المخففة بشكل مناسب والتي تهمك لتغطية الأنسجة (~ 100 ميكرولتر).
4. أغلق الغرفة المرطبة واحتضن الشرائح على سطح مستو عند 4 درجات مئوية في الظلام طوال الليل.

11. غسل الشرائح

1. قم بإزالة الشرائح من الغرفة المرطبة، واضغط برفق على الأجسام المضادة الأولية، وضع الشرائح في رف منزلق مغمور في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
2. قم بإزالة الرف المنزلق وضعه في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء ب PBS لمدة 5 دقائق. كرر الخطوة 1x.

12. الأجسام المضادة الثانوية وتلطيخ النوى

1. لكل شريحة ، حدد فلوروفورات الأجسام المضادة الثانوية المصممة للارتباط بأنواع الأجسام المضادة الأولية. تمييع فلوروفورات الأجسام المضادة الثانوية أو الأجسام المضادة الأولية المترافقة في مخفف الأجسام المضادة الثانوية. كانت الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة هي حمار مضاد للماعز 488 (1: 200) ، حمار مضاد للأرانب cy3 (1: 200) ، حمار مضاد للفأر 647 (1: 200) ، حمار مضاد للأرانب 647 (1: 200) ، وحمار مضاد للفئران cy3 (1: 200). تم استخدام الجسم المضاد الأساسي γ-ACTIN المترافق مع الفلوروفور 647 عند تخفيف 1: 100.
   1. لجعل مخفف الأجسام المضادة الثانوية ، أضف المخزن المؤقت المانع 1: 100 إلى PBS ، في حالة استخدام المخزن المؤقت لحجب جيلاتين الأسماك كما هو موضح أعلاه.
2. قم بإزالة الشرائح من PBS ، وانقر برفق على PBS الزائد ، وضعها أفقيا مرة أخرى في الغرفة المرطبة. تأكد من بقاء الحاجز الذي تم إنشاؤه باستخدام القلم الكارهة للماء في الخطوة 8.3 ؛ حدد الخطوط العريضة للأنسجة مرة أخرى إذا لزم الأمر.
3. أضف فلوروفورات الأجسام المضادة الثانوية المخففة بشكل مناسب أو الأجسام المضادة الأولية المترافقة ذات الأهمية لتغطية الأنسجة (~ 100 ميكرولتر).
4. أغلق الغرفة الرطبة واحتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 1 ساعة.
5. تمييع 10 ملغ / مل Hoechst (انظر جدول المواد) أو DAPI باستخدام PBS لتركيز نهائي من 1 ميكروغرام / مل Hoechst أو DAPI باستخدام PBS وإضافة مباشرة إلى الأنسجة (~ 100 μL). احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
6. قم بإزالة الشرائح من الغرفة الرطبة وضعها في رف منزلق مغمور في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في الظلام.
7. قم بإزالة الرف المنزلق وضعه في طبق جديد مقاوم للمذيبات مملوء ب PBS لمدة 5 دقائق في الظلام. كرر الخطوة 1x.

13. التركيب والتحضير للفحص المجهري

1. قم بإزالة شريحة واحدة في كل مرة من رف الشرائح المغمور في PBS ، مع إبقاء الشرائح المتبقية مغمورة في PBS في الظلام. اضغط برفق على PBS الزائد ، وإذا لزم الأمر ، استخدم منديلا خاليا من النسالة لمسح PBS الزائد بعناية على الشريحة الزجاجية ، وتجنب المنديل.
2. أضف قطرة أو قطرتين من وسط تركيب مضاد التلاشي (انظر جدول المواد) إلى مركز الأنسجة.
3. أمسك غطاء نظيفا (انظر جدول المواد ) من الحواف وقم بخفضه ببطء على الشريحة بزاوية 45 درجة. تأكد من أن وسط التثبيت ينتشر بالتساوي على الأنسجة.
4. بدءا من وسط المنديل ، اضغط برفق على غطاء الغطاء بإصبعين للمساعدة في إزالة فقاعات الهواء ووسط التثبيت الزائد. إذا لزم الأمر ، استمر في الضغط باتجاه الحواف وحافظ على الضغط اللطيف طوال الوقت.
5. اقطع الطرف الصغير من ماصة P200 غير المفلترة وأرفقها بطرف ماصة مصلية متصلة بالفراغ.
6. باتباع حواف غطاء الغطاء ، استخدم المكنسة الكهربائية لإزالة وسيط التثبيت الزائد.
7. في مربع شرائح جديد ، ضع الشريحة أفقيا بشكل مسطح واترك الشريحة تجف في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
8. كرر هذه العملية لكل شريحة.

النتائج

تم إجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E & E) ، كما هو موضح سابقا¹². باستخدام الطريقة المثلى ، تضمنت اللفائف السويسرية المعوية جميع الأجزاء الثلاثة للأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة على شريحة واحدة. يسمح استيعاب الأمعاء بأكملها على شريحة للباحثين بتحليل التغييرات في جميع أجزاء الأمعاء ويوفر التكاليف على كواشف التقسيم والتلوين (الشكل 1). أيضا ، تعريض جميع الأجزاء المعوية لنفس الحلول في وقت واحد عندما يساعد التلوين المناعي على ضمان نتائج دقيقة. توضح الصورة المجهرية H&E البنية المعوية المحفوظة لجميع أجزاء الأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة (الشكل 2). أظهر قياس الزغابات الاثني عشر عدم وجود فرق كبير في ارتفاع الزغابات في الأنسجة المعوية غير المفتوحة مقارنة بطريقة اللف السويسرية هذه مما يشير إلى أن فتح الأمعاء لا يعطل بنية الأنسجة (الشكل 2 د). يظهر التلوين المناعي للفائف السويسرية المعوية الطبقات المختلفة للأمعاء بالإضافة إلى محور القبو الزغبي بأكمله. تظهر الصور الفلورية مستويات خلفية منخفضة من تلطيخ الأجسام المضادة الأولية والثانوية وتصور بوضوح الخلايا الفردية الموجودة في الظهارة. يوضح الشكل 3 مورفولوجيا الأجزاء المعوية المختلفة وتلطيخ الخلايا الكأسية (الخلايا الإيجابية MUC2)¹³ ، والغشاء القمي (γ-ACTIN)¹⁴ ، والغشاء الجانبي للخلايا الطلائية (E-CADHERIN) ¹⁵ ، والنوى. هذا البروتوكول مناسب لتحديد العديد من المقصورات الخلوية المختلفة ، بما في ذلك الخلايا التكاثرية (PCNA) ¹⁶ ، الخلالي (LAMININ; الشكل 4 أ) ¹⁷ ، المجال الليزوزومي (LAMP1) ¹⁴ ، والظهارة (β-CATENIN ؛ الشكل 4 ب) ¹⁸.

الشكل 1: سير العمل لإعداد ومعالجة اللفائف السويسرية المعوية. (أ) تغسل الأجزاء المعوية بحقنة تحتوي على برنامج تلفزيوني ثم تغسل في برنامج تلفزيوني. (ب) توضع الأنسجة المعوية الرطبة على ورق ترشيح جاف. ج: تقطع الأمعاء طوليا على ورق الترشيح، وتفتح (د) برفق. (ه) توضع قطعة من ورق الترشيح فوق الأمعاء المفتوحة، وتوضع الأمعاء برفق بين ورقة الترشيح وتدبيسها. يتم تثبيت الأجزاء المعوية بين عشية وضحاها ، ويتم لف (F) باستخدام ملقط. (ز) إزاحة الأمعاء برفق من ملقط الحركة العكسية، و(H) له مظهر وردة. (ط، ي) يتم تثبيت الأنسجة المعوية ووضعها في شريط كبير. (ك) توضع جميع الأجزاء المعوية الأربعة في نفس الدرج لمعالجة الأنسجة ودمجها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين في الأجزاء الأربعة من الأمعاء. (أ) يوضح مسح البلاط القدرة على تصور الأمعاء بأكملها في شريحة واحدة باستخدام لفات سويسرية فردية من الاثني عشر والصائم والدقاق والقولون. (ب) صورة مجهرية للفة سويسرية معوية و(ج) أقحم تكبير أعلى لإظهار بنية الزغابات والقبوات. (د) لا يظهر القياس الكمي لطول خملات الأمعاء الدقيقة فرقا كبيرا بين الأنسجة السويسرية الملفوفة والأنسجة غير المفتوحة. قضبان المقياس = 1000 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تلطيخ التألق المناعي لجميع أجزاء الأمعاء الأربعة. تم مناعة الفئران الضابطة البالغة C57BL / 6J للنوى (السماوي) ، وعلامة الغشاء الجانبي ، و E-CADHERIN (الأخضر) ، والخلايا الكأسية التي تم تحديدها بواسطة MUC2 (الأصفر) ، وعلامة حدود الفرشاة القمية ، γ-ACTIN، (أرجواني). قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. تلطيخ المناعي للأمعاء. (أ) صورة مجهرية تمثيلية للتلطيخ المناعي لأمعاء الفأر تبرز النوى (سماوية) ، والخلايا التكاثرية ، PCNA (خضراء) ، والصفيحة المخصوصة ، LAMININ (أرجواني). ب: صورة التألق المناعي التي تحدد النوى (سماوية)، وعلامة غشاء الخلية β-CATENIN (خضراء)، وعلامة الليزوزوم LAMP1 (أرجواني) في الأمعاء. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

هنا ، نقدم طريقة محسنة لتثبيت الأنسجة باستخدام تقنية Swiss roll للحفاظ على بنية الأمعاء وتعزيز تلطيخ المناعة الدقيق. بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق في مجموعة متنوعة من الأسئلة البحثية التي تنطوي على فسيولوجيا الأمعاء وبيولوجيا الخلية¹⁹. تم نشر العديد من طرق الدرفلة السويسرية المحسنة وهي مفيدة جدا^20,21. ميزة هذه التقنية هي سهولة فتح الأمعاء بدقة على ورق الترشيح. يسمح ذلك بتثبيت الأنسجة بشكل مسطح ، مما يمنع الأنسجة من التجعيد إلى الداخل عند التدحرج ، وهو أمر مفيد بشكل خاص عند تحليل الأنسجة الملتهبة ذات العضلات السميكة. بالإضافة إلى ذلك ، من الضروري تسليط الضوء على الدور الحاسم لتقسيم الأنسجة في تحقيق نتائج موثوقة. يضمن التقسيم السليم الحفاظ على بنية الأنسجة ويسهل تلطيخ المناعة بدقة ، مما يساهم في النهاية في نجاح التحليلات النهائية¹¹. النهج الأمثل أقل صعوبة مقارنة بالبروتوكولات الأخرى ، مما يؤدي إلى نتائج متسقة بين الأفراد المختلفين. توفر التقنية المطروحة في هذه الورقة أيضا بنية أنسجة محفوظة جيدا ، وتعدد الاستخدامات ، وتلطيخ مناعي عالي التكرار باستخدام أجسام مضادة متنوعة.

أحد الجوانب الحاسمة لهذا البروتوكول هو وقت التثبيت والمعالجة. يمكن أن يؤدي تثبيت الأنسجة ومعالجتها بشكل غير صحيح إلى إضعاف التحليلات الكيميائية النسيجية. تصبح الأنسجة شديدة التثبيت هشة ، بينما تظل الأنسجة غير الثابتة ناعمة جدا. يصعب تقسيم كل من الأنسجة الزائدة وغير الثابتة وتعريض المناعة للخطر. بمجرد تشريحها على ورق الترشيح ، يجب وضع الأنسجة على الفور في الفورمالين لتقليل تعديلات ما بعد الوفاة^22. في هذا البروتوكول ، يتم إصلاح أنسجة الفئران في الفورمالين بين عشية وضحاها. استخدمت العديد من الدراسات وقت التثبيت هذا^20،23،24. ومع ذلك ، أظهر Boenisch et al. أن التلوين المناعي ثابت في الأنسجة المثبتة في الفورمالين لمدة تصل إلى 4 أيام²⁵. مطلوب تحسين وقت التثبيت والتثبيت اعتمادا على التحليلات المطلوبة. على سبيل المثال ، غالبا ما يفضل مثبت Carnoy لتلطيخ^{المخاط 26}. يجب تحسين اختيار المثبتات ومدة وقت التثبيت من قبل كل باحث اعتمادا على نهجه التجريبي. يوصى باستخدام معالج الأنسجة الآلي لضمان أوقات معالجة دقيقة ومتسقة. يستخدم مختبرنا دبابيس صغيرة لتثبيت الأنسجة المعوية في مكانها على شكل لفات. بدون دبابيس ، قد يتم فتح الأنسجة أثناء المعالجة. نظرا لأن هذه المسامير صغيرة جدا وحادة ، يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة. ننصح باستخدام قواطع الأسلاك لإزالة الطرف الحاد للدبوس قبل معالجة الأنسجة. بعض النوى الأنسجة لن تقبل الأنسجة مع دبابيس. لذلك ، من الأفضل التحقق قبل الاستخدام. نهج بديل هو استخدام أجار لتثبيت الأنسجة قبل معالجة²⁷ أو يمكن استخدام إسفنج الكاسيت في أشرطة للمساعدة في الحفاظ على القوائم.

Immunostaining هو بروتوكول يتطلب التحسين لكل جسم مضاد. يوصى باستخدام الأجسام المضادة التي تم التحقق من صحتها بالضربة القاضية كلما أمكن ذلك. تؤدي هذه الطريقة لتثبيت الأنسجة ومعالجتها إلى تلطيخ واضح ، مما يسمح بسهولة التعرف على ارتباط الأجسام المضادة مقارنة بإشارة الخلفية عند استخدام الأجسام المضادة غير المعتمدة. يمكن أن يؤثر الاختيار المثبت واسترجاع المستضد وتخفيف الأجسام المضادة على خصوصية الجسم المضاد. نوصي الباحثين بتقييم البروتوكول وتحسينه بعناية عن طريق ضبط التثبيت واسترجاع المستضد ووقت الحضانة لكل جسم مضاد. للحصول على أفضل النتائج ، يجب اختبار الأجسام المضادة في تخفيفات مختلفة لتحديد التركيز الأمثل وفي مخازن استرجاع المستضد المختلفة. يحسن استرجاع Epitope من تلطيخ المناعة عن طريق كسر جسور الميثيلين التي تشكلت أثناء التثبيت. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام استرجاع الخاتم الناجم عن الحرارة بدلا من استرجاع الخاتم الناجم عن التحلل البروتيني لأن هضم الإنزيم من المرجح أن يعطل مورفولوجيا الأنسجة²⁸. أكثر المخازن المؤقتة لاسترجاع الحواشي التي تسببها الحرارة شيوعا هي العازلة للسيترات ، و tris-HCl ، و tris-EDTA ، مع كون المخزن المؤقت للسيترات هو الألطف على مورفولوجيا^{الأنسجة 29}. يختلف اختيار المخزن المؤقت ويجب تحديده لكل جسم مضاد. تتوفر تجاريا العديد من مخازن استرجاع المستضدات ومحاليل الحظر ومخففات الأجسام المضادة. ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه الحلول مكلفة للغاية وباهظة التكلفة. قدمنا وصفات لحلول استرجاع المستضد الشائعة وحلول الحجب ومخفف الأجسام المضادة لضمان فعالية التكلفة.

أحد قيود هذه الطريقة هو أن التثبيت والمعالجة يمكن أن يغيرا الأنسجة وأقنعة الحواجز. نهج بديل هو مناعةالأنسجة المجمدة الطازجة. يتم تجميد الأنسجة المجمدة الطازجة ، مما يسمح بتجنب التعرض للمثبتات السامة ، والحفاظ على بنية البروتين ، وتحسين إمكانية الوصول إلى بعض الحاتم. ومع ذلك ، فإن بنية الأنسجة ومورفولوجيا أفقر من تلك الموجودة في الأنسجة الثابتة والمضمنة بالبارافين. تشمل التحديات الأخرى للأنسجة المجمدة الطازجة المواد والخدمات اللوجستية اللازمة لتقسيم وتخزين الكتل والشرائح المجمدة. يظهر تحليل اللفائف السويسرية مقابل شرائط الأنسجة المعوية اختلافات في ارتفاع الزغابات وعرضها والاختلافات في الخلايا المناعية في الصفيحة المخصوصة ، كما هو موضح في تقرير سابق³⁰. تشير هذه النتائج إلى أن القوائم السويسرية المعوية تغير بعض السمات المعوية ، والتي يجب مراعاتها عند التخطيط للتجارب. بالإضافة إلى ذلك ، يلزم إعادة التحقق من الأجسام المضادة لأن العديد من الأجسام المضادة التي ترتبط على وجه التحديد بالأنسجة المضمنة في البارافين المثبتة بالفورمالين لا تلطخ جيدا في الأنسجة المجمدة الطازجة³¹.

يمكن استخدام التلوين المناعي للأنسجة المعوية للإجابة على مجموعة متنوعة من الأسئلة المتعلقة ببيولوجيا الخلايا المعدية المعوية وعلم وظائف الأعضاء. تستخدم هذه التقنية على نطاق واسع لتحديد التغيرات الظهارية في وضع التهاب الأمعاء ، بعد العدوى البكتيرية ، وأثناء تطور السرطان. الطريقة المعروضة هنا مثالية للحفاظ على الأنسجة المعوية لأنها فعالة من حيث التكلفة ، وليست صعبة تقنيا ، وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة. لضمان أفضل النتائج ، نشجع على تحسين الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول بناء على التصميم التجريبي والفرضية التي يتم اختبارها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
β-CATENIN	GeneTex	GTX101435
ورق ترشيح السليلوز	Cytiva	10427804	ورق واتمان سميك
شرائح زجاجية مشحونة	Thermo Fisher Scientific	23888114
Coverslip	Epredia	152440
دبابيس تشريح الحجم 00	Phusis	B082DH4TZF
E-CADHERIN	R & D Systems	AF748
قفازات الفريزر	Tempshield	UX-09113-02
كتلة التدفئة	Premiere	XH-2001	Slide Warmer
Histo-Clear II	علوم المجهر الإلكتروني	64111-04	كاشف المقاصة
Hoescht	Thermo Fisher Scientific	62249
حمض الهيدروكلوريك	Sigma Aldrich	320331
قلم مسعور	Millipore	402176
LAMININ	GeneTex	GTX27463
LAMP1	سانتا كروز	SC-19992
أشرطة كبيرة	Tissue-Tek	4173
دبابيس Minutien	أدوات العلوم الدقيقة	NC9679721
الماوس على الماوس يحجب الكاشف	مختبرات ناقلات	MKB-2213	كتلة الماوس على الماوس
MUC2	GeneTex	GTX100664
PCNA	تقنية إشارات الخلية	2586S
طنجرة الضغط	Cuisinart	B000MPA044
إطالة الذهب المضاد للبهتان	الحرارية فيشر العلمي	P36934	تصاعد ملقط
متوسط العمل العكسي	Dumont	5748
شريحة رف	الأنسجة - Tek	62543-06
مجموعة تلطيخ الشرائح	Tissue-Tek	62540-01	أطباق مقاومة للمذيبات وأشرطة معدنية
أشرطة صغيرة	فيشربراند	15-200-403B
سترات الصوديوم ثنائي هيدرات	فيشر الكواشف الحيوية	BP327-1
Teleostein الجيلاتين	Sigma	G7765	مانع العازلة
مناديل تريتون X-100	ثيرمو فيشر Scientific	A16046
توين 20	مناديل Thermo Fisher Scientific	J20605-AP
	KimTech	34155
Xylenes	Fisher Chemical	1330-20-7
& gamma ؛ -ACTIN	Santa Cruz	SC-65638