هنا ، يتم وصف طريقة كروماتوغرافيا السائل ذات المرحلة العادية وعالية الأداء لاكتشاف وتحديد كمية الرتينويدات الحرجة المشاركة في تسهيل الوظيفة البصرية في كل من أنسجة العين والجهازية ، في سياق إمدادات فيتامين أ الجهازية لتوليد كروموفور رودوبسين الحساس للضوء 11-رابطة الدول المستقلة الشبكية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التحليل الكمي لمستقلبات فيتامين أ الغذائية في أنسجة العين وغير العينية في الفئران باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
المستقبلات المقترنة ببروتين G (GPCRs) هي عائلة فائقة من البروتينات عبر الغشاء التي تبدأ شلالات الإشارات من خلال تنشيط بروتين G الخاص بها عند الارتباط بالترابط. في جميع رؤى الثدييات ، فإن رودوبسين هو GPCR المسؤول عن بدء سلسلة التنبيغ الضوئي. داخل المستقبلات الضوئية ، يرتبط رودوبسين بالكروموفور 11-cis-retinal ويتم تنشيطه من خلال الأيزومرة الحساسة للضوء من 11-cis-retinal إلى All-trans-retinal ، والتي تنشط بروتين Transducin G ، مما يؤدي إلى سلسلة النقل الضوئي.
في حين أن النقل الضوئي مفهوم جيدا ، فإن العمليات التي تشارك في توفير سلائف فيتامين أ الغذائية لتوليد 11-رابطة الدول المستقلة في العين ، وكذلك الأمراض التي تؤدي إلى تعطيل هذا الإمداد ، ليست مفهومة تماما بعد. بمجرد امتصاص سلائف فيتامين أ في الأمعاء ، يتم تخزينها في الكبد على شكل استرات الريتينيل ويتم إطلاقها في مجرى الدم كجميع الريتينول المرتبط بالبروتين 4 المرتبط بالريتينول (RBP4). سيتم امتصاص RBP4-retinol الدورة الدموية من قبل الأعضاء الجهازية ، مثل الكبد والرئتين والكلى والعين. ومن ثم ، فإن طريقة القياس الكمي لنواتج الأيض المختلفة لفيتامين أ الغذائي في العين والأعضاء الجهازية أمر بالغ الأهمية لدراسة وظيفة رودوبسين GPCR المناسبة.
في هذه الطريقة ، نقدم طريقة استخراج وتحليل شاملة لتحليل فيتامين أ في أنسجة الفئران. من خلال تحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء في المرحلة العادية ، يمكن اكتشاف جميع الأيزومرات ذات الصلة من الريتينالديهايد والريتينول واسترات الريتينيل في وقت واحد من خلال تشغيل واحد ، مما يسمح بالاستخدام الفعال للعينات التجريبية ويزيد من الموثوقية الداخلية عبر مستقلبات فيتامين أ المختلفة داخل نفس العينة. باستخدام هذه الطريقة الشاملة ، سيتمكن الباحثون من تقييم إمدادات فيتامين أ الجهازية بشكل أفضل في وظيفة رودوبسين GPCR.
المقدمة
تعد المستقبلات المقترنة ببروتين G (GPCRs) واحدة من أكثر فصيلة البروتينات المعروفة دراسة وتميزا. في وظيفتها الأكثر شهرة ، تعمل GPCRs كمستقبل لسطح الخلية في نقل الإشارة ، وتهيئة الاستجابات داخل الخلايا عند الارتباط برابط معين. تتميز GPCRs بسبعة مجالات حلزونية عبر الغشاء (TM) وستة مجالات حلقة إجمالية. من بين الحلقات الست ، يتم توجيه ثلاث حلقات خارج الخلية لتسهيل ربط الترابط ، بينما تقترن الحلقات الثلاث الأخرى داخل الخلايا ببروتين G غير متجانس يتكون من الوحدات الفرعية Gα و Gβ و Gγ1،2.
تصنف GPCRs إلى عدة فئات ، بما في ذلك الفئة أ شبيهة بالرودوبسين ، وعائ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) بجامعة مينيسوتا (البروتوكول # 2312-41637A) وتم إجراؤها وفقا لبيان ARVO لاستخدام في أبحاث طب العيون والرؤية. قم بإجراء جميع عمليات الاستخراج في الظلام ، تحت ضوء أحمر خافت للإضاءة. كن على دراية بالضوء المتبقي المنبعث من شاشات العدادات ومصابيح LED الملحقة.
1. الجيل القياسي للريتينويد الطيفي وتوليد المنحنى القياسي الخارجي
ملاحظة: قم بإعداد وعاء ثلج جاف للتخزين المؤقت للريتينويدات قبل التحليل باستخدام HPLC.
- قم بوزن كمية تعسفية ولكن مناسبة من الريتينويدات وحلها في مذيب م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا ، استخدمنا الطريقة الموضحة أعلاه لاكتشاف وتحديد الرتينويدات في أنسجة العين والجهازية للفئران وإنشاء مخططات كروماتوغرامية تمثيلية. سنقدم أيضا ملخصا للرتينويدات النموذجية التي يمكن اكتشافها في هذه الأنسجة.
في عمر 6 أشهر ، تم القتل الرحيم للفئران من خلال اختناق ثاني أكسيد الكربون2 . للحفاظ على محتوى الريتينويد العيني ، تم تكييف الفئران مع الظلام لمدة يومين قبل القتل الرحيم والاستخراج. تم حصاد عينين و 0.2 غرام من الكبد و 75 ميكرولتر من الدم لاستخراج الريتينويد وتحليل HPLC اللاحق. با.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه الطريقة ، يتم استخدام HPLC في المرحلة العادية لاكتشاف وتحديد كمية الريتينويدات ذات الصلة ، بما في ذلك استرات الريتينيل والريتينالديهايد والريتينول. نظرا لأهمية 11-cis-retinal باعتباره الصبغة الحرجة في تنشيط رودوبسين GPCR ، فإن الطريقة التي يمكنها اكتشاف المستقلبات المرتبطة بإنتاج 11-CIS-Retinal أمر بالغ الأهمية لدراسة الوظيفة البصرية الشاملة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يمكن اكتشاف جميع الأيزومرات ذات الصلة لكل من الريتينالديهايد والريتينول وقياسها كميا ف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منح NIH-NEI (EY030889 و 3R01EY030889-03S1) وجزئيا من خلال صناديق بدء تشغيل جامعة مينيسوتا إلى GPL. نود أيضا أن نشكر المعهد الوطني للعيون على تزويدنا بمعيار 11-cis-retinal المستخدم في هذه المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > كاشف < / قوي > | |||
| 1-أوكتانول ، مناسب ل HPLC ، & ge ؛ 99.5٪ | سيجما ألدريتش ، ميليبور سيجما | 203-917-6 | |
| 1،4-ديوكسان ، مناسبة ل HPLC ، & ge ؛ 99.5٪ | سيجما ألدريتش ، ميليبور سيجما | 204-661-8 | |
| 11-رابطة الدول المستقلة المعهد | الوطني للعيون | N / A | |
| 11-CIS-Retinol | تورونتو للكيماويات البحثية | TRC-R252105 | |
| 13-رابطة الدول المستقلة | تورونتو للكيماويات البحثية | TRC-R239900 | |
| 13-CIS-retinol | تورونتو للكيماويات البحثية | TRC-R252110 | |
| جميع الشبكية | تورونتو للكيماويات البحثية | TRC-R240000 | |
| جميع الريتينول | تورونتو للكيماويات البحثية | TRC-R252002 | |
| أسيتات الإيثيل ، مناسبة ل HPLC ، & ge ؛ 99.7٪ | سيجما ألدريتش ، ميليبور سيجما | 205-500-4 | |
| هكسان ، HPLC الصف | فيشر العلمي ، الطيف الكيميائي | 18-610-808 | |
| الميثانول (HPLC) | فيشر العلوم | A452SK-4 | |
| ريتينيل بالميتات | تورونتو للكيماويات البحثية | TRC-R275450 | |
| كلوريد الصوديوم (بلوري / معتمد ACS) | فيشر ساینستيفيك | S271-500 | |
| Instruments< / strong> | |||
| 1260 Infinity II جامع الكسور التحليلي | Agilent | G1364F | |
| 1260 Infinity II مضخة ثنائية | Agilent | G7112B | |
| 1260 Infinity II كاشف مصفوفة الصمام الثنائي | Agilent | G7115A | |
| 1260 Infinity II ترموستات متعدد الأعمدة | Agilent | G7116A | |
| 1260 Infinity II Vialsampler | Agilent | G7129A | |
| ST40R جهاز طرد مركزي مبرد | حراري علمي | TSST40R | |
| Vacufuge Plus مكثف الطرد المركزي | Eppendorf | 22820168 < | |
| قوي > مستهلكات < / قوي> | |||
| مل قارورة برغي كهرماني علوية | Agilent | 5188-6535 | |
| غطاء تجعيد مع PTFE / حاجز مطاطي أحمر ، 11 مم | Agilent | 5183-4498 | |
| الطرد المركزي الزجاجية المخروطية القابل للتصرف | Millipore Sigma | CLS9950215 | |
| أنبوب غطاء المسمار ، 15 مل | Sarstedt | 62.554.502 | |
| إدراج قارورة ، 150 وميكرو ؛ L ، زجاج بأقدام بوليمر | Agilent | 5183-2088 |
المراجع
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G. F., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459 (7245), 356-363 (2009).....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
