مقالة منهجية

الضوء المرتبط ثنائي اللون والفحص المجهري الإلكتروني لتصور التفاعلات بين الميتوكوندريا والليزوزومات

1.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67020

⸱

سبتمبر 27, 2024

 , 
1Neural circuit research group, Korea Brain Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول آلية لاستخدام الضوء المترابط والفحص المجهري الإلكتروني لتصور تفاعل الميتوكوندريا والليزوسومات المسماة ب mEosEM و APEX2 ، على التوالي.

الملخص

تظهر العضيات الخلوية ، مثل الميتوكوندريا والليزوزومات ، هياكل ديناميكية. على الرغم من الدقة العالية للفحص المجهري الإلكتروني للإرسال للتحليل الهيكلي ، فإن الفحص المجهري الضوئي ضروري لتصور العضيات الديناميكية عن طريق وضع العلامات الخاصة بالهدف. يصف البروتوكول التالي طريقة تجمع بين الضوء المرتبط ثنائي اللون والفحص المجهري الإلكتروني (CLEM) لمراقبة التفاعلات بين الميتوكوندريا والليزوسومات. في هذه الدراسة ، تم تصنيف الميتوكوندريا ب mEosEM (Mito-mEosEM) والليزوزومات باستخدام TMEM192-V5-APEX2. تمكننا النتائج التي تم الحصول عليها من صور CLEM من مراقبة التغيرات في التفاعلات بين الميتوكوندريا والليزوزومات في ظل ظروف الإجهاد الخارجي. أدى العلاج بالبافيلومايسين (BFA) ، الذي يثبط وظيفة الليزوزومات ، إلى زيادة التلامس بين الميتوكوندريا والليزوزومات ، مما يؤدي إلى تكوين الميتوكوندريا المجزأة المحاصرة داخل الجسيمات الحالة على العكس من ذلك ، تسبب العلاج ب U18666A ، الذي يمنع تصدير الكوليسترول من الجسيمات الحالة ، في أن تكون الجسيمات الحالة محاطة بالميتوكوندريا ، مما يشير إلى شكل مميز من التفاعل. تقدم هذه الدراسة طريقة فعالة لمراقبة التفاعلات بين الميتوكوندريا والليزوزومات في الخلايا الثابتة. علاوة على ذلك ، يوفر تصوير CLEM باستخدام مجسات ثنائية اللون أداة قوية للتحقيقات المستقبلية لديناميكيات العضيات وآثارها على وظيفة الخلية وعلم الأمراض.

المقدمة

< p class = "jove_content" >الميتوكوندريا والليزوزومات هي العضيات الرئيسية المرتبطة بالغشاء والتي تعتبر ضرورية للحفاظ على التوازن الخلوي. الميتوكوندريا هي عضيات خلوية ديناميكية للغاية يتم تعديلها بواسطة أحداث الانشطار والاندماج < فئة sup = "xref" >1. بشكل عام ، يشار إلى الميتوكوندريا على أنها قوة الخلية وهي معروفة بدورها المهم في الفسفرة المؤكسدة ، وإنتاج ATP ، وتخزين المستقلب مثل فئة الكالسيوم < sup = "xref" >2. بالإضافة إلى دورها في استقلاب الطاقة ، تشارك الميتوكوندريا في عدد من عمليات الإشارات الخلوية الأخرى ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج < فئة الدعم = "xref" >3،< sup class = "xref" >4 ، وإشارات الكالسيوم < فئة الدعم = "xref" >5 ، < sup class = "xref" >6 ، والتمثيل الغذائي للدهون<فئة sup = "xref">7،8. وبالمثل ، فإن الجسيمات الحالة عبارة عن عضيات خلوية ديناميكية للغاية تلعب أدوارا متعددة كمراكز إعادة تدوير خلوية للحفاظ على النظافة الخلوية من خلال تحلل البروتين ، والالتهام الذاتي ، والالتقام الخلوي ، والبلعمة < فئة sup = "xref">9. بصرف النظر عن دورها في التحلل ، تلعب الجسيمات الحالة أيضا أدوارا في فسيولوجيا الخلوية مثل استشعار المغذيات ، والتوازن < فئة المتابعة = "xref" >10 ، والتمثيل الغذائي للدهون < فئة الدعم = "xref" >11 ، وعدم التمايز الخلوي < فئة sup = "xref">12.

على الرغم من وجود العديد من الدراسات حول وظائف العضيات الخلوية الفردية ، فقد ركزت أبحاثنا الأخيرة على الحديث المتبادل الأقل فهما بين الميتوكوندريا والليزوزومات ، والتي ثبت أنها تؤثر على كل من علم وظائف الأعضاء الخلوي وعلم الأمراض. لوحظت التلامس بين الميتوكوندريا والليزوزومات في أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا السرطانية والخلايا العصبية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) < فئة الدعم = "xref">13 ، ويتم ملاحظتها بشكل أساسي تحت الإجهاد الخلوي أو في الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون < فئة الدعم = "xref" > 13 ، < sup class = "xref" >14 و Charcot-Marie-Tooth disease < sup class = "xref" >15. يلعب الاتصال بين الميتوكوندريا والليزوسومات دورا مهما في الحفاظ على التوازن الأيضي من خلال تبادل الأيونات (على سبيل المثال ، Ca2+) < sup class = "xref" >16 ، وفئة الكوليسترول < sup = "xref" >17 ، و iron18 بين العضيتين. علاوة على ذلك ، يلعب الاتصال بين الميتوكوندريا والليزوزومات دورا مهما في مراقبة جودة العضيات الخلوية. على سبيل المثال ، يمكن استهداف الميتوكوندريا التالفة للتحلل من خلال عملية الانقسام ، حيث يتم ابتلاعها بواسطة الجسيمات الذاتية وتسليمها إلى الجسيمات الحالة للتحلل. وبالتالي ، يمكن تسهيل إزالة الميتوكوندريا المختلة قبل أن تسبب مزيدا من الضرر للخلية أو للميتوكوندريا الطبيعية. هذا التفاعل بين الميتوكوندريا والليزوزومات أمر بالغ الأهمية للحفاظ على التوازن الخلوي ومنع تراكم العضيات المختلة. وبالتالي ، تتم إزالة الميتوكوندريا التالفة فقط بشكل انتقائي ، مما يسمح للميتوكوندريا الصحية بالعمل على النحو الأمثل داخل الخلية.

الضوء المترابط والفحص المجهري الإلكتروني (CLEM) هي تقنية تصوير حظيت مؤخرا بالاهتمام كطريقة بحث من خلال الجمع بين مزايا الفحص المجهري الضوئي (LM) والفحص المجهري الإلكتروني (EM) لتوفير معلومات هيكلية مفصلة على مستويات مختلفة. في CLEM ، يتم تصوير عينة أولا باستخدام LM لتحديد مناطق معينة ذات أهمية ، تليها خطوات تحضير عينة EM مثل التثبيت والجفاف والتضمين. ثم يتم ملاحظة نفس العينة تحت المجهر الإلكتروني. على الرغم من أنه تم الإبلاغ مؤخرا عن طرق CLEM للخلايا الحية < sup class = "xref" >19،20،21،22 ، لا يزال من الصعب الجمع بدقة بين الصور البصرية للعينات البيولوجية عالية الديناميكية مع صور المجهر الإلكتروني للخلايا الثابتة في مستوى واحد. بالنسبة للعضيات عالية الديناميكية مثل الميتوكوندريا والليزوزومات ، يمكن أن يتغير توطينها الدقيق عند ملاحظتها تعيش تحت المجهر الضوئي ، وتستمر في التحرك حتى خلال وقت التأخير القصير المطلوب للتثبيت.

لذلك ، في هذا البروتوكول ، تم استخدام علامتين جزيئيتين مختلفتين لا تزالان نشطتين حتى داخل المحاليل المثبتة لتصور التفاعل بين الميتوكوندريا والليزوسومات ، والتي تلعب دورا مهما في الحفاظ على التوازن الأيضي من خلال تبادل الأيونات (على سبيل المثال ، Ca2+) < sup class = "xref" >16 ، الكوليسترول < فئة الارتفاع = "xref" >17 ، و iron18 بين هذه العضيات. تم استخدام التركيبات TMEM192-V5-APEX2 و Mito-mEosEM لمراقبة تفاعلات الميتوكوندريا والليزوزومات في الخلايا المستزرعة على كل من مستويي EM و LM. بالنسبة للميتوكوندريا ، تم اختيار علامة mEosEM لقدرتها على الحفاظ على إشارة التألق أثناء تحضير عينة EM في محلول مثبت و OsO423. بالنسبة للجسيمات الحالة ، تم استخدام علامة APEX2 ، وهي بروتين يبلغ وزنه حوالي 28 كيلو دالتون ، لدراسة توطين بروتين معين على كل من مستويات EM و LM< فئة الدعم = "xref">24. في وجود بيروكسيد الهيدروجين ، تشكل ركيزة APEX2 ، Amplex-Red ، بوليمر غير قابل للذوبان يمكن ملاحظته عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر في الموقع المستهدف بالعلامة. في هذا البروتوكول ، تم استخدام CLEM ثنائي اللون لتصور بنية التفاعلات بين الجسيمات الحالة والميتوكوندريا في الخلايا الثابتة.

البروتوكول

يظهر سير العمل خطوة بخطوة لإعداد العينة في الشكل 1.

< p class = "jove_title" >1. زراعة الخلايا والتعداء

  1. زراعة خلايا HeLa بكثافة 1 × 105 خلايا في أطباق استزراع شبكية زجاجية مقاس 35 مم تحتوي على DMEM مع مصل بقري جنيني 10٪ و 100 وحدة / مل من البنسلين والستربتومايسين عند 37 درجة مئوية.
  2. في اليوم التالي لبذر الخلايا ، قم بنقل الخلايا بنسبة 30٪ -40٪ مع بلازميدات TMEM192-V5-APEX2 و Mito-mEosEM باستخدام كاشف التعدي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (1 ميكروغرام لكل من الحمض النووي البلازميد TMEM192-V5-APEX2 و Mito-mEosEM مع 3 ميكرولتر من كاشف التعداد). بعد التعدي ، عالج الخلايا باستخدام DMSO أو U18666A (2 ميكروغرام / مل) ، و Bafilomycin A1 (100 نانومتر) لمدة 18 ساعة.
< p class = "jove_title" >2. التصوير المجهري متحد البؤر

  1. بعد معالجة الخلايا بالبافيلومايسين و U18666A لمدة 18 ساعة ، قم بإزالة وسط المزرعة وأضف على الفور 250 ميكرولتر من محلول التثبيت الدافئ (30 درجة مئوية -37 درجة مئوية) (2.5٪ جلوتارالديهايد و 2٪ بارافورمالدهيد في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M [درجة الحموضة 7.0]) عن طريق سحب العينة اللطيف. قم بإزالة المثبت على الفور ، واستبدله ب 1.5 مل من المثبت الطازج ، واحتضنه على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا لمدة 3 × 10 دقائق في 1 مل من محلول كاكوديلات الصوديوم المثلج 0.1 M.
    ملاحظة: أبخرة الألدهيد سامة. يجب إجراء جميع التجارب في غطاء دخان جيد التهوية.
  2. أضف 1 مل من محلول الجلايسين البارد 20 ملي مولار لإخماد الألدهيد واحتضانه على الثلج لمدة 10 دقائق.
  3. قم بإعداد محلول جديد يحتوي على 300 ميكرومتر Amplex-Red عن طريق إضافة 10 ملي مولار H2O2 إلى محلول cacodylate 0.1 M. أضف 500 ميكرولتر من محلول Amplex-Red إلى طبق العينة واحتضنه لمدة 5 دقائق على الثلج.
  4. قم بإزالة محلول Amplex-Red واشطفه 3 × 10 دقائق باستخدام محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M.
  5. بعد تلطيخ Amplex-Red ، استخدم مجهر متحد البؤر لتصوير المنطقة المحيطة بالخلايا ذات الأهمية في وضع مسح البلاط 3 × 3. التقط كلا من تباين التداخل التفاضلي (DIC) وإشارة التألق لتحديد وتسجيل الشبكة والحروف على طبق الشبكة باستخدام هدف 40x (أو 60x).
    ملاحظة: تعمل صور النظرة العامة هذه كخريطة لتحديد الخلايا المستهدفة المحددة في العينات المضمنة في البلاستيك.
  6. قم بتصوير الخلايا المستهدفة بتكبير عال باستخدام هدف 40x (أو 60x) واحصل على صورة Z-stack.
    ملاحظة: يتم تثبيت هذه الصورة عالية التكبير على صورة مجهر إلكتروني لإنشاء صورة مترابطة.
< p class = "jove_title" >3. تحضير عينة لكتلة EM

  1. بعد التصوير المحورون وراثيا ، أضف 1 مل من رابع أكسيد الأوزميوم المختزل بنسبة 1٪ (محضر باحتوائه على 3٪ من فيروسيانيد البوتاسيوم في محلول كاكوديلات 0.3 M بحجم متساو من 2٪ رابع أكسيد الأوزميوم المائي) للتثبيت عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة ، ثم اشطفه لمدة 3 × 10 دقائق بالماء المقطر عند 4 درجات مئوية
    ملاحظة: أبخرة رابع أكسيد الأوزميوم سامة. يجب إجراء جميع التجارب في غطاء دخان جيد التهوية.
  2. اشطف 3 × 10 دقائق بالماء المقطر في درجة حرارة الغرفة ، ثم جففه في سلسلة إيثانول متدرجة لمدة 15 دقيقة في كل مرة (50٪ ، 60٪ ، 70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 95٪ ، 100٪ ، و 100٪) في درجة حرارة الغرفة.
  3. امزج الإيثانول مع راتنجات الايبوكسي بنسب حجم 3: 1 و 1: 1 و 1: 3 ، مع تحضير ما مجموعه 300 ميكرولتر من كل خليط. صب كل راتنجات الايبوكسي في الطبق ، مما يسمح لها بالتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. ثم استخدم راتنجات الايبوكسي بنسبة 100٪ للتشريب طوال الليل.
  4. قم بإعداد كبسولة التضمين أو أنبوب PCR عن طريق ملئها براتنجات الايبوكسي الطازجة ، ضع الأنبوب أو الكبسولة رأسا على عقب على المنطقة محل الاهتمام ، وضعها في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة حتى تتبلمر.

4. التقسيم وتصوير TEM

  1. بعد أن يتبلمر راتنجات الايبوكسي تماما ، افصل الزجاج السفلي عن كتلة البوليمر عن طريق غمره في النيتروجين السائل.
  2. ضع كتلة العينة في حامل عينة الميكروتوم الفائق وضعه في كتلة التشذيب. استخدم شفرة حلاقة لتقليم الراتنج إلى شكل شبه منحرف أو مستطيل حول الكائن محل الاهتمام.
  3. ضع كتلة العينة المشذبة في حامل العينة واضبط الشفرة الماسية. تأكد من أن الحافة الأمامية لكتلة العينة موازية تماما لحافة الشفرة الماسية.
  4. باستخدام ميكروتوم فائق الصغر ، قم بقص أقسام رفيعة للغاية حوالي 60-70 نانومتر من الخلايا المسطحة. اجمع الأقسام التسلسلية على شبكة فتحة مطلية بالفورمفار وجففها على طبق ساخن.
  5. تلطخ القسم ببقعة التباين لمدة دقيقتين وسيترات الرصاص لمدة 1 دقيقة.
  6. ضع الشبكة في حامل عينة TEM للمراقبة. حدد الخلية المستهدفة ذات الأهمية بناء على صورة DIC من المجهر الضوئي. صور منطقة الخلية بأكملها باستخدام صور متجانبة متداخلة بتكبير 1,700 ضعف.

5. خياطة الصور باستخدام imageJ Fiji.

  1. لبدء خياطة الصور ، ابدأ imageJ Fiji25 وانقر فوق ملف | جديد | TrakEM2 (فارغ) | حدد مجلد التخزين لإنشاء مشروع TrakEM226 ( الشكل 2A1).
  2. افتح مجموعة بيانات صورة التجانب عن طريق سحب بيانات صورة اللوحة الأولية وإفلاتها في مساحة العمل (الشكل 2A2).
  3. انقر فوق زر الماوس الأيمن وحدد محاذاة | مونتاج جميع الصور في هذه الطبقة | مرن (مراسلات الكتلة غير الخطية) ، ثم انقر فوق موافق لقبول القيم الافتراضية المعلمات المتبقية (<فئة قوية = "xfig">الشكل 2A3).
  4. انقر فوق زر الماوس الأيمن وحدد تصدير | إنشاء صورة مسطحة لإنشاء صورة مخيطة، ثم انقر على ملف | حفظ باسم لحفظ الصورة.
< p class = "jove_title" >6. تغيير حجم الصورة الفلورية

  1. افتح برنامج تكبير الصور (انظر جدول المواد). انقر فوق ملف | افتح وحدد صورة التألق.
  2. أدخل العرض والارتفاع ليكونا بنفس حجم صورة المجهر الإلكتروني ، وحدد الخوارزمية المراد تطبيقها في طريقة تغيير الحجم (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2B1).
  3. انقر فوق ملف | حفظ AS لحفظ الصورة التي تم تغيير حجمها.
< p class = "jove_title" >7. تسجيل الصور المستندة إلى المعالم باستخدام المكون الإضافي Big Warp

  1. افتح ImageJ Fiji واسحب وأفلت الرسم المجهري الفلوري الذي تم تغيير حجمه (صورة FM) والميكروغراف الإلكتروني المخيط (صورة EM).
  2. انقر فوق الإضافات | عارض البيانات الكبيرة | التفاف كبير لبدء التسجيل ، ثم انقر فوق القائمة المنسدلة لتحديد صورة FM كصورة متحركة وصورة EM كصورة الهدف (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2C1).
    ملاحظة: ستحتوي كل صورة FM و EM على ثلاث نوافذ منبثقة جديدة (صورة متحركة BigWrap وصورة BigWrap الثابتة والمعالم المميزة) لعرض المعالم.
  3. قارن بين صور FM و EM باستخدام وظائف مثل التكبير/التصغير (عجلة الماوس)، وتدوير الصورة (تحريك الماوس مع الضغط باستمرار على الزر الأيسر)، والتحرك (تحريك الماوس مع الضغط باستمرار على الزر الأيمن)، ثم اضغط على شريط المسافة على لوحة المفاتيح لتشغيل وضع لاندمارك، واضغط على زر الماوس الأيسر لتمييز ثلاثة معالم على الأقل تم تحديدها في صور FM وEM ( <فئة قوية = "xfig" >الشكل 2C2 ، النقاط الوردية والسهم الأحمر).
  4. بعد وضع علامة على جميع المعالم المحددة ، انتقل إلى ملف | تصدير الصورة المتحركة | حسنا وستظهر نافذة منبثقة جديدة مع صورة FM المحولة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2C3).
    ملاحظة: النافذة المنبثقة التي تم إنشاؤها حديثا هي صورة FM تم تحويلها بناء على أساس المعلم. راجع المحاذاة وقم بإجراء التعديلات، إذا لزم الأمر، عن طريق إضافة أو تعديل المعالم وإعادة حساب التحويل.
  5. انقر فوق ملف | حفظ باسم لحفظ صورة FM المحولة.

8. تراكب صور CLEM

  1. في ImageJ ، قم بسحب وإسقاط صورة FM المحولة وصورة EM المخيطة.
  2. انقر على الصورة | النوع | لون 8 بت لتعيين نفس نوع الصورة لكل من صور LM و EM (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2D1).
    ملاحظة: يجب تحويل الصورة EM مرتين بالترتيب التالي: 8 بت -> RGB Color -> 8 بت Color.
  3. انقر على الصورة | > اللون | دمج القنوات لدمج الصور في صورة مركبة عن طريق تحديد صور FM و EM من القائمة المنسدلة ، على التوالي (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2D2).
  4. انقر فوق ملف | حفظ باسم لحفظ صورة CLEM.

النتائج

لتصوير التفاعلات بين الميتوكوندريا والليزوسومات باستخدام بروتوكول CLEM ثنائي اللون هذا، استخدمنا Mito-mEosEM و TMEM192-V5-APEX2. تم تصوير الخلايا المثبتة أولاً باستخدام المجهر الضوئي، يليه أخذ عينات وتصوير بالمجهر الإلكتروني. تظهر نتائج الصور المترابطة في الشكل 3A،B وفي الشكل 4A. وبناءً على البروتوكول الموصوف أعلاه، تحققنا مما إذا كان بإمكاننا ملاحظة التغيرات في التفاعل بين الميتوكوندريا والليزوسومات تحت تأثير الإجهاد الخارجي.

تؤدي معالجة الخلايا بـ BFA، وهو مثبط لـ V-ATPase الليزوزومي، إلى تثبيط عملية الالتهام الذاتي، مما ينتج عنه انخفاض في جودة الميتوكوندريا وزيادة في التفاعلات بين الميتوكوندريا والليزوزومات27. وقد لاحظنا في الخلايا المعالجة بـ BFA انحباس الميتوكوندريا داخل الليزوزومات (الشكل 3B)، مقارنة بالخلايا الضابطة المعالجة بـ DMSO (الشكل 3A). وعلى الرغم من صعوبة التمييز بين الميتوكوندريا المجزأة ذات الكثافة الإلكترونية والمكونات الخلوية داخل الليزوزومات باستخدام الصور المجهرية الإلكترونية وحدها، إلا أنه يمكن تمييزها بسهولة في الصور المترابطة (الشكل 3B1,B2). إن بنية تعطّل الميتوكوندريا (الشكل 3A1,A2؛ السهم الأزرق) التي لوحظت في ميتوكوندريا الخلايا المعالجة بـ DMSO لا علاقة لها بالليزوزومات، أما البنية التي تظهر في صورة الفلورسنت وكأنها ليزوزوم محبوس داخل ميتوكوندريا كبيرة فهي بنية تحيط فيها الميتوكوندريا بالليزوزوم (الشكل 3A2؛ السهم الأحمر).

بعد ذلك، اختبرنا تأثيرات U18666A (بتركيز 2 µg/mL لمدة 18 h)، وهو مثبط معروف لـ NPC1 يعمل على منع خروج الكوليسترول من الليزوسومات28. أظهرت الخلايا المعالجة بـ U18666A زيادة في التفاعل المباشر بين الميتوكوندريا والليزوسومات (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك، كانت نقاط التلامس بين الميتوكوندريا والليزوسومات في العينات المعالجة بـ U18666A مختلفة عن تلك الموجودة في العينات المعالجة بـ BFA. ففي خلايا HeLa المعالجة بـ BFA، تكون الميتوكوندريا المجزأة محتجزة تماماً داخل الليزوسوم، وهو مظهر مورفولوجي لعملية الميتوفاجي تم الإبلاغ عنه سابقاً12,29. ومع ذلك، في المجموعة المعالجة بـ U18666A، تبدو بعض الليزوسومات الموجبة لـ TMEM192 وكأنها محاطة بالميتوكوندريا (الشكل 4D,E)30,31.

سير عمل تحضير الخلايا والتصوير: ترانسفكشن، ووسم APEX2، والمجهر البؤري، وتحليل إعداد TEM.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على تقنية CLEM المعتمدة على TEM باستخدام مسبار فلوري موسوم جينياً. (A) تم استنبات خلايا HeLa في أطباق زراعة زجاجية ذات قاع شبكي بقطر 35 mm. (B) تم وسم الخلايا المثبتة بـ Amplex-Red بواسطة بروتين APEX2. (C) تم الحصول على الصور الفلورية باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope). استُخدمت منصة آلية ووظيفة المسح المجمّع (tile-scan) لالتقاط صورة عامة واسعة وصورة عالية الدقة للخلية المستهدفة. تعمل الصورة الواسعة كخريطة ملاحة لتحديد موقع الخلية المستهدفة في العينات المغمورة في البلاستيك. (D) المتابعة بعمليات التثبيت اللاحق والتجفيف والتضمين. (E) تم التضمين باستخدام أنبوب PCR أو كبسولة BEEM مملوءة بالراتنج فوق الخلية المستهدفة على غطاء الشريحة. (F) بعد بلمرة الراتنج، أدت إزالة غطاء الشريحة إلى ترك نمط شبكي مطبوع على السطح السفلي للكتلة. (G) تم تحديد الخلية المستهدفة من خلال النمط المطبوع على سطح الراتنج، ثم قُطعت الخلية المستهدفة بسُمك 60 nm تقريباً باستخدام ميكروتوم فائق الدقة (ultramicrotome). (H) جُمعت المقاطع المتتالية على شبكة نحاسية ذات فتحات مطلية بـ formvar. (I) تم تصوير الشبكات باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ. الاختصارات: TEM = المجهر الإلكتروني النافذ؛ CLEM = المجهر الضوئي والإلكتروني الارتباطي؛ ROI = المنطقة المستهدفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط معالجة الصور: دمج الصور، تغيير حجم الفلورة، تسجيل المعالم، تراكب CLEM.
الشكل 2: معالجة الصور وتوليد صورة CLEM باستخدام imageJ Fiji. (A1) واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية لـ Fiji و TrakEM2. (A2) استيراد مجموعة بيانات الصور المقطعة التي تم الحصول عليها باستخدام TEM بتكبير 1,700x. (A3) محاذاة ومثال لصورة مدمجة باستخدام طريقة محاذاة الصور في TrakeEM2. (B1-B3) تحويل الصور المجهرية الضوئية الصغيرة إلى صور كبيرة عالية الجودة باستخدام برنامج تكبير الصور. (C1-C3) سير العمل لعملية التسجيل بين صور المجهر الضوئي وصور المجهر الإلكتروني باستخدام برنامج الملحق Big Wrap. (D1-D3) عملية تراكب صورة FM محولة وصورة EM لتخليق صورة مجهرية مترابطة. الاختصارات: TEM = المجهر الإلكتروني النافذ؛ CLEM = المجهر الضوئي والإلكتروني المترابط؛ FM = المجهر الفلوري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط المجهر البؤري، والمجهر الإلكتروني النافذ، والمجهر الضوئي والإلكتروني المترابط؛ تموضع الميتوكوندريا والجسيمات الحالة؛ تحليل البنية الخلوية.
الشكل 3: صور CLEM لمواقع التلامس بين الميتوكوندريا والجسيمات الحالة المعالجة أو غير المعالجة بـ bafilomycin A1. تم إجراء ترانسفكشن مشترك لخلايا HeLa بـ Mito-mEosEM (الميتوكوندريا؛ الأخضر) وTMEM192-APEX2 (الجسيمات الحالة؛ الأحمر) ثم صُبغت بصبغة Amplex-Red. (A) خلايا HeLa غير معالجة. تم دمج المعلومات الجزيئية من إشارة الفلورسنت (اللوحة اليسرى) والمعلومات فائقة البنية التي تم الحصول عليها بواسطة TEM (اللوحة الوسطى) (اللوحة اليمنى) بناءً على إشارة الميتوكوندريا ومورفولوجيتها. (A1,A2) في خلايا HeLa غير المعالجة، يكون الغشاء الداخلي للميتوكوندريا متقطعاً (السهم الأزرق)، أو تكون الميتوكوندريا والجسيمات الحالة قريبة جداً من بعضها البعض (السهم الأحمر). (B1,B2) في خلايا HeLa المعالجة بـ bafilomycin A1 لمدة 18 h، لوحظ حدوث عملية الميتوفاجي، والتي تتميز باحتجاز الميتوكوندريا غير المتحللة داخل الجسيمات الحالة (السهم الأخضر). أشرطة المقياس = 1 µm (A1,A2,B1,B2). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

صور مجهرية بـ Confocal و TEM و CLEM للميتوكوندريا (باللون الأخضر) والليسوسومات (باللون الأحمر) في الخلايا.
الشكل 4: صور CLEM لمواقع التلامس الميتوكوندرية والليسوسومية المعالجة بـ U18666A (A) صور CLEM ثنائية اللون لخلايا HeLa التي تعبر عن Mito-mEosEM و TMEM192-V5-APEX2 (الموسومة بـ Amplex-Red) تحت تأثير المعالجة بـ U18666A (بتركيز 2 µg/mL لمدة 18 h). (A1,A2) تشير الأسهم الحمراء إلى مواقع التلامس بين الميتوكوندريا والليسوسومات. أشرطة المقياس = 1 µm. (B1-B3,C1-C3) يشير السهم الأحمر إلى ظهور اندماج بين العضيات بين الميتوكوندريا والليسوسومات من خلال الصور المتسلسلة. أشرطة المقياس = 500 nm (B1-B3). أشرطة المقياس = 1 µm (C1-C3). (D,E) صور TEM عالية التكبير لمواقع الاندماج بين الميتوكوندريا والليسوسومات. استُخدمت الألوان الاصطناعية للتمييز بين الميتوكوندريا (باللون الأخضر) والليسوسوم (باللون الأحمر). أشرطة المقياس = 100 nm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول CLEM ثنائي اللون لمراقبة تفاعل الميتوكوندريا والجسيمات الحالة في الخلايا الثابتة باستخدام علامات mEosEM و APEX2 المشفرة وراثيا. على مدى العقود القليلة الماضية ، أدى التقدم في الفحص المجهري إلى تحسين القدرة على مراقبة التغيرات في شبكات العضياتبشكل كبير 32،33 ، وأصبحت دراسة تفاعلات العضيات مثيرة للاهتمام بشكل متزايد. تم استخدام الفحص المجهري فائق الدقة لمراقبة التغيرات في الاتصالات الديناميكية للغاية بين الميتوكوندريا والليزوزومات34،35،36. ومع ذلك ، على الرغم من استخدام الفحص المجهري فائق الدقة ، فمن الصعب التمييز بين التغيرات في سمك أغشية الميتوكوندريا الداخلية والخارجية (حوالي 22 نانومتر) وتقاطعات cristae (حوالي 28 نانومتر)37. يتميز الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال بالقدرة على مراقبة بنية العينات البيولوجية بدقة عالية جدا ولكن له عيب في أنه لا يمكن عرض الصور إلا بالأبيض والأسود ، مما يجعل من الصعب تمييز العضيات في الصور المعقدة. في بروتوكولنا ، استخدمنا طريقة CLEM التي تجمع بين مزايا الفحص المجهري للضوء والإلكترون لمراقبة تفاعل عضيتين مختلفتين عن طريق تلطيخهما بألوان مختلفة. على وجه الخصوص ، يعد CLEM ثنائي اللون أداة لا تقدر بثمن لمراقبة وتحليل الانقسام ، وهي عملية تحلل الميتوكوندريا داخل الجسيمات الحالة ، كما هو موضح في الشكل 3.

عادة ما يتم إجراء تصوير الخلايا الحية في ظل ظروف فسيولوجية ، مما يمكن الباحثين من مراقبة العمليات الخلوية الديناميكية في الوقت الفعلي. ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب تقنيات الفحص المجهري الإلكتروني إجراءات تحضير العينات التي تستغرق وقتا طويلا ، بما في ذلك التثبيت والتلوين. يحد التأخير الزمني بين تصوير الخلايا الحية وتحضير عينة الفحص المجهري الإلكتروني من الدقة الزمنية للتقنية ويمكن أن يؤدي إلى أحداث خلوية ديناميكية محتملة ضائعة. للتغلب على قيود الخلية الحية CLEM ، قمنا بتطوير طريقة CLEM ثنائية اللون حيث يتم تلطيخ مسبار mEosEM23 والصبغة الكيميائية (Amplex-Red) بواسطة إنزيم وضع العلامات القريبة APEX238 دون فقدان إشارة التألق حتى في البيئات المثبتة القاسية. في دراسة سابقة أجرتها CLEM للخلية الحية39 ، تم العثور على تناقضات بين إشارات التألق وصور EM بسبب مشكلات الدقة الزمنية في أخذ عينات TEM بعد تصوير الخلايا الحية والقيود الفنية في تحضير العينة. ومع ذلك ، من خلال الحصول على صور مضان للخلايا الثابتة لفترة كافية (تصوير z-stack للخلايا بأكملها بتكبير عال) ، يمكننا حل مشكلة الدقة الزمنية وتحسين الارتباط بين صور LM و EM (الشكل 3 والشكل 4).

عامل رئيسي آخر لنتائج CLEM الناجحة هو كيفية تسجيل صورة LM بدقة مع صورة EM. للقيام بذلك ، استخدمنا أولا مزيجا من أوضاع التصوير DIC والتصوير الفلوري أثناء التصوير المجهري الضوئي لإنشاء خريطة ملاحة حول الخلايا المستهدفة. باستخدام خريطة التنقل هذه ، يمكننا بسهولة تحديد الخلايا ذات الأهمية على ultramicrotome و TEM. ثانيا ، من خلال الحصول على صور بلاط TEM لخلايا كاملة بتكبير عال ، تمكنا من الحصول على العديد من المعالم التي يمكن استخدامها لتسجيل الصور. في تجربتنا ، كلما زاد عدد المعالم ، كانت دقة محاذاة صور LM و EM أفضل في المكون الإضافي Big Warp.

في هذه الدراسة ، أظهرنا مجالات تفاعل الجسيمات الحالة والميتوكوندريا مع نتائج CLEM عالية الدقة. بالإضافة إلى ذلك ، سمح المسبار ثنائي اللون بالتمييز الدقيق بين الميتوكوندريا والجسيمات الحالة. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها بعض القيود. أولا ، إذا كان وقت التفاعل أثناء وضع العلامات القريبة ل Amplex-Red بواسطة إنزيم APEX2 طويلا جدا ، فإن Amplex-Red سوف ينتشر ويلطخ على نطاق أوسع من موقع البروتين المستهدف38. ثانيا ، سمك (حجم المحور z) للمنطقة التي يبتلع فيها الجسيم الحالة في الميتوكوندريا صغير جدا ، لذلك لا يمكن تحديد اندماج غشاءي العضية في قسم تسلسلي بسمك 50 نانومتر. علاوة على ذلك ، يعد تحديا كبيرا لمحاذاة المحور z للقسم البصري بدقة بواسطة المجهر الضوئي والقسم الميكانيكي بواسطة ultramicrotome. للتغلب على هذه القيود ، يمكن استخدام CLEM ثنائي اللون مع التصوير المقطعي الإلكترونيالتقليدي 40 أو حجم المقطع التسلسلي CLEM41.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحث الأساسي KBRI من خلال معهد أبحاث الدماغ الكوري بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (24-BR-01-03). تم توفير بلازميدات TMEM192-V5-APEX2 من قبل Hyun-Woo Rhee (جامعة سيول الوطنية). تم الحصول على بيانات TEM في المرافق الأساسية لأبحاث الدماغ في KBRI.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوية > المواد الكيميائية والكواشف < / قوية > 25
٪ الجلوتارالديهايدعلوم المجهر الإلكتروني16200أبخرة الألدهيد شديدة السمية. استخدم فقط في غطاء الدخان.
محلول بيروكسيد الهيدروجين 30Merck107210
محلول بارافورمالدهايد 4٪أبخرة BiosesangPC2031-100-00أبخرة لدهيد شديدة السمية. استخدم فقط في غطاء الدخان.
Amplex RedThermoFisherA12222
Epon 812علوم المجهر الإلكتروني14120
الإيثانولMerck100983
Fugene HDPromegaE2311تعداء البلازميد
GlycineSIGMAG8898
سترات الرصاص 3٪علوم المجهر الإلكتروني22410
رابع أكسيد الأوزميوم 4٪ محلول مائيعلوم المجهر الإلكتروني16320شديد السمية. استخدم فقط في غطاء الدخان.
سداسي سيانوفيرات البوتاسيوم (II) ثلاثي هيدرات   ؛SIGMAP3289
الكاكوديلات الصوديوم ثلاثي الهيدراتسيجما-ألدريتشC0250-500G
أسيتات اليورانيلعلوم المجهرالإلكتروني 22400
UranyLess EM صبغعلوم المجهر الإلكتروني22409
<قوي > بناء البلازميد < / قوي >
Mito-mEosEMaddgene132706DOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
TMEM192-V5-APEX2Sharma N.  et al.N / ADOI:  10.1016 / j.chembiol.2024.02.007
الأدوات < / قوي >
0.22 مرشح حقنةأم Sartorius16534
35 مم طبق غطاءMattekP35G-1.5-14-CGRD
BEEM تضمين كبسولاتتيد بيلا130
فورفار مدعوم شبكة نحاسية ذات فتحة واحدةتيد بيلا01705
سكين الماسDiATOMEDU4530
Ultra-microtomeLeicaARTOS 3D
< قوي > مجاهر < / قوي >
مقلوب مجهر متحد البؤرNikonA1 RSI / Ti-E
الفحص المجهري الإلكتروني لنقلFEITecnai G2
< قوي > البرمجيات و خوارزميات< / قوي>
فيجي / صورة JNIH / مفتوح المصدرhttps://imagej.nih.gov/ij/
ImageJ BigWarp حزمة البرمجياتNIH / المصدر المفتوحhttps://imagej.net/plugins/bigwarp
Photozoom Pro 8   ؛BenVistahttps://www.benvista.com/photozoompro

البرامج البديلة
Image Resizer < / strong>: https://imageresizer.com/
Gigapixel الذكاء الاصطناعي< / قوي>: https://www.topazlabs.com/gigapixel
ON1 تغيير الحجم < / قوي>: https://www.on1.com/products/resize-ai/
٪ شبكي

المراجع

  1. Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).
  2. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nat Cell Biol. 20 (7), 745-754 (2018).
  3. Lopez, J., Tait, S. W. G. Mitochondrial apoptosis: Killing cancer using the enemy within. Br J Cancer. 112 (6), 957-962 (2015).
  4. Wang, C., Youle, R. J. The role of mitochondria in apoptosis*. Annu Rev Genet. 43, 95-118 (2009).
  5. Rossi, A., Pizzo, P., Filadi, R. Calcium, mitochondria and cell metabolism: A functional triangle in bioenergetics. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1068-1078 (2019).
  6. Giorgi, C., Marchi, S., Pinton, P. The machineries, regulation and cellular functions of mitochondrial calcium. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 713-730 (2018).
  7. Talari, N. K., et al. Lipid-droplet associated mitochondria promote fatty-acid oxidation through a distinct bioenergetic pattern in male wistar rats. Nat Commun. 14 (1), 766(2023).
  8. Enkler, L., et al. Arf1 coordinates fatty acid metabolism and mitochondrial homeostasis. Nat Cell Biol. 25 (8), 1157-1172 (2023).
  9. Trivedi, P. C., Bartlett, J. J., Pulinilkunnil, T. Lysosomal biology and function: Modern view of cellular debris bin. Cells. 9 (5), 1131(2020).
  10. Mony, V. K., Benjamin, S., O'Rourke, E. J. A lysosome-centered view of nutrient homeostasis. Autophagy. 12 (4), 619-631 (2016).
  11. Thelen, A. M., Zoncu, R. Emerging roles for the lysosome in lipid metabolism. Trends Cell Biol. 27 (11), 833-850 (2017).
  12. Ma, X., et al. Mitochondria-lysosome-related organelles mediate mitochondrial clearance during cellular dedifferentiation. Cell Rep. 42 (10), 113291(2023).
  13. Kim, S., Wong, Y. C., Gao, F., Krainc, D. Dysregulation of mitochondria-lysosome contacts by gba1 dysfunction in dopaminergic neuronal models of Parkinson's disease. Nat Commun. 12 (1), 1807(2021).
  14. Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of pink1, parkin, and mitochondrial fidelity in parkinson's disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
  15. Wong, Y. C., Peng, W., Krainc, D. Lysosomal regulation of inter-mitochondrial contact fate and motility in charcot-marie-tooth type 2. Dev Cell. 50 (3), 339-354.e4 (2019).
  16. Peng, W., Wong, Y. C., Krainc, D. Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial Ca(2+) dynamics via lysosomal trpml1. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19266-19275 (2020).
  17. Juhl, A. D., et al. Quantitative imaging of membrane contact sites for sterol transfer between endo-lysosomes and mitochondria in living cells. Sci Rep. 11 (1), 8927(2021).
  18. Khalil, S., et al. A specialized pathway for erythroid iron delivery through lysosomal trafficking of transferrin receptor 2. Blood Adv. 1 (15), 1181-1194 (2017).
  19. Russell, M. R., et al. 3d correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. J Cell Sci. 130 (1), 278-291 (2017).
  20. Van Rijnsoever, C., Oorschot, V., Klumperman, J. Correlative light-electron microscopy (clem) combining live-cell imaging and immunolabeling of ultrathin cryosections. Nat Methods. 5 (11), 973-980 (2008).
  21. Loginov, S. V., et al. Correlative organelle microscopy: Fluorescence guided volume electron microscopy of intracellular processes. Front Cell Dev Biol. 10, 829545(2022).
  22. De Beer, M., et al. Visualizing biological tissues: A multiscale workflow from live imaging to 3D cryo-CLEM. Microscopy and Microanalysis. 27 (S2), 11-12 (2021).
  23. Fu, Z., et al. Meosem withstands osmium staining and epon embedding for super-resolution clem. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
  24. Lam, S. S., et al. Directed evolution of apex2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Cardona, A., et al. Trakem2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), e38011(2012).
  27. Redmann, M., et al. Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons. Redox Biol. 11, 73-81 (2017).
  28. Lu, F., et al. Identification of npc1 as the target of u18666a, an inhibitor of lysosomal cholesterol export and ebola infection. eLife. 4, e12177(2015).
  29. Jung, M., Choi, H., Mun, J. Y. The autophagy research in electron microscopy. Appl Microsc. 49 (1), 11(2019).
  30. Hao, T., et al. Hypoxia-reprogramed megamitochondrion contacts and engulfs lysosome to mediate mitochondrial self-digestion. Nat Commun. 14 (1), 4105(2023).
  31. Hoglinger, D., et al. Npc1 regulates ER contacts with endocytic organelles to mediate cholesterol egress. Nat Commun. 10 (1), 4276(2019).
  32. Jung, M., Mun, J. Y. Mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy. J Vis Exp. (149), e59750(2019).
  33. Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3d architecture using fib-sem. Microscopy (Oxf). 70 (2), 161-170 (2021).
  34. Wang, H., et al. Lysosome-targeted biosensor for the super-resolution imaging of lysosome-mitochondrion interaction. Front Pharmacol. 13, 865173(2022).
  35. Chen, Q., et al. Quantitative analysis of interactive behavior of mitochondria and lysosomes using structured illumination microscopy. bioRxiv. , (2018).
  36. Wong, Y. C., Ysselstein, D., Krainc, D. Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial fission via rab7 gtp hydrolysis. Nature. 554 (7692), 382-386 (2018).
  37. Perkins, G., et al. Electron tomography of neuronal mitochondria: Three-dimensional structure and organization of cristae and membrane contacts. J Struc Biol. 119 (3), 260-272 (1997).
  38. Sharma, N., Jung, M., Mishra, P. K., Mun, J. Y., Rhee, H. -W. Flex: Genetically encodable enzymatic fluorescence signal amplification using engineered peroxidase. Cell Chem Biol. 31 (3), 502-513.e506 (2024).
  39. Jung, M., Choi, H., Kim, J., Mun, J. Y. Correlative light and transmission electron microscopy showed details of mitophagy by mitochondria quality control in propionic acid treated sh-sy5y cell. Materials (Basel). 13 (19), (2020).
  40. Mourik, M. J., et al. Methods Cell Biol. Müller-Reichert, T., Verkade, P. 124, Academic Press. 71-92 (2014).
  41. Hegermann, J., et al. Volume-clem: A method for correlative light and electron microscopy in three dimensions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 317 (6), L778-L784 (2019).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

HeLa
الضوء المرتبط ثنائي اللون والفحص المجهري الإلكتروني لتصور التفاعلات بين الميتوكوندريا والليزوزومات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.