مقالة منهجية

المقايسة المناعية للتدفق الجانبي الفلوري على أساس النقاط الكمومية النانوية

DOI:

10.3791/67000

⸱

يونيو 28, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Central Laboratory, Shanghai Skin Disease Hospital, School of Medicine, Tongji University, 2Department of Dermatology, Shanghai Skin Disease Hospital, Institute of Dermatology, School of Medicine, Tongji University, 3Department of Pharmacy, Changzheng Hospital, Naval Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف بروتوكولا لإعداد حبيبات نانوية نقطية كمومية (QDNB) والكشف عن المؤشرات الحيوية للمرض باستخدام شرائط المقايسة المناعية للتدفق الجانبي القائمة على QDNB. يمكن تقييم نتائج الاختبار نوعيا تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية وقياسها كميا باستخدام قارئ شريط الفلورسنت في غضون 15 دقيقة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النقاط الكمومية ، والمعروفة أيضا باسم بلورات أشباه الموصلات النانوية ، هي ملصقات فلورية جديدة للتصوير البيولوجي والاستشعار. ومع ذلك ، فإن اتحادات الأجسام المضادة ذات النقاط الكمومية ذات الأبعاد الصغيرة (~ 10 نانومتر) ، والتي يتم تحضيرها من خلال إجراءات تنقية شاقة ، تظهر حساسية محدودة في الكشف عن بعض علامات المرض النزرة باستخدام شرائط المقايسة المناعية للتدفق الجانبي. هنا ، نقدم طريقة لإعداد حبيبات نانوية نقطية كمومية (QDNB) باستخدام طريقة تبخر مستحلب من خطوة واحدة. باستخدام QDNB كما تم إعداده ، تم تصنيع اختبار مناعي للتدفق الجانبي الفلوري للكشف عن المؤشرات الحيوية للمرض باستخدام البروتين التفاعلي C (CRP) كمثال. على عكس الجسيمات النانوية ذات النقطة الكمومية المفردة ، فإن اتحادات الأجسام المضادة للخرزة النانوية ذات النقاط الكمومية أكثر حساسية مثل تسميات المقايسة المناعية بسبب تضخيم الإشارة عن طريق تغليف مئات النقاط الكمومية في حبة نانوية مركبة من البوليمر. علاوة على ذلك ، فإن الحجم الأكبر ل QDNBs يسهل فصل الطرد المركزي عند اقتران QDNBs بالأجسام المضادة. تم تصنيع المقايسة المناعية للتدفق الجانبي الفلوري على أساس QDNBs ، وتم قياس تركيز CRP في العينة في 15 دقيقة. يمكن تقييم نتائج الاختبار نوعيا تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية وقياسها كميا باستخدام قارئ الفلورسنت في غضون 15 دقيقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعمل شرائط المقايسة المناعية للتدفق الجانبي (LFIA) كأدوات حاسمة للكشف السريع في نقطة الرعاية 1,2 ، لا سيما في فحص الأمراض أثناء الأوبئة. ومع ذلك ، فإن شرائط اختبار LFIA التقليدية القائمة على الذهب الغروي تظهر حساسية منخفضة للكشف وتوفر نتائج نوعية فقط3. لتعزيز حساسية الكشف عن LFIA ، ظهرت العديد من الجسيمات النانوية الجديدة ، بما في ذلك اللاتكسالملون 4,5 ، والجسيمات النانوية الفلورية6 ، والكرات المجهرية الفلورية التي تم حلها بمرور الوقت 7,8 ، والنقاط الكمومية9،10،11. توفر النقاط الكمومية (QDs)12,13 ، والمعروفة أيضا باسم بلورات أشباه الموصلات النانوية ، أطوال موجية انبعاث قابلة للضبط ، ونطاق إثارة واسع ، وكفاءة تلألؤ عالية ، مما يجعلها ملصقات مثالية للتصوير البيولوجي.

ومع ذلك ، تظل الإشارة الفلورية المنبعثة من النقاط الكمومية الفردية ضعيفة ، مما يؤدي إلى حساسية كشف منخفضة نسبيا في المقايسات المناعية. يمكن أن يؤدي تغليف العديد من النقاط الكمومية داخل الكرات المجهرية إلى تضخيم الإشارات وتحسين حساسية المقايسات المناعية القائمة على النقاط الكمومية. تم استخدام طرق مختلفة ، مثل التجميع الذاتي طبقة تلو الأخرى14،15،16،17،18 ، وطريقة التورم19،20 ، وتغليف السيليكاالمجهري 21،22،23،24 ، لتغليف النقاط الكمومية داخل المجهرية. على سبيل المثال ، يمكن تحقيق ملصقات السيليكا النانوية الوظيفية بالنقاط الكمومية عن طريق زيادة تحميل QD لكل تفاعل مناعي محصور25. كما تم استخدام مجفف رذاذ مجهز برذاذ بالموجات فوق الصوتية لإعداد النانوية QD-BSA26. ومع ذلك ، فإن الطرق المذكورة أعلاه تعاني من خطوات متعددة معقدة ، وتبريد مضان ، وإنتاجية منخفضة.

في عملنا السابق27 ، تم الإبلاغ عن طريقة تبخر مستحلب المذيب لتغليف النقاط الكمومية داخل حبيبات البوليمر النانوية. تقنية التحضير هذه بسيطة ، وتحافظ على كفاءة الفلورسنت ل QDs ، وتضمن كفاءة تغليف عالية ، وتسمح بإنتاج سهل قابل للتطوير. نجحت العديد من المجموعات البحثية في تطوير شرائط LFIA باستخدام QDNBs المحضرة من خلال هذه الطريقة للتطبيقات ، بما في ذلك الكشف عن السموم الغذائية28،29،30 ، والكشف عن العلامات الحيوية للأمراض المعدية31،32 ، والرصد البيئي33.

يقدم هذا البروتوكول خطوات تحضير محددة لحبيبات نانوية النقاط الكمومية (QDNB) ، و QDNB واقتران الأجسام المضادة ، وإعداد LFIA القائم على QDNB ، وقياس البروتين التفاعلي C (CRP) في عينات البلازما البشرية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى شنغهاي للأمراض الجلدية (رقم 2020-15). وأجريت جميع الإجراءات التجريبية التي شملت عينات دم بشرية في مختبر من المستوى الثاني للسلامة الأحيائية. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. إعداد QDs نانوبيدات

ملاحظة: بالنسبة لتخليق QD nanobead ، تم استخدام تقنية تبخير مستحلب المذيبات لتجميع حبيبات QD النانوية ، مع نسبة من مرحلة الزيت إلى مرحلة الماء تبلغ 1: 5. يتم إنشاء مستحلب صغير عن طريق الموجات فوق الصوتية ، ويتم ترسيخ nanobeads من خلال تبخر المذيبات (الكلوروفورم). تم استخدام هيدروكسيد الصوديوم لتحفيز التحلل المائي لمجموعات أنهيدريد على سطح الحبيبات النانوية ، وتحويلها إلى مجموعات كربوكسيل.

  1. تحضير مرحلة الزيت ومحاليل الطور المائي
    1. تحضير 1 مل من مرحلة الزيت: 0.4 مل من محلول بولي (أنهيدريد ستايرين كو ماليك) (PSMA) (50 مجم / مل) ، 0.1 مل من محلول QDs (100 مجم / مل) ، املأ أي حجم أقل من 1 مل بالكلوروفورم.
    2. تحضير 5 مل من الطور المائي: محلول مائي SDS (0.5 بالوزن٪).
  2. تحضير المستحلب والتصلب
    1. أضف 1 مل من طور الزيت و 5 مل من الطور المائي إلى قنينة (15 مل) ، وضع القارورة على محرك مغناطيسي. قم بتشغيل قوة المحرك المغناطيسي.
    2. بعد خلط مراحل الزيت والمائية تماما ، قم بنقل القارورة على الفور إلى الموجات فوق الصوتية المبرمجة (60 ثانية ، نبضة 3 ثوان متبوعة بتوقف مؤقت لمدة 3 ثوان ، سعة 50٪) وقم بتشغيل الطاقة.
    3. مراقبة الحل بعد الموجات فوق الصوتية. انتقل المحلول ذو اللون القرمزي في البداية إلى مرحلة براق لا تزال تحتفظ بمسحة حمراء.
    4. ضع القارورة مرة أخرى على المحرك المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة ، مع التحريك المستمر طوال الليل. تم تبخير الكلوروفورم تدريجيا ، وتصلب المستحلب إلى حبيبات نانوية مركبة.
  3. تعديل سطح الحبيبات النانوية
    1. أضف 0.1 مل من 0.1 mM هيدروكسيد الصوديوم إلى معلق nanobeads لمدة 1 ساعة. تتحلل مجموعات أنهيدريد الموجودة على سطح الحبيبات النانوية إلى مجموعات كربوكسيل.
  4. تنقية الحبيبات النانوية
    1. قم بإيقاف تشغيل المحرك المغناطيسي وانقل الحبيبات النانوية الصلبة إلى أنبوب طرد مركزي. قم بطرد الأنبوب عند 13523 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية.
    2. أضف الحجم الأولي من الماء منزوع الأيونات إلى هطول الأمطار ، وقم بتغطية الأنبوب بغطاءه ، وغمره في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية ، وحافظ على الغمر حتى يتم تشتيت الراسب بالكامل.
    3. كرر الخطوات 1.4.1-1.4.2 مرتين ، وأخيرا ، انقل الحبيبات النانوية إلى الزجاجة الزجاجية. قم بتخزينه على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  5. توصيف الحبيبات النانوية
    1. توصيف حجم ومورفولوجيا حبيبات QDs النانوية باستخدام التصوير المجهري الإلكتروني (TEM)22.
      ملاحظة: يمكن الحصول على أحجام مختلفة من الحبيبات النانوية عن طريق تغيير نسبة محلول QDs ومحلول PSMA. يمكن أيضا تحديد حجم حبيبات QDs النانوية من خلال تشتت الضوء الديناميكي (DLS) 27.

2. تحضير اتحادات الأجسام المضادة QDNB

  1. تفعيل مجموعات الكربوكسيل
    1. أضف 100 ميكرولتر من QDNB المحضر (10 مجم / مل) في 200 ميكرولتر من محلول الفوسفات (PB ، 20 mM ، pH 6.0) ، ثم أضف 6 ميكرولتر من EDC (20 مجم / مل).
    2. احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على خلاط دوار.
    3. بعد الحضانة ، قم بطرد الخليط عند 13523 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية.
    4. أضف 100 ميكرولتر من PB (20 mM ، pH 6.0) إلى هطول الأمطار ، وقم بتغطية الأنبوب بغطاءه ، واغمر الأنبوب في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية حتى يتم تشتيت الراسب بالكامل.
  2. اقتران الأجسام المضادة والخرز النانوي
    1. قم بتفريق 100 ميكروغرام من الجسم المضاد في 200 ميكرولتر من PB (20 mM ، درجة الحموضة 6.0) وأضف تعليق QDNB المنشط الذي تم الحصول عليه من الخطوة 2.1 إلى محلول الأجسام المضادة.
    2. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع الدوران المستمر. قم بإزالة الأجسام المضادة الزائدة عن طريق الطرد المركزي عند 6010 × جم لمدة 5 دقائق (في درجة حرارة الغرفة) ، ثم تخلص بعناية من المادة الطافية.
  3. حجب الحبيبات النانوية
    1. أضف 200 ميكرولتر من محلول الكازين 1٪ (في محلول 20 مللي مول PB ، درجة الحموضة 7.4) إلى البقايا (التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.2.2) ، وقم بتغطية الأنبوب بغطاءه ، واغمره في حمام الماء بالموجات فوق الصوتية التشغيلي حتى يتم تشتيت البقايا بالكامل.
    2. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة مع دوران مستمر.
      ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو حجب أي مواقع غير متفاعلة على سطح QDNB.
  4. تخزين الاتحادات
    1. أضف 100 ميكرولتر من محلول حافظة (20 mM PB buffer ، pH 7.4 ، 1٪ BSA ، 5٪ تريهالوز ، 6٪ سكروز ، 0.1٪ S9 ، درجة حموضة 7.4) إلى الخليط واحفظه عند 4 درجات مئوية للاستخدام اللاحق.

3. إعداد شرائط المقايسة المناعية للتدفق الجانبي

ملاحظة: يتكون الشريط الكروماتوجرافي المناعي من غشاء نيتروسليلوز (NC) ، ووسادة عينة ، ووسادة مترافقة ، ووسادة ماصة ، ولوحة كلوريد البولي فينيل (PVC) (الشكل 1). يجب إعداد جميع الحلول واستخدامها على الفور. يوصى بإعداد شرائط المقايسة المناعية للتدفق الجانبي في غرفة نظيفة ذات رطوبة متحكم فيها.

  1. إعداد غشاء NC
    1. تحضير محلول طلاء خط الاختبار (T-line) وخط التحكم (C-line): قم بتخفيف الجسم المضاد لالتقاط CRP والماعز المضاد للأرانب IgG باستخدام PB إلى تركيز نهائي قدره 1 مجم / مل.
    2. ضع لوح PVC بشكل صحيح ، وقم بإزالة الورق الواقي الموجود على بعد 25 مم من حافة لوح PVC. قم بمحاذاة غشاء NC وإلصاقه على طول الحافة السفلية للورق الواقي المتبقي بلوحة PVC.
    3. قم بتوزيع محاليل طلاء T-line و C-line على غشاء NC بمعدل نفث يبلغ 1 ميكرولتر / سم ، مما يضمن وضعه على بعد 20 مم عن الحافة العلوية ، لتشكيل خط اختبار (بعرض 1 مم).
    4. ضع غشاء NC في ظروف ذات رطوبة أقل من 30٪ ونطاق درجة حرارة 18-26 درجة مئوية للتجفيف. يجب أن يكون وقت التجفيف 24 ساعة على الأقل.
      ملاحظة: تأكد من أن الحواف العلوية والسفلية لغشاء NC متدفقة مع الحواف المقابلة للمناطق المجاورة. لا ينبغي لمس أغشية NC باليدين. يجب التحكم في الرطوبة خلال هذه الخطوة في حدود 45٪ إلى 65٪. قبل المتابعة ، يجب موازنة محلول طلاء T-line ومحلول طلاء C-line وغشاء NC بنفس درجة الحرارة.
  2. إعداد وسادة مترافق
    1. اغمر الوسادة المترافقة في محلول معالجة الوسادة المترافقة (20 مللي مول PB buffer ، درجة الحموضة 7.4 ، 1٪ BSA).
    2. ضع الوسادة المترافقة المنقوعة في فرن تجفيف لمعالجة التجفيف (درجة حرارة الغرفة) طوال الليل.
    3. قم بلصق الوسادة المترافقة المعدلة برفق على لوح PVC.
    4. قم بتخفيف محلول اقتران الأجسام المضادة QDNB المحضر بمحلول حافظة (20 mM PB buffer ، pH 7.4 ، 1٪ BSA ، 5٪ تريهالوز ، 6٪ سكروز ، 0.1٪ S9 ، درجة حموضة 7.4).
    5. قم بتوزيع محلول اقتران الأجسام المضادة QDNB على الوسادة المترافقة بمعدل نفث 1 ميكرولتر / سم وجفف الوسادة المترافقة لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: يجب تعديل نسبة التخفيف المحددة وفقا لهدف الكشف.
  3. إعداد وسادة عينة
    1. اغمر وسادة العينة في محلول معالجة وسادة العينة (20 مللي مول PB buffer ، درجة الحموضة 7.4 ، 1٪ BSA ، 5٪ تريهالوز ، 6٪ سكروز ، 0.1٪ S9 ، درجة حموضة 7.4).
    2. ضع وسادة العينة المنقوعة في فرن تجفيف (45 درجة مئوية) وجففها لمدة 24 ساعة.
  4. تجميع البطاقة وتقطيعها إلى شرائح
    1. كما هو موضح في الشكل 1 ، ضع على التوالي الورق الماص (وسادة ماصة) ، وسادة مترافقة ، ووسادة عينة على لوح PVC مع غشاء NC.
    2. قطع البطاقة إلى شرائط عرض 3.8 مم.
  5. تغليف الشرائط
    1. قم بتغليف شرائط الاختبار في كاسيت بلاستيكي وأغلق كيس رقائق الألومنيوم الذي يحتوي على مادة مجففة.

4. عملية الفحص والتقييم النوعي

ملاحظة: يوصى بإجراء العمليات التي تشمل عينات دم بشرية في مختبر من المستوى الثاني للسلامة الأحيائية. تم الحصول على عينات البلازما البشرية من مختبر سريري (من أشخاص مجهولي الهوية). عادة ، تم جمع الدم البشري باستخدام أنبوب فراغ EDTA ، وتم عزل البلازما وفقا للبروتوكول القياسي34. جهاز طرد مركزي عند 3000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لفصل البلازما. اجمع الطبقة العليا من البلازما الصفراء باستخدام ماصة ، وقم بتخزين البلازما في أنبوب سعة 1.5 مل عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

  1. ماصة 10 ميكرولتر من عينة البلازما أو محلول المعاير إلى 1 مل من مخزن مؤقت PBS يحتوي على 0.1٪ Tween 20. بعد ذلك ، انقل 100 ميكرولتر من العينة المخففة المحضرة إلى وسادة العينة الخاصة بشريط الاختبار.
  2. بعد تشغيل لمدة 15 دقيقة ، راقب إشارات التألق للخط T والخط C تحت التعرض للأشعة فوق البنفسجية للحصول على نتائج نوعية.
  3. أدخل بطاقة الشريط في قارئ فحص التدفق الجانبي الفلوري للحصول على شدة التألق للتحليل الكمي.
    ملاحظة: في هذا المثال ، يتم استخدام طريقة المقايسة المناعية للشطيرة35,36 ؛ يشير خط أحمر واحد (خط التحكم) إلى نتيجة سلبية ، بينما يشير الخطان الأحمران (خطوط الاختبار والتحكم) إلى نتيجة إيجابية. يشير عدم وجود خط التحكم إلى أن الاختبار الذي تم إجراؤه غير صالح.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إجراءات إعداد QDNB موضحة بشكل تخطيطي في الشكل 1 أ. تم خلط مرحلة الزيت التي تحتوي على QDs والبوليمر في الكلوروفورم مع مرحلة الماء ، وتم الحصول على مستحلب صغير عن طريق الصوتنة. تم ترسيخ المستحلب عن طريق التبخر التدريجي للكلوروفورم. يتم عرض الصورة المجهرية الإلكترونية (TEM) ل QDNB في الشكل 2A. تتميز QDNBs بمورفولوجيا كروية ، بمتوسط أقطار 96 نانومتر ، تقاس بأكثر من 50 QDNBs في صور TEM. يتم ملاحظة الجسيمات النانوية QD بوضوح داخل الحبيبات النانوية ، مما يشير إلى التغليف الناجح. يوضح الشكل 2B والشكل 2D أطياف التألق والامتصاص ل QDNB ، على التوالي.

تم اقتران QDNB والجسم المضاد باستخدام كيمياء الكربوديميد، كما هو موضح في الشكل 1B. تم استخدام اقتران الأجسام المضادة QDNB لتحضير LFIA القائم على QDNB. هيكل LFIA موضح في الشكل 1C. إذا كان مستضد CRP موجودا في العينة ، فإن اتحادات QDNB-anti-CRP تتراكم عند خط الاختبار.

كما هو موضح في الشكل 3 ، يتم القياس بإضافة 100 ميكرولتر من العينة المخففة إلى فتحة العينة. بعد وقت رد فعل مدته 15 دقيقة ، يمكن قراءة نتائج الاختبار نوعيا تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية. يمكن الحصول على النتائج الكمية باستخدام قارئ شريط الفلورسنت ، ويمكن حساب تركيز العينة باستخدام معادلة معايرة مضمنة في برنامج قارئ الشريط37,38.

figure-results-1
الشكل 1: رسم توضيحي للمقايسة المناعية للتدفق الجانبي الفلوري بناء على حبيبات نانوية للنقاط الكمومية. (أ) إجراءات إعداد QDNB. (ب) مبدأ اتحادات الأجسام المضادة QDNB. (ج) مبدأ LFIA القائم على QDNB للكشف عن CRP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: توصيف QDNBs. (أ) صورة TEM ل QDNBs. شريط المقياس: 100 نانومتر. (ب) أطياف الانبعاث الفلوري ل QDNB. (ج) أطياف امتصاص QDNB. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: إجراءات المقايسة المناعية للتدفق الجانبي ل CRP. (أ) رسم توضيحي للكشف. (ب) صور فوتوغرافية لشرائط LFIA المستندة إلى QDNB التي تكتشف عينات CRP في نطاق 0-30 مجم / لتر تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. (ج) قارئ الفلورسنت للقياس الكمي للنتائج. د: صورة فوتوغرافية للنتائج الكمية. (ه) الكشف عن البروتين التفاعلي C (CRP) باستخدام التحويل اللوجستي متبوعا بالانحدار الخطي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف بروتوكولا لإعداد الحبيبات النانوية ذات النقاط الكمومية (QDNB)27 واستخدام QDNB لإعداد المقايسات المناعية للتدفق الجانبي الفلوري (LFIA). يتم توضيح القياس النوعي والكمي ل CRP في العينات. يمكن أيضا تطبيق LFIA القائم على QDNB على المؤشرات الحيوية للأمراضالأخرى 25,32 ، والسموم الغذائية29,30 ، والفيروسات16,27 ، والمزيد.

تتمثل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول في تحضير اتحادات الأجسام المضادة QDNB و QDNB. يجب تحسين حجم جسيمات QDNB ومحتوى QD في الخرز النانوي للحصول على QDNB عالي الفلورسنت مع إشارات خلفية منخفضة في LFIA. يعد التقاط أزواج الأجسام المضادة واكتشافها أمرا بالغ الأهمية للمقايسة المناعية ويجب فحصها للحصول على أفضل التطابقات من مختلف البائعين. يجب تحسين اقتران الجسم المضاد مع QDNB ، بما في ذلك نسبة الجسم المضاد / QDNB ، ودرجة الحموضة العازلة ، والكواشف المانعة. على وجه التحديد ، يجب تجنب تجميع QDNBs والأجسام المضادة عن طريق تحسين الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت وتركيز الملح ووقت التفاعل في إجراءات الاقتران.

بالمقارنة مع طرق التحضير الأخرى للخربدات النانوية ذات النقاط الكمومية ، يتميز هذا البروتوكول بمزايا البساطة والتشغيل السهل والإنتاجية العالية. علاوة على ذلك ، فإن حبيبات البوليمر النانوية المركبة متوافقة حيويا ، على عكس حبيبات السيليكا النانوية ، والتي تتطلب عادة تعديلا إضافيا للسطح مع البوليمرات. ومع ذلك ، فإن QDNBs المحضرة باستخدام هذا البروتوكول ليست أحادية التشتت مثل تلك المحضرة باستخدام حبيبات نانوية من قالب البوليمر19 أو السيليكا21 . يتراوح حجم جسيمات QDNBs عادة من 70 نانومتر إلى 200 نانومتر.

يتم تحضير شرائط المقايسة المناعية للتدفق الجانبي (LFIA) القائمة على QDNB بشكل مشابه لشرائط LFIA الفلورية الأخرى. نظرا للعوائد الكمية العالية ل QDs وتضخيم إشارة QDNBs ، فإن LFIA القائم على QDNB باستخدام هذا البروتوكول أكثر حساسية من LFIAs الأخرى القائمة على الكرات المجهرية الفلورية ، مثل الكرات المجهرية الفلورية التي تم حلها بمرور الوقت والكرات المجهرية الفلوريسين. بالإضافة إلى ذلك ، يتفوق استقرار QDNB على الفلوريسئين التقليدي ، مما يوفر LFIAs القائمة على QDNB وقت تخزين أطول.

ومع ذلك ، فإن الكادميوم الموجود على سطح النقاط الكمومية عرضة للاستخلاب مع مجموعات سلفهيدريل في البروتينات ، خاصة في البيئات المائية. يعد تجنب استخدام تركيزات عالية من البروتين أمرا بالغ الأهمية لاستقرار LFIAs القائمة على QDNB. الكادميوم سام ، واستخدامه محدود في بعض الحالات ، مما يستلزم تحضير نقاط كمومية خالية من الكادميوم ذات عوائد كمية عالية واستقرار.

باختصار ، يتم توفير طريقة متعددة الاستخدامات لإعداد حبيبات نانوية نقطية كمومية في خطوة واحدة ، وهي قابلة للتطوير للإنتاج الصناعي. باستخدام QDNBs المعدة ، تم إنشاء شرائط المقايسة المناعية للتدفق الجانبي الفلوري للكشف النوعي والكمي عن المؤشرات الحيوية للمرض. QDNB المثالي ل LFIA هو حبة نانوية صغيرة الحجم مغلفة بالعديد من QDs دون تبريد مضان.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pengfei Zhang هو مؤسس Shanghai Kundao Biotech ولديه مصالح مالية محتملة مع هذه الشركة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع لجنة شنغهاي للعلوم والتكنولوجيا (STCSM) (22S31902000) وبرنامج حضانة البحوث السريرية لمستشفى شنغهاي للأمراض الجلدية (NO. lcfy2021-10).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(ثنائي ميثيل أمينو) بروبيل) -N'-إيثيل كاربوديميد هيدروكلوريدسيجما-ألدريتش03450
ورق الامتصاص  Kinbio BiotechCH37K
ألبومين مصل الأبقارSigma-AldrichB2064
الكازينSigma-AldrichC8654
CdSe / ZnS النقطة الكموميةSuzhou Mesolight Inc.CdSe / ZnS-625
CholoroformSino Pharm10006818
CRP الأجسام المضادةHytest Biotech4C28
قارئ فحص التدفق الجانبي الفلوريSuzhou Helmence Precision InstrumentFIC-H1
وسادة الألياف الزجاجيةKinbio BiotechSB06
الماعز المضادة للأرانب IgGSangon BiotechD111018
غشاء النيتروسليلوز ساتوريوسCN140
بولي (أنهيدريد الستايرين-ماليك) كوبوليمر   ؛سيجما ألدريتشS458066
أرنب IgGسانجون التكنولوجيا الحيويةD110502
كبريتات دوديسيل الصوديومسينو فارم30166428
هيدروكسيد الصوديومالصينيةفارم 10019718

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. de Puig, H., Bosch, I., Gehrke, L., Hamad-Schifferli, K. Challenges of the nano-bio interface in lateral flow and dipstick immunoassays. Trends Biotechnol. 35 (12), 1169-1180 (2017).
  2. Miller, B. S., et al. Spin-enhanced nanodiamond biosensing for ultrasensitive diagnostics. Nature. 587 (7835), 588-593 (2020).
  3. Gao, Z., et al. Platinum-decorated gold nanoparticles with dual functionalities for ultrasensitive colorimetric in vitro diagnostics. Nano Lett. 17 (9), 5572-5579 (2017).
  4. Fan, L., et al. Deeply-dyed nanobead system for rapid lateral flow assay testing of drugs at point-of-care. Sensors Actuators B Chem. 362, 131829(2022).
  5. Garcia, V. S., Guerrero, S. A., Gugliotta, L. M., Gonzalez, V. D. G. A lateral flow immunoassay based on colored latex particles for detection of canine visceral leishmaniasis. Acta Trop. 212, 105643(2020).
  6. You, M., et al. Household fluorescent lateral flow strip platform for sensitive and quantitative prognosis of heart failure using dual-color upconversion nanoparticles. ACS Nano. 11 (6), 6261-6270 (2017).
  7. Ye, Z., Tan, M., Wang, G., Yuan, J. Novel fluorescent europium chelate-doped silica nanoparticles: preparation, characterization and time-resolved fluorometric application. J Mater Chem. 14 (5), 851(2004).
  8. Xu, Y., Li, Q. Multiple fluorescent labeling of silica nanoparticles with lanthanide chelates for highly sensitive time-resolved immunofluorometric assays. Clin Chem. 53 (8), 1503-1510 (2007).
  9. Zhang, B., et al. Improving detection sensitivity by oriented bioconjugation of antibodies to quantum dots with a flexible spacer arm for immunoassay. RSC Adv. 6 (55), 50119-50127 (2016).
  10. Li, Z., et al. Rapid and sensitive detection of protein biomarker using a portable fluorescence biosensor based on quantum dots and a lateral flow test strip. Anal Chem. 82 (16), 7008-7014 (2010).
  11. Wang, L., et al. Fluorescent strip sensor for rapid determination of toxins. Chem Commun. 47 (5), 1574-1576 (2011).
  12. Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labeling and sensing. Nat Mater. 4 (6), 435-446 (2005).
  13. Smith, A. M., Nie, S. Compact quantum dots for single-molecule imaging. J Vis Exp. (68), e4236(2012).
  14. Wang, C., et al. Layer-by-layer assembly of magnetic-core dual quantum dot-shell nanocomposites for fluorescence lateral flow detection of bacteria. Nanoscale. 12 (2), 795-807 (2020).
  15. Hu, J., Tang, F., Jiang, Y. Z., Liu, C. Rapid screening and quantitative detection of Salmonella using a quantum dot nanobead-based biosensor. Analyst. 145 (6), 2184-2190 (2020).
  16. Wang, W., et al. Introduction of graphene oxide-supported multilayer-quantum dots nanofilm into multiplex lateral flow immunoassay: A rapid and ultrasensitive point-of-care testing technique for multiple respiratory viruses. Nano Res. 16 (2), 3063-3073 (2023).
  17. Wang, C., et al. Colorimetric-fluorescent dual-signal enhancement immunochromatographic assay based on molybdenum disulfide-supported quantum dot nanosheets for the point-of-care testing of monkeypox virus. Chem Eng J. 472, 144889(2023).
  18. Zheng, S., et al. Dual-color MoS2@QD nanosheets mediated dual-mode lateral flow immunoassay for flexible and ultrasensitive detection of multiple drug residues. Sensors Actuators B Chem. 403, 135142(2024).
  19. Wang, G., et al. Efficient incorporation of quantum dots into porous microspheres through a solvent-evaporation approach. Langmuir. 28 (14), 6141-6150 (2012).
  20. Li, H., et al. Fluorescent lateral flow immunoassay for highly sensitive detection of eight anticoagulant rodenticides based on cadmium-free quantum dot-encapsulated nanospheres. Sensors Actuators B Chem. 324, 128771(2020).
  21. Gao, F., et al. Rational design of dendritic mesoporous silica nanoparticles' surface chemistry for quantum dot enrichment and an ultrasensitive lateral flow immunoassay. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (18), 21507-21515 (2021).
  22. Xu, L. D., Zhu, J., Ding, S. N. Immunoassay of SARS-CoV-2 nucleocapsid proteins using novel red emission-enhanced carbon dot-based silica spheres. Analyst. 146 (16), 5055-5060 (2021).
  23. Tao, S., et al. SARS-Cov-2 Spike-S1 antigen test strip with high sensitivity endowed by high-affinity antibodies and brightly fluorescent QDs/silica nanospheres. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (23), 27612-27623 (2023).
  24. Wang, C., et al. Development of an ultrasensitive fluorescent immunochromatographic assay based on multilayer quantum dot nanobead for simultaneous detection of SARS-CoV-2 antigen and influenza A virus. Sensors Actuators B Chem. 345, 130372(2021).
  25. Chen, L., Chen, C., Li, R., Li, Y., Liu, S. CdTe quantum dot functionalized silica nanosphere labels for ultrasensitive detection of biomarker. Chem Commun. 19, 2670-2672 (2009).
  26. Chu, M., et al. A novel method for preparing quantum dot nanospheres with narrow size distribution. Nanoscale. 2 (4), 542-547 (2010).
  27. Zhang, P., Lu, H., Chen, J., Han, H., Ma, W. Simple and sensitive detection of HBsAg by using a quantum dots nanobeads based dot-blot immunoassay. Theranostics. 4 (3), 307-315 (2014).
  28. Ouyang, S., et al. An on-site, ultra-sensitive, quantitative sensing method for the determination of total aflatoxin in peanut and rice based on quantum dot nanobeads strip. Toxins. 9 (4), 137(2017).
  29. Liu, J., et al. Quantitative ciprofloxacin on-site rapid detections using quantum dot microsphere based immunochromatographic test strips. Food Chem. 335, 127596(2021).
  30. Chen, Y., Fu, Q., Xie, J., Wang, H., Tang, Y. Development of a high sensitivity quantum dot-based fluorescent quenching lateral flow assay for the detection of zearalenone. Anal Bioanal Chem. 411 (10), 2169-2175 (2019).
  31. Zhang, Q., et al. SARS-CoV-2 detection using quantum dot fluorescence immunochromatography combined with isothermal amplification and CRISPR/Cas13a. Biosens Bioelectron. 202, 113978(2022).
  32. Zhong, X., et al. CRISPR-based quantum dot nanobead lateral flow assay for facile detection of varicella-zoster virus. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (10), 3319-3328 (2023).
  33. Liu, Y., Xiao, M., Xu, N., Yang, M., Yi, C. Point-of-need quantitation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid using a ratiometric fluorescent nanoprobe and a smartphone-based sensing system. Sensors Actuators B Chem. 367, 132083(2022).
  34. McCafferty, C., et al. Blood collection processing and handling for plasma and serum proteomics BT - Serum/plasma proteomics. Methods Mol Biol. 2628, 33-40 (2023).
  35. Zhang, P., et al. Rapid and quantitative detection of C-reactive protein based on quantum dots and immunofiltration assay. Int J Nanomedicine. 10, 6161-6173 (2015).
  36. Hu, J., et al. Sensitive and quantitative detection of C-reaction protein based on immunofluorescent nanospheres coupled with lateral flow test strip. Anal Chem. 88 (12), 6577-6584 (2016).
  37. Fan, L., et al. One-component dual-readout aggregation-induced emission nanobeads for qualitative and quantitative detection of c-reactive protein at the point of care. Anal Chem. 96 (1), 401-408 (2024).
  38. Gui, Y., et al. Colorimetric and reverse fluorescence dual-signal readout immunochromatographic assay for the sensitive determination of sibutramine. ACS Omega. 9 (6), 7075-7084 (2024).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

C

مقالات ذات صلة