مقالة منهجية

منهجية دراسة تفاعلات مستقبلات غشاء فيتامين أ وبروتين أوبسين مع روابطها في توليد بروتين الريتينيليدين

DOI:

10.3791/67036

⸱

أكتوبر 4, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Neurosciences, University of Minnesota, 2High Throughput Screening Laboratory, Institute for Therapeutics Discovery & Development, University of Minnesota

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف طريقتين كميتين لدراسة تفاعلات البروتين والترابط لمستقبلات غشاء فيتامين أ ومستقبلات الضوء opsin مع الروابط الفسيولوجية الخاصة بها.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد توزيع فيتامين أ / الريتينول المتحول بالكامل (ROL) في جميع أنحاء الجسم أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على وظيفة الريتينويد في الأنسجة المحيطية وتوليد بروتين الريتينيلدين للوظيفة البصرية. RBP4-ROL هو مركب ROL مع البروتين المرتبط بالريتينول 4 (RBP4) ، الموجود في الدم. مستقبلان غشاءيان ، مستقبلات ربط الريتينول 4 مستقبلات 2 (RBPR2) في الكبد ويتم تثبيتها بواسطة حمض الريتينويك 6 الريتينول (STRA6) في العين ، يربطان RBP4 الدورة الدموية وهذه الآلية ضرورية لاستيعاب ROL في الخلايا. يعد إنشاء طرق للتحقيق في حركية المستقبلات والترابط أمرا ضروريا لفهم الوظيفة الفسيولوجية لمستقبلات فيتامين أ لتوازن الريتينويد. باستخدام فحوصات رنين البلازمون السطحي (SPR) ، يمكننا تحليل صلات الارتباط والمعلمات الحركية لمستقبلات غشاء فيتامين أ باستخدام الترابط الفسيولوجي RBP4.

يمكن أن تكشف هذه المنهجيات عن معلومات هيكلية وكيميائية حيوية جديدة عن الزخارف المرتبطة ب RBP4 في RBPR2 و STRA6 ، والتي تعتبر ضرورية لفهم الحالات المرضية لنقص فيتامين A. في العين ، يتم استقلاب ROL الداخلي إلى شبكية العين 11-cis ، وهو الصبغي البصري الذي يرتبط ب opsin في المستقبلات الضوئية لتشكيل بروتين الريتينيليدين ، رودوبسين. يتسبب امتصاص الضوء في تزومرة رابطة الدول المستقلة إلى العابرة لشبكية العين 11-cis ، مما يؤدي إلى تغييرات توافقية في رودوبسين والتنشيط اللاحق لسلسلة النقل الضوئي. يمكن أن يؤثر انخفاض تركيزات المصل و ROL العيني على تكوين بروتين الريتينيليدين ، والذي بدوره يمكن أن يتسبب في سوء تحديد موقع الرودوبسين ، وتراكم أوبسين ، والعمى الليلي ، وتنكس الجزء الخارجي لمستقبلات الضوء ، مما يؤدي إلى التهاب الشبكية الصباغي أو داء ليبر الخلقي.

لذلك ، فإن منهجيات القياس الطيفي لتحديد كمية مركب الشبكية opsin-11-cis المقترن ببروتين G في شبكية العين أمر بالغ الأهمية لفهم آليات تنكس خلايا الشبكية في الحالات المرضية المذكورة أعلاه. باستخدام هذه المنهجيات الشاملة ، سيتمكن الباحثون من تقييم إمدادات فيتامين أ الغذائية بشكل أفضل في الحفاظ على توازن الريتينويد الجهازي والعيني ، وهو أمر بالغ الأهمية لتوليد تركيزات بروتين الريتينيلدين والحفاظ عليها في المستقبلات الضوئية ، وهو أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الوظيفة البصرية لدى البشر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد فيتامين أ / الريتينول / ROL الذي تم الحصول عليه في النظام الغذائي مكونا مهما يلعب دورا في الوظيفة البصرية1،2. يرتبط شبكية الشبكية chromophore 11-cis ، وهو مستقلب لفيتامين A الغذائي ، بمستقبلات G المقترنة بالبروتين G (GPCR) opsin لتوليد بروتين الريتينيلدين ، رودوبسين ، في المستقبلات الضوئية. عندما يسقط الضوء على العين ، يخضع تكوين رودوبسين لتغيير جوهري من خلال تحويل مكون شبكية العين 11 رابطة الدول المستقلة إلى الشبكية العابرة بالكامل. يؤدي هذا التغيير في التكوين إلى سلسلة من التنبيغ الضوئي داخل المستقبلات الضوئية للقضيب ، مما يحول الضوء إلى إشارة كهربائية ، والتي تنتقل إلى القشرة البصرية في الدماغ عبر العصب البصري3،4،5،6،7،8،9،10. يمكن أن يؤثر انخفاض تركيزات المصل و ROL العيني على تكوين بروتين الريتينيليدين ، والذي بدوره يتسبب في وضع خلل في opsin ، وتراكم opsin apoprotein ، والعمى الليلي ، وتنكس OS المستقبلات الضوئية ، مما يؤدي إلى التهاب الشبكية الصباغي أو Leber Congenital Amaurosis ، والذي يمكن أن يسبب العمى3،10.

الريتينول المتحولة بالكامل هو شكل النقل الأساسي لفيتامين أ الغذائي وهو المصدر الذي يتم اشتقاق منه جميع الرتينويدات الوظيفية ومستقلبات فيتامين أ الغذائية. يعمل الكبد كعضو أساسي لتخزين فيتامين أ الغذائي. يتم نقل الريتينول الكبدي عبر المصل كمركب مع البروتين المرتبط بالريتينول 4 (RBP4). RBP4 ، الذي يتم التعبير عنه بشكل أساسي في الكبد ، يشكل مركبا هولو مع ركيزة الريتينول وترانسثيريتين (TTR) ، والذي يدخل الدورة الدموية11،12،13،14،15،16،17. أدى تقرير مستقبلات سطح الخلية ل RBP4 في السبعينيات إلى فرضية بروتينات نقل الغشاء التي تساعد في نقل الريتينويدات داخل وخارج الخلايا. تم تحديد مستقبل سطح الخلية للريتينول المرتبط ب RBP4 (RBP4-ROL) على أنه STimulated بواسطة حمض الريتينويك 6 ريتينول (STRA6) في ظهارة صبغة الشبكية (RPE) للعين. يرتبط STRA6 بمركب الدورة الدموية holo-RBP4 وينقل الريتينول المرتبط ب RBP4 عبر RPE لاستخدامه بواسطة المستقبلات الضوئية18،19. يمكن أن تؤدي الطفرات في STRA6 إلى عدد لا يحصى من الأمراض والأنماط الظاهرية المرتبطة بانخفاض تركيزات ROL في العين. يمكن أن تؤدي طفرات STRA6 أثناء التطور إلى فقدان الملتحمة ، وصغر الملتحمة ، والأعراض غير العينية الأخرى التي تتداخل مع الأنماط الظاهرية المرتبطة بمتلازمة ماثيو وود20،21،22،23،24،25،26،27. يتم التعبير عن STRA6 في أعضاء وأنسجة مختلفة ، مثل RPE في العين ، ولكن ليس في جميع الأنسجة26،27. على الرغم من أن الموقع الأساسي لتخزين الريتينويد هو الكبد ، إلا أن STRA6 لا يتم التعبير عنه في الكبد.

اكتشف ألابات وزملاؤه أن مستقبلات بروتين ربط الريتينول 4 2 (RBPR2) مرتبطة ب RBP4 مع تقارب عال وكان مسؤولا عن امتصاص الريتينول المرتبط ب RBP4 في الكبد ، على غرار STRA6 في RPE28. تم الإبلاغ عن أن RBPR2 يشترك في التماثل الهيكلي مع STRA629،30،31. يقترح RBP4 أن يرتبط بالمخلفات S294 و Y295 و L296 على RBPR2 ، وهو مجال مرتبط بالأحماض الأمينية محفوظ جزئيا بين RBPR2 و STRA6 وكذلك29،30،31. من هذه الدراسات ، يقترح أن تتفاعل مستقبلات غشاء فيتامين أ مثل STRA6 و RBPR2 ، والتي تحتوي على واحد أو أكثر من بقايا / مجالات الارتباط خارج الخلية ، مع RBP4-ROL الدورة الدموية. لذلك ، تلعب مستقبلات الغشاء دورا مهما في ارتباط المستقبلات بالدورة الدموية RBP4 لاستيعاب ROL في الأنسجة المستهدفة ، مثل الكبد والعين.

في الجزء الأول من هذه الدراسة ، استخدمنا رنين البلازمون السطحي (SPR) للتحقيق في تفاعل اثنين من مستقبلات غشاء فيتامين أ (RBPR2 و STRA6) مع الترابط الفسيولوجي RBP431. يمكن قياس صلات الارتباط وحركية الارتباط / الانفصال للبروتين بمجمعات الترابط في الوقت الفعلي باستخدام SPR. تهدف هذه المنهجية إلى توفير معلومات حركية وهيكلية وكيميائية حيوية مهمة حول الزخارف المرتبطة ب RBP4 في RBPR2 و STRA6 ، والتي تعتبر ضرورية لفهم الحالات المرضية لنقص فيتامين أ31،32. كما ذكرنا أعلاه ، يتم استيعاب ROL الدورة الدموية في RPE عبر STRA6 لتوليد شبكية الصبغة 11-cis ، والتي ترتبط ب opsin لتوليد بروتين الريتينيلدين ، رودوبسين ، في المستقبلات الضوئية33. استخدمنا منهجيات القياس الطيفي لتحديد كمية GPCR-opsin ومركب شبكية الترابط 11-cis في محلل شبكية الفئران ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم آليات انخفاض بروتين الريتينيلدين ، رودوبسين ، في التهاب الشبكية الصباغي أو حالات ليبر المرضية المرضية للعين الخلقية34. بشكل عام ، يمكن تطبيق هذه البروتوكولات لدراسة العواقب الفسيولوجية المتحولة RBP4 أو STRA6 أو RBPR2 في المختبر في التأثير على توازن فيتامين أ الجهازي والعيني أو تأثير بروتينات دورة الرودوبسين أو دورة الريتينويد الطافرة على الوظيفة البصرية35،36.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. منهجية رنين البلازمون السطحي (SPR)

  1. تحضير وتنقية بروتين RBP4 للفأر
    1. صمم بادئات لإنشاء ماوس كامل الطول RBP4 (msRBP4) (التسلسل المرجعي NCBI: NM_001159487.1). استنساخ msRBP4 cDNA في ناقل تعبير مقاوم للكاناميسين pET28a والتعبير عنه في خلايا BL-21 DE3 (جدول المواد).
    2. قم بتحويل الخلايا المختصة BL-21 DE3 (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة) باستخدام ناقل MSRBP4-pET28a ثم اللوحة على ألواح مرق Luria-Bertani (LB) Agar التي تحتوي على Kanamycin 50 ميكروغرام / مل30،37. احتضان الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة وفحص المستعمرات الإيجابية في اليوم التالي.
    3. اختر مستعمرة واحدة واحتضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية في 5 مل من مرق LB الذي يحتوي على Kanamycin 50 ميكروغرام / مل.
    4. للاستزراع الثانوي في 500 مل من مرق LB المحتوي على 50 ميكروغرام / مل ، استخدم حجم 1٪ من المزرعة الأولية (من الخطوة 1.1.3) واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعات ؛ تحقق من الكثافة البصرية باستخدام مقياس الطيف الضوئي. من الناحية المثالية ، تابع إذا كانت قيمة OD بين 0.6 و 1 للحث على التعبير عن البروتين مع 0.5 ملي مولار IPTG عند 24 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    5. استخدم تركيزات IPTG متعددة من 0.1-1 ملي مولار ونطاق درجة حرارة 16-30 درجة مئوية لتحسين تعبير مللي ثانيةRBP4 واستقراره.
    6. قم بالطرد المركزي للثقافة (من الخطوة 1.1.5) عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، واحتفظ بالحبيبات على الجليد.
    7. تجانس الحبيبات مع محلول التحلل (50 ملي مولار Tris-HCl ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ (حجم / حجم) تريتون X-100 ، 10٪ جلسرين ، 0.5 ملي مولار PMSF ، ومثبطات الإنزيم البروتيني [درجة الحموضة 8.0]). قم بتشغيل المحللة لمدة 15 ثانية ودورة إيقاف تشغيل 30 ثانية باستخدام الخالط بإخراج 250 وات وتردد إخراج 40-50٪ 20 كيلو هرتز. كرر 5x.
    8. قم بإزالة بقايا الخلية والخلايا غير المتحللة عن طريق الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 20 دقيقة. مرر المادة الطافية للمحللة من خلال عمود NTA من النيكل متوازن المخزن المؤقت.
    9. اغسل العمود بمحلول التحلل (من الخطوة 1.1.8) الذي يحتوي على 30 ملي مولار من إيميدازول.
    10. في الكسور ، قم بإزالة بروتين MSRBP4 المرتبط باستخدام المخزن المؤقت الذي يحتوي على 250 ملي مولار إيميدازول. قم بتشغيل الكسور المملحة وراقب كمية البروتين بصريا باستخدام جل بولي أكريلاميد SDS بنسبة 12٪ ، ملطخ بمحلول Coomassie Brilliant Blue R-250 في محلول الميثانول: الماء: حمض الأسيتيك (45:45:10) وإزالة البقع بمحلول بدون صبغة Coomassie الميثانول: الماء: حمض الأسيتيك (45:45:10).
    11. قم بتجميع الكسور غير المستخدمة وغسيل الكسور المجمعة باستخدام كاسيت غسيل الكلى 10K بسعة 10 كيلو دالتون MWCO.
    12. قم بتقييم جودة الجزء المخلل على جل SDS-PAGE بنسبة 12٪ وحدد تركيز البروتين.
      ملاحظة: تم استخدام بروتين Apo-RBP4 في تحليل SPR. لتوليد holo-RBP4 (RBP4-retinol) ، راجع البروتوكولات التفصيلية المنشورة في مكان آخر36،37.
  2. التحقق الأولي من الببتيدات RBPR2 و STRA6 باستخدام RBP4 للبنية والتفاعل عن طريق مقايسة مضان التربتوفان والتحليل الطيفي لثنائي اللون الدائري (CD)
    1. مقايسة مضان التربتوفان
      1. استخدم أداة تحليل تكوين البروتين عبر الإنترنت (https://web.expasy.org/protparam/) والصق تسلسل الأحماض الأمينية في رمز مكون من حرف واحد لتقييم التركيب الهيكلي لبروتين RBP4 المؤتلف والببتيدات الفردية ل RBPR2 و STRA6 لتحديد بقايا الأحماض الأمينية التربتوفان في الببتيدات والبروتين الفردي (جدول المواد).
      2. انقر فوق زر معلمات الحساب وقم بتقييم تكوين الأحماض الأمينية لبقايا التربتوفان (Trp).
        ملاحظة: يجب أن تكون بقايا التربتوفان موجودة في الببتيدات الفردية أو البروتينات التي يتم تحليلها.
      3. قم بتخفيف ببتيدات RBPR2 و STRA6 الفردية بتركيزات ميكرومولار مختلفة واحتضانها بشكل فردي مع 3 ميكروغرام مللي ثانيةRBP4 في صفيحة 96 بئرا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. قم بإثارة المزيج عند 290 نانومتر ومسح الانبعاثات من 300 نانومتر إلى 400 نانومتر الطول الموجي.
      4. تطبيع البيانات باستخدام الفراغ (المخزن المؤقت فقط ، لا الببتيد ولا البروتين) وحالة التحكم في الببتيد (بدون بروتين) والمؤامرة.
        ملاحظة: تشير الزيادة الفلورية في التربتوفان عند التعرض لتركيز ببتيد منخفض إلى مرتفع إلى تفاعل إيجابي بين الببتيدات الفردية وبروتين RBP4.
    2. التحليل الطيفي لثنائي اللون الدائري (CD)
      1. خفف الببتيدات الفردية وبروتين RBP4 المؤتلف في 1x PBS buffer ، درجة الحموضة 7.0. استخدم تركيزات مختلفة من ببتيدات RBPR2 و STRA6 وبروتين RBP4 من 0.1 إلى 10 ميكروغرام / مل لفحص الجودة ، كما هو موضح أدناه.
      2. أضف الببتيدات المخففة الفردية والبروتين في كوفيت بطول مسار 0.1 سم وقم بقياس امتصاص / إهليلجية القرص المضغوط باستخدام مقياس الطيف الضوئي CD (195-250 نانومتر). استخدم الصيغة أدناه لحساب متوسط الإهليلجية للبقايا (θ).
        [v] = (S × mRw) / (10cl)
        يمثل S إشارة القرص المضغوط بالبالمتر المكعب. يمثل mRw متوسط كتلة البقايا. ج يمثل تركيز البروتين في ملغم / مل ؛ ويمثل l طول المسير بالسنتيمتر.
      3. احسب النسبة المئوية للتغير في بنية الجزيء باستخدام تحليل الهيكل الثانوي BeStSel للتنبؤ بطية البروتين بواسطة التحليل الطيفي للقرص المضغوط (https://bestsel.elte.hu).
        ملاحظة: يشير الهيكل الثانوي إلى التأكيدات المناسبة والمحفوظة الحاسمة لدراسة التفاعل ونتائج التفاعلات. افحص الهيكل المتوقع للمجال وتابع دراسة التفاعل.

2. تحليل SPR لتحديد صلات الارتباط والمعلمات الحركية لمستقبلات غشاء فيتامين أ (RBPR2 و STRA6) مع الترابط الفسيولوجي RBP4

  1. لتثبيت RBP4 على إعداد سطح رقاقة CM5 ، نستخدم شريحة مستشعر SPR ، والتي تحمل رابط كربوكسي ميثيل ديكستران ممتد إلى حجم ~ 100 نانومتر متصل تساهميا على سطح ذهبي. في وجود 1-إيثيل -3- (3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) كاربوديميد هيدروكلوريد (EDC) ، يقوم N-hydroxysuccinimide (NHS) بتحويل مجموعات الكربوكسيل الموجودة على سطح الرقاقة إلى استرات N-Hydroxysuccinimide ، والتي تتفاعل تلقائيا مع مجموعات الأمين من الأحماض الأمينية والبروتينات ، مما يجبر الترابط على الارتباط بشكل تساهمي على سطح الرقاقة (جدول المواد).
    1. قم بتثبيت بروتين MSRBP4 المنقى على شريحة المستشعر (الشكل 1 والشكل 2). في قائمة تشغيل البرنامج ، اختر المعالج وتابع خيار الشلل. قم بتخفيف الترابط (مولثانيةRBP4 بروتين تم الحصول عليه من الخطوة 1.1) في مخزن مؤقت للتثبيت (10 ملي مولار من أسيتات الصوديوم ، درجة الحموضة 5.0) إلى 10 ميكروغرام / مل (4 ميكرولتر من الترابط + 396 ميكرولتر من المخزن المؤقت) وقم بنقل كواشف الاقتران في قوارير. افتح نافذة معالج إعداد الشلل من عنصر التحكم في البرنامج ، وحدد شريحة CM5 ، وخيار تثبيت خلية التدفق 2 والمستوى المستهدف 1,200 وحدة استجابة (RU) لتحقيق Rmax يبلغ 30 RU في الدراسة الحركية ومحلول الغسيل: الإيثانول أمين. أدخل الاسم RBP4 وانقر فوق التالي.
      ملاحظة: اختياري: لا يلزم وجود مربع حوار System Preparations لخيار Prime قبل التشغيل إذا تم إجراء التحضير باستخدام PBST المؤقت قيد التشغيل (محلول ملحي مخزن مؤقت بالفوسفات مع محلول منظف Tween 20 بنسبة 0.05٪) مسبقا.
    2. في مربع الحوار موضع الحامل ، انقر فوق إخراج الرف. خذ الرف وضع القوارير ذات الأحجام المخصصة لكل كاشف: 156 ميكرولتر من مللي ثانيةRBP4 ، 177 ميكرولتر من الإيثانول أمين ، 89 ميكرولتر من EDC ، 89 ميكرولتر من NHS ، وقارورة فارغة. أدخل الرف مع قوارير العينة وانقر فوق موافق و التالي.
    3. في مربع الحوار إعداد بروتوكول التشغيل، انقر فوق البدء وحفظ.
  2. إعداد الفحص الحركي للببتيدات RBPR2 و STRA6
    1. قم بتخفيف ببتيدات RBPR2 و RBPR2 و STRA6 المتبادلة بشكل متسلسل (تم تصنيعها كيميائيا سابقا31 والمدرجة في جدول المواد) في تشغيل المخزن المؤقت في نطاق 0.8-26.6 ميكرومتر.
    2. افتح برنامج التحكم وحدد معالج الحركية/التقارب. انقر فوق ملف | افتح القالب وحدد الحركية/التقارب. أدخل مسار تدفق مربع حوار تسلسل الحقن 2-1 (خلية التدفق 2 كنشطة وخلية التدفق 1 كمرجع)، وتحقق من نوع الرقاقة CM5، وانقر فوق التالي. في مربع حوار الإعداد، تحقق من تشغيل دورات بدء التشغيل، وأدخل الحل: المخزن المؤقت والدورات: وانقر فوق التالي.
    3. في مربع حوار معلمات الحقن ، أدخل قيم معلمات العينة : وقت الاتصال: 120 ثانية ، معدل التدفق 30 ميكرولتر / دقيقة ، وقت التفكك 300 ثانية ؛ للحصول على معلمات التجديد : أدخل اسم محلول التجديد: Glycine-HCl (درجة الحوهضة 2.5) ، وقت الاتصال: 30 ثانية ، معدل التدفق: 30 ميكرولتر / دقيقة وانقر فوق التالي.
    4. في مربع حوار العينات ، أدخل اسم الببتيدات والوزن الجزيئي والتركيزات وانقر فوق التالي. في مربع حوار موضع الرف ، قم بتعيين الببتيدات المخففة كعينات فردية ~ 120 ميكرولتر بتركيزات مختلفة من 1 إلى 100 ميكرومتر و ~ 230 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، ~ 120 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، و ~ 1,000 ميكرولتر من الجلايسين ، درجة الحموضة 2.5 ، إلى المواضع الموجودة على الرف. انقر فوق Eject Rack وأدخل جميع القوارير. انقر فوق التالي، وفي مربع الحوار إعداد بروتوكول التشغيل، انقر فوق ابدأ، وأدخل اسم ملف، وحفظ (الشكل 2).
    5. في البرنامج، انقر فوق قائمة ابدأ وحدد التقييم. اختر فتح الملف في البرنامج ، ومن قائمة التحديد المنسدلة ، اختر Fc2-1 لتحليل مخطط الاستشعار النشط المطروح للخلية المرجعية فارغة لمراحل الاقتران والتفكك لببتيدات msRBP4 والطافرة msRBPR2 و msSTRA6.
    6. انقر فوق زر القائمة المنسدلة Kinetics / Affinity واختر Surface bound ؛ لفتح مربع الحوار تحديد المنحنيات ، حدد تضمين العمود في الجدول وانقر فوق التالي. حدد مربع حوار البيانات لإظهار أجهزة الاستشعار المطروحة الفارغة. انقر فوق Kinetics and Affinity، واحتفظ بالمعلمات الافتراضية، وانقر فوق خيار Fit لملاءمة المنحنى. افحص علامة التبويب "تقرير" بحثا عن ثابت تفكك التوازن Kd و Kأو Kعلى معدل الاقتران وKD أو Kمن معدل التفكك. احفظ مخطط استشعار بيانات Kinetics بتنسيق محدد لعلامة التبويب .txt واستخدم القيم لرسم الرسوم البيانية (الشكل 3).
    7. لتحديد ثابت حركية التقارب Kd (تركيز الترابط الذي يرتبط بنصف المستقبلات عند التوازن) ، انسخ والصق أعمدة البيانات في ملف تنسيق .txt الذي تم إنشاؤه من مخطط التقييم إلى XY المستخدم في البرنامج. انقر فوق تحليل والانحدار غير الخطي (ملاءمة المنحنى)، وتحقق من عمود البيانات، ثم انقر فوق موافق. في مربع حوار المعلمة، انقر فوق تشبع الربط ونموذج ملاءمة ربط خاص بموقع واحد مع صيغة:
      Y = (Bmax * X) / (دينار كويتي + X)
      حيث Bmax هو الحد الأقصى لعدد مواقع الربط (وحدة الاستجابة) ، X هو تركيز الببتيدات ، و Y هو الربط (وحدة الاستجابة) (الشكل 3).

3. منهجية القياس الطيفي لتحديد مركب بروتين الشبكية GPCR-11- رابطة الدول المستقلة (بروتين الريتينيلدين رودوبسين) في محللات الشبكية

  1. انقل مجموعة الفئران المحددة مسبقا المكونة من الفئران البالغة WT-C57BL / 6J إلى الغرفة المظلمة.
  2. قم بتكييف الفئران طوال الليل لمدة 12-16 ساعة ، وتحت الضوء الأحمر ، ضع الماوس في غرفة القتل الرحيم وافتح صمام غاز ثاني أكسيد الكربون2 على المنظم إلى 5 لتر / دقيقة لمدة ~ 5 دقائق. ضمان الموت عن طريق الضغط على الرقبة والذيل المسحوب للخلف (خلع عنق الرحم).
  3. استئصال كرات العين وتجانس العينين في عازلة مثلجة باردة تحتوي على 20 ملي مولار ثنائي تريس البروبان (1،3 مكرر (تريس (هيدروكسي ميثيل) ميثيلامينو) البروبان. BTP) درجة الحموضة 7.4 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA ومع مثبط البروتياز (جدول المواد).
  4. جهاز الطرد المركزي المتجانس لمدة 15 دقيقة عند 16000 × جم عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية التي تحتوي على بروتينات العصارة الخلوية القابلة للذوبان في الماء. أعد تعليق وحل الغشاء المحبب وبروتينات الغشاء في مخزن مؤقت يحتوي على 20 ملي مولار n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM) ، 20 ملي مولار ثنائي البروبان (BTP) درجة الحموضة 7.4 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA ومع مثبط البروتياز لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية على منصة دوارة.
  5. جهاز الطرد المركزي لجزء الغشاء القابل للذوبان لمدة 1 ساعة عند 16000 × جم ، 4 درجات مئوية. امزج المادة الطافية مع 30 ميكرولتر من حبات الأجسام المضادة Rho 1D4 واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية على منصة دوارة.
  6. باستخدام حامل مغناطيسي ، افصل المنسدلة باستخدام الخرز ، وتخلص من المادة الطافية ، واغسل الخرزات بمحلول عازل 20 ملي مكرر البروبان (BTP) درجة الحموضة 7.4 ، و 500 ملي كلوريد الصوديوم ، و 2 ملي مولار DDM.
  7. قم بتخطيب بروتين رودوبسين عن طريق الحضانة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع محلول عازل 20 ملي مولار مكرر البروبان (BTP) درجة الحموضة 7.4 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي مولار DDM يحتوي على 0.2 مجم / مل 1D4 الببتيد (-TETSQVAPA) (الشكل 4 والشكل 5).
  8. قم بتحليل السطح للامتصاص من 200 نانومتر إلى 800 نانومتر باستخدام فتحة مستطيلة ، شبه دقيقة ، كوارتز ، فتحة 2 مم ، طول مسار 10 مم ، كوفيت 50 ميكرولتر في إعداد مسح سريع باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    ملاحظة: استخدم فقط كوفيت الكوارتز عالي الجودة (الشكل 4).
  9. للتحقق من صحة الجودة وتحديدها ، تحقق من الغطاء وعرضه للضوء الساطع لمدة دقيقة واحدة ، ثم كرر الخطوة 3.8.
  10. اطرح الامتصاص الفارغ واحسب نسبة أطياف الامتصاص التي تم تحليلها مع الامتصاص عند 500 نانومتر ل 11-cis opsin المرتبط بالشبكية ، و 380 نانومتر للأوبسين المرتبط بالشبكية بالكامل المتعرض للضوء ، و 280 نانومتر لبروتين Apo-Opsin الخالي من الترابط (الشكل 6). يعطي opsin الحر الذي لا يحتوي على شبكية الترابط امتصاصا أساسيا عند 500 نانومتر.
  11. لتحديد تركيز رودوبسين ، استخدم قانون بير لامبرت:
    أ = ε · C · l أو C = A / ε · ل
    حيث A هو الامتصاص ، ε معامل الانقراض المولي (رودوبسين ε500 = 40،600 M−1 cm−1 مجانا Apo Opsin ε280 = 81،200 M−1 cm−1) ، C هو التركيز ، و l طول المسار.
  12. لقياس Opsin liganded بالنسبة المئوية ، استخدم نسبة A280 / A500.
  13. ارسم أطياف الامتصاص المطروحة الفارغة واحسب قيمة opsin الحرة32.
  14. احسب تركيز رودوبسين باستخدام معامل الانقراض ε500 = 40600 M−1 cm−1. يتم حساب تركيز opsin الخالي من الترابط باستخدام قانون Beer-Lambert باستخدام معامل الانقراضε 280 = 81،200 M−1 cm−1.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم وصف الطرق الكمية لدراسة تفاعلات البروتين والترابط لمستقبلات غشاء فيتامين أ ومستقبلات الضوء مع الروابط الفسيولوجية الخاصة بها. يجب التعبير عن الفأر المؤتلف RBP4 في الإشريكية القولونية والبروتين المنقى المستخدم كرابط مترافق على شريحة SPR. يتم استخدام RBPR2 و STRA6 والمتحور S294A RBPR2 "موقع SYL motif RBP4 المتفاعل خارج الخلية" لببتيد ~ 40 من الأحماض الأمينية كمادة تحليلية بتركيزات مختلفة لقياس حركية الارتباط وتشبع التوازنKD للتفاعل (الشكل 1 والشكل 2).

أظهر بروتين RBP4 المؤتلف ، كرابط ل RBPR2 و STRA6 ، تقاربا مرتبطا تجاه المواقع المتفاعلة في هذه الببتيدات ، مقاسة عند Kd ~ 22.38 ميكرومتر و ~ 26.73 ميكرومتر ، على التوالي. يلعب شكل الأحماض الأمينية "SYL" دورا أساسيا في تثبيت هذه التفاعلات في كل من RBPR2 و STRA6 ، وكما هو متوقع ، زاد الببتيد المتحور S294A من Kd من ~ 114.9 ميكرومتر ، مما يشير إلى زيادة عدد النسخ من متطلبات الببتيد الطافرة RBPR2 للوصول إلى تشبع الربط (الشكل 3). امتصاص الريتينول في العين عبر STRA6 وتحويله إلى رتينويدات مختلفة إلى التحويل النهائي لشبكية 11-cis مثل الكروموفور مع الارتباط ببقايا Lysine 296 من رودوبسين يجعل مستقبلا وظيفيا لاستشعار الفوتون والرؤية. يظهر الارتباط التساهمي للشبكية 11-cis ببروتين Opsin لتشكيل رودوبسين بعض ميزات الامتصاص المميزة. يحدث امتصاص البروتين عند 280 نانومتر ، ويكون امتصاص الريتينول الحر عند ~ 325 نانومتر. ومع ذلك ، فإن holo-Opsin مع امتصاص شبكية العين أو رودوبسين 11-cis يحدث عند طول موجي 500 نانومتر.

أي عيب في هذا التكوين المعقد بسبب انخفاض الريتينول الجهازي أو عيب في امتصاص الريتينول عن طريق طفرة في RBPR2 أو STRA6 يؤدي إلى تراكم Opsin الحر أو opsin apoprotein الخالي من شبكية الصبغة 11-cis ، مما يؤدي إلى تغيير تحولات الامتصاص المميز إلى امتصاص منخفض عند 500 نانومتر. من خلال تحديد الامتصاص واستخدام نسبة الامتصاص 280 نانومتر و 500 نانومتر الطول الموجي ، من الممكن تقدير Opsins أو Rhodopsin المقبوض. من خلال التعرض القصير للضوء ، من الممكن التحقق من الأيزمرة الضوئية لامتصاص Opsin المرتبط بشبكية 11-cis عند 500 نانومتر إلى امتصاص Opsin المرتبط بالشبكية بالكامل (Meta II rhodopsin) عند 380 نانومتر (الشكل 4 ، الشكل 5 ، والشكل 6). في الإعداد التجريبي ، تكون فرصة القطع الأثرية والملوثات عالية. المصدران الرئيسيان للقطع الأثرية التي تم العثور عليها هما التعرض غير المقصود للضوء من الأدوات وغسل الملح منخفض التركيز مع الفشل في إزالة جزيئات الملوثات من RPE أو العدسة (الشكل 7).

figure-results-1
الشكل 1: مساحة عمل Surface Plasmon Resonance. المواد المطلوبة ونظرة عامة على أجهزة SPR. (أ) رصيف تحميل رقاقة SPR. (أ) رقاقة CM5 مع سطح ذهبي متصل بالكربوكسي ميثيل ديكستران تساهميا للتثبيت عبر مجموعات -NH2 أو -SH أو -CHO أو -OH أو -COOH. (ب) رف حاقن روبوتي لتحميل العينة. (B') أغطية مطاطية من النوع 3. (B'') قوارير بلاستيكية مقاس 7 مم لعينات الأقسام. (ج، د) التوازن / تشغيل خزان عازل وخزان جمع النفايات. (ه) لوحة التحكم في برنامج Biacore. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: نظرة عامة تخطيطية على رنين البلازمون السطحي وخطوات عمليات الاستحواذ على المخطط الاستشعاري. الخطوة 1: سطح رقاقة CM5 مشدود ببروتين RBP4 بهدف 1,200 وحدة استجابة. الخطوة 2: يتم تشغيل تركيزات مختلفة من ببتيدات RBPR2 كتحليلات ، وهذا التفاعل الجزيئي الحيوي يغير كثافة شحنة الإلكترون على سطح رقاقة الذهب ، مما يؤدي إلى تغيير / تقليل انعكاس الضوء بزاوية معينة أو زاوية رنين. الخطوة 3: يعكس الغسيل ظاهرة البلازمون السطحي ، مما يؤدي إلى انعكاس شدة الانعكاس وانخفاض جهاز الاستشعار إلى خط الأساس. تم استخدام حركية هذه التفاعلات أيضا لتحديد ثوابت الارتباط والتفكك وقوة التفاعلات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: دراسات ربط رنين البلازمون السطحي لببتيدات مجال ربط مستقبلات فيتامين أ الفردية مع الترابط الفسيولوجي RBP4. (أ) موجه البرنامج الذي يوضح الشلل المحقق ل RBP4 على سطح رقاقة CM5. (ب ، ج ، د) مخططات حسية للتفاعلات المتحولة بين الببتيد والليجند RBPR2-RBP4 و STRA6-RBP4 والمتحولة S294A RBPR2-RBP4 بتركيزات مختلفة. (ب '، ج '، د') حركية الربط وتحديد التوازنKD يوضح الاختلاف والتقارب في نمط الربط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: مساحة عمل امتصاص الشبكية Opsin-11-cis ونظرة عامة على الأجهزة. (أ) جهاز طرد مركزي مبرد على الطاولة ، جميع مؤشرات LED مغطاة بالروتين الأحمر ؛ (ب) مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية ، مؤشر LED واحد مغطى بالشريط الأحمر ؛ (ب') خلية مستطيلة فائقة الصغر ، كوفيت كوارتز ، وحامل مغناطيسي. (ج) مسح برمجيات التطبيقات؛ (د) غطاء حجرة مقياس الطيف الضوئي مفتوح ، حامل كوفيت للتحليل ، وغطاء المقصورة مغلق. (ه) إعداد إيقاف تشغيل الضوء مع إيقاف تشغيل الشاشة لإعداد العينة تحت مصدر ضوء أحمر واحد. (و) دوار مبرد لإعداد العينات والذوبان. (ز) إعداد إيقاف الضوء مع تشغيل الشاشة لقياس امتصاص العينة. (ح) تحليل الامتصاص في XY-Plot. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: نظرة عامة على سير العمل لمنهجية امتصاص الشبكية Opsin-11-cis. الخطوة 1: يتم عزل شبكية العين من الفئران المتكيفة مع الظلام تحت مصدر واحد للضوء الأحمر وتجانسها وذوبها للحصول على كسور غشاء الشبكية. الخطوات 2-4: في سلسلة من أجهزة الطرد المركزي ، يتم إذابة الحبيبات في حالة عدم وجود منظف ووجود مخزن مؤقت للمنظفات DDM. الخطوات 5-6: الحبيبات القابلة للذوبان التي تحتوي على مستقبلات ضوئية للشبكية وبروتينات غشائية أخرى جاهزة لسحب الأجسام المضادة وتنقيتها. الخطوة 7: Opsin المغطى باستخدام VAPA 1D4-peptide جاهز لتحليل الامتصاص. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: أطياف امتصاص رودوبسين. (أ) مستخلص شبكية العين للفئران المتكيفة الداكنة باستخدام رودوبسين منقى 1D4 يظهر ذروة امتصاص 500 نانومتر ، و (ب) مستخلص شبكية العين المكشوف للضوء باستخدام رودوبسين منقى 1D4 يظهر ذروة امتصاص 380 نانومتر. (ج) اللطخة الغربية باستخدام الجسم المضاد للرودوبسين 1D4 الذي يظهر جودة تنقية رودوبسين وتوزيع الحجم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: قطعة أثرية لأطياف امتصاص رودوبسين. (أ) تظهر قطعة أثرية في أطياف امتصاص مستخلص العين المتكيف مع الظلام مع ذروة الامتصاص عند 380 نانومتر؛ يؤدي التعرض غير المقصود للضوء من مؤشرات LED للأدوات أو فشل مانع ضوء باب الغرفة المظلمة إلى تبييض بروتين رودوبسين. (ب) يتسبب عدم كفاية الغسيل مع محلول عالي الملح في تراكم الملوثات من RPE أو العدسة أو مصادر أخرى من مستخلص العين ، مما يؤدي إلى انتشار طيف الامتصاص العالي والقطع الأثرية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 8: التمثيل التخطيطي للتفاعلات بين مستقبلات غشاء فيتامين أ (RBPR2 و STRA6) وبروتين Opsin مع الروابط الخاصة بها (RBP4 و 11-cis) الحاسمة لتوليد بروتين الريتينيليدين في المستقبلات الضوئية للوظيفة البصرية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: شدة مضان التربتوفان الجوهرية. دليل أولي على التفاعل والتغيير في اتجاهات بقايا التربتوفان الجوهرية ل RBP4 عند التفاعل مع تركيزات مختلفة من ببتيدات RBPR2 و STRA6. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: RBPR2 و RBP4 لرسو البروتين والبروتين والتفاعل. يتم تصور بقايا الواجهة في PyMOL ويتم تصور اتجاه RBPR2 في الغشاء باستخدام أداة الخادم https://opm.phar.umich.edu/. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3: خط أنابيب لتحليل داخل السيليكو لتفاعل إرساء البروتين والبروتين ومواقع الاتصال المحتملة. يوضح خط أنابيب التحليل تسلسل تشغيل البرنامج النصي Python واستخدام سطر أوامر PyMOL من الخطوات من 1 إلى 6 ، مما يضمن موثوقية الحصول على مواقع التفاعلات. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S4: تحليل الهيكل الثانوي للتحليل الطيفي للقرص المضغوط يوضح تكوين الببتيدات RBP4 و RBPR2 و STRA6. يوضح الرسم البياني الدائري حصص الهياكل الثانوية الموجودة في الجزيء. باستخدام أداة الهيكل الثانوي BeStSel ، تم تحليل التنبؤ بطية البروتين عن طريق التحليل الطيفي لثنائي اللون الدائري (https://bestsel.elte.hu). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
منهجية SPR
في تحليل النمذجة والالتحام السيليكو: يجب استخدام الهيكل المتوقع ل RBPR2 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q9DBN1) و STRA6 ، والهيكل المعروف لقاعدة بيانات msRBP4 PDB (RSCB PDB ID: 2wqa) ، لدراسة الإرساء29،31. بالإضافة إلى ذلك ، يجب استخدام طرق المختبر (زراعة الخلايا) لتأكيد تفاعل مواقع الارتباط المفترضة على مستقبلات فيتامين أ (RBPR2 و STRA6) مع الترابط (RBP4) 29،31 (الشكل التكميلي S1 ، الشكل التكميلي S2 ، والشكل التكميلي S3). تحديد جودة الببتيدات باستخدام التحليل الطيفي للقرص المضغوط. في السابق ، بالنسبة لطيف القرص المضغوط للأشعة فوق البنفسجية البعيدة ، تم استخدام خلية مستطيلة 1 مم 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر ~ 200 ميكرولتر (3-4 ميكروغرام من بروتين RBP4 ، و 32 ميكرومتر RBPR2 ، و 32 ميكرومتر ببتيدات STRA6)31 (الشكل التكميلي S4). يجب استخدام تدفق غاز النيتروجين لمنع تكوين الأوزون الضار تحت مصابيح زينون الانبعاث وتقليل امتصاص الخلفية عند 200-300 نانومتر. باستخدام المعلمة الافتراضية ، تم قياس الطيف من 185 نانومتر إلى 300 نانومتر. يجب تصحيح خط الأساس بالطرح باستخدام الفراغ. يتم حساب محتوى حلزون ألفا وورقة بيتا بناء على خاصية الامتصاص ، مثل القمم السالبة لحلزون ألفا عند 222 نانومتر.

قم بتحليل بروتينات RBPR2 و STRA6 وبيانات المجالات الطوبولوجية في قاعدة البيانات (https://www.uniprot.org) ، وتأكيد مواقع التفاعل المحتملة المعروفة سابقا من المناطق خارج الخلية ، واستخدام التسلسل ~ 40-50 من الأحماض الأمينية لتصنيع الببتيدات كيميائيا. تتطلب الدراسة بروتين RBP4 المؤتلف المنقى RBP4 (msRBP4) وببتيدات RBPR2 و STRA6 المركبة كيميائيا والتي تشمل بقايا ربط RBP4 المقترحة لدراسة تفاعلات المستقبلات والترابط18،19،29،31. قبل وضع قائمة مختصرة بالببتيدات ، يجب تحديد تسلسل الببتيد خارج الخلية لبروتينات مستقبلات فيتامين أ المتفاعلة باستخدام تحليل السيليكو (إرساء البروتين القائم على الكمبيوتر)31. يتم إجراء اختبار SPR لفهم حركية تفاعلات المستقبل والترابط. من الأهمية بمكان معرفة المواقع المتوقعة للتفاعلات عن طريق المقايسات المستندة إلى الكمبيوتر في السيليكو أو من التحليل في المختبر . في هذه الدراسة ، يشير الببتيد المصمم إلى المنطقة خارج الخلية لبروتينات الغشاء RBPR2 و STRA6 ، والتي من المعروف أنها تتفاعل مع RBP4. لضمان نتائج دقيقة ومنع القطع الأثرية المحتملة وأجهزة استشعار SPR السلبية ، من الضروري توحيد المخازن المؤقتة وتركيزات الببتيد والذوبان. بالنسبة لدراسات امتصاص الرودوبسين ، يتطلب عزل محللة الشبكية ظروفا مظلمة صارمة وخطوات غسيل لتجنب القطع الأثرية وقمم الامتصاص غير المرغوب فيها (الشكل 7).

لفهم أهمية فكرة SYL على ناقلات فيتامين أ في ربط RBP4 و RBPR2 و STRA6 و S294A-RBPR2 المتحور تمتصنيع الببتيدات 31 كيميائيا باستخدام تفاعل تكثيف للكربوكسيل والمجموعات الأمينية بين اثنين من الأحماض الأمينية. اتبع البروتوكول الإضافة الدقيقة تدريجيا للأحماض الأمينية المتسلسلة إلى راتنج التثبيت. تخضع عملية تخليق الأحماض الأمينية لتعديلات كيميائية للحماية وإزالة الحماية لوحدة الأحماض الأمينية N-terminal ، مما يسمح بالتخليق وتكوين بوليمر الببتيد. بمجرد الانتهاء ، يتم استرداد الببتيد من الراتنج وتنقيته. يجب تأكيد التحقق الأولي من تفاعلات بروتين RBP4 وببتيدات مستقبلات فيتامين أ باستخدام مقايسة مضان التربتوفان الداخلية وفحصها باستخدام مطياف القرص المضغوط (الشكل التكميلي S1). يجب تأكيد جودة التفاعل الأولي لبروتين RBP4 المؤتلف مع الفأر STRA6 (msSTRA6) ، والفأر RBPR2 (msRBPR2) ، وببتيدات التحكم باستخدام مقايسة مضان التربتوفان الجوهري (الشكل التكميلي S1). يعد اختبار مضان التربتوفان الجوهري إجراء تجريبيا حاسما لتقييم تبريد أو تعزيز بقايا الأحماض الأمينية التربتوفان في البروتينات للتألق عند ربط المستقبل والترابط. التألق المقاس هو مؤشر مباشر على التغير في البيئة المحلية نتيجة للتفاعل.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للطرق
قم بتحسين SPR باستخدام المخازن المؤقتة قيد التشغيل: 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (Tween 20) أو 1x HEPES (P20). لتجنب الرواسب ، يجب طرد الببتيدات المخففة وترشيحها قبل الاستخدام. قم بتوحيد امتصاص رودوبسين باستخدام العديد من المخازن المؤقتة عالية الملح (300-500 ملي كلوريد الصوديوم). للتأكد من قمم امتصاص الرودوبسين في الظلام عند 500 نانومتر ، قم بتعريض العينات للضوء لمدة 30 ثانية وكرر القياس لضمان الجودة من خلال تحول ذروة الامتصاص إلى 380 نانومتر وفعالية المنسدل.

قيود الأساليب
يمكن أن يوفر SPR معلومات محددة عن تفاعل بروتينين. ومع ذلك ، إذا كان التفاعل يتطلب مكونا ثالثا غير معروف ، فقد يصبح فهم البيانات معقدة. سيظل التغيير في شكل الجزيء غير محدد في التفاعل. نظرا لأن بروتين RBP4 يتم تحضيره في حالة عدم وجود الريتينول (apo-RBP4) ، فإن ما يتم قياسه هو ارتباط apo-RBP4 بمستقبلاته. لذلك ، يمكن أن يكون ل RBP4 المحمل بالريتينول (holo-RBP4) تقارب متغير لمستقبلات RBPR2 و STRA6 مقارنة ب apo-RBP435،36. ومن المثير للاهتمام ، أن الصلات بين apo- و holo-RBP4 ل STRA6 تم عرضها سابقا في كل من النطاق الميكرومولار ، ولم يلاحظ أي فرق إحصائي بين روابط apo- و holo-RBP4 بمستقبل STRA635. يمكن لمنهجية امتصاص رودوبسين تحديد وجود الأوبسين غير المجلد (apoprotein opsin) في العين ولكن لا يمكنها تحديد الآلية (الآليات) المسببة.

أطياف امتصاص رودوبسين
نقطة تفتيش حرجة: إن الأيزومرة الضوئية لشبكية العين 11-cis إلى الشبكية المتحولة بالكامل حساسة للغاية وفورية32. يجب إجراء القياس الكمي للرودوبسين (holo-Opsin) في ظل ظروف مظلمة صارمة لقياس محتوى Opsin المناسب و 11-cis في الظلام (500 نانومتر) أو في ظل ظروف متكيفة مع الضوء مثل Meta II Rhodopsin (380 نانومتر) 32. لذلك يجب أن تكون الفئران مظلمة تتكيف في غرفة مظلمة لمدة 12-16 ساعة لقياس رودوبسين32 غير المبيض. لهذا الغرض ، يجب أن تكون الغرفة المظلمة مظلمة تماما ، مع تغطية باب الدخول بقطعة قماش معتمة ومصادر إضاءة LED خارجية على جميع المعدات مغطاة بالروتين الأحمر. قم بتغطية شاشة الكمبيوتر المحمول بغطاء بلاستيكي أحمر واتركه مغلقا لحين الحاجة. مطلوب أيضا مصدر ضوء أحمر علوي.

خطوة حاسمة: قم بتوحيد خطوات الغسيل بتركيزات عالية مختلفة من الأملاح لإزالة بروتينات العدسة أو RPE أو ملوثات الجزيئات التي لها امتصاص الطول الموجي 300-500 نانومتر ويمكن أن تتداخل مع قياس امتصاص opsin.

أهمية الأساليب فيما يتعلق بالطرائق القائمة/البديلة
لا يوجد نهج عملي لدراسة الاستخدام الجهازي للريتينويد ، والمساهمات متعددة الأنسجة ، وتأثير الطفرات في مستقبلات البروتين المرتبطة بالريتينول لآليات توزيع الريتينول. يستخدم هذا البروتوكول تقنيتين أساسيتين لفهم وملء الروابط المفقودة في استنفاد الريتينول في المستقبلات الضوئية باستخدام Apo-Opsin واستخدام تخزين الريتينويد في الكبد عبر تفاعلات RBPR2-RBP4 بين مستقبلات الترابط (الشكل 3 والشكل 6 والشكل 8).

أهمية الطريقة وتطبيقاتها المحتملة في مجالات بحثية محددة
توفر مقايسات التحليل الطيفي القائم على SPR والرودوبسين القائمة على الامتصاص استراتيجية ذات مغزى لدراسة آليات التوازن الجهازي والعيني لتوليد بروتين الريتينيليدين (رودوبسين). باختصار ، يمكن لهذه التقنيات والأساليب التجريبية أن توضح حركية نقل الريتينويدات الغذائية المعتمدة على مستقبلات الغشاء عبر الكبد وإلى العين ، مما يسهل توليد الرودوبسين (الشكل 8). كما أنها تساعد في فهم الآليات والعواقب العينية للطفرات في مستقبلات فيتامين أ وبروتينات الأوبسين ، لا سيما في الارتباط بالروابط الخاصة بها. قد تؤثر هذه التفاعلات على توليد بروتين الريتينيليدين ، وهو أمر بالغ الأهمية للوظيفة البصرية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة. في جمع البيانات أو تحليلها أو تفسيرها. في كتابة المخطوطة، أو في قرار نشر النتائج.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون الدكتورة بياتا جاسترزيبسكا ، دكتوراه (قسم علم الأدوية ، جامعة كيس ويسترن ريزيرف ، أوهايو) على نصيحتها بشأن بروتوكول امتصاص رودوبسين. تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH-NEI (EY030889 و 3R01EY030889-03S1) ، وجزئيا ، من خلال صناديق بدء تشغيل جامعة مينيسوتا إلى GPL.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-D Quant KitCytiva80648356
Amine CouplingCytivaBR100050
Biacore برنامج التقييم Biacore1.1Biacore
Sensor Chip CM5CytivaBR100530
Bis tris البروبانSigmaB6755-25G20 mM
BL21 DE3 الخلايا المختصةThermo مقياس الطيف الضوئي العلميEC0114
CD JascoJ-815 مقياس الطيف القطبي
جلايسين HCLفيشر الكواشف الحيويةBP381-1
GraphPad Prism   ؛تركيب النموذج ، تحليل البيانات
LB مرقفيشر الكواشف الحيويةBP1426-500
n-dodecyl-β-d-maltoside (DDM)EMDMillipore324355-1GM2-20 mM
pET28a ناقلات التعبير المقاوم للكاناميسين  Addgene69864-3
طقم تنقية البلازميدQiagen27106
Rho1D4 MagBeadsCubeBiotech33299
Slide-A_Lyzer 10K كاسيت غسيل الكلىThermo Scientific66810
Tween20Fisher BiorecodesBP337-5000.05٪
UV مقابل مقياس الطيف الضوئيAgilent & nbsp ؛كاري 60 UV-Viس
<قوي>اسم الببتيد< قوي><قوي>تسلسل الببتيد<قوي>HPLC-نقاء<قوي>مواصفات الكتلة
ماوس Rbpr2 (42)HVRDKLDMFEDKLESYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		92.14٪مطابق
الماوس Stra6 (40)SVVPTVQKVRAGINTDVSYL
LAGFGIVLSEDRQEVVELVK		90.84٪مطابقة
الماوس Rbpr2 متحولة S294A (42)HVRDKLDMFEDKLEAYLTHM
NETGTLTPIILQVKELISVTKG		0.92٪مطابقة
Kit الإصدار

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dowling, J. E., Wald, G. Vitamin A deficiency and night blindness. Proc Natl Acad Sci U S A. 44 (7), 648-6618 (1958).
  2. Dowling, J. E., Wald, G. The biological function of vitamin A acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 46 (5), 587-608 (1960).
  3. Kiser, P. D., Palczewski, K. Retinoids and retinal diseases. Annu Rev Vis Sci. 2 (1), 197-234 (2016).
  4. Harrison, E. H. Mechanisms involved in the intestinal absorption of dietary vitamin A and provitamin A carotenoids. Biochim Biophys Acta. 1821 (1), 70-77 (2012).
  5. Harrison, E. H. Carotenoids, β-apocarotenoids, and retinoids: the long and the short of it. Nutrients. 14 (7), 1411(2022).
  6. Li, Y., Wongsiriroj, N., Blaner, W. S. The multifaceted nature of retinoid transport and metabolism. Hepatobiliary Surg Nutr. 3 (3), 126-139 (2014).
  7. O'Byrne, S. M., Blaner, W. S. Retinol and retinyl esters: biochemistry and physiology. J Lipid Res. 54 (7), 1731-1743 (2013).
  8. Blomhoff, R. Transport and metabolism of vitamin A. Nutr Rev. 52 (2 Pt 2), S13-S23 (2009).
  9. Chelstowska, S., Widjaja-Adhi, M. A. K., Silvaroli, J. A., Golczak, M. Molecular basis for vitamin A uptake and Storage in Vertebrates. Nutrients. 8 (11), 676(2016).
  10. Martin Ask, N., Leung, M., Radhakrishnan, R., Lobo, G. P. Vitamin A transporters in visual function: A mini review on membrane receptors for dietary vitamin A uptake, storage, and transport to the eye. Nutrients. 13 (11), 3987(2021).
  11. Yamamoto, Y., et al. Interactions of transthyretin (TTR) and retinol-binding protein (RBP) in the uptake of retinol by primary rat hepatocytes. Exp Cell Res. 234 (2), 373-378 (1997).
  12. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J Biol Chem. 252 (15), 5216-5221 (1977).
  13. Gjøen, T., et al. Liver takes up retinol-binding protein from plasma. J Biol Chem. 262 (23), 10926-10930 (1987).
  14. Blomhoff, R., Norum, K. R., Berg, T. Hepatic uptake of [3H]retinol bound to the serum retinol binding protein involves both parenchymal and perisinusoidal stellate cells. J Biol Chem. 260 (25), 13571-13575 (1985).
  15. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: The transport protein for vitamin A in human plasma. J Clin Invest. 47 (9), 2025-2044 (1968).
  16. Quadro, L., et al. The role of extrahepatic retinol binding protein in the mobilization of retinoid stores. J Lipid Res. 45 (11), 1975-1982 (2004).
  17. Blaner, W. S. STRA6, a cell-surface receptor for retinol-binding protein: The plot thickens. Cell Metab. 5 (3), 164-166 (2007).
  18. Kawaguchi, R., et al. Membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315 (5813), 820-825 (2007).
  19. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-catalyzed vitamin A influx, Efflux, and Exchange. J. Membr. Biol. 245 (11), 731-745 (2012).
  20. Pasutto, F., et al. Mutations in STRA6 cause a broad spectrum of malformations including anophthalmia, congenital heart defects, diaphragmatic hernia, alveolar capillary dysplasia, lung hypoplasia, and mental retardation. Am J Hum Genet. 80 (3), 550-560 (2007).
  21. Golzi, C., et al. Matthew-Wood Syndrome is caused by truncating mutations in the retinol-binding protein receptor gene STRA6. Am J Hum Genet. 80 (14), 1179-1187 (2007).
  22. Isken, A., et al. RBP4 disrupts vitamin A uptake homeostasis in a STRA6-deficient animal model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7 (3), 258-268 (2008).
  23. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses, and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Investig Opthalmol Vis Sci. 53 (6), 3027-3039 (2012).
  24. Kelly, M., von Lintig, J. STRA6: Role in cellular retinol uptake and efflux. Hepatobiliary Surg Nutr. 4 (4), 229(2015).
  25. Berry, D. C., et al. The STRA6 receptor is essential for retinol-binding protein-induced insulin resistance but not for maintaining vitamin A homeostasis in tissues other than the eye. J Biol Chem. 288 (34), 24528-24539 (2013).
  26. Amengual, J., et al. STRA6 is critical for cellular vitamin A uptake and homeostasis. Hum Mol Genet. 23 (20), 5402-5417 (2014).
  27. Steinhoff, J. S., Lass, A., Schupp, M. Retinoid homeostasis and beyond: How retinol binding protein 4 contributes to health and disease. Nutrients. 14 (6), 1236(2022).
  28. Alapatt, P., et al. Liver retinol transporter and receptor for serum retinol-binding protein (RBP4). J Biol Chem. 288 (2), 1250-1265 (2013).
  29. Radhakrishnan, R., et al. Mice lacking the systemic vitamin A receptor RBPR2 show decreased ocular retinoids and loss of visual function. Nutrients. 14 (12), 2371(2022).
  30. Solanki, A. K., et al. A functional binding domain in the Rbpr2 receptor is required for vitamin A transport, ocular retinoid homeostasis, and photoreceptor cell survival in zebrafish. Cells. 9 (5), 1099(2020).
  31. Radhakrishnan, R., Leung, M., Solanki, A. K., Lobo, G. P. Mapping of the extracellular RBP4 ligand binding domain on the RBPR2 receptor for vitamin A transport. Front Cell Dev Biol. 11 (11), 1105657(2023).
  32. Ramkumar, S., et al. The vitamin A transporter STRA6 adjusts the stoichiometry of chromophore and opsins in visual pigment synthesis and recycling. Hum Mol Genet. 31 (4), 548-560 (2022).
  33. Tian, H., Sakmar, T. P., Huber, T. The energetics of chromophore binding in the visual photoreceptor rhodopsin. Biophys J. 113 (1), 60-72 (2017).
  34. Fan, J., Rohrer, B., Frederick, J. M., Baehr, W., Crouch, R. K. Rpe65-/- and Lrat-/- mice: comparable models of leber congenital amaurosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (6), 2384-2389 (2008).
  35. Breen, C. J., et al. Production of functional human vitamin A transporter/RBP receptor (STRA6) for structure determination. PLoS One. 10 (3), e0122293(2015).
  36. Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein. J Vis Exp. 28 (71), e50169(2013).
  37. Shi, Y., Obert, E., Rahman, B., Rohrer, B., Lobo, G. P. The retinol binding protein receptor 2 (Rbpr2) is required for photoreceptor outer segment morphogenesis and visual function in zebrafish. Sci Rep. 7 (1), 16207(2017).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة