مقالة منهجية

الجمع بين التصوير والفيزيولوجيا الكهربية لتصور وتسجيل انتشار إزالة الاستقطاب في الفئران

DOI:

10.3791/67032

⸱

أكتوبر 4, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosciences and The Center for Brain Recovery and Repair, University of New Mexico School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول مزيجا من التصوير والفيزيولوجيا الكهربية للكشف بشكل موثوق عن انتشار إزالة الاستقطاب في الفئران البالغة بعد إصابة دماغية خفيفة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

انتشار إزالة الاستقطاب (SDs) هي أحداث ضخمة في الدماغ غالبا ما لا يتم اكتشافها بسبب انتشارها البطيء عبر المادة الرمادية. نظرا لأن اكتشاف SD يمكن أن يكون بعيد المنال ، يتم تأكيده على النحو الأمثل باستخدام طرق متعددة. يصف هذا البروتوكول طرق الجمع بين التصوير والفيزيولوجيا الكهربية للكشف عن SDs بطريقة يمكن لمعظم المختبرات اعتمادها بشكل موثوق وسهولة. تحدث SDs بعد إصابات الدماغ الرضحية والسكتة الدماغية والنزيف تحت العنكبوتية ونقص التروية والصداع النصفي. تاريخيا ، تم تسجيل SDs باستخدام مكبرات الصوت DC ، والتي يمكنها حل التحول البطيء خارج الخلية والاكتئاب في النشاط عالي التردد. ومع ذلك ، يكاد يكون من المستحيل استخدام مكبرات الصوت DC للتسجيلات المزمنة في الجسم الحي. يستخدم هذا البروتوكول مضخم تيار متردد مشترك لتسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي لتأكيد الاكتئاب عالي التردد ، جنبا إلى جنب مع التصوير غير الجراحي الضروري للكشف عن موجة انتشار SD. يمكن اعتماد هذه الطرق و / أو تعديلها بشكل موثوق لمعظم الأساليب التجريبية لتأكيد وجود أو عدم وجود SDs بعد إصابة الدماغ.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ترتبط إزالة الاستقطاب المنتشرة (SDs) بحالات عصبية مختلفة ، بما في ذلك إصابات الدماغ الرضحية (TBI) والسكتة الدماغية والنزيف تحت العنكبوتية ونقص التروية والصداع النصفي<فئة السعيد النصفي = "xref">1. تورطت SDs في تطور تلف الأنسجة في السكتات الدماغية و TBIs< sup class = "xref" >2. لا تزال الآلية الدقيقة الكامنة وراء تطور فقدان الأنسجة غير واضحة < فئة الدعم = "xref" >3،< sup class = "xref" >4. ومع ذلك ، تحدث SDs عندما لا يتم تلبية متطلبات التمثيل الغذائي للخلايا العصبية بكمية كافية من الأكسجين والجلوكوز ، حيث تصبح وظيفة مضخة الصوديوم والبوتاسيوم المعتمدة على ATP غير كافية للحفاظ على تدرجات الأيونات. لفهم دور SDs في فقدان الأنسجة ، هناك حاجة إلى تقنيات دقيقة لقياسها ودراستها ، وهو أمر بالغ الأهمية لتطوير المعرفة العلمية. SDs هي أحداث عصبية مهمة يمكن أن تمر في كثير من الأحيان دون اكتشافها بسبب التصميم التجريبي و / أو قيود الأجهزة.

يتم حاليا توضيح دور انتشار إزالة الاستقطاب (SDs) في تطور الإصابة ، لكن دورها في إصابات الدماغ الرضحية الخفيفة (mTBIs) لا يزال غير واضح. أظهرت الدراسات الحديثة باستخدام التقنيات الموضحة في هذه المخطوطة أن SDs تبدأ في نماذج فئران mTBI ذات الجمجمة المغلقة ، حتى في حالة عدم وجود تلف أو نزيف علني للأنسجة < فئة الدعم = "xref" >5 ، < فئة الدعم = "xref">6. تشير هذه الدراسات إلى أن SDs قد تساهم في الإعاقات العصبية الحادة والالتهاب العصبي. بالإضافة إلى ذلك ، ارتبط وجود SDs التي يسببها mTBI ارتباطا وثيقا بالعجز السلوكي الحاد < فئة الدعم = "xref" >6،7. لذلك ، من المحتمل أن يتم بدء SDs في جميع نماذج TBI ، ولكن لا يزال من الصعب التأكد من دورها دون تأكيد. يعد تأكيد وجود SDs أمرا بالغ الأهمية لتقييم نتائج mTBIs بدقة.

يتم تحديد إزالة الاستقطاب المنتشرة (SDs) من خلال انخفاض كبير في الإمكانات خارج الخلية ، والمعروف باسم "تحول التيار المستمر" ، وعن طريق انخفاض النشاط عالي التردد < فئة sup = "xref" >8. عادة ما يستغرق "تحول التيار المستمر" ثوان لحل (~ 10 ثوان) < فئة الدعم = "xref" >9. لالتقاط "تحول التيار المستمر" ، يلزم وجود مضخم تيار مستمر وأقطاب كهربائية من الأسلاك الفضية. ومع ذلك ، عادة ما يتم إجراء الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي باستخدام مكبرات الصوت AC ، والتي تم تصميمها لتصفية الأحداث منخفضة التردد لتقليل القطع الأثرية للحركة. لسوء الحظ ، يزيل هذا الترشيح منخفض التردد أيضا "تحول التيار المستمر". بالإضافة إلى ذلك ، فإن الفضة سامة وغير مناسبة للتسجيلات المزمنة. يمكن لمضخمات التيار المتردد شائعة الاستخدام اكتشاف انخفاض النشاط عالي التردد ، ولكن بدون "تحول التيار المستمر" المصاحب ، فإن تأكيد وجود SD يمثل تحديا.

يمكن أيضا اكتشاف انتشار إزالة الاستقطاب (SDs) باستخدام تقنيات التصوير المختلفة. الأكثر شيوعا ، يتم تصوير SDs باستخدام تصوير تباين البقع بالليزر ، والذي يقيس تدفق الدم الدماغي عبر الجمجمة السليمة < فئة sup = "xref" >10. تؤثر SDs بشكل كبير على الأوعية الدموية الدماغية وتدفق الدم. في معظم الأنواع بخلاف الفئران ، تحفز SDs موجة انتشار من فرط التروية التي تنتقل مع الحافة الأمامية لفئة SD11. يمكن أيضا تصوير SDs باستخدام مؤشرات فلورسنت الكالسيوم أو الغلوتامات < فئة sup = "xref" >12 ، على الرغم من أن هذا يتطلب تحميل الأنسجة بالأصباغ أو مؤشرات الفلورسنت المشفرة وراثيا< فئة الدعم = "xref">12،< sup class = "xref">13. ومن المثير للاهتمام ، أنه يمكن ملاحظة SDs بالعين المجردة بسبب الإشارات الضوئية الجوهرية (iOS) المرتبطة بفئة SD14. iOS عبارة عن إشارات معقدة تتكون من جزيئات ذاتية الفلورسنت مثل NAD (P) H و FADH< sup class = "xref" >15,< sup class = "xref" >16 ، تورم الأنسجة < فئة sup = "xref" >17 ، والتغيرات المحتملة في تدفق الدم الدماغي. على الرغم من تعقيدها ، إلا أن إشارات iOS موثوقة ويمكن التقاطها في فئة الفئران من النوع البري < sup class = "xref">18. يصف هذا البروتوكول طريقة تصوير iOS لأنه يمكن تنفيذ هذه التقنية في أي مختبر دون الحاجة إلى فيروسات متخصصة أو معدلة وراثيا.

الهدف العام لهذه الطريقة هو تأكيد وجود أو عدم انتشار إزالة الاستقطاب (SD) تجريبيا بعد إصابة دماغية رضحية خفيفة (mTBI) باستخدام التصوير المتزامن والفيزيولوجيا الكهربية. الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي ، التي تسهلها مكبرات الصوت المتقدمة ، هي تقنية شائعة الاستخدام. ومع ذلك ، فإن مكبرات الصوت هذه غير قادرة على اكتشاف "تحول التيار المستمر" المميز. لذلك ، يتم استخدام تقنيات التصوير ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، لتأكيد وجود أو عدم وجود SDs بثقة. تتمثل ميزة الجمع بين التصوير والفيزيولوجيا الكهربية في أن التصوير يمكن أن يكتشف انتشار SD ، بينما يمكن للفيزيولوجيا الكهربية تحديد الاكتئاب عالي التردد المرتبط به.

< p class = "jove_content" >بشكل عام ، هذه الطريقة مناسبة للتحقيق في وجود انتشار إزالة الاستقطاب (SDs) بعد إصابة الدماغ الرضحية (TBI). يمكن أن يعزز تطبيقه فهم وظيفة الشبكة القشرية بعد TBI و SDs. يمكن تكييف هذا البروتوكول من نموذج تأثير الجمجمة المغلق إلى نماذج أخرى ، مثل التأثير القشري المتحكم فيه أو الإيقاع السائل أو انخفاض الوزن. يمكن أن يوضح تنفيذ هذا البروتوكول عبر مختبرات متعددة دور SDs عبر شدة مختلفة من إصابات الدماغ الرضية. يمكن استخدام أي نموذج TBI محدد ، متبوعا بإجراءات التصوير والفيزيولوجيا الكهربية لنظام iOS الموضحة في هذا البروتوكول.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content">تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للجنة رعاية واستخدامه في المعهد (IACUC) في جامعة نيو مكسيكو. تم الحصول على الفئران C57BL / 6J من مصدر تجاري. تم استخدام أعداد متساوية من ذكور وإناث الفئران في الفئة العمرية من 8 إلى 14 أسبوعا. تزن جميع الفئران حوالي 20 جراما. تفاصيل والكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد. يحتوي الملف التكميلي 1 على قائمة الاختصارات.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الجمجمة للتصوير والفيزيولوجيا الكهربية

  1. قم بتخدير في صندوق تحريض من الأيزوفلوران مع 2٪ -3٪ إيزوفلوران في 100٪ أكسجين ، مما يضمن عمق التخدير المناسب دون التردد من قرصة المخلب.
  2. يجب تطبيق المسكنات قبل الجراحة (بوبرينورفين بطيء الإطلاق، 3.25 ملغ/كغ، SQ) قبل وضع في إطار تجسيمي والحفاظ على التخدير (2٪ إيزوفلوران).
  3. أضف مرهم العين وحافظ على درجة حرارة جسم باستخدام وسادة تدفئة تحتوي على ردود فعل لدرجة حرارة الجسم.
  4. احلق الشعر فوق الجمجمة حيث سيكون الشق ، أسفل خط الوسط من شق العين إلى لامدا.
  5. قم بإزالة الشعر المقصوص قبل تعقيم الجلد بمقشر ومحلول مطهر ومطهر. انتهي من 70٪ إيثانول ، وكرر ثلاث مرات لضمان موقع جراحي معقم.
  6. باستخدام شفرة مشرط # 10 ، قم بعمل شق أسفل خط الوسط من المنقاري إلى الذيلي ، متبوعا مباشرة بتطبيق غراء سيانواكريليت طبي على الشق. انشر الجلد بشكل جانبي لكشف الجمجمة.
  7. أضف قطرة أخرى أو قطرتين من غراء سيانواكريليت فوق الجمجمة لإضافة حماية إضافية للجمجمة.
    ملاحظة: تطبيق الغراء حساس للوقت حيث ستبدأ الجمجمة في التعتيم عند تعرضها للهواء لمدة تزيد عن 10 ثوان. سيؤدي ذلك إلى حجب تصور SD من خلال طرق التصوير.
  8. أثناء تجفيف الغراء ، استخدم مقصا جراحيا معقما لزيادة حجم الشق فوق المخيخ. بمجرد ضبط الغراء ، ابدأ في زرع أقطاب لولبية للجمجمة.
    1. تعقيم مسامير الجمجمة بواسطة معقم الخرز لمدة 20-30 ثانية قبل الزرع.
    2. ضع براغي الجمجمة في منطقة بعيدة عن موقع بدء SD للحفاظ على نافذة مرئية مفتوحة.
      ملاحظة: بالنسبة للتسجيلات المزمنة في القشرة البصرية الأولية ، يتم استخدام ثلاثة براغي للجمجمة. يتم وضع المسمار الأول تقريبا عند y = -6.00 مم من bregma ، في المخيخ ، ويعمل كقطب مرجعي. يتم وضع أقطاب التسجيل عند y = -2.79 مم من بريجما و x = ±2.5 مم من خط الوسط ، داخل نصفي الكرة الأيمن والأيسر.
    3. باستخدام مثقاب بحجم 0.8 مم ، قم بحفر ثقوب تجريبية من خلال الجمجمة. لضمان عدم حدوث أي ضرر للأنسجة الأساسية ، يعد -0.5 مم في z مثاليا. استخدم مسامير # 00-90 ملحومة مسبقا بدبابيس ذهبية بسلك من الفولاذ المقاوم للصدأ.
    4. اقلب البراغي لأسفل في الجمجمة.1.5-2 لفات كاملة ستحصل على المسمار من خلال الجمجمة وملامسة السطح القشري.
      5. قم
    5. بلف الأسلاك الزائدة حول المسمار ، مما يسمح ببعض الركود في السلك لوضع المسرح لاحقا.
    6. باستخدام نفس الإجراءات ، ضع مسامير الجمجمة الأخرى.
    7. بمجرد وضع جميع براغي الجمجمة في مكانها ، قم بتوصيل جميع المسامير الذهبية بموصل المسرح المطلوب. أمسك الموصل في مكانه باستخدام الذراع التجسيمي وأمسك دبابيس الموصل بالقرب من رؤوس البراغي مع التأكد من عدم ملامسة الأسلاك.
    8. أغلق المنطقة بأكملها بغراء سيانواكريليت ، مع التأكد من عدم تعطيل منطقة التصوير أمام مسامير الجمجمة.
    9. قم ببناء الأسمنت السني حول قاعدة المسامير الذهبية ، مما يضمن عدم توصيل المسامير الذهبية من براغي الجمجمة بالدبابيس الذهبية في مرحلة الرأس.
    10. اسمح لأسمنت الأسنان بالشفاء قبل إزالة موصل الرأس.
    11. قم بإزالة من الإطار التجسيمي وضعه مرة أخرى في قفص المنزل للتعافي. اتبع الرعاية القياسية بعد الجراحة واحتفظ بالحيوانات على وسادة تدفئة أثناء التعافي من التخدير.
      ملاحظة: بعد الجراحة ، تم تخزين بمفردها ومراقبتها بحثا عن الألم يوميا. اتبع الإرشادات المؤسسية المحلية للتسكين. في حالة استخدام جهاز مراقبة بوبرينورفين بطيء الإطلاق للألم وربما تعطي جرعة إضافية في 72 ساعة.
  9. قم بإزالة أي أجسام قد تلتصق بالأقطاب الكهربائية ، بما في ذلك السكن والتخصيب. استخدم الفراش القياسي مع الوصول إلى الطعام والماء.
    ملاحظة: اترك فترة نقاهة لمدة يومين بين الجراحة والتسجيل.

2. الكشف عن انتشار إزالة الاستقطاب باستخدام تصوير الإشارة الضوئية الجوهرية (iOS) والفيزيولوجيا الكهربية AC

  1. تخدير ب 2٪ إيزوفلوران في 100٪ أكسجين.
    ملاحظة: يجب أن يستغرق جزء التصوير من هذا الإجراء ~ 5 دقائق ، ويجب أن يكون مقدار التعرض للأيزوفلوران متسقا.
  2. ضع في إطار تجسيم. من خلال مخروط الأنف ، حافظ على 1٪ -2٪ من الأيزوفلوران في الأكسجين.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان الحفاظ على عمق التخدير المناسب ، حيث من المعروف أن الأيزوفلوران يقلل من SDs. يوصى بالحفاظ على 60-70 نفسا / دقيقة طوال التجربة.
  3. ضع أسفل الكاميرا وتأكد من تركيز الكاميرا على السطح القشري عن طريق ضبط حلقة التركيز البؤري.
  4. ضع الزيت المعدني على منطقة التصوير لزيادة الشفافية.
  5. قم بتشغيل أجهزة الكمبيوتر ولوحة لوحة LED ومعدات الفيزيولوجيا الكهربية.
    ملاحظة: تعمل لوحة لوحة LED بشكل أفضل عند وضعها أمام لإضاءة نافذة التصوير أثناء إطفاء الأضواء العلوية. تم ضبط الضوء على ~ 2,400 لوكس (95٪ طاقة) مع إعداد درجة حرارة باردة تبلغ 4000 كلفن.
  6. إعداد التحميل لنظام التشغيل iOS باستخدام Micro-Manager 19,20, 21,22.
    1. اضغط على Live لعرض الماوس أسفل الكاميرا وتوسيط جمجمة أسفل الكاميرا. أغلق نافذة "مباشر".
    2. اضغط على Multi-D Acq.
    3. في نافذة الاستحواذ متعدد الأبعاد، حدد النقاط الزمنية المطلوبة.
      ملاحظة: يوصى بعدد 750 صورة بفاصل زمني قدره 250 مللي ثانية.
    4. احفظ الصور في مسار الملف المطلوب وبادئة الاسم.
  7. قم بتوصيل المسامير الذهبية من بموصل المسرح ثم إلى المسرح
    8. .
  8. إعداد التحميل لبرنامج Intan.
    1. انقر فوق أيقونة اختيار تنسيق الملف ، وفي النافذة المنبثقة ، حدد ملفا واحدا لكل تنسيق نوع الإشارة. سيؤدي هذا إلى حفظ الملف ك ".dat" لاستخدامه مرة أخرى في MATLAB.
    2. في علامة التبويب BW ضمن عرض النطاق الترددي للأجهزة، حدد عرض النطاق الترددي لمكبر الصوت من 0.13-500 هرتز.
    3. ضمن محدد شاشة التصفية ، حدد WIDE لتغطية أوسع نطاق من الإشارات.
    4. لتحديد مسار الملف المطلوب حفظه ، انقر فوق رمز تحديد اسم الملف.
  9. قم بإجراء التأثير باستخدام الاصطدام الكهرومغناطيسي.
    ملاحظة: إعدادات الاصطدام هي سرعة تأثير 4 م / ث وانحراف 5 مم.
    1. قم بتشغيل المصادب وتأكد من أن الطرف يتراجع ويمتد بشكل مناسب عن طريق النقر فوق مفتاح التبديل ثلاثي الاتجاهات لسحب الطرف وتمديد الطرف. يجب تمديد الطرف قبل وضع تحت الحافة.
    2. تحرك بسرعة ، ضع على سرير رغوي وحرك السرير أسفل الحافة.
    3. قم بمحاذاة طرف الاصطدام عند خط الوسط و 1 مم منقاري من البريجما.
    4. اخفض طرف الاصطدام حتى يلامس الجزء العلوي من رأس بقوة.
      ملاحظة: لا تدفع الطرف لأسفل في الرأس.
    5. ادفع الذراع لسحب طرف المصطدم ثم قم بخفضه يدويا 5 مم قبل تنشيط ذراع الاصطدام.
    6. قم بإزالة على الفور من طبقة الإسفنج وضع أسفل الكاميرا للتصوير في غضون 5 ثوان ، حيث يتم بدء SD من الاصطدام.
  10. ابدأ تصوير iOS بالنقر فوق اكتساب! في نافذة الاستحواذ متعدد الأبعاد. صورة لمدة 4 دقائق لالتقاط SD بالكامل.
  11. ابدأ تسجيل الفيزيولوجيا الكهربية بالنقر فوق أيقونة التسجيل في برنامج Intan.
  12. أخرج من وسادة الرغوة واترك يتعافى في ساحة مفتوحة أو قفص منزلي.
    ملاحظة: يوصى بتسجيل الفيزيولوجيا الكهربية لمدة ساعة واحدة على الأقل للسماح لوظيفة الشبكة القشرية بالتعافي.
  13. عند الانتهاء من التسجيل ، افصل عن المسرح والموصل وضع مرة أخرى في قفصه.
    ملاحظة: يوصى بالسماح ب 24 ساعة بين كل جلسة تأثير وتسجيل. يمكن للحيوان البقاء في قفص منزله طوال الوقت خارج جلسات التسجيل.

3. تصور صورة iOS وقياسها

  1. في ImageJ19,20,21,22 ، افتح مكدس الصور بالنقر فوق ملف > استيراد > تسلسل الصورة.
    2. قم
  2. بالتمرير يدويا عبر الصور للتأكد من عدم وجود حركة أو أي قطع أثرية أخرى.
  3. لإنشاء مخطط SD ، قم بإنشاء عائد استثمار باستخدام المؤشر لرسم مربع.
    ملاحظة: يوصى باستخدام مربع 30 × 30 بكسل. يمكن للمرء استخدام أي شكل أو حجم ، ولكن تأكد من عدم تغيير حجم عائد الاستثمار عبر.
  4. قم بإنشاء مؤامرة بالنقر فوق Image > Stacks > Plot X-axis Profile. في الرسم البياني الذي تم إنشاؤه حديثا ، انقر فوق الزر المباشر. ارجع إلى مكدس الصور الخاص ب SD وحرك عائد الاستثمار حتى يظهر الرسم البياني منحنى SD. يجب أن تبدو المؤامرة وكأنها موجة خطيئة مع ارتفاع أولي يتبعه انخفاض أسفل خط الأساس وعودة بطيئة إلى خط الأساس في غضون بضع دقائق.
    ملاحظة: يمكن التعبير عن المخططات كوحدات عشوائية (AU) أو كخط أساس بالنسبة المئوية باستخدام الصور القليلة الأولى كمتوسط أساسي.
  5. في المؤامرة التي تم إنشاؤها ، انقر فوق قائمة لإنشاء قائمة بالقيم التي يمكن رسمها في برامج أخرى لإنشاء الرسم البياني أو Matlab.
  6. للمرئيات ، قم بتحويل الصورة ذات التدرج الرمادي إلى جدول بحث في ImageJ بواسطة Image > Lookup Tables > Fire.
< p class = "jove_title" >4. تحليل الفيزيولوجيا الكهربية

ملاحظة: يوصى باستخدام خبرة مختبر Buzsaki والتعليمات البرمجية التي تم إنشاؤها بواسطة MATLAB بشكل كبير لتصور وتحليل بيانات الفيزيولوجيا الكهربية. سيتطلب التحليل تنزيل MATLAB برمز تنشيط مؤسسي وملف مضغوط مختبر Buzsaki "Buzcode" عبر GitHub (https://github.com/buzsakilab/buzcode).

  1. في برنامج الفيزيولوجيا الكهربية Intan ، تأكد من حفظ البيانات الأولية المصدرة بتنسيق ".dat".
    ملاحظة: يمكن تثبيت Matlab من موقع MathWorks على الويب. يعد رمز التفعيل المؤسسي أو الفردي ضروريا لشراء واستخدام Matlab. بعض الخبرة السابقة في تشغيل التعليمات البرمجية في Matlab ضرورية لإجراء هذا التحليل.
  2. استخدم وظيفة bz_LoadBinary كود بوزاكي لتحميل البيانات في Matlab.
    ملاحظة: مثال "'data' = bz_LoadBinary ('مسار ملف البيانات الكامل','التردد'، تكرار أخذ العينات، nChannels، عدد القنوات)؛
  3. قم بتصفية ضوضاء التيار المتردد باستخدام مرشح الشق المتمركز عند 60 هرتز
    ملاحظة: مثال notch_freq = 60 ؛ [ب ، أ] = iirnotch (notch_freq / (sampling_frequency/2) ، notch_bandwidth / (sampling_frequency/2)) ؛ filtered_data = filtfilt (ب ، أ ، بيانات) ؛
  4. عزل النشاط عالي التردد باستخدام مرشاح ممر النطاق بمدى يتراوح بين 0,5 و100 هرتز، وفقا لتوصيات مجموعة COSBID لتحليل وتصور عمليات إزالة الاستقطاب المنتشرة (SDs).
  5. احسب مخطط طياف الطاقة باستخدام الأمر pspectrum في MatLab.
  6. للتصور ، ارسم مخطط طيف التردد عالي الطاقة على نفس المقياس الزمني وفي عمود واحد.
    ملاحظة: من المؤامرات ، سيكون هناك امتداد للاكتئاب عالي التردد وفقدان الطاقة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

< strong class = "xfig" >يوضح الشكل 1 تمثيلا رسوميا للإعداد التجريبي. يتم وضع براغي الجمجمة المؤقتة في القشرة البصرية الأولية ، مع وضع قطب لولبي واحد للجمجمة في الدودة المخيخية كقطب كهربائي أرضي. يتم تثبيت براغي الجمجمة والدبابيس الذهبية على الجمجمة باستخدام غراء سيانواكريليت وأسمنت الأسنان. من الأهمية بمكان قصر الأسمنت السني على الجزء الذيلي من الجمجمة لترك مساحة للتأثير والتصوير. يشار إلى موقع التأثير ، المتمركز عند خط الوسط وحوالي 1 مم منقاري إلى بريجما ، في <فئة قوية = "xfig">الشكل 1.

تظهر صور الإشارات الضوئية الجوهرية التمثيلية (iOS) في <فئة قوية = "xfig" > الشكل 2 أ. يتم تحويل الصور ذات التدرج الرمادي باستخدام جدول البحث عن النار لتحسين تصور انتشار إزالة الاستقطاب (SDs). يشتمل نظام iOS على إشارات مختلفة ، بما في ذلك NAD (P) H و FADH وانعكاس الأنسجة ، مما يجعل تفسير هذه الإشارات ومقارنتها أمرا صعبا. يجب أن تكون الأوعية الكبيرة مرئية بوضوح من خلال نافذة الغراء الفائقة (يشار إليها بالأسهم) ، بينما يشير الخط المتقطع في <الفئة القوية = "xfig">الشكل 2A إلى موجة انتشار SD. على الرغم من صعوبة ملاحظة SDs في الوقت الفعلي ، إلا أنها تصبح أكثر وضوحا عند تسريع الصور (انظر الفيديو التكميلي 1). قد يبدو أن بعض الفروع الصغيرة "تختفي" بسبب تضيق الأوعية (<فئة قوية = "xfig">الشكل 2 أ). يجب أن ينتج عن منطقة اهتمام صغيرة (ROI) المستخرجة من مكدس الصور مخطط المحور Z مشابه ل الشكل 2 ب. من تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية ، يجب أن تشبه الإشارة عالية التردد المستخرجة اللوحات العلوية <فئة قوية = "xfig" >الشكل 2C ، D. بدأت هذه التسجيلات مباشرة بعد إصابة الدماغ الرضحية الخفيفة (mTBI) ، مع بقاء تحت تخدير الأيزوفلوران خلال 4 دقائق من تصوير iOS. عند إزالة الأيزوفلوران ، يجب أن يعود النشاط عالي التردد بسرعة في غضون دقيقة واحدة في الوهمية ، كما هو موضح في <فئة قوية = "xfig"> الشكل 2C (المربع الأحمر). على العكس من ذلك ، في حالة حدوث SD ، سيظل النشاط عالي التردد منخفضا لعدة دقائق قبل الاسترداد (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2D ، المربع الأحمر). تعرض الألواح السفلية من <فئة قوية = "xfig">الشكل 2C ، D الطاقة المحسوبة (V²) لكل مخطط عالي التردد. تساعد مخططات الطاقة هذه في تحديد قمع واستعادة النشاط عالي التردد من خلال الارتفاع السريع في الطاقة (المشار إليه بالحافة اليمنى للمربعات الحمراء).

figure-results-1
<فئة قوية = "xfig">الشكل 1: الإعداد التجريبي وموقع مسامير الصدمات والجمجمة. يتعرض السطح الظهري للجمجمة من خلال شق جلدي. يتم إغلاق الجمجمة والجلد بغراء سيانواكريليت لتعزيز الشفافية. يتم حفر حفرة لدغ للأرض عند y = -6.00 و x = 0 من bregma. يتم وضع ثقوب الأزيز لتسجيل الأقطاب الكهربائية عند y = -2.79 و x = ±2.5 من bregma. يتم ربط مسامير الفولاذ المقاوم للصدأ من خلال الجمجمة وملحومة بدبابيس ذهبية بسلك فولاذي مقاوم للصدأ غير مطلي. يتم الحرص على تجنب التغطية المفرطة لسطح الجمجمة بأسمنت الأسنان لضمان مساحة كافية للتأثير والتصوير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

< p class = "jove_content biglegend" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-2
الشكل 2: صور iOS التمثيلية وتسجيلات التيار المتردد. (أ) صور iOS التمثيلية مع أسهم تشير إلى الأوعية الدموية. يتم تحويل الصور ذات التدرج الرمادي إلى جدول البحث Fire في ImageJ لتحسين المرئيات. يشير الخط الأسود المنقط إلى انتشار SD ، والذي يتم تصوره على أنه موجة من الكثافة المتزايدة في iOS. يكون SD مرئيا بوضوح عند التمرير السريع عبر مجموعة الصور بأكملها. تعكس إشارة iOS العديد من التغيرات الفسيولوجية والتمثيل الغذائي المرتبطة ب SD ، بما في ذلك إنتاج الميتوكوندريا ل NAD (P) H و FADH والوذمة العصبية. يسلط المربع الأسود الضوء على منطقة الاهتمام (ROI) المستخدمة لإنشاء التتبع في (B). شريط المقياس: 1 مم. (ب) التتبع التمثيلي لنظام التشغيل iOS SD معبرا عنه كنسبة مئوية من خط الأساس. ترتفع إشارة iOS وتعود بالقرب من خط الأساس في غضون 60 ثانية تقريبا. على الرغم من أن التغييرات في إشارات iOS صغيرة (حوالي 10٪) ، إلا أنها كافية لتحديد SD. في تسجيلات التيار المتردد لكل من الزائفة (C) و SD (D) ، تظهر الآثار العلوية نشاطا عالي التردد ، وتمثل الآثار السفلية الطاقة (V²). تشير المربعات الزرقاء إلى فترات تخدير الأيزوفلوران ، بينما يشير المربع الأحمر إلى فترة الشفاء من النشاط عالي التردد من الأيزوفلوران و SD. يتناقض الاكتئاب المطول الناجم عن SD مع الانتعاش السريع للنشاط بعد الأيزوفلوران وحده (الوهم). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو تكميلي 1: نشر تصور الموجة. يتم تسريع ملف الفيديو بسرعة تصل إلى 8x تقريبا لتسهيل التعرف البصري على موجة الانتشار. تم تحويل الصورة ذات التدرج الرمادي إلى جدول البحث Fire وحفظها كملف .AVI في ImageJ. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: قائمة الاختصارات. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد انتشار إزالة الاستقطاب أمرا بالغ الأهمية في نماذج الأمراض المختلفة ، بما في ذلك إصابات الدماغ الرضحية (TBI) والسكتة الدماغية والصداع النصفي1. يعد الكشف الدقيق عن SDs أمرا ضروريا لفهم دورها في العجز السلوكي الحاد و / أو تنشيط جهاز المناعة العصبية بعد إصابات الدماغ الرضحية الخفيفة (mTBIs) 23،24. للتخفيف من مخاطر فقدان SDs عند استخدام طريقة واحدة ، يعد النهج متعدد الأساليب ضروريا لتصور SDs وتسجيلها بفعالية.

في حين أن الجمع بين التقنيات يتيح تأكيد انتشار إزالة الاستقطاب (SDs) ، فقد يكون لكل تقنية مزالق محتملة. يمكن الوصول إلى تقنيات التصوير الموضحة في هذا البروتوكول لمعظم المختبرات ويتم تفصيلها من قبل Zepeda وزملاؤه25. يعد إعداد نافذة الجمجمة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يمكن أن تؤدي النوافذ غير الشفافة إلى صور غير حاسمة26. يمكن التخفيف من هذه المشكلة عن طريق تقليل تعرض الجمجمة للهواء قبل وضع غراء سيانوأكريلات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحسين شفافية النافذة بقطرة من الزيت المعدني قبل التصوير. يمكن أن تؤدي القطع الأثرية للحركة أيضا إلى تعقيد تأكيد SD ، لذا فإن تقليل هذه القطع الأثرية أمر ضروري للحصول على فيديو واضح. لمعالجة هذا الأمر ، من المهم إبقاء تحت الأيزوفلوران طوال عملية التصوير27. يسهل استخدام مخروط الأنف النقل الفعال للحيوان بين الصدمة وإعداد التسجيل. من الأهمية بمكان إعادة بسرعة تحت مخروط الأنف بعد الاصطدام لالتقاط أكبر قدر ممكن من انتشار SD. في نموذج إصابات الدماغ الرضحية الخفيفة (mTBI) ، عادة ما يكون التسجيل لمدة 4 دقائق تقريبا كافيا لالتقاط SD بأكمله. ومع ذلك ، في إصابات الدماغ الرضية الأكثر شدة ، قد تتولد SDs التلقائية بسبب تلف الأنسجة28. يمكن للتصوير المستمر اكتشاف SDs التلقائية هذه ، لكن التخدير الأيزوفلوران الممتد يمكن أن يجعل من الصعب ملاحظة الاكتئاب عالي التردد. يمكن اكتشاف SDs العفوية باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية عن طريق انخفاضات إضافية في نشاط عالي التردد ، ولكن من الصعب تأكيد العلاقة بين الاكتئاب و SD بدون تصوير.

مع تطوير مكبرات الصوت Open-Ephys و Intan ، أصبح الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي متاحا الآن للعديد من المختبرات. تتطلب جميع التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية زرع مسامير الجمجمة و / أو الأقطاب الكهربائية. في هذا البروتوكول ، هناك فترة زمن انتقال لمدة يومين بين زرع مسامير الجمجمة والتسجيل لدعم الشفاء. في حين أن هذه الفترة قد لا تكون كافية للدماغ للتعافي تماما من الزرع ، يجب أن يكون هناك حد أدنى من الضرر لأن مسامير الجمجمة لا تخترق أنسجة المخ. بالإضافة إلى ذلك ، تقل شفافية الجمجمة المختومة بسيانواكريليت بمرور الوقت ، لذلك يجب إجراء التصوير في أسرع وقت ممكن لتحقيق الشفافية المثلى. بالنسبة للفيزيولوجيا الكهربية ، من الضروري تقليل ضوضاء 60 هرتز. تأكد من عزل المنطقة التجريبية عن طاقة التيار المتردد وتأريضها بشكل صحيح على مضخم Intan. على الرغم من أنه لا يمكن التخلص من القطع الأثرية للحركة تماما ، إلا أن مقاييس التسارع على مسرح الرأس يمكن أن تساعد في تحديد فترات الحركة وإزالتها أثناء المعالجة اللاحقة. بشكل عام ، يمكن أن توفر هذه التقنيات رؤى قيمة حول استعادة SD ووظيفة الشبكة القشرية بعد إصابات الدماغ الرضحية الخفيفة (mTBIs).

أحد قيود هذه التقنيات هو أن تخضع للتخدير أثناء التصوير. ومع ذلك ، فإن معظم نماذج إصابات الدماغ الرضية تتطلب تخديرا ، ومن غير المرجح أن يؤثر التخدير الممتد بشكل كبير على التصميم التجريبي. يقلل الأيزوفلوران بشكل كبير من النشاط عالي التردد27. إذا امتد التعرض للأيزوفلوران إلى ما بعد فترة التصوير ، فقد يعقد الكشف عن استعادة النشاط عالي التردد بعد SD. لذلك ، من الأهمية بمكان تضمين مجموعة زائفة أو إيزوفلوران وحدها في التصميم التجريبي لمقارنة استعادة النشاط عالي التردد ، كما هو موضح في الشكل 2. قيد آخر هو أن تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية لا تكتشف تحول التيار المستمر. تعد سعة ومدة تحول DC مؤشرات على صحة الأنسجة والتعافي من SD28. ومع ذلك ، فإن تأكيد SDs بهذه التقنيات سيظل يوفر رؤى قيمة في أبحاث إصابات الدماغ الرضية.

سيستفيد جميع باحثي إصابات الدماغ الرضية من التقنيات الموضحة هنا ، حيث من المحتمل جدا أن تنتج جميع نماذج إصابات الدماغ الرضية إزالة الاستقطاب المنتشرة (SDs). سيكسب مجال إصابات الدماغ الرضية بشكل كبير من فهم دور SDs في الإصابة وتطور الإصابة وتنشيط المناعة العصبية والتعافي. تشير الأبحاث الحديثة إلى أن SDs تساهم في العجز السلوكي وقد تكون آلية أساسية للضعف العصبي5،7. ستساعد التقنيات الموضحة في هذا البروتوكول في توضيح العلاقة بين إصابات الدماغ الرضية و SD. يمكن أن تمتد التطبيقات المستقبلية لهذه التقنيات إلى مجالات بحثية أخرى ، بما في ذلك السكتة الدماغية والصرع والصداع النصفي.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل منح NIGMS P20GM109089 ووزارة الدفاع PR200891.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
# 00-90 × .118 آلة برغيالولايات المتحدة الجزئي المسمار00.90-118-M-SS-P، مثقاب الأمازون
بقطر 0.8 مممثقاب ثنائي الفينيل متعدد الكلورWYTP21، Amazon
16-A HeadstageIntan C3335
2.1 مم شفرات مثقاب صغيرأدوات العلوم الدقيقة19007-21
مكبر للصوت ACIntanRHD
C57BL / 6J الفئران  مختبر جاكسون Jax # 000664
كاميرا CCDMightexTCE-1304-U
عدسة تمديدZeikos  ZE-ETN
Ethiqa XR (بوبرينورفين بطيء الإطلاق)الغرب الأوسط للإمدادات البيطريةرقم المنتج 267.10000.3
دبوس موصل ذهبي (أنثى)أنظمة AM520100
دبوس موصل ذهبي (ذكر)أنظمة AM520200
ImageJ2 / FijiImage JNA
Impactor OneLeica39463930
لوحة لوحة LEDSuponL122t
MATLABMathWorksالتنشيط المؤسسي أو الفردي
الطبي cyanoacrylate الغراءMasterBondMB287
برنامج الكاميرا Micro-Managerصورة JNA
مثقاب / ملمعماكارت مثقاب الأظافر ملف الأظافر الكهربائيJD700 JD700
موصلات OmneticOmneticsA79014-001
RHX Data AcquisitionSoftware IntanNA
أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ غير المطلية (0.005 بوصة) أنظمةAM792800
Stereotaxic FrameKopf Intruments1923-B
Teets أنظمة أسمنت الأسنان "العلاج البارد"525000 ، 526000
عدسة كاميرا XLRنيكونNIKKOR 50 مم f / 1.8-16
نظام تسجيل رمز الصف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pietrobon, D., Moskowitz, M. Chaos and commotion in the wake of cortical spreading depression and spreading depolarizations. Nat Rev Neurosci. 15 (6), 379-393 (2014).
  2. Hartings, J. A., et al. Repetitive cortical spreading depolarizations in a case of severe brain trauma. Neurological Res. 30 (8), 876-882 (2008).
  3. Andrew, R. D., et al. Questioning glutamate excitotoxicity in acute brain damage: The importance of spreading depolarization. Neurocrit Care. 37, 11-30 (2022).
  4. Andrew, R. D., et al. Thecritical role of spreading depolarizations in early brain injury: Consensus and contention. Neurocrit Care. 37, 83-101 (2022).
  5. Pacheco, J., et al. Spreading depolarizations are associated with concussion-like behavior. eNeuro. 6 (6), (2019).
  6. Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C. Y., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. J Neurotrauma. 35, 1-10 (2018).
  7. Pinkowski, N. J., et al. Spreading depolarizations contribute to the acute behavior deficits associated with a mild traumatic brain injury in mice. J Neurotrauma. 41 (1-2), 271-291 (2023).
  8. Dreier, J. P., et al. Recording, analysis, and interpretation of spreading depolarizations in neurointensive care: Review and recommendations of the COSBID research group. J Cereb Blood Flow and Metab. 37 (5), 1595-1625 (2017).
  9. Herreras, O., Somjen, G. G. Analysis of potential shifts associated with recurrent spreading depression and prolonged unstable spreading depression induced by microdialysis of elevated K+ in hippocampus of anesthetized rats. Brain Res. 610 (2), 283-294 (1993).
  10. Boas, D. A., Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging in biomedical optics. J Biomed Opt. 15 (1), 011109(2014).
  11. Hadjikhani, N., et al. Mechanisms of migraine aura revealed by functional MRI in human visual cortex. PNAS. 98 (8), 4687-4692 (2001).
  12. Dietz, R. M., Weis, J. H., Shuttleworth, C. W. Contributions of Ca2+ and Zn2+ to spreading depression-like events and neuronal injury. J Neurochem. 109 (Suppl 1), 145-152 (2009).
  13. Reinhart, K. M., Shuttleworth, C. W. Ketamine reduces deleterious consequences of spreading depolarizations. Exp Neurol. 305, 121-128 (2018).
  14. Mané, M., Müller, M. Temporo-spectral imaging of intrinsic optical signals during hypoxia-induced spreading depression-like depolarization. PLoS One. 7 (8), (2012).
  15. Brennan, A. M., Connor, J. A., Shuttleworth, C. W. NAD(P)H fluorescence transients after synaptic activity in brain slices: predominant role of mitochondrial function. J Cereb Blood Flow and Metab. 26 (11), 1389-1406 (2006).
  16. Shuttleworth, C. W., Brennan, A. M., Connor, J. A NAD(P)H fluorescence imaging of postsynaptic neuronal activation in murine hippocampal slices. J Neurosci. 23 (8), 3196-3208 (2003).
  17. Sword, J., Croom, D., Wang, P. L., Thompson, R. J., Kirov, S. A. Neuronal pannexin-1 channels are not molecular routes of water influx during spreading depolarization-induced dendritic beading. J Cereb Blood Flow and Metab. 37 (5), 1626-1633 (2017).
  18. Chung, D. Y., et al. Real-time non-invasive in vivo visible light detection of cortical spreading depolarizations in mice. J Neurosci Methods. 309, 143-146 (2018).
  19. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  20. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinform. 18 (1), 1-26 (2017).
  21. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. 14, (2010).
  22. Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. J of Biol Methods. 1 (2), e10(2014).
  23. Soldozy, S., et al. Cortical spreading depression in the setting of traumatic brain injury. World Neurosurg. 134, 50-57 (2020).
  24. Zepeda, A., Arias, C., Sengpiel, F. Optical imaging of intrinsic signals: Recent developments in the methodology and its applications. J Neurosci Methods. 136 (1), 1-21 (2004).
  25. Steinzeig, A., Molotkov, D., Castrén, E. Chronic imaging through "transparent skull" in mice. PLoS One. 12 (8), (2017).
  26. Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
  27. Hudetz, A. G., Vizuete, J. A., Pillay, S. Differential effects of isoflurane on high-frequency and low-frequency oscillations in the cerebral cortex and hippocampus in freely moving rats. Anesthesiology. 114 (3), 1588-1595 (2011).
  28. Reinhart, K. M., Morton, R. A., Brennan, K. C., Carlson, A. P., Shuttleworth, C. W. Ketamine improves neuronal recovery following spreading depolarization in peri-infarct tissues. J Neurochem. 168 (5), 855-867 (2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة