يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التعديل الضوئي تحت ضوابط تخطيط كهربية الدماغ للنوم لتحفيز الإزالة اللمفاوية للسموم من دماغ الفأر

1.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67035

⸱

يونيو 28, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Saratov State University, 2Institute of Physics, Department of Optics and Biophotonics, Saratov State University, 3Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Saratov Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه الدراسة التكنولوجيا غير الغازية والمحمولة للتعديل الضوئي عبر الجمجمة تحت التحكم في تخطيط كهربية الدماغ لتحفيز الإزالة اللمفاوية للسموم (على سبيل المثال ، بيتا أميلويد القابل للذوبان) من دماغ ذكور الفئران المسنة وغير المخدرة BALB / c أثناء النوم العميق الطبيعي.

الملخص

تلعب الأوعية اللمفاوية السحائية (MLVs) دورا مهما في إزالة السموم من الدماغ. يعد تطوير التقنيات المبتكرة لتحفيز وظائف MLV اتجاها واعدا في تقدم علاج أمراض الدماغ المختلفة المرتبطة بتشوهات MLV ، بما في ذلك أمراض الزهايمر وباركنسون وأورام المخ وإصابات الدماغ الرضحية والنزيف داخل الجمجمة. النوم هو حالة طبيعية عندما تكون عمليات تصريف الدماغ أكثر نشاطا. لذلك ، قد يكون لتحفيز تصريف الدماغ و MLVs أثناء النوم الآثار العلاجية الأكثر وضوحا. ومع ذلك ، لا توجد مثل هذه التقنيات التجارية حاليا.

تقدم هذه الدراسة تقنية محمولة جديدة للتعديل الضوئي عبر الجمجمة (tPBM) تحت التحكم في تخطيط كهربية الدماغ (EEG) للنوم مصممة لإزالة السموم بالضوء (على سبيل المثال ، بيتا أميلويد القابل للذوبان (Aβ)) من دماغ الفئران المسنة BALB / c مع القدرة على مقارنة الفعالية العلاجية للموارد البصرية المختلفة. يمكن استخدام هذه التقنية في الحالة الطبيعية للقفص المنزلي دون تخدير ، والحفاظ على النشاط الحركي للفئران. تفتح هذه البيانات آفاقا جديدة لتطوير تقنيات ضوئية غير جراحية وواعدة سريريا لتصحيح التغيرات المرتبطة بالعمر في وظائف MLV وعمليات تصريف الدماغ وللتطهير الفعال لأنسجة المخ من المستقلبات والسموم. هذه التقنية مخصصة للدراسات قبل السريرية لوظائف الدماغ النائم ولتطوير علاجات ذات صلة سريريا لأمراض الدماغ المرتبطة بالنوم.

المقدمة

تلعب الأوعية اللمفاوية السحائية (MLVs) دورا مهما في إزالة السموم والمستقلبات من أنسجة المخ1،2،3. يصاحب تلف MLVs في أمراض الدماغ المختلفة ، بما في ذلك الأورام وإصابات الدماغ المؤلمة والنزيف والعمليات التنكسية العصبية ، انخفاض في وظائف MLV مما يؤدي إلى تطور هذه الأمراض.1،2،3،4،5،6. لذلك ، فإن تطوير طرق لتحفيز MLVs يفتح آفاقا جديدة في ظهور تقنيات فعالة لعلاج أمراض الدماغ. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح تقنية غير جراحية للتعديل الضوئي الفعال عبر الجمجمة (tPBM) لتحفيز MLVs وإزالة السموم مثل الدم و Aβ من الدماغ5،7،8،9،10،11،12. من المثير للاهتمام أن نلاحظ أن النوم العميق هو عامل طبيعي لتنشيط عمليات التصريف اللمفاوي في الدماغ13,14. بناء على هذه الحقيقة ، من المنطقي افتراض أن tPBM من MLVs أثناء النوم قد يكون له آثار علاجية أكثر فعالية من أثناء اليقظة9،11،12،15. ومع ذلك ، لا توجد حاليا تقنيات تجارية ل tPBM أثناء النوم16. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إجراء التجارب على لدراسة الآثار العلاجية ل tPBM تحت التخدير ، وهو أمر مطلوب لتوصيل الضوء بدقة إلى الدماغ. ومع ذلك ، يؤثر التخدير بشكل كبير على تصريف الدماغ ، مما يقلل من جودة نتائج البحث17.

Aβ هو منتج استقلابي للنشاط العصبي الطبيعي18. كما تم تأسيسه في الخلايا العصبية القشرية للفئران المستزرعة ، يتم إطلاق Aβ منها بمعدلات عالية في الفضاء خارج الخلية (2-4 جزيئات / خلية عصبية / ثانية ل Aβ) 19. هناك أدلة على أن الشكل المذاب من Aβ ، الموجود في المساحات خارج الخلية وحول الأوعية الدموية ، هو الأكثر سمية للخلايا العصبية والمشابكالعصبية 20. يتم مسح Aβ القابل للذوبان بسرعة من الدماغ البشري خلال 1-2.5 ساعة21. MLVs هي أنفاق لإزالة Aβ القابل للذوبان من الدماغ 1,7 الذي ينخفض مع تقدم العمر ، مما يؤدي إلى تراكم Aβ في الدماغ المسن 1,22. هناك أدلة على أن التشوهات خارج الخلية لمستويات Aβ في الدماغ ترتبط بالأداء المعرفي في الشيخوخة وترتبط بتطور مرض الزهايمر (AD)23,24. لذلك ، تعتبر القوارض القديمة والقديمة بدائل للنماذج المعدلة وراثيا لدراسة الداء النشواني ، بما في ذلك25،26 بعد الميلاد.

تقدم هذه الدراسة تقنية tPBM الأصلية والمحمولة تحت التحكم في تخطيط كهربية الدماغ (EEG) لنوم حركة العين العميقة أو غير السريعة (NREM) في ذكور الفئران BALB / c غير المخدرة من مختلف الأعمار لتحفيز التصفية اللمفاوية ل Aβ من الدماغ إلى الجهاز اللمفاوي المحيطي (الغدد الليمفاوية العنقية العميقة ، dcLNs).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا ل "دليل رعاية واستخدام المختبر" ، والتوجيه 2010/63 / EU بشأن حماية المستخدمة للأغراض العلمية ، والمبادئ التوجيهية الصادرة عن وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي (رقم 742 من 13.11.1984) ، والتي تمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات البيولوجيا بجامعة ولاية ساراتوف (البروتوكول رقم 7 ، 22.09.2022).

1. تجميع الأجهزة

  1. قطع قطعة من رقائق النسيج التي يبلغ سمكها 1.5 مم إلى أبعاد 1.5 مم × 2 مم. سيشار إلى هذا الجزء باسم لوحة الدوائر المطبوعة (PCB) للصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) (الشكل 1C).
  2. لحام LED إلى ثنائي الفينيل متعدد الكلور ، كما هو موضح في الشكل 1.
  3. قم بلحام سلكين نحاسيين تقطعت بهم السبل بدبابيس LED ثم قم بتغطيتها بجلبة.
  4. طباعة نموذج 3D للإطار (الشكل 1 أ) ؛ ضع LED (الشكل 1 ب) ومغناطيسا (الشكل 1 د) على الإطار ؛ ضع غسالة (الشكل 1E) على رأس الماوس.
  5. لتجميع الدائرة (الشكل 2) ، اتبع هذه الخطوات.
    1. أولا ، قم بتوصيل المقاوم (الشكل 2 ؛ R1) بين أنود LED ومنفذ 5 فولت على Arduino.
    2. بعد ذلك ، قم بتوصيل كاثود LED بترانزستور التأثير الميداني لأكسيد المعادن وأشباه الموصلات (MOSFET) (الشكل 2 ؛ س 1) استنزاف. ثم قم بتوصيل مصدر MOSFET بالأرض.
    3. قم بتوصيل المقاوم المنسدل (الشكل 2 ؛ R2) بين بوابة MOSFET والأرض. أخيرا ، قم بتوصيل بوابة MOSFET بالدبوس 3 على Arduino.
  6. قم بتوصيل درع لوحة مفاتيح شاشة الكريستال السائل (LCD) بجهاز Arduino.
  7. اطبع نماذج 3D للحالة ولوحة الغطاء والأزرار. أدخل لوحة Arduino مع درع لوحة مفاتيح LCD و MOSFET وموصل LED في العلبة ، كما هو موضح في الشكل 3.

2. دليل البرمجيات (الشكل 4)

  1. قم بتنزيل رسم Arduino (ملف .ino) وافتحه عبر بيئة التطوير المتكاملة Arduino (IDE) (ملف الترميز التكميلي 1).
  2. حدد منفذ الاتصال الصحيح (COM) وقم بفلاش البرنامج الثابت.
  3. تتضمن الواجهة عمودين. استخدم الزرين يسار ويمين للتنقل بين هذه الأعمدة. يقع مؤشر التحديد على يسار العمود.
  4. العمود الأيسر على الشاشة هو حقل اختيار دورة عمل تعديل عرض النبضة (PWM). استخدم الزرين لأعلى ولأسفل لضبط دورة العمل. حقق جرعة 10/20/30 Dj / cm2 من PBM مع دورة عمل PWM المقابلة 2٪ / 4٪ / 6٪ في جلسة مدتها 17 دقيقة.
  5. العمود الأيمن على الشاشة هو حقل RUN/Off. لتحديد هذا العمود، اضغط على الزر الأيمن على لوحة المفاتيح ثم اضغط على تحديد. عند تشغيل العملية ، سيومض مؤشر النشاط ، وسيتغير النص الموجود على الزر RUN إلى OFF.
    ملاحظه. يتم تحضير الفئران للتجارب على مدى 10 أيام ، بما في ذلك زرع أقطاب EEG ، وزرع قسطرة مزمنة في البطين الجانبي الأيمن لحقن الفلورسنت Aβ ، ووضع لوحة ل PBM.

3. زرع نظام تسجيل EEG (الشكل 5)

  1. وزن الفأر وتخديره بمزيج من زوليتيل 100 وزيلانيت (100 ملغم/كغ؛ 10 ملغم/كغ، على التوالي) عن طريق الحقن العضلي في الفخذ.
  2. عندما تتوقف ردود فعل سحب القدم الخلفية واستجابة قرصة الذيل ، ضع الماوس في إطار مجسم فوق وسادة تدفئة (الشكل 5 أ).
  3. ضع مرهم العيون على الجفون لمنع جفاف مقل العيون أثناء الجراحة. كرر هذا الإجراء كلما لزم الأمر.
  4. حلق الرأس في المنطقة من عظام الأنف إلى العظام القذالية باستخدام آلة حلاقة وعقم الجلد المكشوف أولا بالكحول.
  5. باستخدام مقص تشريح مستقيم ، قم بقطع فروة الرأس ، وأمسكها بالملقط الصغير ، ونظف الجمجمة من اللفافة ، وجففها بمسحات القطن. إذا لزم الأمر ، استخدم عوامل مرقئ.
  6. باستخدام مثقاب بقطر 1.3 مم ، قم بعمل فتحتين في العظام الزمنية على كل جانب على طول الإحداثيات: AP = -1 مم للزوج الأول من البراغي و AP = -3 مم للزوج الثاني من البراغي.
  7. ضع مسامير EEG مع أسلاك سلكية في الكحول لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، ضع مسامير EEG في المحلول الملحي.
  8. ضع أربعة مسامير مطلية بالفضة مع أقطاب كهربائية في الثقوب على عمق 1 مم (الشكل 5 ب).
  9. ثبت البراغي على سطح الجمجمة باستخدام أكريليك الأسنان بحيث توجد الأقطاب الكهربائية الممتدة منها باتجاه أنف (الشكل 5C). اترك أكريليك الأسنان يتصلب لمدة 15 دقيقة.
  10. قم بتوصيل مستشعر تسجيل EEG بأنف باستخدام أكريليك الأسنان. اترك أكريليك الأسنان يتصلب لمدة 30 دقيقة (الشكل 5 د).
  11. ضع أقطاب EMG على الجزء الخلفي من عضلة orbicularis oculi باستخدام ملاقط منحنية وقم بتثبيتها باستخدام أكريليك الأسنان. اترك أكريليك الأسنان يتصلب لمدة 15 دقيقة (الشكل 5E).
  12. قم بتوصيل أقطاب EEG بالتجويف المطلي بالفضة للمستشعر ولحامها باستخدام محطة لحام. بعد ذلك ، قم بإصلاح أقطاب EEG باستخدام أكريليك الأسنان (الشكل 5F).
  13. بعد الجراحة ، ضع الماوس على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم حتى يتعافى تماما من التخدير.
  14. بعد ذلك ، ضع الفأر في قفص منزلي فردي مع حرية الوصول إلى الطعام والماء مع الإيبوبروفين (40 مجم / كجم في 200 مل من الماء) للحصول على تسكين بعد الجراحة لمدة 10 أيام.

4. زرع صفيحة ل PBM

  1. وزن الفأر وتخديره بمزيج من زوليتيل 100 وزيلانيت (100 مجم / كجم ؛ 10 مجم / كجم ، على التوالي) عن طريق الحقن العضلي في الفخذ بعد 7 أيام من زرع نظام تسجيل EEG.
  2. عندما تتوقف ردود فعل سحب القدم الخلفية واستجابة قرصة الذيل ، قم بتثبيت الماوس في نظام تجسيمي.
  3. ضع مرهم العيون على الجفون لمنع جفاف مقل العيون أثناء الجراحة. كرر هذا الإجراء كلما لزم الأمر.
  4. ثبت صفيحة معدنية بقطر 5 مم على العظم القذالي للجمجمة باستخدام ملقط أكريليك الأسنان وملقط دومون. اترك أكريليك الأسنان يتصلب لمدة 15 دقيقة (الشكل 6).

5. إعداد قسطرة مزمنة

  1. ضع علامة على إبرة الأنسولين على بعد 2 سم من جانب الطرف المشطوف.
  2. ثبت إبرة الأنسولين في حامل الإبرة من جانب الطرف المشطوف إلى الجزء المحدد.
  3. ضع قسطرة بولي إيثيلين 2 سم-PE-10 على كامل الطول المتبقي للإبرة.
  4. املأ القسطرة بمحلول ملحي وقم بتغطيتها بغطاء بلاستيكي لإغلاقها.

6. زرع قسطرة مزمنة في البطين الجانبي الأيمن

  1. بعد زرع اللوحة ل PBM ، قم بعمل ثقب نقب عند الإحداثيات AP = -0.5 مم و ML = 1.2 مم ، بقطر 1.5 مم ، باستخدام مثقاب.
  2. ضع قسطرة البولي إيثيلين PE-10 في حامل تجسيمي وأدخله في جمجمة الماوس (DV = 2 مم). بعد ذلك ، قم بإصلاحه باستخدام أكريليك الأسنان. اترك أكريليك الأسنان يتصلب لمدة 15 دقيقة (الشكل 7).
  3. بعد الجراحة ، ضع الماوس على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم حتى يتعافى تماما من التخدير.
  4. بعد ذلك ، ضع الفأر في قفص منزلي فردي مع حرية الوصول إلى الطعام والماء مع الإيبوبروفين (40 مجم / كجم في 200 مل من الماء) للحصول على تسكين بعد الجراحة لمدة 10 أيام.

7. tPBM تحت سيطرة EEG لنوم NREM

  1. قم بتوصيل أي نظام تسجيل EEG تجاري بالموصل الموجود على رأس الماوس وقم بتعيين القيمة المطلوبة لدورة عمل PWM.
  2. راقب إشارة EEG وانتظر نشاط إيقاع دلتا. إذا شوهد نوم حركة العين غير السريعة ، فابدأ عملية PBM وأوقف العملية إذا انتقل نوم حركة العين غير السريعة إلى نوم حركة العين السريعة (REM) أو اليقظة. تزداد الجرعة مع كل تفاعل حتى تصل إلى القيمة المطلوبة.
  3. عندما يتم الحصول على جرعة PBM المطلوبة ، تنتهي الجلسة.

8. التصوير البؤري للإزالة اللمفاوية ل Aβ من دماغ الفأر

  1. قم بتوصيل قسطرة 10 سم بإبرة الأنسولين.
  2. باستخدام حقنة هاملتون بإبرة 29 جرام ، قم بإعداد ضخ بيتا اميلويد الفلورسنت (FAβ) بحجم 5 ميكرولتر في القسطرة. دع القسطرة تبقى على حقنة هاملتون.
  3. ثبت يد الفأر وقم بتوصيل القسطرة من خلال إبرة بالقسطرة المزمنة المزروعة.
  4. قم بتوصيل القسطرة بحاقن دقيق. بعد ذلك ، ضع الماوس في صندوق فردي ؛
  5. حدد معدل الحقن 0.1 ميكرولتر / دقيقة في قائمة الحاقن الدقيق ، واضغط على زر ابدأ.
  6. جعل حقن FAβ في البطين الجانبي الأيمن.
  7. بعد إدارة FAβ ، اجعل PBM باستخدام مؤشر LED لمدة 61 دقيقة باتباع الخوارزمية: 17 دقيقة - ضوء و 5 دقائق - توقف مؤقتا لمدة 61 دقيقة.
  8. بعد PBM ، حقن الوريد أي مادة تتبع لوضع العلامات على الأوعية الدماغية عبر الذيل.
  9. بعد الحقن ، القتل الرحيم الفئران باستخدام غرفة القتل الرحيم CO2 .
  10. باستخدام مقص حاد ومستقيم ، قم بعمل شق عرضي صغير في الجلد على طول القصبة الهوائية ، مع إمساك الجلد بملاقط مستقيمة غير حادة.
  11. قم بعمل شق طولي على طول الرقبة بالكامل باستخدام مقص مستقيم.
  12. باستخدام ملاقط منحنية ، تناول الغدد اللعابية وافصلها بعناية عن النسيج الضام. ضع ضاما للجرح على الجزء المفتوح من الشق وقم بإصلاحه بطريقة تدفع الأنسجة المحيطة للخلف.
  13. افحص المنطقة الواقعة بين القصبة الهوائية والعضلة العضلية الخشائية باستخدام ملقطين منحنيين من جانبي الرقبة.
  14. عندما يتم الكشف عن العقدة الليمفاوية العنقية العميقة (dcLN) على كل جانب ، خلع dcLNs باستخدام ملاقط مستقيمة ذات نهايات حادة وقطعها من النسيج الضام.
  15. ضع dcLNs في طبق بتري بمحلول ملحي وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي موجه أفقيا (25 مم × 50 مم × 0.17 مم).
  16. استخدم أي مجهر تجاري متحد البؤر للحصول على صور لشبكات DCLN كاملة.

9. تحليل Aβ في محللات أنسجة المخ

  1. تحضير العينات للفحص.
    1. القتل الرحيم للفئران باستخدام غرفة القتل الرحيم CO2 .
    2. قطع رأس الفأر وإزالة الجلد من رأسه وإزالة العضلات من الجمجمة.
    3. قم بعمل شقين بمقص حاد ومستقيم من الثقبة القذالية الكبيرة إلى القناة السمعية.
    4. باستخدام ملاقط مستقيمة ، افصل الجزء البطني من الجمجمة والعظم القذالي والعظام التي تشكل تجاويف الأذن الوسطى.
    5. باستخدام ملاقط ، افصل الدماغ عن العظام الجدارية والأمامية.
    6. باستخدام مقص مستقيم ، قم بإزالة الفك العلوي وقطع المصابيح الشمية.
    7. ضع الدماغ في المحلول الفسيولوجي.
    8. شطف الدماغ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد لإزالة الدم الزائد جيدا ووزنه قبل التجانس.
    9. قم بإعداد محلول تحلل درجة الحموضة 7.2 يحتوي على 1.5 مم KH2PO4 ، 8 مم Na2HPO4 ، 3 مم KCl ، 137 مم كلوريد الصوديوم و 0.1٪ Tween20 ، 10 mM EDTA مع خليط مثبط للإنزيم البروتيني الطازج.
    10. تجانس الدماغ في محلول تحلل جديد (1 مل من محلول التحلل لعينة أنسجة 200-500 ملغ) باستخدام خالط زجاجي على الجليد.
    11. قم بتنشيط التعليق الناتج باستخدام معطل للخلايا بالموجات فوق الصوتية حتى يتم توضيح المحلول.
    12. أجهزة الطرد المركزي المجانسات عند 10000 × جم لمدة 5 دقائق.
    13. اجمع المادة الطافية باستخدام ماصة ميكانيكية أحادية القناة (100-1000 ميكرولتر) وقم بفحصها على الفور أو قسمة وتخزينها في درجة حرارة ≤-20 درجة مئوية.
  2. تحضير المواد التالية: قارئ الصفائح الدقيقة مع مرشح 450 نانومتر ± 10 نانومتر ؛ أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ماصات أحادية أو متعددة القنوات بدقة عالية ونصائح يمكن التخلص منها ؛ ورقة ماصة لنشاف الصفيحة الدقيقة ؛ حاوية لمحلول الغسيل ؛ 0.01 مول / لتر (أو 1x) محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ؛ والماء منزوع الأيونات أو المقطر.
  3. تحضير الكواشف.
    1. أحضر مكونات المجموعة والعينات إلى درجة حرارة الغرفة (RT ؛ 18-25 درجة مئوية) قبل الاستخدام.
    2. أعد تكوين المعيار باستخدام 1.0 مل من المادة المخففة القياسية ، واحتفظ بها لمدة 10 دقائق في RT ، ورجها برفق (وليس إلى رغوة). حل المخزون القياسي هو 300 بيكوغرام / مل. تحضير 5 أنابيب تحتوي على حجم 0.6 مل من المخفف القياسي وجعل سلسلة التخفيف الثلاثي.
    3. قم بإعداد 5 نقاط (300 بيكوغرام / مل ، 100 بيكوغرام / مل ، 33.33 بيكوغرام / مل ، 11.11 بيكوغرام / مل ، و 3.70 بيكوغرام / مل) من المعيار المخفف ، والأنابيب الأخيرة ذات الفراغ تحتوي فقط على المادة المخففة القياسية (0 بيكوغرام / مل).
    4. قم بتدوير حلول المخزون الخاصة بكاشف الكشف A وكاشف الكشف B بسرعة قبل الاستخدام. قم بتخفيفها 100 ضعف باستخدام مخفف الفحص A و B لإعداد تركيز العمل.
    5. قم بتخفيف 20 مل من محلول الغسيل المركز (30x) مع 580 مل من الماء منزوع الأيونات أو المقطر لصنع 600 مل من محلول الغسيل (1x).
    6. نضح الجرعة المطلوبة من المحلول بنصائح معقمة ، ولا تفرغ المحلول المتبقي في القارورة مرة أخرى.
  4. إجراء الفحص.
    1. تحديد الآبار لمعيار مخفف ، فارغ ، وعينة.
    2. قم بإعداد 5 آبار للنقاط القياسية وبئر واحدة فارغة.
      1. أضف 50 ميكرولتر لكل من التخفيفات القياسية والفارغة والعينة في الآبار المقابلة ، على التوالي. ثم أضف 50 ميكرولتر من كاشف الكشف A إلى كل بئر على الفور.
      2. هز اللوحة برفق (يوصى باستخدام شاكر الصفائح الدقيقة) وقم بتغطيتها بسدادة ألواح. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. قد يبدو كاشف الكشف A غائما. قم بتسخين محلول RT واخلطه برفق حتى يبدو موحدا.
    3. قم بنضح المحلول واغسل كل بئر بمحلول غسيل 350 ميكرولتر من 1x بمساعدة زجاجة بخ أو ماصة متعددة القنوات أو موزع مشعب أو غسالة تلقائية. اترك الطبق دون إزعاج لمدة 1-2 دقيقة. ضع اللوحة على ورق ماص لإزالة السائل المتبقي تماما من جميع الآبار. كرر هذا الإجراء 3 مرات.
    4. بعد آخر غسلة ، قم بشفط أو صب أي مخزن مؤقت متبقي للغسيل. تأكد من الإزالة الكاملة لمحلول الغسيل عن طريق قلب اللوحة ونشافها على الورق الماص.
    5. أضف 100 ميكرولتر من محلول عمل كاشف الكشف B إلى كل بئر واحتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية بعد تغطيتها بمانع تسرب الألواح.
    6. كرر خطوات الشفط / الغسيل لمدة 5 دقائق.
    7. أضف 90 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر وقم بتغطية اللوحة بسدادة لوحة جديدة. احتضان لمدة 10-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية (لا تتجاوز 30 دقيقة) محمية من الضوء. بعد إضافة محلول الركيزة ، سيتحول السائل إلى اللون الأزرق.
    8. أضف 50 ميكرولتر من محلول التوقف إلى كل بئر لإنهاء التفاعل. ستؤدي إضافة محلول التوقف إلى تحويل السائل إلى اللون الأصفر. اضغط على اللوحة على جانبها لخلط السائل. إذا كان تغيير اللون غير متناسق ، فانقر برفق على اللوحة لضمان الخلط الشامل.
    9. تأكد من الإزالة الكاملة للماء وبصمات الأصابع الموجودة أسفل اللوحة وعدم تكوين فقاعة على سطح السائل. ثم اقرأ اللوحة في قارئ microplate عند 450 نانومتر على الفور.
  5. احسب النتائج.
    1. أوجد متوسط القراءات المكررة لكل معيار وعنصر تحكم وعينة. ارسم منحنى قياسي مع سجل تركيز Aβ 1-42 على المحور y والامتصاص على المحور x.
    2. ارسم منحنى الأنسب من خلال النقاط ، والتي يمكن تحديدها عن طريق تحليل الانحدار.
    3. إذا تم استخدام عينات مخففة ، اضرب التركيز الذي تم الحصول عليه من المنحنى القياسي بعامل التخفيف.
      ملاحظة: بالنسبة ل ELISA ، تم استخدام مجموعة لتحديد Aβ 1-42 في هذه الدراسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في الخطوة الأولى ، ركزت الدراسة على تحديد جرعة الضوء الفعالة (1050 نانومتر LED) لتحفيز الإزالة اللمفاوية للفلورسنت Aβ من الدماغ إلى dcLNs في البالغين المستيقظين (2-3 أشهر ، 26-29 جم) ذكور الفئران BALB / c. تم اختيار الجرعات الخفيفة عشوائيا على أنها 10 J / cm2 و 20 J / cm2 و 30 J / cm2 بناء على دراساتنا السابقة لتأثيرات tPBM على إزالة الأصباغ المختلفة وخلايا الدم الحمراء من الدماغ7،8،9<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعد MLVs هدفا مهما لتطوير تقنيات مبتكرة لتعديل تصريف الدماغ وإزالة الحطام الخلوي والنفايات من الدماغ ، خاصة في الأشخاص المسنين الذين تنخفض وظيفة MLV لديهم 1,22. في حالة الاستتباب ، يرتبط النوم العميق بالتنشيط الطبيعي لتطهير أنسجة المخ13,14. لذلك ، من الواضح أن نتوقع أن تحفيز MLVs أثناء النوم العميق سيكون أكثر فعالية مما كان عليه أثناء اليقظة15,16....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث بمنحة من مؤسسة العلوم الروسية (رقم 23-75-30001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.1٪ Tween20Helicon,  روسياSB-G2009-100ML
قسطرةعلمية للسلع ، الولايات المتحدة الأمريكيةPE-10 ، 0.28 مم معرف & 0.61 مم OD
CO2< / sub> غرفةالموثق ، ألمانياCB-S 170
مجهر متحد البؤرنيكون ، اليابانA1R MP
أكريليك الأسنانZermack ، بولندا - روسياVillacryl S ، V130V4Z05
DrillForedom ، روسياSR W-0016
Dumont ملقطStoelting ، الولايات المتحدة الأمريكية52100-07
Evans Blue dyeSigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية206334
هاميلتونهاميلتون Bonaduz AG ، سويسرا29 G إبرة
إيبوبروفينسينتز OJSC ، روسياN / A& nbsp ؛ عقار مسكن
إبرة الأنسولينINSUPEN ، إيطاليا31 جم ، 0.25 مم × 6 مم
Levomekol مرهم مضاد للبكتيرياNizhpharmD06C للاستخدام الخارجي بجرعة 40 مجم / جم ، 1 مرة في اليوم
ملقط صغيرStoelting ، الولايات المتحدة الأمريكية52102-02P
جهاز طرد مركزي دقيقGyrozen ، كوريا الجنوبيةGZ-1312
MicroinjectorStoelting ، الولايات المتحدة الأمريكية53311
ملاقط غير حادةStoelting ، الولايات المتحدة الأمريكية52108-83P
نظام PINNACLEPinnacle Technology ، الولايات المتحدة الأمريكيةنظام 8400-K3-SLلتسجيل EEG (قناتان) و EMG (قناة واحدة) لآلة
الحلاقةBraunSeries 3310s
ماصات أحادية ومتعددة القنواتEppendorf ، النمساEpp 3120 000.020 ، Epp 3122 000.019
كلوريد الصوديومKraspharma ، روسياN / A
محطة لحامAOYUE ، الصينN / A
إطار StereotaxicStoelting ، الولايات المتحدة الأمريكية51500
مقص تشريح مستقيمStoelting ، الولايات المتحدة الأمريكية52132-10P
TetracyclineJSC Tatkhimfarmpreparate ، روسياN / Aمرهم العين
ملاقطStoelting ، الولايات المتحدة الأمريكية52100-03
معطل الخلايا بالموجات فوق الصوتيةBiobase ، الصينUSD-500
ضام الجرحStoelting ، الولايات المتحدة الأمريكية52125
XylanitNita-Farm ، روسياN / Aمرخي العضلات
Zoletil 100Virbac Sante Animale ، فرنساN / Aالتخدير العام

المراجع

  1. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  2. Chen, J., et al. Meningeal lymphatics clear erythrocytes that arise from subarachnoid hemorrhage. Nat Commun. 11, 3159(2020).
  3. Zou, W., et al. Blocking meningeal lymphatic drainage aggravates Parkinson's disease-like pathology in mice overexpressing mutated α-synuclein. Transl Neurodegener. 8, 7(2019).
  4. Hu, X., et al. Meningeal lymphatic vessels regulate brain tumor drainage and immunity. Cell Res. 30 (3), 229-243 (2020).
  5. Dong-Yu, L., et al. Photostimulation of brain lymphatics in male newborn and adult rodents for therapy of intraventricular hemorrhage. Nat Comm. 14 (1), 6104(2023).
  6. Bolte, A., et al. Meningeal lymphatic dysfunction exacerbates traumatic brain injury pathogenesis. Nat Commun. 11 (1), 4524(2020).
  7. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Mechanisms of phototherapy of Alzheimer's disease during sleep and wakefulness: the role of the meningeal lymphatics. Front Optoelectron. 16, 22(2023).
  8. Dongyu, L., et al. Photostimulation of lymphatic clearance of β- amyloid from mouse brain: new strategy for the therapy of Alzheimer's disease. Front Optoelectron. 16, 45(2023).
  9. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Mechanisms of phototherapy of Alzheimer's disease during sleep and wakefulness: the role of the meningeal lymphatics. Front Optoelectron. 16, 22(2023).
  10. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Intranasal delivery of liposomes to glioblastoma by photostimulation of the lymphatic system. Pharmaceutics. 15 (1), 36(2023).
  11. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Night photostimulation of clearance of beta-amyloid from mouse brain: New strategies in preventing Alzheimer's disease. Cells. 10 (12), 3289(2021).
  12. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Technology of the photobiostimulation of the brain's drainage system during sleep for improvement of learning and memory in male mice. Biomed Opt Express. 15 (1), 44-58 (2024).
  13. Fultz, N., et al. Coupled electrophysiological, hemodynamic, and cerebrospinal fluid oscillations in human sleep. Science. 366 (6465), 628-631 (2019).
  14. Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
  15. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Phototherapy of Alzheimer's disease: Photostimulation of brain lymphatics during sleep: A systematic review. Int J Mol Sci. 24 (13), 10946(2023).
  16. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Brain waste removal system and sleep: Photobiomodulation as an innovative strategy for night therapy of brain diseases. Int J Mol Sci. 24 (4), 3221(2023).
  17. Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Sci Adv. 5 (2), 5447(2019).
  18. Fukumoto, H., et al. Primary cultures of neuronal and non-neuronal rat brain cells secrete similar proportions of amyloid beta peptides ending at A beta40 and A beta42. Neuroreport. 10 (14), 2965-2969 (1999).
  19. Moghekar, A., et al. Large quantities of Abeta peptide are constitutively released during amyloid precursor protein metabolism in vivo and in vitro. J Biol Chem. 286 (16), 15989-15997 (2011).
  20. Wells, C., Brennan, S., Keon, M., Ooi, L. The role of amyloid oligomers in neurodegenerative pathologies. Int J Biol Macromol. 181, 582-604 (2021).
  21. Savage, M., et al. Turnover of amyloid beta-protein in mouse brain and acute reduction of its level by phorbol ester. J Neurosci. 18 (5), 1743-1752 (1998).
  22. Ahn, J., et al. Meningeal lymphatic vessels at the skull base drain cerebrospinal fluid. Nature. 572 (7767), 62-66 (2019).
  23. Stevens, D., et al. Regional amyloid correlates of cognitive performance in ageing and mild cognitive impairment. Brain Commun. 4 (1), 016(2022).
  24. Ma, C., Hong, F., Yang, S. Amyloidosis in Alzheimer's disease: Pathogeny, etiology, and related therapeutic directions. Molecules. 27 (4), 1210(2022).
  25. Kobro-Flatmoen, A., Hormann, T., Gouras, G. Intracellular amyloid-β in the normal rat brain and human subjects and its relevance for Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 95 (2), 719-733 (2023).
  26. Ahlemeyer, B., Halupczok, S., Rodenberg-Frank, E., Valerius, K., Baumgart-Vogt, E. Endogenous murine amyloid-β peptide assembles into aggregates in the aged C57BL/6J mouse suggesting these animals as a model to study pathogenesis of amyloid-β plaque formation. J Alzheimers Dis. 61 (4), 1425-1450 (2018).
  27. Zhinchenko, E., et al. Pilot study of transcranial photobiomodulation of lymphatic clearance of beta-amyloid from the mouse brain: Breakthrough strategies for nonpharmacologic therapy of Alzheimer's disease. Biomed Opt Express. 10 (8), 4003-4017 (2019).
  28. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Transcranial photobiomodulation of clearance of beta-amyloid from the mouse brain: Effects on the meningeal lymphatic drainage and blood oxygen saturation of the brain. Adv Exp Med Biol. 1269, 57-61 (2021).
  29. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Photobiomodulation of lymphatic drainage and clearance: Perspective strategy for augmentation of meningeal lymphatic functions. Biomed Opt Express. 11 (2), 725-734 (2020).
  30. Zhinchenko, E., et al. Photostimulation of extravasation of beta-amyloid through the model of blood-brain barrier. Electronics. 9 (6), 1056(2020).
  31. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Photostimulation of cerebral and peripheral lymphatic functions. Transl Biophotonics. 2 (1-2), e201900036(2020).
  32. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Photomodulation of lymphatic delivery of liposomes to the brain bypassing the blood-brain barrier: New perspectives for glioma therapy. Nanophotonics. 10 (12), 3215-3227 (2021).
  33. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Photomodulation of lymphatic delivery of Bevacizumab to the brain: The role of singlet oxygen. Adv Exp Med Biol. 1395, 53-57 (2022).
  34. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Transcranial photosensitizer-free laser treatment of glioblastoma in rat brain. Int J Mol Sci. 24 (18), 13696(2023).
  35. Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biol. 13, 39-59 (2017).
  36. Spitler, R., Berns, M. Comparison of laser and diode sources for acceleration of in vitro wound healing by low-level light therapy. J Biomed Opt. 19 (3), 038001(2014).
  37. Sato, K., Watanabe, R., Hanaoka, H., Nakajima, T., Choyke, P., Kobayashi, H. Comparative effectiveness of light emitting diodes (LEDs) and Lasers in near infrared photoimmunotherapy. Oncotarget. 7 (12), 14324-14335 (2016).
  38. Keshri, G., Gupta, A., Yadav, A., Sharma, S., Singh, S. Photobiomodulation with pulsed and continuous wave near-infrared laser (810 nm, Al-Ga-As) augments dermal wound healing in immunosuppressed rats. PLoS One. 11 (11), e0166705(2016).
  39. Kim, H., et al. Pulse frequency dependency of photobiomodulation on the bioenergetic functions of human dental pulp stem cells. Sci Rep. 7 (1), 15927(2017).
  40. Chen, Z., et al. The pulse light mode enhances the effect of photobiomodulation on B16F10 melanoma cells through autophagy pathway. Lasers Med Sci. 38 (1), 71(2023).
  41. Mezey, E., et al. An immunohistochemical study of lymphatic elements in the human brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (3), e2002574118(2021).
  42. Chang, J., et al. Characteristic features of deep brain lymphatic vessels and their regulation by chronic stress. Research. 6, 0120(2023).
  43. Prineas, L. W. Multiple sclerosis: Presence of lymphatic capillaries and lymphoid tissue in the brain and spinal cord. Science. 203 (4385), 1123-1125 (1979).
  44. Semyachkina-Glushkovskaya, O., et al. Pilot identification of the Live-1/Prox-1 expressing lymphatic vessels and lymphatic elements in the unaffected and affected human brain. bioRxiv. , 458990(2021).
  45. Semyachkina-Glushkovskaya, O., Postnov, D., Kurths, J. Blood-brainbarrier, lymphatic clearance, and recovery: Ariadne's thread in labyrinths of hypotheses. Int J Mol Sci. 19 (12), 3818(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

علاج التعديل الحيوي الضوئيالأوعية اللمفاوية السحائيةمراقبة النوم عبر تخطيط كهربائية الدماغتصريف الدماغإزالة بيتا أميلويدالتعديل الحيوي الضوئي عبر الجمجمةالمجهر البؤريتحفيز نوم حركة العين غير السريعةسموم دماغ الفأرعلاج الدماغ غير الجراحي
التعديل الضوئي تحت ضوابط تخطيط كهربية الدماغ للنوم لتحفيز الإزالة اللمفاوية للسموم من دماغ الفأر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.