مقالة منهجية

مراقبة طويلة الأجل لمعدلات استهلاك الأكسجين في الثقافات الظهارية الصبغية الشبكية شديدة التمايز والاستقطاب

6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67038

⸱

أغسطس 16, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2School of Optometry and Vision Science, University of New South Wales, 3Lucid Scientific, 4Schepens Eye Research Institute of Mass. Eye and Ear, Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 5Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم جهازا جديدا لقياس معدلات استهلاك الأكسجين (OCR) في الثقافات الظهارية الصبغية في شبكية العين (RPE). يمكن للجهاز قياس التعرف الضوئي على الحروف لأسابيع في كل مرة على RPE نمت على لوحات زراعة الخلايا القياسية مع الوسائط القياسية بينما تكون اللوحات في حاضنة زراعة الخلايا القياسية.

الملخص

يعد استقلاب الميتوكوندريا أمرا بالغ الأهمية للوظيفة الطبيعية لظهارة صبغة الشبكية (RPE) ، وهي طبقة أحادية من الخلايا في شبكية العين مهمة لبقاء المستقبلات الضوئية. يعد خلل الميتوكوندريا RPE سمة مميزة للتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو السبب الرئيسي للعمى الذي لا رجعة فيه في العالم المتقدم ، واعتلال الشبكية الزجاجي التكاثري (PVR) ، وهو أحد المضاعفات المسببة للعمى لانفصال الشبكية. تم تصميم الظروف التنكسية RPE بشكل جيد من خلال أنظمة زراعة RPE المتباينة للغاية والاستقطاب لتقليد RPE في الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن مراقبة معدلات استهلاك الأكسجين (OCR) ، وهي وكيل لوظيفة الميتوكوندريا ، كانت صعبة في أنظمة الاستزراع هذه لأن الظروف التي تعزز الاستقطاب والتمايز المثاليين RPE لا تسمح بقياسات OCR سهلة.

هنا ، نقدم نظاما جديدا ، Resipher ، لمراقبة التعرف الضوئي على الحروف لأسابيع في كل مرة في ثقافات RPE متباينة جيدا مع الحفاظ على RPE على ركائز النمو المثلى ووسائط الثقافة الفسيولوجية في حاضنة زراعة الخلايا القياسية. يحسب هذا النظام OCR عن طريق قياس تدرج تركيز الأكسجين الموجود في الوسائط فوق الخلايا. نناقش مزايا هذا النظام على الطرق الأخرى للكشف عن التعرف الضوئي على الحروف وكيفية إعداد نظام قياس التعرف الضوئي على الحروف في ثقافات RPE. نحن نغطي النصائح والحيل الرئيسية لاستخدام النظام ، والحذر بشأن تفسير البيانات ، وإرشادات لاستكشاف النتائج غير المتوقعة وإصلاحها.

نوفر أيضا آلة حاسبة عبر الإنترنت لاستقراء مستوى تجربة ثقافات نقص الأكسجة أو النورموكسيا أو فرط التأكسج RPE بناء على تدرج الأكسجين في الوسائط فوق الخلايا التي اكتشفها النظام. أخيرا ، نراجع تطبيقين للنظام ، قياس الحالة الأيضية لخلايا RPE في نموذج PVR وفهم كيفية تكيف RPE الأيضي مع نقص الأكسجة. نتوقع أن استخدام هذا النظام على ثقافات RPE شديدة الاستقطاب والتمايز سيعزز فهمنا لعملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا RPE في كل من الحالات الفسيولوجية والمرضية.

المقدمة

ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية من الخلايا الظهارية بعد الميتوتيكية وظيفيا وشديدة الاستقطاب والتي تشكل حاجزا بين المستقبلات الضوئية الحساسة للضوء في شبكية العين والدورة الدموية ، وهو سرير شعري يسمى المشيمة الشعرية. مثل دور الخلايا العصبية الداعمة للخلايا الدبقية ، يقوم RPE بوظائف لا تعد ولا تحصى لدعم المستقبلات الضوئية ، بما في ذلك البلعمة للأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية ، ونقل العناصر الغذائية والدعم الأيضي للمستقبلات الضوئية ، وإفراز عوامل النمو الأساسية ، وكلها ضرورية للحفاظ على الوظيفة البصرية.

يكمن انحطاط RPE وراء العديد من الاضطرابات التنكسية الشائعة في الرؤية. في التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو أحد الأسباب الأكثر شيوعا لفقدان البصر غير القابل للشفاء في العالم ، يموت RPE ، وبالتالي تعاني المستقبلات الضوئية العلوية من تنكس ثانوي. في اعتلال الشبكية الزجاجي التكاثري (PVR) ، يخرج RPE بدلا من ذلك من حالته الهادئة عادة بعد الانقسام ، ويتكاثر ويفوز إلى حالة اللحمة المتوسطة (ما يسمى بالانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة [EMT]) مع تغيرات في عملية التمثيل الغذائي. يؤدي عدم تمايز RPE إلى فقدان دعم RPE للمستقبلات الضوئية مع تحفيز حالة أكثر تليفية. ينتج عن هذا تنكس المستقبلات الضوئية والتندب الناجم عن RPE ، وكلاهما يؤدي إلى فقدان البصر 1,2.

جزء كبير من دعم RPE للمستقبلات الضوئية هو التمثيل الغذائي ، وعدم التنظيم الأيضي هو عامل حاسم في العديد من أمراض الشبكية ، بما في ذلك AMD و PVR. يعمل RPE كحاجز تنظيمي بين المستقبلات الضوئية ومصدرها للأكسجين والمواد المغذية ، المشيمية. وبالتالي ، فإن ما يختاره RPE لاستقلاب مقابل ما يختار RPE المرور من المشيمية إلى المستقبلات الضوئية يحكم بقوة استقلاب المستقبلات الضوئية والبقاء على قيد الحياة. أظهرت العديد من الدراسات أن RPE يعتمد بشكل كبير على استقلاب الميتوكوندريا لصحته الطبيعية ، وأن المستقبلات الضوئية تعتمد بدلا من ذلك بشكل كبير على تحلل السكر3. وقد أدخل هذا مفهوم الحالات الأيضية التكميلية والمتشابكة بين المستقبلات الضوئية و RPE. على وجه التحديد ، يقلل RPE من عملية التمثيل الغذائي للركائز الأيضية المفضلة للمستقبلات الضوئية ويستخدم بدلا من ذلك المنتجات الثانوية لعملية التمثيل الغذائي للمستقبلات الضوئية جنبا إلى جنب مع المستقلبات التي لا تستهلكها المستقبلات الضوئية. في أمراض مثل PVR و AMD ، تشير الأدلة بقوة إلى أن RPE يصبح أكثر تحلل للسكر وأقل اعتمادا على استقلاب الميتوكوندريا. قد يؤدي هذا التحول نحو تحلل السكر RPE إلى تجويع المستقبلات الضوئية للمستقلبات التي يحتاجها ، مما يؤدي إلى تنكس4،5،6. بالنظر إلى مدى ترابط RPE واستقلاب المستقبلات الضوئية ومقدار الأيض المتغير الذي يكمن وراء مرض الشبكية ، هناك اهتمام قوي بنمذجة ومعالجة استقلاب RPE لأغراض علاجية.

في حين أن دراسة استقلاب الميتوكوندريا RPE في الجسم الحي مثالية ، لا يمكن فحص العديد من جوانب استقلاب الميتوكوندريا RPE عمليا إلا في نظام الثقافة في المختبر. تم إحراز تقدم كبير نحو ثقافات RPE عالية الدقة في العقود العديدة الماضية ، لدرجة أن ثقافات RPE الأكثر عناية يتم استخدامها الآن للعلاج باستبدال الخلايا في التجارب السريرية البشرية7. للحفاظ على مثل هذه الثقافات عالية الدقة ، يجب أن تنمو RPE على ركائز معينة في وسائط معينة لعدة أشهر قبل التجريب. مع هذه الظروف ، يتم تمييز ثقافات RPE واستقطابها إلى أقصى حد ، وتقترب في RPE في الجسم الحي. لسوء الحظ ، لا توجد معدات متاحة حاليا يمكنها قياس استقلاب الميتوكوندريا على وجه التحديد من RPE في الجسم الحي. في حين تم تحقيق مراقبة الأكسجين لشبكة الشعيرات الدموية في شبكية العين في الجسم الحي باستخدام قياس التأكسجبالرنين المغنطيسي الإلكتروني (EPR) 8 ، فإن هذا غير ممكن لتحليل RPE. لم يتم وصف الاختلافات بين استقلاب RPE في الجسم الحي وفي المختبر بشكل جيد ، ولكن ثبت أن ثقافات RPE لها نشاط ميتوكوندريا مرتفع ، على غرار RPE في الجسم الحي 3,9 ، مما يشير إلى أنه يمكن الحصول على نظرة ثاقبة مهمة في استقلاب RPE للميتوكوندريا باستخدام ثقافات RPE عالية الدقة.

نظرا لأن جميع عمليات التمثيل الغذائي للميتوكوندريا تؤدي إلى استهلاك الأكسجين ، فإن قياس معدلات استهلاك الأكسجين RPE (OCR) هو وكيل مخلص لعملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا. كان قياس التعرف الضوئي على الحروف في ثقافات RPE أمرا صعبا ، حيث أن الظروف التي تعزز أقصى استقطاب وتمايز RPE غالبا ما تمنع قياسات OCR الدقيقة على المدى الطويل باستخدام التقنيات المتاحة حاليا ، مثل محلل فرس البحر. في ورقة الأساليب هذه ، يتم تقديم جهاز جديد ، يسمى Resipher (يشار إليه فيما يلي باسم "النظام") ، والذي يسمح بالقياس المستمر ل OCR على مدار أسابيع في RPE نمت في ظل ظروف تعزز الاستقطاب والتمايز إلى أقصى حد. إن السهولة التي يمكن بها قياس التعرف الضوئي على الحروف بواسطة هذا النظام في ظروف ثقافة RPE التي تعزز إلى أقصى حد تمايز RPE والاستقطاب فريدة من نوعها بين أجهزة قياس التعرف الضوئي على الحروف الحالية.

تقدم هذه الورقة نصائح وحيل لاستخدام النظام مع ثقافات RPE ، متبوعة بعرض توضيحي لتطبيقين معينين. أولا ، يتم تشغيل RPE EMT ، الذي يحاكي PVR ، من خلال التعرض لتحويل عامل النمو بيتا (TGFβ) 1،10،11،12. يستخدم النظام لمراقبة كيفية تطور استقلاب RPE أثناء عملية EMT. ثانيا ، يتم استكشاف دور نقص الأكسجة في استقلاب RPE باستخدام هذا النظام. نقص الأكسجة هو مساهم مهم في التسبب في AMD ، حيث تضعف المشيمية مع سن13,14. الجمع بين هذا النظام مع غرف نقص الأكسجة يسمح للمرء بنمذجة التمثيل الغذائي للميتوكوندريا RPE المتغير مع نقص الأكسجة الخفي الذي يصاحب الشيخوخة. أخيرا ، يتم تقديم آلة حاسبة عبر الإنترنت باستخدام بيانات Resipher للسماح للشخص بتحديد ما إذا كانت ثقافات RPE في ظروف نقص الأكسجين أو النورموكسيك أو فرط التأكسج. هذه المعلومات ضرورية لاستخلاص أي استنتاجات حول استقلاب RPE من دراسات ثقافة RPE في المختبر.

البروتوكول

للاطلاع على بروتوكولات إنشاء ثقافات بشرية أولية أو iPSC-RPE ، راجع المراجع التالية15،16،17،18. تمت مراجعة اقتناء واستخدام الأنسجة البشرية لهذه البروتوكولات والسماح بها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة ميشيغان (HUM00105486).

1. التطبيق العام للنظام على ثقافة RPE

  1. صفيحة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالإنسان (iPSC) المشتقة من RPE أو خلايا RPE البشرية الأولية في لوحات 96 بئرا متوافقة مع النظام.
    1. بافتراض وجود مزارع ناضجة موجودة بالفعل نمت على ألواح زراعة خلايا 24 بئرا ، اغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مرة واحدة ثم أضف 500 ميكرولتر من 0.25٪ trypsin-EDTA (جدول المواد). احتضان لمدة 10-40 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا ، والتحقق كل 5-10 دقائق حتى يتم تقريب الخلايا وجاهزة تقريبا للانفصال.
    2. قم بتدوير وسائط الماصة برفق فوق الخلايا لفصلها عن بلاستيك زراعة الخلايا ، متبوعا بالنقل إلى حجم 3x من وسائط زراعة الخلايا (1500 ميكرولتر لكل 24 بئرا) ، وتدور لأسفل في جهاز طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: وصفة وسائط زراعة الخلايا RPE مفصلة في الجدول 1 ومتاحة في المراجع المنشورة سابقا9،15،16،17،18.
    3. أعد تعليق الخلايا في وسائط زراعة الخلايا RPE باستخدام مصل بقري جنيني بنسبة 15٪ (FBS) وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
    4. بذر 74000 خلية لكل بئر من صفيحة 96 بئرا (بشكل عام 225-300 × 105 خلايا / سم2) ، بعد الطلاء بركائز طلاء مصفوفة خارج الخلية عالية التخصص (جدول المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: خلايا البذور فقط على لوحة متوافقة مع Resipher (جدول المواد) وفقط في الآبار المقابلة لمصفوفة المسبار على غطاء الاستشعار (الأعمدة 3 و 4 و 9 و 10 للغطاء المكون من 32 قناة ؛ انظر جدول المواد). يتوفر غطاء استشعار النظام مع مستشعرات ذات 4 أو 32 أو 96 قناة (انظر مواقع المستشعر في الشكل 1A-D) ، ومجموعة من لوحات زراعة الخلايا القياسية متوافقة.
    5. نظرا لأن آبار الحافة عرضة للتبخر ، مما يؤثر بشكل كبير على توافر الأكسجين ، وبالتالي ، قراءات OCR ، تجنب خلايا البذر في جميع آبار الحافة (الصفان A و H من لوحة 96 بئرا). علاوة على ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من الماء المعقم في كل من الآبار الفارغة للوحة 96 بئرا لتقليل آثار التبخر.
    6. احتفظ باللوحة على سطح طاولة ثابت لمدة 10 دقائق للسماح للخلايا بالاستقرار ؛ ثم أعده إلى الحاضنة. قم بتغيير الوسائط بعد 24-72 ساعة ، مع استبدال وسائط ثقافة RPE القياسية بنسبة 5٪ FBS. الثقافة لمدة 4 أسابيع على الأقل ، وتغيير الوسائط 2x في الأسبوع.
      ملاحظة: تكون الخلايا جاهزة للتجربة عندما تكون مصطبغة ومرصوفة بالحصى ومضغوطة للغاية (الشكل 1E).
  2. إعداد البيانات والحصول عليها باستخدام النظام
    1. ضع غطاء الاستشعار على لوحة استقبال فارغة ذات 96 بئرا ثم ضعها مرة أخرى في حاضنة زراعة الخلايا. قم بمحاذاة الجهاز وتركيبه على غطاء الاستشعار وقم بتوصيله بلوحة التحكم عبر كبل USB المرفق. هذا يخلق "شطيرة" ريسيفر. (الشكل 2 أ).
    2. انتقل إلى تطبيق موقع مختبر Lucid (https://lab.lucidsci.com/) وانقر فوق الزر تجربة جديدة في الزاوية العلوية اليمنى لإنشاء تجربة جديدة.
    3. قم بتسمية عنوان التجربة وأدخل أي ملاحظات تجريبية ذات صلة للدراسة المعينة (على سبيل المثال ، رقم مرور iPSC-RPE الذي يستخدمه المرء).
    4. خلق ظروف جيدة ومجموعات العلاج. على سبيل المثال ، في حالة اختبار تأثيرات تركيزات المصل المختلفة في الوسائط على OCR ، حدد المصل في اسم المجموعة ، ثم أدخل تركيزات مصل الوسائط المراد استخدامها ، مع إضافة المزيد من قيم النسبة المئوية للمصل بالنقر فوق الزر +. قم بتعيين الآبار التي ستحصل على نسبة مصل معينة وحدد نمط لون لتلك الآبار. أضف المزيد من المجموعات (على سبيل المثال ، متغير تجريبي مختلف للاختبار) حسب الحاجة بالنقر فوق الزر "إضافة مجموعة".
    5. حدد إعداد اللوحة وحدد الجهاز المقابل ونمط اللوحة. انقر فوق زر إضافة لوحة واختر الجهاز ؛ حدد نوع اللوحة. حدد العلاج وانقر على البئر المقابلة.
    6. انقر فوق الزر ابدأ الآن لبدء التجربة. تحقق من أن المؤشر الموجود على موقع الويب ومؤشر LED على لوحة التحكم باللون الأخضر الثابت.
    7. اسمح للنظام بالعمل لمدة 15-60 دقيقة لضمان معايرة كل مستشعر بشكل صحيح واكتشاف الأكسجين الجوي بدقة ، والذي يجب أن يكون بتركيز ~ 200 ميكرومتر في حاضنة زراعة خلايا مرطبة بالكامل مع 5٪ CO2 (الشكل 2Bi).
      ملاحظة: إذا كان أي من المستشعرات أقل من 20٪ من متوسط المستشعرات الأخرى في إعداد حاضنة زراعة الخلايا القياسي ، ففكر في استبعاد ذلك جيدا في تحليل البيانات ، لأن المستشعر معيب (الشكل 2Bii).
      ملاحظة: إذا كانت جميع المستشعرات أكثر من 20٪ من متوسط أجهزة الاستشعار الأخرى ومن الغلاف الجوي المتوقع O2 المبلغ عنه على أنه 200 ميكرومتر في إعداد حاضنة زراعة الخلايا القياسية ، فقد تم استخدام غطاء الاستشعار عدة مرات ؛ استبدله بغطاء استشعار جديد (الشكل 2Biii).
      ملاحظة: يؤدي الحصول على قراءات O2 في الهواء قبل بدء التجربة إلى تحسين استكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل كبير بعد ذلك. إذا ظهر بئر معين كقيمة شاذة بعد إجراء التجربة وكان هذا البئر يحتوي على مستشعر خارج المعايرة ، فقد تكون المشكلة في المستشعر ، وليس النسخ البيولوجي المتماثل.
    8. قم بإزالة الجهاز من غطاء الاستشعار (ولكن لا تفصل كبل USB عن الجهاز). ضع الجهاز رأسا على عقب في الحاضنة للسماح بإعادة ضبط المحرك الموجود على الجهاز. لا تقم بإعادة استخدام الجهاز حتى تتوقف جميع أصوات المحرك (حوالي 20-30 ثانية).
      ملاحظة: من المهم إبقاء الجهاز متصلا بلوحة التحكم عبر كبل USB في جميع الأوقات أثناء التجربة، حتى عندما يكون الجهاز خارج غطاء الاستشعار. يسمح ذلك للجهاز بالمراقبة المستمرة والإبلاغ عن بيئة حاضنة زراعة الخلايا.
    9. ضع اللوحة مع غطاء الاستشعار مرة أخرى في غطاء زراعة الخلية ، جنبا إلى جنب مع لوحة 96 بئرا تحتوي على مزارع RPE. قم بتغيير الوسائط في اللوحة باستخدام ثقافات RPE بنفس الوسائط ونفس الحجم لجميع الآبار للحصول على قيم OCR الأساسية لكل بئر. تأكد من ملء جميع الآبار بدون RPE بالماء المعقم للمساعدة في منع التبخر.
      ملاحظة: بشكل عام، نوصي باستخدام 60-100 ميكرولتر من وسائط زراعة RPE لكل 96 بئرا، استنادا إلى البيانات التي توضح أن انخفاض أحجام الوسائط يؤدي إلى استنفاد سريع للمغذيات ولكن أحجام الوسائط الأعلى تؤدي إلى نقص الأكسجة غير المقصود9.
    10. انقل غطاء الاستشعار إلى اللوحة التي تحتوي على مزارع الخلايا والغطاء القياسي (غير Resipher) على اللوحة التي تحتوي على مزارع الخلايا إلى لوحة الاستقبال الفارغة المكونة من 96 بئرا للحفاظ على عقم الغطاء القياسي ، والذي سيكون مطلوبا في نقاط مختلفة أثناء التجريب.
    11. ضع اللوحة مع مزارع الخلايا وغطاء الاستشعار مرة أخرى في حاضنة زراعة الخلايا. مرة أخرى ، قم بمحاذاة الجهاز وتركيبه على غطاء الاستشعار وقم بتوصيله بلوحة التحكم عبر كبل USB المرفق (تجميع "الساندويتش"). تحقق من أن المؤشرات الموجودة على واجهة موقع الويب والمركز كلها خضراء خالصة.
      ملاحظة: ستظهر بيانات تركيز O2 على الفور ، بينما لن تظهر بيانات OCR إلا بعد جمع بيانات O2 كافية ، حوالي 1 ساعة.
    12. دع الجهاز يقيس OCR على كل بئر لمدة 12-24 ساعة على الأقل لالتقاط OCR أساسي.
      ملاحظة: سيختلف التعرف الضوئي على الحروف الأساسي وفقا للعديد من العوامل، بما في ذلك نوع الوسائط التي يتم تطبيقها على الخلايا. في الشكل 2C ، تحتوي وسائط ثقافة RPE القياسية بكميات مختلفة من FBS (0٪ ، 5٪ ، 15٪) على قيم OCR مختلفة قليلا. علاوة على ذلك ، يمكن للمزارع التي تحتوي على المزيد من FBS الحفاظ على نشاط الميتوكوندريا لفترة أطول بعد تطبيق الوسائط على الخلايا قبل انخفاض OCR بسبب استنفاد مستقلبات الميتوكوندريا (الجانب الأيمن من المنحنى).
    13. بمجرد الحصول على OCR الأساسي ، كرر الخطوات 1.2.8-1.2.12 ، ولكن قم بتغيير الوسائط الموجودة على اللوحة باستخدام ثقافات RPE إلى الظروف التجريبية للفرد (عادة ، ± دواء أو مقارنة بين ظروف الوسائط المختلفة).
      ملاحظة: يمكن أيضا التعامل مع التغييرات الروتينية للوسائط بنفس الطريقة. في أي وقت يتم فيه فتح حاضنة زراعة الخلايا ، توقع اضطرابا كبيرا في قراءات التعرف الضوئي على الحروف ، لأنها تعتمد على درجة الحرارة والرطوبة وتركيزات CO2 وعوامل أخرى تتعطل جميعها مؤقتا مع فتح باب الحاضنة. أثناء أي إزالة للجهاز من غطاء الاستشعار ، ليست هناك حاجة لإيقاف التجربة مؤقتا عبر الإنترنت. بعد فتح باب حاضنة زراعة الخلايا أو تغيير الوسائط على اللوحة التي يتم فحصها ، سيستغرق الأمر عموما 2-4 ساعات لإعادة إنشاء تدرج الأكسجين والبدء في قياس OCR دقيق.
    14. بعد الحصول على البيانات ، اطرح خط الأساس OCR لكل بئر من OCR بعد تطبيق الحالة التجريبية ، لتحديد Delta OCR الناجم عن العلاج.
    15. بعد اكتمال التجربة ، قم بتعقيم وإعادة استخدام غطاء الاستشعار (والذي يمكن إعادة استخدامه 3-5x ، على الرغم من أن الأداء يتدهور مع الاستخدام المتكرر). لتعقيم غطاء الاستشعار ، اغمر الغطاء بالكامل في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق في غطاء زراعة الخلايا ، ثم أخرجه من الغمر واستريح في جانب مسبار الخزانة لأعلى (تجنب لمس أطراف المسبار الحساسة) ، واترك الإيثانول والماء يتبخران تماما قبل وضع غطاء الاستشعار على لوحة استقبال جديدة ذات 96 بئرا.
  3. التقط صور برايتفيلد لتطبيع قيم OCR إلى رقم الخلية.
    ملاحظة: يسهل تراكم الميلانين في RPE تطبيع التعرف الضوئي على الحروف بناء على عدد بسيط من أعداد الخلايا في المزارع الحية باستخدام مجهر برايت فيلد.
    1. قم بإزالة الجهاز ووضعه رأسا على عقب ، كما في الخطوة 1.2.8. في غطاء زراعة الخلايا ، قم بتبديل غطاء الاستشعار الموجود على لوحة زراعة RPE بغطاء قياسي من 96 بئرا.
    2. باستخدام مجهر مقلوب قياسي ، التقط صورا برايت فيلد لكل بئر.
      ملاحظة: حافظ على تناسق صور المنطقة بين الآبار (الموقع النسبي في البئر والتكبير الموضوعي).
    3. في غطاء زراعة الخلايا ، استبدل الغطاء القياسي المكون من 96 بئرا على لوحة زراعة RPE بغطاء الاستشعار وضعه مرة أخرى في الحاضنة لمزيد من المراقبة.
    4. احسب رقم الخلية في كل بئر باستخدام ImageJ أو برامج أخرى.
    5. تطبيع OCR إلى رقم الخلية في المجموعات التجريبية المختلفة. يبلغ النظام عن التعرف الضوئي على الحروف بوحدات fmol∙ (mm2) -1∙s-1- الاستهلاك لكل وحدة وحدة مقطع عرضي. لذلك ، لتطبيع OCR لكل خلية ، قسم OCR على عدد الخلايا لكل مم2 (بدلا من عدد الخلايا لكل بئر). وبالمثل ، اضرب OCR الذي أبلغ عنه النظام في مساحة المقطع العرضي للبئر (حوالي 31 مم2 للوحة 96 بئرا قياسية) لإنتاج OCR بوحدات fmol∙s-1∙well-1.
  4. ضوابط لتحديد معلمات الطاقة الحيوية RPE.
    ملاحظة: للتأكد من أن النظام وثقافات RPE تستجيب للتلاعب بالميتوكوندريا بطرق يمكن التنبؤ بها ، يمكن للمرء اختبار بعض الجزيئات الصغيرة الراسخة لاستهداف خطوات معينة من الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا. هذه الاختبارات مماثلة للخطوات التي يتم إجراؤها في اختبار إجهاد الميتوكوندريا باستخدام محلل فرس البحر10 وتوفر ملف تعريف للطاقة الحيوية لثقافات RPE.
    1. خلايا RPE الثقافية في 65 ميكرولتر من وسائط ثقافة RPE القياسية مع 5٪ FBS وقياس OCR لمدة 24 ساعة لإنشاء خط أساس.
    2. نضح الوسائط المستزرعة وأضف 65 ميكرولتر من وسائط زراعة RPE القياسية مع 5٪ FBS ومع مفككات الميتوكوندريا (3 ميكرومتر كربونيل السيانيد-p-ثلاثي فلورو روميثوكسي فينيل هيدرازون [FCCP] أو 500 نانومتر Bam15 ، جدول المواد). احتضان بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: يجب أن تزيد أجهزة فك التوصيل الميتوكوندريا بشكل كبير من التعرف الضوئي على الحروف. تأكد من أن OCR المتزايد ليس عند أو بالقرب من الحد الأقصى النظري للانتشار محدود OCR البالغ حوالي 275 fmol∙ (mm2) -1∙s-1 ل 65 ميكرولتر من الوسائط في ظروف الاستزراع القياسية. يتوفر الحد الأقصى OCR لوحدات تخزين الوسائط المختلفة شائعة الاستخدام في قسم المناقشة.
    3. بعد الحضانة الليلية ، قم بشفط الوسائط باستخدام أجهزة فك اقتران الميتوكوندريا واستبدلها ب 65 ميكرولتر من وسائط زراعة RPE القياسية بنسبة 5٪ FBS. راقب اللوحة لمدة 24 ساعة أخرى لتحديد استرداد RPE OCR بعد إزالة الأدوية.
    4. احسب تأثيرات أجهزة فك التوصيل على OCR عن طريق طرح OCR الذي تم الحصول عليه بعد العلاج من OCR الذي تم الحصول عليه قبل العلاج (الشكل 3).
      ملاحظة: تشير الزيادة في التعرف الضوئي على الحروف مع إضافة أجهزة فك ارتباط الميتوكوندريا إلى القدرة التنفسية الاحتياطية للميتوكوندريا للخلية19.
    5. لقياس معلمات الميتوكوندريا الأخرى التي يتم التقاطها عادة أثناء اختبار إجهاد الميتوكوندريا باستخدام محلل فرس البحر ، قم بتنفيذ نفس الخطوات المذكورة أعلاه باستخدام المركبات التالية (الشكل 4).
      1. استخدم أوليغومايسين عند 1 ميكرومتر لتقييم التنفس المرتبط بالأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP).
      2. استخدم مضاد الميسين A والروتينون عند 1 ميكرومتر لتقييم أي تنفس غير ميتوكوندريا.
        ملاحظة: FCCP ، oligomycin ، antimycin A ، والروتينون يمكن أن تكون سامة ل RPE. إذا تسببت في موت الخلايا بشكل كبير ، فلن تكون قياسات التعرف الضوئي على الحروف دقيقة. وبالتالي ، يجب الحصول على قياسات التعرف الضوئي على الحروف فقط في نقطة زمنية لا يوجد فيها موت واضح للخلايا ، بشكل عام خلال الساعات العديدة الأولى بعد إضافة الأدوية (الشكل 4).

2. قياس التغيرات في استقلاب الميتوكوندريا في RPE يخضع ل EMT

  1. اتبع نفس البروتوكول كما هو موضح في القسم 1.2.
  2. للحث على EMT بعد الحصول على قياسات OCR الأساسية ، أضف TGF-β2 (10 نانوغرام / مل) إلى ثقافات RPE وراقب OCR على مدار 3 أسابيع. قم بتحديث الوسائط باستخدام TGFβ2 جديد كل 2-3 أيام (الشكل 5).
  3. على الأقل 2x في الأسبوع ، احصل على صور برايتفيلد كما في القسم 1.3 للتأكد من أن عدد الخلايا لا يتغير. إذا تغير العدد ، فقم بتطبيع قيم OCR إلى رقم الخلية في كل بئر.
    ملاحظة: يمكن استخدام نفس البروتوكول لمحفزات أخرى من EMT لمراقبة تغيرات التعرف الضوئي على الحروف على المدى الطويل طوال فترة المزرعة أثناء وجود الخلايا في الحاضنة.

3. قياس التغيرات في استقلاب الميتوكوندريا في RPE نقص الأكسجين

ملاحظة: تطبيق النظام في ظل ظروف نقص الأكسجين أو المعيارية أو فرط التأكسج هو نفسه القسم 1.2 ، باستثناء الاحتفاظ ب "الساندويتش" في غرفة نقص الأكسجة (جدول المواد) الموضوعة في حاضنة زراعة الخلايا القياسية.

  1. احفر ثقبا على غطاء غرفة نقص الأكسجة لتركيب كابل USB من النوع c وختمه بالسيليكون أو المعجون (الشكل 6 أ).
  2. قم بتجميع غطاء الاستشعار مع لوحة زراعة الخلايا في الغطاء ونقلها إلى غرفة نقص الأكسجة.
  3. قم بإعداد "الساندويتش" (اللوحة ، غطاء الاستشعار ، الجهاز) في غرفة نقص الأكسجة. ضع أيضا في غرفة نقص الأكسجة طبق بتري بالماء المعقم للمساعدة في الحفاظ على الرطوبة. أخيرا ، ضع مستشعر O2 محمول في غرفة نقص الأكسجة (جدول المواد). يتم عرض الإعداد في الشكل 6A.
  4. أغلق الحجرة وقم بتوصيلها بأسطوانة غاز بتركيز نقص الأكسجين من O2 وتركيز زراعة الخلايا القياسي لثاني أكسيدالكربون (على سبيل المثال ، 1٪ O2 و 5٪ CO2).
  5. استبدل الهواء ببطء في غرفة نقص الأكسجةمع هواء CO 2 بنسبة 1٪ O2/5٪ في الأسطوانة حتى يظهر مستشعر الأكسجين تركيز O2 المطلوب ، عادة في مكان ما بين 1٪ و 10٪.
    ملاحظة: يتطلب مستشعر O2 المحمول وقتا للتوازن ، لذلك يجب إضافة الغاز من الأسطوانة إلى غرفة نقص الأكسجة ببطء.
  6. أغلق صمامات مدخل ومخرج غرفة نقص الأكسجة وانقل الغرفة بأكملها إلى الحاضنة.
  7. قم بإعداد التجربة وبدء تشغيلها كما في القسم 1.2.
    ملاحظة: يمكن أن تؤدي وسائط التوازن المسبق في غرفة نقص الأكسجة قبل إضافتها إلى الخلايا إلى تقليل الوقت الذي تستغرقه الطبقة الأحادية للخلية لتجربة نقص الأكسجة الحقيقي (الشكل 6 ب).

4. حساب تركيز O2 في طبقة RPE الأحادية لتحديد ما إذا كانت الخلايا في ظروف نقص الأكسجين أو النورموكسيك أو فرط التأكسج

ملاحظة: يقيس النظام تركيز O2 بين حوالي 1 إلى 1.5 مم فوق قاع البئر افتراضيا بافتراض استخدام لوحة قياسية مع غطاء الاستشعار الموصى به المقابل للزراعة أحادية الطبقة (راجع https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf). في حين أن تركيز O2 في الطبقة الأحادية للخلية لا يتم قياسه مباشرة ، يمكن استخدام البيانات من النظام لتقدير تركيز O2 على مستوى RPE. على وجه التحديد ، مع العلم بوجود تدرج أكسجين بين الجزء العلوي من عمود الوسائط ، حيث يتوفر O2 ، وأسفل عمود الوسائط ، حيث يتم استهلاك O2 ، يمكن دمج قوانين انتشار Fick مع معدل OCR المقاس لاستقراء مستويات O2 في الطبقة الأحادية للخلية. يتم توفير آلة حاسبة لهذا التقدير عبر الإنترنت: https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (وفي شكل دفتر ملاحظات تفاعلي مفتوح المصدر في https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture ، يمكن العثور على الكود المصدري لهذه الآلة الحاسبة في https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator).

  1. بمجرد الوصول إلى الآلة الحاسبة ، أدخل حجم الوسائط بالميكرولتر (على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر).
  2. أدخل تركيز الأكسجين المشبع في واجهة الهواء السائل (الجزء العلوي من عمود الوسائط أعلى الخلايا). هذه القيمة هي ~ 185 ميكرومتر عند الضغط الجوي القياسي مع رطوبة 5٪ O2 و 95٪.
    ملاحظة: يمكن أيضا تحديد ذلك من قياسات O2 بواسطة مجسات النظام في آبار الوسائط فقط (مع عدم وجود خلايا في قاع البئر).
  3. في إدخال Flux ، أدخل Flux / OCR الذي أبلغ عنه النظام.
  4. بناء على هذه القيم ، يتم حساب تركيز الأكسجين في الحالة المستقرة عند كل ارتفاع في عمود الوسائط ويظهر في الرسم (الشكل 7). المحور السيني للمؤامرة هو الارتفاع بالملليمتر فوق قاع البئر. المحور ص هو تركيز O2 المحسوب عند هذا الارتفاع (بالميكرومتر).
  5. يتم الإبلاغ عن تركيز O2 في قاع البئر (حيث توجد الخلايا) في السطر الموجود أسفل قطعة الأرض.
    ملاحظة: بشكل عام ، تشير التقديرات إلى أن RPE في الجسم الحي يرى تركيز O2 بنسبة 4-9٪. كل 10 ميكرومتر من O2 في الظروف الجوية القياسية يتوافق مع حوالي 1٪ O2. وبالتالي ، فإن normoxia على مستوى الخلايا حوالي 40-90 ميكرومتر من O2. كلما ارتفع عمود الوسائط ، انخفض O2 عند مستوى الطبقة الأحاديةRPE 9. وبالتالي ، إذا بدت الخلايا في ظروف نقص الأكسجين ، فيمكن تقليل حجم الوسائط. إذا بدت الخلايا في ظروف فرط التأكسج ، فيمكن زيادة حجم الوسائط.

النتائج

يوضح الشكل 2 أ إعداد "الساندويتش" لتجربة Resipher. توجد أغطية استشعار مع 32 مجسا تقابل الأعمدة 3 و 4 و 9 و 10 على لوحة 96 بئرا بين لوحة الخلية والجهاز. بعد الاتصال بلوحة التحكم ، يقوم الجهاز بتنشيط المحركات لتحريك غطاء الاستشعار لأعلى ولأسفل ، وقياس تركيز O2 في عمود الوسائط على نطاق من الارتفاعات فوق الطبقة الأحادية للخلية (عادة 1-1.5 مم). لذلك يتم قياس تدرج O2 باستمرار عن طريق تسجيل تركيزات O2 عند هذه الارتفاعات المختلفة فوق الطبقة الأحادية. من قياسات التدرج وتطبيق قوانين انتشار Fick ، يقوم الجهاز تلقائيا بحساب تدفق الأكسجين من أعلى نطاق ارتفاع المسبار إلى أسفله ، وهو معدل استهلاك الأكسجين (OCR) للخلية أحادية الطبقة. يكتشف غطاء الاستشعار O2 بغض النظر عما إذا كان البئر فارغا (الهواء فقط) ، مملوءا بالوسائط ولكن بدون خلايا (الوسائط فقط) ، أو يحتوي على وسائط تغطي طبقة أحادية الخلية (وسائط + خلايا). كفحص جودة لمدى جودة عمل المستشعرات الموجودة في غطاء الاستشعار ، يمكن أولا وضع الغطاء فوق لوحة فارغة (الهواء فقط) ذات 96 بئرا. إذا كان كل مستشعر لكل بئر يعمل ، فيجب أن يكون O2 المبلغ عنه متسقا مع بعضها البعض وقريبا من 200 ميكرومتر ، وهو قريب من O2 المتوقع في الغلاف الجوي في ظل ظروف حاضنة زراعة الخلايا القياسية. يوضح الشكل 2Bi قراءات O2 من ثمانية مجسات في الهواء الجوي (تم الإبلاغ عنها على أنها التركيز بالميكرومتر لأن تحويل الوحدة الافتراضي يفترض أن المجسات في سائل 37 درجة مئوية). هذه القراءات ضيقة (±5٪) وقريبة من 200 ميكرومتر ، مما يعني أن جميع أجهزة الاستشعار الثمانية تعمل بشكل جيد. في الشكل 2Bii ، يتم استخدام نفس غطاء الاستشعار كما في الشكل 2Bi ، ولكن يتم نشر جهاز مختلف. هنا ، يتم التقاط مستشعرين معيبين للجهاز بناء على منحنيات متطرفة (باللون الأحمر). يشير هذا إلى أن الجهاز يمثل مشكلة ويجب استبداله (أو يجب ترك الآبار المقابلة لأجهزة الاستشعار المعيبة خارج التجربة). في الشكل 2Biii ، يتم استخدام نفس الجهاز مثل الشكل 2Bi ، ولكن يتم استخدام غطاءين مختلفين للاستشعار. يتميز Lid1 (الجانب الأيسر) بتباين كبير بين المجسات ، مما يشير إلى أن مادة استشعار الغطاء متدهورة ، عادة بسبب استخدام الغطاء عدة مرات. Lid2 (الجانب الأيمن) جديد ، حيث يوضح قراءات ضيقة ومتجمعة حول 200 ميكرومتر. باستخدام النظام ، يمكن للمرء تحليل تأثير مكملات المصل في الوسائط على استقلاب الميتوكوندريا RPE. كما هو موضح في الشكل 2 ج ، أدت زيادة مستويات مكملات المصل إلى ارتفاع مستويات RPE OCR بمهارة. الأهم من ذلك ، أن مكملات المصل العالية سمحت أيضا بالحفاظ على استقلاب الميتوكوندريا لفترة أطول. حتى بدون أي مكملات مصل ، يتم الحفاظ على OCR لمدة 90 ساعة تقريبا قبل أن يؤدي استنفاد ركائز التمثيل الغذائي للميتوكوندريا إلى انخفاض في التعرف الضوئي على الحروف. وبالتالي ، فإن تغييرات الوسائط مع 100 ميكرولتر لكل 96 بئرا كل 3.5 أيام (مرتين في الأسبوع) كافية ، حتى مع الوسائط الخالية من المصل ، لتجنب استنفاد المغذيات في ثقافات RPE الناضجة والمتباينة للغاية والمستقطبة.

يمكن أن تختلف معدلات التعرف الضوئي على الحروف بشكل كبير من بئر إلى آخر ، حتى في الثقافات التي يبدو فيها أن جميع الآبار لها نفس رقم الخلية والتشكل. وبالتالي ، لعزل ما إذا كانت الزيادات في التعرف الضوئي على الحروف تعزى إلى حالة تجريبية أو مجرد اختلافات خط الأساس في التعرف الضوئي على الحروف بين الآبار ، فإن التطبيع ضروري. تتمثل الخطوة الأولى في التطبيع في ضمان اتساق عدد الخلايا بين الآبار ، كما هو موضح في قسم البروتوكول 1.3. إذا كان عدد الخلايا يختلف بين الآبار ، فيجب تطبيع OCR للبئر إلى رقم الخلية. بشكل عام ، بالنسبة لثقافات RPE الناضجة للغاية والمستقطبة ، يكون عدد الخلايا بين الآبار ثابتا بشكل ملحوظ9. حتى في مثل هذه السيناريوهات ، يمكن أن يختلف خط الأساس OCR بين الآبار ، كما هو موضح في الشكل 3A. هنا ، يختلف OCR الأساسي ، قبل أي معالجة ، بمقدار 100 fmol / mm2 / sec بين الآبار. من خلال قياس التعرف الضوئي على الحروف قبل المعالجة ، يمكن للمرء بعد ذلك تحديد Delta OCR الناجم عن المعالجة التجريبية وعزل ذلك عن أي اختلافات في OCR الأساسي بين الآبار. في هذه الحالة ، تقارن العلاجات اثنين من أجهزة فك ارتباط الميتوكوندريا (FCCP مقابل BAM15) مع التحكم في السيارة. بمجرد استخدام OCR الأساسي للتطبيع ، تصبح تأثيرات العلاج الخاصة بأجهزة فك التوصيل مقابل التحكم واضحة (قارن الشكل 3B مقابل الشكل 3C). بشكل عام ، يجب تقسيم التجارب التي يمكن أن تغير التعرف الضوئي على الحروف إلى مرحلتين على الأقل: التعرف الضوئي على الحروف الأولي لإنشاء OCR أساسي ومرحلة العلاج لتحديد Delta OCR.

للتأكد من أن ثقافات RPE تستجيب بالطرق المتوقعة للتلاعب بالميتوكوندريا وإنشاء ملف تعريف للطاقة الحيوية ل RPE ، يمكن استخدام أدوات الجزيئات الصغيرة الكلاسيكية المستخدمة في اختبار إجهاد الميتوكوندريا على محلل فرس البحر من Agilent مع النظام. أولا ، يمكن قياس سعة الميتوكوندريا الاحتياطية باستخدام جهاز فك اقتران الميتوكوندريا19. في مزارع RPE ، يظهر جهاز فك اقتران الميتوكوندريا BAM15 زيادة أكثر قوة واستدامة في التعرف الضوئي على الحروف مقارنة ب FCCP (الشكل 3C ، D) ، دون إحداث سمية. يمكن حساب المعلمات الأخرى المتوفرة في اختبار إجهاد الميتوكوندريا لمحلل فرس البحر ، بما في ذلك التنفس القاعدي ، والتنفس المرتبط ب ATP ، وتسرب البروتون ، والقدرة التنفسية غير الميتوكوندريا ، باستخدام النظام. في حين أن محلل فرس البحر يعتمد على منافذ الحقن لتوصيل السموم بالتتابع التي تمنع مجمعات الفسفرة التأكسدية المحددة لاستنتاج المعلمات المذكورة أعلاه ، فإن Resipher لا تملك هذه القدرة. ومع ذلك ، يمكن إضافة كل سم ميتوكوندريا إلى آبار منفصلة ، ويمكن حساب معلمات تنفسية مختلفة بناء على تغيير الطي على الآبار المعالجة بالمركبة. في الشكل 4 أ ، تتم مقارنة الاختلافات في التعرف الضوئي على الحروف بين الآبار المعالجة بوحدة فك ربط الميتوكوندريا BAM15 ، ومثبط سينثيز ATP oligomycin ، ومثبطات المركب I و III antimycin / rotenone ، والتحكم في السيارة (DMSO). نظرا لأن هذه السموم يمكن أن تحفز موت الخلايا على مدى فترات زمنية أطول وسيؤثر موت الخلايا على التعرف الضوئي على الحروف ، فقد تم أخذ قراءات OCR بعد بضع ساعات فقط من العلاج. يوضح الشكل 4B الاختلافات في التعرف الضوئي على الحروف بين السيارة والآبار المعالجة بكل جزيء صغير نشط في الميتوكوندريا في شكل رسم بياني شريطي ، تم استقرائه من النقاط الزمنية الأخيرة في الشكل 4A. يمكن بعد ذلك استخدام قيم التعرف الضوئي على الحروف في الشكل 4B لحساب معلمات الطاقة الحيوية لثقافة RPE ، كما هو موضح في الشكل 4C. تأتي كل قيمة مرمزة بالألوان في ملف تعريف الطاقة الحيوية في الشكل 4C من نفس القيمة المرمزة بالألوان في الشكل 4B. وبالتالي ، يمكن تقدير معلمات مثل التنفس المرتبط ب ATP ، وتسرب البروتون ، والقدرة التنفسية القصوى للميتوكوندريا ، والقدرة التنفسية غير الميتوكوندريا باستخدام نظام التعرف الضوئي على الحروف. يوضح الشكل 4 د ملخصا لطريقة عمل كل جزيء صغير نشط في الميتوكوندريا.

بعد إظهار بروتوكول هذا النظام على ثقافات RPE وتجارب التحكم لفحص ملامح الطاقة الحيوية RPE ، يمكن للمرء استكشاف التطبيقات التجريبية للنظام على بيولوجيا RPE وعلم الأمراض. في اعتلال الشبكية الزجاجي التكاثري (PVR) ، وهي حالة تحدث بعد انفصال الشبكية أو صدمة العين ، يخضع RPE لتحول دراماتيكي يعرف باسم الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة (EMT) حيث يفقد RPE المنتظم للغاية والحصوي التصاقات الخلايا الخلوية ويتمايز إلى خلايا متوسطة على شكل مغزل تكون مقلصة ومتحركة 1,2. يؤدي هذا إلى قوى انقباض عرضية على الشبكية يمكن أن تحفز انفصال الشبكية. تشمل المحرضات الكلاسيكية ل EMT في RPE تحويل عامل النمو بيتا (TGFβ) وعامل نخر الورم ألفا (TNFα) 10،11،12. من بين الأشكال المتماثلة الثلاثة للثدييات TGFβ ، يعد TGFβ2 أبرز وأقوى محفز ل EMT في شبكية العين1 ، مما يتسبب في استطالة خلوية مميزة لخلايا RPE سداسية مميزة وزيادة التعبير عن علامات اللحمة المتوسطة. تترافق استجابة EMT التي يسببها TGFβ2 في RPE مع قمع تنفس الميتوكوندريا وزيادة لاحقة في قدرة تحلل السكر ، كما هو موضح سابقا باستخدام فرس البحر XFe9610. بينما يوفر فرس البحر ملفات تعريف الطاقة الحيوية في الوقت الفعلي ، إلا أنه لا يسمح بمراقبة التعرف الضوئي على الحروف على المدى الطويل. وهكذا ، في التطبيق الأول لنظام التعرف الضوئي على الحروف في هذه الدراسة (الشكل 5) ، تم تتبع تنفس الميتوكوندريا على مدى ثلاثة أسابيع حيث تم تحفيز EMT باستخدام TGFβ2 في RPE ، مما يسمح بالنمذجة المختبرية لإعادة البرمجة الأيضية التي تحدث أثناء PVR. على عكس تحليل النقطة الزمنية الفردية ل RPE EMT باستخدام محلل فرس البحر ، يمكن تتبع الحالة الأيضية ل RPE التي تخضع ل EMT لعدة أسابيع. من الواضح أن التعرض المتكرر ل RPE ل TGFβ2 يسبب انخفاضا تدريجيا مستمرا في استقلاب الميتوكوندريا. أشارت البيانات السابقة باستخدام محلل فرس البحر XF إلى أن TGFβ2 قلل بشكل كبير من قدرة التنفس القصوى عند 24 ساعة و 72 ساعة ولكنه لم يؤثر على مستويات OCR القاعدية10. تم تأكيد OCR القاعدي غير المتغير مع TGFβ2 حتى 72 ساعة بواسطة نظام OCR المستخدم في هذه الدراسة (الشكل 5). ومع ذلك ، تكشف البيانات طويلة المدى من نظام التعرف الضوئي على الحروف في هذه الدراسة أنه بعد 5 أيام من التعرض ل TGFβ2 ، تبدأ مستويات التعرف الضوئي على الحروف القاعدية في الانخفاض ، مع انخفاض في التعرف الضوئي على الحروف القاعدي يصبح أكثر وضوحا في 20 يوما. تسلط هذه النتائج الضوء على التغييرات طويلة المدى في التعرف الضوئي على الحروف القاعدية التي لم يتم التقاطها بنقاط زمنية سابقة لفرس البحر.

في التطبيق الثاني ، يمكن استخدام النظام لمراقبة استقلاب الميتوكوندريا RPE في ظل ظروف نقص الأكسجين. نظرا لأن AMD مرتبط بترقق المشيمية ونقص الأكسجة13,20 ، فإن فهم تعديلات RPE على نقص الأكسجة تحت السمية يجب أن يوفر نظرة ثاقبة على التسبب في AMD. لإخضاع ثقافات RPE لنقص الأكسجة الخاضع للرقابة أثناء مراقبة استقلاب الميتوكوندريا ، يمكن وضع النظام في غرفة نقص الأكسجة التي بدورها توضع في حاضنة زراعة الخلايا. لتسهيل هذا الإعداد ، يتم حفر ثقب صغير في غطاء غرفة نقص الأكسجة ، مما يسمح لكابل USB الخاص بالنظام بالوصول إلى داخل غرفة نقص الأكسجة. الفتحة مختومة بالمعجون أو السيليكون (الشكل 6 أ). يمكن وضع مستشعر O2 محمول في غرفة نقص الأكسجة لمراقبة مستويات O2 في الغلاف الجوي وضمان بقاء ختم غرفة نقص الأكسجة سليما. باستخدام هذا الإعداد ، يمكن تحديد معدل التوازن بين تركيز O2 في الغلاف الجوي وتركيز الوسائط O2. في الشكل 6B ، يتم وضع الوسائط المتوازنة مع الغلاف الجوي O2 في آبار فردية على صفيحة 96 بئرا ، بدون أي خلايا ، ويتم إدخالها في غرفة نقص الأكسجة التي تحتوي على 5٪ O2 فقط (~ 50 μM O2). بمرور الوقت ، تتوازن الوسائط في كل بئر مع تركيز الغلاف الجوي الجديد. كلما زاد ارتفاع عمود الوسائط (حجم أكبر) ، كلما استغرق التوازن وقتا أطول. مع وجود 65 ميكرولتر من الوسائط في بئر صفيحة 96 بئرا ، يستغرق التوازن مع الغلاف الجوي O2 حوالي 5 ساعات. ومع ذلك ، يستغرق وقت التوازن أكثر من 10 ساعات عندما يكون حجم الوسائط 100-200 ميكرولتر. تؤكد هذه النتائج على أهمية التوازن المسبق للوسائط مع تركيز O2 المطلوب في الغلاف الجوي قبل تطبيق الوسائط على الخلايا أثناء تجربة نقص الأكسجة.

بالنسبة لتجارب نقص الأكسجة ، من المهم التأكد من أن مستويات O2 في غرفة نقص الأكسجة تظل مستقرة. إن الحفاظ على أحد آبار الحافة على لوحة 96 بئرا خاليا من الخلايا أو الوسائط سيسمح لأحد مستشعرات غطاء الاستشعار بمراقبة الغلاف الجوي O2 باستمرار. في الشكل 6C ، توضح هذه المراقبة مع بئر واحد معرض للهواء أن غرفة نقص الأكسجة بها تسرب بطيء ، بحيث تكون الخلايا قريبة من تركيزات O2 في الغلاف الجوي بحلول 30 ساعة. كعنصر تحكم نهائي لتجارب نقص الأكسجة ، من المهم تحديد ما إذا كانت قابلية الذوبان O2 تختلف بين الوسائط "الطازجة" و "المشروطة". إذا اختلفت الذوبان بين الوسائط الموضوعة في البداية على الخلايا والوسائط التي كانت موجودة على الخلايا لفترة طويلة من الوقت ، فإن تدرج O2 في عمود الوسائط أعلى الخلايا سيختلف ك "ظروف" وسائط مع مرور الوقت على الخلايا. وهذا بدوره يؤثر على حساب التعرف الضوئي على الحروف. في الشكل 6D ، تم وضع صفيحة 96 بئرا مع آبار فارغة ("الهواء") ، وآبار بدون خلايا ولكن مع وسائط جديدة ("وسائط جديدة") ، وآبار بدون خلايا ولكن مع وسائط تم تحضينها سابقا على ثقافات RPE لمدة 48 ساعة ("وسائط مكيفة") تم وضعها لأول مرة في الغلاف الجوي O2 للسماح بالتوازن الكامل. ثم تم وضع اللوحة في غرفة نقص الأكسجة عند حوالي 3-4٪ O2 (30-40 μM) وسمح لها بالتوازن. أخيرا ، أعيدت اللوحة مرة أخرى إلى تركيزات O2 في الغلاف الجوي. منحنيات تركيز O2 للوسائط الجديدة والوسائط المشروطة متطابقة ، مما يدل على أن قابلية ذوبان O2 بين الوسائط الجديدة والمشروطة متطابقة ، مما يؤكد أن التغييرات في تكوين الوسائط بمرور الوقت حيث يتم استهلاك العناصر الغذائية وإفراز المنتجات الثانوية في الوسائط لا تغير بشكل هادف قابلية ذوبان O2 وبالتالي لا تؤثر عن غير قصد على التعرف الضوئي على الحروف.

نظرا لأن ارتفاع عمود الوسائط فوق الخلايا يؤثر بشكل كبير على توفر O2 في الطبقة الأحاديةRPE 9 ، فمن المهم تحديد ما إذا كان حجم وسائط معين يسبب نقص الأكسجة أو normoxia أو فرط التأكسج في طبقة RPE الأحادية. باستخدام القياسات من النظام ، جنبا إلى جنب مع آلة حاسبة عبر الإنترنت (https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion (وفي شكل دفتر ملاحظات تفاعلي مفتوح المصدر في https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture) - الكود المصدري لهذه الآلة الحاسبة عند https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator) ، يمكن تقدير تركيز الأكسجين في طبقة RPE الأحادية. يوضح الشكل 7 لقطة شاشة للآلة الحاسبة التفاعلية. RPE في الجسم الحي عادة ما يرى تركيز O2 من 4-9 ٪ ، مما يترجم إلى تركيز O2 المولي من ~ 40-90 μM.

figure-results-1
الشكل 1: موقع المستشعرات على أغطية استشعار مختلفة ، وتخطيط اللوحة لغطاء الاستشعار المكون من 32 قناة ، ومورفولوجيا RPE. الآبار التي تتوافق مع موقع المستشعرات في أغطية الاستشعار المختلفة لخيارات الغطاء (A) 4 قنوات و (B) 32 قناة و (C) 96 قناة. ( د) تخطيط اللوحة الموصى به لغطاء المستشعر المكون من 32 قناة. بسبب تأثيرات الحافة ، لا ينبغي زرع الخلايا في آبار الحافة وبدلا من ذلك ، يجب وضع الوسائط في هذه الآبار الأربعة (أرجواني). يتم زرع الخلايا في آبار برتقالية. يجب ملء الآبار المتبقية بالماء المعقم (الأزرق) لمنع آثار التبخر. (ه) زراعة RPE الناضجة بخلايا سداسية ومعبأة بإحكام ومصطبغة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: RPE = ظهارة صبغة الشبكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: إعداد "شطيرة" نظام Resipher ومراقبة الجودة. (أ) يحل غطاء الاستشعار محل غطاء لوحة قياسي مكون من 96 بئرا ويتم إدخال مجساته في الآبار المقابلة. يستقر الجهاز باللون الأسود بإحكام على غطاء الاستشعار عبر المغناطيس. تظهر الصور الموجودة على الجانب الأيسر من الشكل الجهاز وغطاء الاستشعار في اتجاههما الصحيح. ومع ذلك ، بالنسبة للصور الموجودة على الجانب الأيمن ، تم تدوير الجهاز وغطاء الاستشعار على جانبيهما لعرض ملف التعريف السفلي بشكل أفضل. (ب) مراقبة الجودة لأغطية الاستشعار والجهاز. (الأول، الثاني) يتم وضع نفس غطاء الاستشعار في لوحة استقبال فارغة ذات 96 بئرا (الهواء فقط) ، ويتم وضع جهازين مختلفين بالتتابع أعلى غطاء الاستشعار. (ط) يبين الجهاز الأول بيانات من ثمانية مجسات ذات تباين منخفض وقراءات O2 ~ 200 μM ، متوقعة للغلاف الجوي O2. (ii) يوضح الجهاز الثاني بيانات من ثمانية مجسات يقرأ فيها مجسان بشكل غير طبيعي (نقاط حمراء). (iii) تم استخدام جهاز واحد مع لوحة فارغة من 96 بئرا (الهواء فقط) ولكن مع اثنين من أغطية الاستشعار المختلفة التي تم اختبارها بالتتابع. تم رسم بيانات من 16 مسبارا ، مما يدل على تباين واسع ل Lid1 (الجانب الأيسر) وتباين منخفض ل Lid2 (الجانب الأيمن). (ج) تم رصد مخططات التعرف الضوئي على الحروف لمزارع RPE في وسط 100 ميكرولتر بكميات مختلفة من المصل لمدة 120 ساعة. تحتوي خلايا RPE في الوسائط الخالية من المصل (أرجواني) على OCR أقل ، مع انخفاض OCR في وقت أبكر من الوسائط التي تحتوي على كميات أعلى من المصل. الاختصارات: OCR = معدل استهلاك الأكسجين ؛ RPE = ظهارة الصباغ الشبكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: الآثار طويلة المدى لغير مقرنات الميتوكوندريا الموضحة بشكل فريد مع نظام التعرف الضوئي على الحروف. (أ) بيانات OCR الخام بمرور الوقت (ساعات) تسلط الضوء على OCR الأولي (الذي تم إنشاؤه على مدار 50 ساعة) ، ومرحلة العلاج (~ 20 ساعة بعد إضافة الأدوية) ، ومرحلة الاسترداد (~ 20 ساعة بعد غسل الدواء). تمت معالجة RPE بجهازي فك مقرنة ميتوكوندريا مختلفين ، FCCP (3 ميكرومتر ، N = 4) أو BAM15 (500 نانومتر ، N = 4) ومقارنة بالتحكم في مركبة DMSO (0.6٪ ، N = 7). يمثل كل أثر بئرا واحدا. (ب) متوسط التعرف الضوئي على الحروف لجميع الآبار لكل حالة في (أ) مرسومة لمرحلتي المعالجة والاسترداد. بدون تطبيع (المحور Y هو OCR المطلق) ، من الصعب رؤية حجم تأثير العلاج باستخدام FCCP. (ج) عندما يتم طرح كل أثر OCR من OCR الخاص به قبل العلاج ، يمكن حساب Delta OCR (مرسوم على المحور Y). هذا يسمح للمرء بعزل آثار العلاج على التعرف الضوئي على الحروف ، على الرغم من التباين في خط الأساس OCR بين الآبار. باستخدام Delta OCR ، يصبح تأثير FCCP واضحا. يصبح من الواضح أيضا مدى قصر عمر تأثير FCCP على فصل الميتوكوندريا ، مقارنة ب BAM15. أخيرا ، يصبح من الواضح أنه بالمقارنة مع FCCP ، فإن التعرض ل BAM15 ، حتى بعد غسل الدواء ، يخلق حالة "متكيفة" جديدة من OCR أعلى مستدام. (د) يتم عرض المؤامرات في (B) و (C) في شكل رسم بياني شريطي ، مما يسمح بإجراء مقارنة مباشرة بين البيانات غير الطبيعية (الرسم البياني الأيسر ، من (B)) والبيانات الطبيعية (Delta OCR ، الرسم البياني الأيمن ، من (C)). الاختصارات: OCR = معدل استهلاك الأكسجين ؛ RPE = ظهارة الصباغ الشبكية. FCCP = سيانيد الكربونيل - ف ثلاثي فلورو روميثوكسي فينيل هيدرازون ؛ DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: استخدام نظام التعرف الضوئي على الحروف لحساب معلمات الطاقة الحيوية للميتوكوندريا. (أ) باستخدام نفس الجزيئات الصغيرة التي تشكل جزءا من اختبار إجهاد الميتوكوندريا لمحلل فرس البحر ، تم تصوير OCR خلال أول 2.5 ساعة من مرحلة المعالجة لثقافات RPE. (الرسم البياني الأيسر) مثبط ATP-synthase oligomycin (N = 3) ، مثبطات المركب I و III antimycin A / rotenone (N = 7) ، أو السيارة ، DMSO 0.4٪ (N = 4). (الرسم البياني الأيمن) جهاز فك اقتران الميتوكوندريا BAM15 (N = 4) أو السيارة DMSO 0.6٪ (N = 4). (ب) متوسط النقاط الزمنية الثلاث الأخيرة لكل مجموعة علاجية (المربعات الحمراء في (أ)). (ج) تصوير محاكاة محلل فرس البحر اختبار إجهاد الميتوكوندريا ملف تعريف الطاقة الحيوية بناء على بيانات Resipher. تتوافق نقاط البيانات المرمزة بالألوان على الرسم البياني المحاكي مع التمثيلات البيانية الشريطية المرمزة بالألوان في (B). يمكن حساب جميع المعلمات التنفسية باستخدام بيانات Resipher واختيار جزيئات صغيرة. د: رسم تخطيطي لطريقة عمل الكواشف المستخدمة في الشكل 3 والشكل 4. الاختصارات: OCR = معدل استهلاك الأكسجين ؛ RPE = ظهارة الصباغ الشبكية. DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد ؛ AA = أنتيمايسين أ ؛ تعفن = روتينون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: مراقبة التعرف الضوئي على الحروف على المدى الطويل ل RPE التي تمر بالانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة التي يحفزها TGFβ2. تمت معالجة مزارع RPE البشرية الأولية الناضجة ب 10 نانوغرام / مل TGFβ2 أو التحكم في السيارة كل 2-3 أيام. (أ) تمت مراقبة قياسات التعرف الضوئي على الحروف في الوقت الفعلي لمدة 3 أسابيع باستخدام (ب) القياس الكمي لدلتا OCR بمرور الوقت (اليوم 19-اليوم 6). N = 6-7 آبار لكل حالة ، اختبار t غير مزاوج ، * P < 0.05. الاختصارات: OCR = معدل استهلاك الأكسجين ؛ RPE = ظهارة الصباغ الشبكية. TGFβ2 = تحويل عامل النمو بيتا -2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: مراقبة استجابة الميتوكوندريا RPE لنقص الأكسجة. (أ) تم تجميع "شطيرة" نظام التعرف الضوئي على الحروف في غرفة نقص الأكسجة وتم توصيل كابل USB بالمحور عبر ثقب محفور في الغطاء ومختوم بشحم السيليكون أو المعجون. أيضا في غرفة نقص الأكسجة هو طبق بتري من الماء المعقم للحفاظ على الرطوبة وجهاز استشعار O2 المحمولة. تم ترك النظام بأكمله في حاضنة زراعة الخلايا بعد استبدال الغلاف الجوي لغرفة نقص الأكسجة بتركيز O2 أقل. (ب) يستغرق الوسيط وقتا للتوازن إلى تركيزاتO 2 فوق السطح البيني بين الهواء والسائل. وأضيفت كميات مختلفة من وسائط RPE المتوازنة مع الغلاف الجوي O2 في آبار فارغة (بدون خلايا) من صفيحة من 96 بئرا. ثم تم تعديل غرفة نقص الأكسجة إلى 5٪ (50 ميكرومتر) O2. تم رصد تركيز O2 في وسائط كل بئر لمدة 20 ساعة. الآبار ذات أحجام الوسائط الأعلى متوازنة إلى 5٪ O2 بشكل أبطأ من أحجام الوسائط المنخفضة. ن = 8. (ج) يمكن استخدام النظام للكشف عن تسرب الهواء في غرفة نقص الأكسجة. تم إنشاء غرفة نقص الأكسجة بنسبة 1٪ O2 ، وتم وضع غطاء الاستشعار فوق الآبار الفارغة (الهواء فقط). تركت منافذ مدخل ومخرج غرفة نقص الأكسجة مفتوحة ، وأعيد توازن الغلاف الجوي لغرفة نقص الأكسجة إلى مستويات O2 في الغلاف الجوي على ~ 90 ساعة. (د) الوسائط الجديدة والطافات ("الوسائط المكيفة") لها قابلية ذوبان O2 مماثلة. هذا يلغي القلق من الذوبان التفاضلي O2 في الوسائط حيث يتغير تكوينه أثناء وجوده في الثقافة ، مما قد يؤثر على اتساق قراءات التعرف الضوئي على الحروف بمرور الوقت. تمت إضافة نفس الحجم (100 ميكرولتر) من الوسائط الطازجة ("الوسائط الجديدة") أو الوسائط المحتضنة لمدة 48 ساعة فوق الخلايا ("الوسائط المكيفة") إلى آبار صفيحة بدون خلايا. تعرض نظام OCR "شطيرة" في البداية لمستويات O2 في الغلاف الجوي ، ثم نقل إلى غرفة نقص الأكسجة (3-5٪ O2 أو 30-50 μM) ، ثم نقل مرة أخرى إلى مستويات O2 في الغلاف الجوي. تم رصد مستويات O2 في الهواء بواسطة مجسات في آبار فارغة (الهواء فقط). التغيير في تركيز O2 أثناء كل انتقال بين نوعي الوسائط متطابق ، مما يدل على أن قابلية ذوبان O2 بين نوعي الوسائط متطابقة. ن = 6. الاختصارات: OCR = معدل استهلاك الأكسجين ؛ RPE = ظهارة الصباغ الشبكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: تركيزات O2 في الطبقة الأحادية RPE المحددة باستخدام آلة حاسبة عبر الإنترنت. لقطة شاشة للآلة الحاسبة على الإنترنت (https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture). انظر النص للحصول على تفاصيل حول كيفية استخدام الآلة الحاسبة لتحديد كمية الأكسجين المتاحة في طبقة RPE الأحادية. الاختصارات: RPE = ظهارة صبغة الشبكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 8: استكشاف أخطاء تجارب استكشاف الأخطاء وإصلاحها: التبخر والخلايا غير السليمة والتقلبات المفرطة في التعرف الضوئي على الحروف. أ: التبخر المفرط. عندما يكون هناك عدم انتظام في تتبع OCR لبئر ، ابدأ بالنقر فوق علامة التبويب البيئة على واجهة النظام عبر الإنترنت (يسار). هنا ، يمكن مراقبة الرطوبة ودرجة الحرارة والضغط الجوي. سيؤدي فتح حاضنة زراعة الخلايا إلى تعطيل الرطوبة مؤقتا (انظر 2 ساعة و 28 ساعة على التتبع). ومع ذلك ، بدءا من 30 ساعة ، ينخفض تتبع الرطوبة باستمرار بمرور الوقت ، حتى بدون فتح الباب. هذا يشير إلى أن صينية مياه حاضنة زراعة الخلايا جافة. أي اضطراب في الرطوبة أو درجة الحرارة سيغير قراءات التعرف الضوئي على الحروف. (يمين) الرطوبة المنخفضة تؤدي إلى تفاقم التبخر. في التتبع الموجود على اليمين ، يظهر البئر الذي يخضع للتبخر السريع اختلافات أصغر تدريجيا في تركيز O2 بين الجزء العلوي والسفلي من رحلة مسبار المستشعر (1 مم إلى 1.5 مم فوق الطبقة الأحادية RPE). هذا يشير إلى أن طرف المسبار قريب من واجهة الوسائط الجوية. عندما يقرأ تركيز O2 "الخطوط المسطحة" بقيمة قريبة من تركيزات O2 المعروفة في الغلاف الجوي (~ 200 μM) ، فإن هذا يشير إلى أن طرف المسبار خارج عمود الوسائط تماما وأخذ عينات من الهواء فقط. لم تعد قراءات التعرف الضوئي على الحروف صالحة وتحتاج هذه الآبار إلى تغيير فوري في الوسائط. ب: الخلايا غير السليمة. يتيح رسم تتبع O2 و OCR لكل بئر فردي تحديد البئر الشاذ ، وعادة ما يحدث ذلك بسبب كون الخلايا غير صحية. هنا ، البئر المعين من قبل التتبع الأزرق غير صحي. N = 6 آبار. (ج) فتحات أبواب الحاضنة وتغيير الوسائط. تؤدي التغيرات في الرطوبة الجوية ودرجة الحرارة والضغط وثاني أكسيدالكربون 2 أثناء فتحات أبواب الحاضنة ، إلى جانب أي تغيير في الوسائط ، إلى تعطيل التدرج O2 للتوازن الموجود في البئر مؤقتا ، مما يتسبب في حدوث طفرات شاذة O2 و OCR مبكرا ومتأخرا في هذه الرسوم البيانية. N = 6 آبار. الاختصارات: OCR = معدل استهلاك الأكسجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9
الشكل 9: تجارب استكشاف الأخطاء وإصلاحها: حجم الوسائط والتطبيع. (أ) يحد حجم الوسائط من الحد الأقصى الممكن للتعرف الضوئي على الحروف. نظرا لأن أحجام الوسائط الأعلى تؤدي إلى انخفاض توافر O2 في طبقة RPE الأحادية ، فإن كل حجم وسائط في بئر واحد من لوحة 96 بئرا له حد أقصى OCR. فوق هذا OCR ، يكون O2 على مستوى الخلايا هو في الأساس 0٪ (نقص الأكسجين). وبالتالي ، إذا كان المرء قريبا من الحد الأقصى النظري للتعرف الضوئي على الحروف لحجم وسائط معين ، فهناك فائدة في خفض حجم الوسائط ، بحيث لا يتم رؤية "تأثير السقف" OCR على مدار التجربة. يتم عرض الحد الأقصى النظري للتعرف الضوئي على الحروف الذي يمكن تحقيقه عند كل حجم وسائط (في لوحة قياسية ذات 96 بئرا). تم حساب جميع القيم باستخدام الآلة الحاسبة عبر الإنترنت التي تمت مناقشتها في قسم البروتوكول 4 وعرضها في الشكل 7. (ب) التطبيع المناسب. بالنسبة للتجارب التي يهتم فيها المرء بتأثير متغير واحد على قدرة متغير آخر على تحفيز استقلاب الميتوكوندريا ، يعد الإعداد التجريبي ل Delta-Delta OCR مثاليا. في الإعداد في (ب) ، تم اختبار قدرة وسيطين مختلفين على تعزيز أكسدة β للبالميتات. في حالة حدوث أكسدة β للأحماض الدهنية ، يجب أن تكون هناك زيادة كبيرة في التعرف الضوئي على الحروف للميتوكوندريا. قد تعزز بعض الوسائط أكسدة β بالميتات بشكل أفضل من الوسائط الأخرى. على الجانب الأيسر من الرسم البياني OCR ، يتم إدخال وسيطين مختلفين (Media 1 مقابل Media 2) إلى الآبار المتوازية لثقافات RPE. يتم الحصول على OCR خط الأساس. يضاف البالميتات التالي إلى نصف الآبار التي تحتوي على كل نوع وسائط. هذا يخلق أربعة شروط: وسائل الإعلام 1 - بالميتات ، وسائل الإعلام 1 + بالميتات ، وسائل الإعلام 2 - بالميتات ، وسائل الإعلام 2 + بالميتات. يتم تسجيل استجابة OCR لكل من هذه الظروف الإعلامية الجديدة. بعد ذلك ، يتم طرح قيم OCR بعد المعالجات التجريبية (متوسط المربع المتقطع الأحمر ضمن مرحلة المعالجة) من قيم OCR الأساسية قبل المعالجة (متوسط المربع المتقطع الأحمر ضمن مرحلة خط الأساس) ، مما يؤدي إلى إنشاء الرسوم البيانية الشريطية Delta OCR (أسفل اليسار). أخيرا ، يتم تحديد قدرة الوسائط 1 مقابل الوسائط 2 على تعزيز أكسدة β في الرسم البياني الشريطي Delta-Delta OCR (أسفل اليمين). هنا ، يتم حساب الفرق بين "Delta OCR of Media 1 + palmitate" و "Delta OCR of Media 1 - palmitate" ومقارنته بالفرق بين "Delta OCR of Media 2 + palmitate" و "Delta OCR of Media 2 - palmitate". هذا النوع من الإعداد التجريبي والتطبيع يعزل آثار الوسائط 1 مقابل الوسائط 2 على تعزيز أكسدة β. ينطبق الهيكل العام لهذا التطبيع على أي تجربة حيث يقوم المرء بقياس تأثير متغير واحد على قدرة متغير آخر على تغيير التعرف الضوئي على الحروف. الاختصارات: OCR = معدل استهلاك الأكسجين ؛ RPE = ظهارة الصباغ الشبكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: وصفة وسائط زراعة الخلايا RPE. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

يلعب استقلاب الميتوكوندريا في RPE دورا مهما في التسبب في أمراض الشبكية الشائعة المسببة للعمى ، بما في ذلك AMD و PVR. تسمح نمذجة استقلاب الميتوكوندريا RPE في المختبر للمرء بعزل حالته الأيضية عن تلك الموجودة في الأنسجة المحيطة ، إلى جانب تعريض الأنسجة لإهانات مختلفة تحاكي المرض بطريقة خاضعة للرقابة. تم تسهيل مثل هذه النمذجة في المختبر لعملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا RPE من خلال ظهور الثقافات الأولية البشرية عالية الدقة و iPSC-RPE التي تحقق حالة التمايز المناسبة والقطبية اللازمة لتقريب RPE عن كثب في الجسم الحي. في حين أن مراقبة معدل استهلاك الأكسجين (OCR) في مثل هذه الثقافات هي طريقة مثالية لمراقبة استقلاب الميتوكوندريا ، فإن الإعداد لمراقبة التعرف الضوئي على الحروف غالبا ما يحول دون نمو الثقافات في الظروف اللازمة ل RPE شديد الاستقطاب والمتمايز تماما. هنا ، نصف Resipher كنظام جديد لمراقبة استقلاب الميتوكوندريا RPE من خلال تقييم طويل الأجل في الوقت الفعلي ل OCR في ثقافات RPE شديدة التمايز والاستقطاب.

تم استخدام طرق أخرى لمراقبة التعرف الضوئي على الحروف في RPE. تم تصميم محلل فرس البحر XF لمراقبة التعرف الضوئي على الحروف على مدى فترات زمنية قصيرة مع التلاعب الحاد بوظيفة الميتوكوندريا. ومع ذلك ، تتطلب مقايسات فرس البحر زراعة الخلايا على ألواح مخصصة ، والتي لا تفضي إلى دعم قطبية RPE العالية والتمايز21. قام كالتون وفولراث وزملاؤه بتكييف فرس البحر لتقييم ثقافات RPE شديدة التمايز المزروعة على دعامات صغيرة يسهل اختراقها عن طريق قطع الغشاء الصغير الذي يسهل اختراقه إلى قطع ووضعها في صفيحة فرس البحر ، لكن هذه الطريقة لا تزال تعمل فقط من أجل مراقبة نقطة النهاية قصيرة المدى للمزارع حيث لا تستطيع الخلايا الوصول إلى CO2 أثناء الفحص ، لا يمكن إجراء الفحص إلا في ظل ظروف غير معقمة ، وسيؤدي قطع الدعم الصغير الذي يسهل اختراقه إلى الموت والخلل الوظيفي في الجزء الحافة من الدعم الصغير الذي يسهل اختراقه بمرور الوقت22. Barofuse هو نظام نضح بدون مضخة يمكن فيه تحميل شرائط RPE المزروعة على دعامات صغيرة يسهل اختراقها في نظام التروية ، مما يسمح بمراقبة التعرف الضوئي على الحروف في الوقت الفعلي23. على غرار الإعداد المعدل لفرس البحر من قبل كالتون وفولراث وزملائه ، فإن القيود الرئيسية لتقييم RPE مع Barofuse هي الحاجة إلى قطع الدعامات الصغيرة التي يسهل اختراقها وطبيعة نقطة النهاية قصيرة المدى للفحص. تم تصميم Oxygraph أيضا للتغيرات الحركية السريعة في OCR استجابة للتلاعب الأيضي24. لم يتم استخدامه لثقافات RPE وسيعاني من نفس القيود لتقييم ثقافات RPE شديدة الاستقطاب والاختلاف مثل فرس البحر و Barofuse.

على عكس هذه الطرق الأخرى ، يسمح نظام التعرف الضوئي على الحروف الموصوف هنا بمراقبة التعرف الضوئي على الحروف بينما يتم استزراع RPE في ألواح / ركائز زراعة الخلايا القياسية في ظل ظروف قياسية مع وسائط RPE القياسية في حاضنة CO2 القياسية لزراعة الخلايا ، مما يوفر فحصا سهلا ومريحا لثقافات RPE شديدة التمايز والاستقطاب. بالإضافة إلى توليد بيانات حول تغييرات التعرف الضوئي على الحروف في الوقت الفعلي بواسطة النظام ، يمكن استخدام هذه الخلايا نفسها لإجراء فحوصات إضافية في نهاية فترة مراقبة التعرف الضوئي على الحروف. يسمح ذلك بإجراء تجارب مرنة للغاية حيث يتم اختبار تأثير التدخل على التعرف الضوئي على الحروف بشكل متكرر على مدار أسابيع (على سبيل المثال - تحريض RPE EMT في الشكل 5) أو حيث يمكن اختبار التعافي طويل المدى من التدخل (على سبيل المثال - التعافي من فصل الميتوكوندريا في الشكل 3) أو حيث يمكن مراقبة التغيرات الأيضية المتتالية استجابة للتدخل الأولي (على سبيل المثال - آثار المصل على التعرف الضوئي على الحروف بمجرد استنفاد مغذيات الوسائط في الشكل 2). نظام التعرف الضوئي على الحروف في هذه الورقة مناسب بشكل خاص لقياس التعرف الضوئي على الحروف في ثقافات RPE شديدة الاستقطاب والتمايز. هذه الثقافات هي postmitotic وظيفيا ، مع التعبئة الضيقة والتصبغ الثقيل. هذا يعني أن كل بئر يحتوي على أرقام خلايا متطابقة تقريبا9 ، وبالتالي تجنب الحاجة إلى تطبيع OCR إلى رقم الخلية لمعظم التجارب. حتى عندما يكون التطبيع مع رقم الخلية مطلوبا ، فإن تصبغ RPE الثقيل وحدود الخلايا المحددة جيدا تسمح بحدوث التطبيع باستخدام عدد خلايا بسيط غير جراحي يعتمد على تصوير برايتفيلد. بالنسبة للتجارب التي تنطوي على انتشار RPE و RPE غير متمايز ، مثل تجارب EMT في الشكل 5 ، يصبح تطبيع OCR لكل بئر إلى رقم الخلية ضروريا لمعرفة ما هو OCR "لكل خلية".

خارج مجال الشبكية ، تم استخدام النظام لدراسة التنفس الخلوي والنشاط الأيضي في أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك خلايا جزيرة البنكرياس25 ، والعضلات الهيكلية26 ، وسرطان المبيض27 ، وخلايا عضلة القلب28 ، وحتى الكائنات الحية بأكملها ، مثل C. elegans29. كشفت المراقبة طويلة المدى في الوقت الفعلي ل OCR باستخدام نظام OCR الموصوف هنا عن رؤى رئيسية حول تحولات الطاقة الحيوية واختلال الميتوكوندريا عبر نماذج الأمراض المتنوعة هذه.

نظام Resipher يحمل قيودا. تختلف طريقة تحديد OCR اختلافا جوهريا عن محلل فرس البحر أو BaroFuse أو Oxygraph. يتطلب إنشاء تدرج O2 لحساب OCR ، ويمكن أن يستغرق التدرج ساعات لتأسيسه. وبالتالي ، فإن التجارب الحركية السريعة ، الممكنة في الأنظمة الأخرى ، غير ممكنة مع هذا النظام. علاوة على ذلك ، على عكس الأنظمة الأخرى ، لا يحتوي Resipher على أي منافذ حقن للتوصيل السريع للجزيئات الصغيرة أو جمع المستقلبات. بدلا من ذلك ، يجب إزالة غطاء الاستشعار في غطاء زراعة الخلايا ، مع زيادة الأدوية أو استبدال الوسائط ، إلى جانب الجمع اليدوي للمستقلبات ليتم تحليلها.

لإنشاء تجربة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها باستخدام نظام التعرف الضوئي على الحروف الموضح في هذه الورقة ، يوصى بما يلي. أولا ، قلل من التبخر. تذكر أن تدرج O2 في عمود الوسائط أعلى الطبقة الأحادية RPE يعتمد بشكل كبير على ارتفاع العمود9 ، ويحسب النظام OCR بناء على تدرج O2 . وبالتالي ، إذا كان هناك انخفاض ملحوظ في عمود الوسائط أثناء التجربة بسبب التبخر ، فسيتغير تدرج O2 ، مما يؤثر على قراءات التعرف الضوئي على الحروف. يعد الحفاظ على صينية المياه للحاضنة ممتلئة أمرا بالغ الأهمية ، ولكن يقترح أيضا وضع المياه في جميع الآبار غير المستخدمة في لوحة 96 بئرا. علاوة على ذلك ، فإن الآبار الموجودة على حافة اللوحة لها معدلات تبخر أعلى ، لذلك تترك هذه الآبار فارغة من الخلايا في التجارب النموذجية المعروضة أعلاه. يمكن أن يساعد مستشعر الرطوبة الموجود على نظام OCR في مراقبة رطوبة الحاضنة. في الشكل 8 أ، يشير انخفاض الرطوبة أثناء التجربة إلى أن صينية مياه الحاضنة فارغة. مع تسارع التبخر في البئر ، سترتفع قراءات تركيز O2 للبئر أعلى وفي النهاية "خط مسطح" عند تركيز O2 في الغلاف الجوي (~ 200 ميكرومتر) (الشكل 8 أ).

ثانيا ، تأكد من أن "شطيرة" نظام التعرف الضوئي على الحروف قد تم تجميعها بشكل مناسب. يجب أن تكون نقاط التلامس المعدنية الموجودة أسفل الجهاز والجزء العلوي من غطاء الاستشعار نظيفة ، بدون حطام لإعاقة الاتصال الكامل. يجب توصيل الجهاز وغطاء الاستشعار بشكل كامل ومحاذاة بالتساوي على لوحة 96 بئرا دون أي إمالة. يجب ألا يكون كبل USB الذي يربط الجهاز بلوحة التحكم في حالة توتر ، مما قد يؤدي إلى عزم دوران "الساندويتش" وتقييد الحركة الصحيحة للجهاز.

ثالثا ، تأكد من معايرة الجهاز وأجهزة استشعار غطاء الاستشعار. يوضح الشكل 2B كيفية التحقق بسرعة من وظيفة المستشعر المناسبة في بداية كل تجربة. رابعا ، تأكد من أن بئرا معينا لا يظهر OCR متطرفا قبل التلاعب التجريبي. بعد التأكد من عمل المستشعرات ، يمكن أن يساعد تحديد قيم OCR الأساسية لجميع الآبار التي تحتوي على خلايا في تحديد ما إذا كانت بعض الآبار تحتوي على خلايا غير صحية. يوضح الشكل 8B العديد من الآبار التي تخضع لتقييم OCR الأساسي ، حيث يوضح البئر ذو اللون الأزرق بوضوح انخفاض التعرف الضوئي على الحروف (وبالتالي تركيز O2 العالي). هذا البئر هو الشاذ ويجب استبعاده من التلاعب التجريبي.

خامسا ، تقليل التلاعب البيئي أثناء قراءات OCR النشطة. التدرج O2 حساس للغاية للتغيرات في درجة الحرارة والرطوبة ومستويات CO2 للحاضنة والضغط الجوي. يؤثر فتح باب الحاضنة بشكل كبير على هذه العوامل ، مما يتسبب في اضطرابات مؤقتة في قراءات OCR حتى يعود التدرج O2 لعمود الوسائط إلى التوازن (الشكل 8C). يمكن مراقبة المعلمات التي تؤثر على التعرف الضوئي على الحروف في واجهة النظام عبر الإنترنت ضمن علامة التبويب "البيئة" (الشكل 8 أ).

سادسا ، حدد حجم الوسائط الأمثل للتجربة. في حين أن حجم الوسائط غير الكافي يمكن أن يخلق قطعا أثرية من التبخر المفرط (انظر أول إجراء لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها أعلاه) أو الاستنفاد المبكر للمغذيات في الوسائط ، فإن حجم الوسائط المفرط يحد من توافر O2 إلى طبقة RPE الأحادية ، مما يؤدي إلى نقص الأكسجة9. الشكل 7 هو لقطة شاشة للآلة الحاسبة عبر الإنترنت المتاحة لتحديد تأثير حجم الوسائط على تركيز O2 عند الطبقة الأحادية RPE. يتم عرض الحد الأقصى ممكن للتعرف الضوئي على الحروف لحجم وسائط معين في الشكل 9A. إذا كان معدل التعرف الضوئي على الحروف لتجربة معينة باستخدام حجم معين يقترب من المعدل المعروض في الشكل 9A ، فإن تركيز O2 عند طبقة RPE الأحادية يقترب من نقص الأكسجين (0٪) وهناك حاجة إلى حجم وسائط أقل. بشكل عام ، يجب أن تحتوي التجارب التي تتضمن عمليات مكثفة للميتوكوندريا في ثقافة RPE على أحجام وسائط لا تزيد عن 75 ميكرولتر لكل 96 بئرا.

سابعا ، إجراء التطبيع المناسب لعزل آثار التدخل التجريبي على التعرف الضوئي على الحروف. نظرا لأن الآبار المختلفة يمكن أن يكون لها خط أساس مختلف للتعرف الضوئي على الحروف ، فمن الأهمية بمكان الحصول على قراءات OCR الأساسية لكل بئر قبل التدخل التجريبي. اطرح خط الأساس OCR من OCR بعد التدخل التجريبي للحصول على "Delta OCR" ، والذي يوضح تأثير التدخل التجريبي على التعرف الضوئي على الحروف. طريقة الحصول على "دلتا OCR" موضحة في الشكل 3 والشكل 9 ب. إذا كان المرء مهتما بآثار تدخل تجريبي واحد على قدرة تدخل تجريبي آخر على تحفيز التعرف الضوئي على الحروف ، فهناك حاجة إلى خطوة تطبيع إضافية ، "Delta-Delta OCR". يوضح الشكل 9 ب هذا المثال ، حيث تعتمد قدرة البالميتات (تدخل تجريبي واحد) على تحفيز زيادة التعرف الضوئي على الحروف (عن طريق تحريض أكسدة β) على نوع الوسائط لثقافة RPE (تدخل تجريبي ثان).

أخيرا ، قلل من خطر التلوث. يراقب النظام التعرف الضوئي على الحروف عن طريق إدخال مستشعر الأكسجين في الوسائط فوق الخلايا. هذا يزيد من خطر العدوى. قد تكون الانخفاضات غير المتوقعة في التعرف الضوئي على الحروف أثناء التجربة أو انخفاض OCR بشكل غير متوقع في بداية التجربة علامات على وجود عدوى. يجب مراقبة اللوحات بنشاط بحثا عن العدوى تحت مجهر زراعة الخلايا. يمكن أن يحدث التلوث المتبادل بين ألواح 96 بئرا إذا تم إعادة استخدام غطاء الاستشعار. لتقليل هذا التلوث المتبادل ، يجب على المرء غمر الغطاء بالكامل في 70٪ من الإيثانول لمدة 20 دقيقة لإزالة التلوث بعد إجراء التجربة ، قبل إعادة استخدام غطاء الاستشعار في تجربة جديدة (انظر قسم البروتوكول 1.2.15).

في الختام ، يتم تقديم بروتوكول للمراقبة في الوقت الفعلي وطويلة الأجل لعملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا في ثقافات RPE عالية الدقة من خلال تقييم OCR باستخدام نظام جديد يسمى Resipher. يمكن استخدامه للعديد من التطبيقات على ثقافات RPE شديدة الاستقطاب والتمايز ، على وجه الخصوص ، فحص الخصائص الأيضية الفسيولوجية ل RPE المعزول وكذلك التمثيل الغذائي RPE المتغير في النماذج المختبرية لأمراض الشبكية ، بما في ذلك AMD و PVR.

الإفصاحات

ريتشارد أ. بريان وكين لو موظفان في Lucid Scientific ، التي تصنع نظام Resipher.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور دانيال هاس وجيم هيرلي على فكرة اختبار قابلية ذوبان O2 في الوسائط الجديدة مقابل الوسائط المشروطة كعنصر تحكم. نشكر الدكتور ماغالي سانت جينييز على مساهمته التحريرية في المخطوطة. نشكر سكوت سزالاي في مركز الأدوات والخدمات الإلكترونية ، مركز كيلوغ للعيون ، على تعديل غرفة نقص الأكسجة بكابل Resipher USB. لم يتم استخدام أي أموال فيدرالية لأبحاث HFT. يتم دعم نواة الخدمات الإلكترونية من قبل P30 EY007003 من المعهد الوطني للعيون. يتم دعم هذا العمل من خلال منحة إدارية غير مقيدة من أبحاث الوقاية من العمى (RPB). يتم دعم J.M.L.M. من قبل مبادرة جيمس جروسفيلد للتنكس البقعي المرتبط بالعمر الجاف ، ومؤسسة E. Matilda Ziegler للمكفوفين ، ومنحة بنك العيون Eversight ، ومنحة K08EY033420 من المعهد الوطني للعيون ، ودعم من Dee و Dickson Brown بالإضافة إلى مؤسسة David and Lisa Drews لاكتشاف الأمل. يتم دعم D.Y.S. من قبل برنامج العلوم بجامعة نيو ساوث ويلز. يتم دعم L.A.K. من قبل جائزة Iraty ، و Monte J. Wallace ، و Michel Plantevin ، ومنحة R01EY027739 من المعهد الوطني للعيون ، ونشاط اكتساب البحوث الطبية للجيش التابع لوزارة الدفاع VR220059.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ Trypsin-EDTAGibco# 25-200-056
3،3 '، 5-triiodo-L-thyronine ملح الصوديومSigmaT5516
غطاء Resipher 32 قناةLucid ScientificNS32-101A ل Falcon
Antimycin A من Streptomyces sp.مثبط SigmaA8674-25MGللمركب الثالث لسلسلة نقل الإلكترون
BAM15SigmaSML1760-5MGعامل فصل لزيادة تنفس الميتوكوندريا
DMSO ، درجة ثقافة الخلاياSigma-aldrichD4540-100MLمركبة لإعادة تشكيل أدوية الميتوكوندريا
ركائز طلاء المصفوفة خارج الخلية:
Synthemax II-SC		Corning# 3535مصفوفة خارج الخلية ل hfRPE
ركائز طلاء المصفوفة خارج الخلية: مصفوفة VitronectinGibcoA14700خارج الخلية ل iPSC-RPE
FCCPSigmaC2920-10MGعامل فك الاقتران لزيادة تنفس الميتوكوندريا
مصل الأبقار الجنيني (Bio-Techne S11550H)Bio-TechneS11550H
هيدروكورتيزون-سيكلودكسترينسيجماH0396
غرفة نقص الأكسجةEmbrient Inc.MIC-101
N1 Media SupplementSigmaN6530
الأحماض الأمينية غير الأساسيةGibco11140050
O2 مستشعرتقنية Sensit أو كاشفات الطب الشرعيP100 أو FD-90A-O2
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
المؤتلف البشري TGF & beta ؛ 2Peprotech100-35Bتحويل عامل النمو بيتا -2 للحث على الانتقال الظهاري الوسيط
RotenoneSigmaR8875-1Gمثبط المركب الأول لسلسلة نقل الإلكترون
لوحة متوافقةمع النظام Corning# 353072
TaurineSigmaT8691
& alpha ؛ MEM (تعديل ألفا لوسائط النسر)كورنينج15-012-السيرة الذاتية
محلول

المراجع

  1. Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration. Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).
  2. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis. Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).
  3. Hurley, J. B. Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection. Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).
  4. Wu, W., et al. Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420(2023).
  5. Hansman, D. S., et al. Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration. Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904(2024).
  6. Li, K. X., et al. Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213(2021).
  7. Gupta, S., et al. Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery. Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).
  8. Wilson, D. F., et al. Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging. Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).
  9. Hass, D. T., et al. Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4(2023).
  10. Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (9), 4701(2021).
  11. Shu, D. Y., et al. Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium. Front Mol Neurosci. 15, 896786(2022).
  12. Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition. Metabolites. 13 (2), 213(2023).
  13. Kar, D., et al. Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41(2023).
  14. Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4(2024).
  15. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  16. Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. J Vis Exp: JoVE. (45), e2032(2010).
  17. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).
  18. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (3), 101582(2022).
  19. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  20. Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration. Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).
  21. Fitch, T. C., et al. Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry. J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).
  22. Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Mol Vis. 24, 425-433 (2018).
  23. Grumbine, M. K., et al. Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system. J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).
  24. Mu, C., Shearer, J. Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats. STAR Protoc. 4 (4), 102560(2023).
  25. Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets. Mol Metab. 83, 101922(2024).
  26. Kanaan, M. N., et al. Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation. Redox Biol. 73, 103213(2024).
  27. da Veiga Moreira, J., et al. Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth. Cancers. 16 (2), 355(2024).
  28. McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology. J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).
  29. Misare, K. R., et al. The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics. Sci Rep. 13 (1), 18125(2023).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ظهارة صبغة الشبكيةوظيفة الميتوكوندريامستنبتات ظهارة صبغة الشبكيةحاضنة زراعة الخلاياغرفة نقص الأكسجةالتوصيف الطاقي الحيوياستقطاب ظهارة صبغة الشبكيةقياس تدرج الأكسجين
مراقبة طويلة الأجل لمعدلات استهلاك الأكسجين في الثقافات الظهارية الصبغية الشبكية شديدة التمايز والاستقطاب
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.