مقالة منهجية

منظار صغير يسجل إشارات الكالسيوم في الحصين للفئران التي تتنقل في عمود الرائحة

1.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67039

⸱

سبتمبر 20, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Neurotechnology Center, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Bioengineering, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 4Civil, Environmental & Architectural Engineering, University of Colorado, 5Neuroscience Graduate Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus

في هذه المقالة

ملخص

يبحث هذا البروتوكول في العلاقة بين الدماغ والسلوك في الحصين CA1 في الفئران التي تتنقل في عمود الرائحة. نحن نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة ، بما في ذلك الجراحة للوصول إلى تصوير الحصين ، والتدريب السلوكي ، وتسجيل المنظار المصغر GCaMP6f ومعالجة الدماغ ، والبيانات السلوكية لفك تشفير موضع الماوس من النشاط العصبي لعائد الاستثمار.

الملخص

تتنقل الفئران في عمود رائحة بهيكل زماني مكاني معقد في الظلام للعثور على مصدر الروائح. توضح هذه المقالة بروتوكولا لمراقبة السلوك وتسجيل العابرين Ca2+ في الخلايا العصبية الهرمية للطبقة الظهرية CA1 في الحصين (dCA1) في الفئران التي تتنقل في عمود رائحة في ساحة رائحة 50 سم × 50 سم × 25 سم. قام منظار صغير متألق يركز من خلال عدسة مؤشر التدرج (GRIN) على تصوير عابرين Ca2+ في الخلايا العصبية dCA1 التي تعبر عن مستشعر الكالسيوم GCaMP6f في فئران Thy1-GCaMP6f. تصف الورقة البروتوكول السلوكي لتدريب الفئران على أداء مهمة الملاحة في عمود الرائحة هذه في ساحة الرائحة الآلية. تتضمن الطرق إجراء خطوة بخطوة لجراحة زرع عدسة GRIN ووضع الصفيحة الأساسية لتصوير GCaMP6f في CA1. توفر المقالة معلومات حول التتبع في الوقت الفعلي لموضع الماوس لأتمتة بدء التجارب وتسليم مكافأة المياه. بالإضافة إلى ذلك ، يتضمن البروتوكول معلومات حول استخدام لوحة واجهة لمزامنة البيانات الوصفية التي تصف أتمتة مهمة التنقل في الرائحة وأوقات الإطارات للمنظار المصغر وموضع ماوس تتبع الكاميرا الرقمية. علاوة على ذلك ، تحدد الطرق خط الأنابيب المستخدم لمعالجة أفلام مضان GCaMP6f عن طريق تصحيح الحركة باستخدام خوارزمية NorMCorre متبوعة بتحديد مناطق الاهتمام باستخدام EXTRACT. أخيرا ، تصف الورقة نهج الشبكة العصبية الاصطناعية لفك تشفير المسارات المكانية من نشاط المجموعة العصبية CA1 للتنبؤ بالتنقل بالماوس لعمود الرائحة.

المقدمة

على الرغم من إحراز تقدم كبير في فهم الدوائر العصبية المشاركة في الملاحة الشمية في الفئران الثابتةبالرأس 1،2،3 واستراتيجيات الملاحة في الفئران التي تتحرك بحرية4،5،6،7،8 ، إلا أن دور الدوائر العصبية في الملاحة ذات الصلة بحرية ذات الصلة بالحرارة لأعمدة الرائحة المضطربة لا يزال غير معروف. توضح هذه المقالة مراقبة النشاط العصبي عن طريق تصوير عابرات Ca2+ في الخلايا التي تعبر عن مستشعر الكالسيوم المشفر وراثيا GCaMP6f في الفئران Thy1-GCaMP6f9 لدراسة ما إذا كانت الديناميكيات العصبية المتسلسلة للخلايا العصبية الهرمية للطبقة الظهرية CA1 في الحصين (dCA1) تلعب دورا في التنقل في عمود الرائحة. توفر الطرق معلومات عن التألق GCaMP6f المصور من خلال مجهر مشمشق مصغر يركز من خلال عدسة GRIN على dCA110،11،12. تشرح الطرق كيفية مراقبة الملاحة المكانية في وقت واحد والخلايا العصبية dCA1 GCaMP6f عابرة الكالسيوم في الفئران التي تؤدي مهمة ملاحة ذات عمود الرائحة حيث تلقوا مكافأة مائية عندما وصلوا إلى الفوهة التي تنقل رائحة إلى ساحة الرائحة مع تدفق هواء رقائقي في الخلفية13،14. توضح هذه المقالة الطرق المطلوبة لتحقيق هذه المهمة (الشكل 1) ، بما في ذلك الجراحة التجسيمية لزرع عدسات مؤشر التدرج (GRIN) ، ووضع صفيحة أساسية لتأمين المنظار المصغر على الجمجمة في فأرة تتحرك بحرية ، والتصوير باستخدام المجهر المصغر ومراقبة حركة الماوس بكاميرا رقمية عالية السرعة ، والمعالجة المسبقة للبيانات لإزالة القطع الأثرية للحركة والعثور على مناطق الاهتمام (ROIs) ، وإعداد مجموعات البيانات والتدريب على الشبكة العصبية الاصطناعية والتنبؤ بها لفك تشفير مواضع X و Y للفأر في ساحة الرائحة من التغيرات في التألق في عائد الاستثمار dCA17.

يعد تسجيل المنظار المصغر لإشارات الكالسيوم في منطقة CA1 من الحصين للفئران التي تتنقل في عمود الرائحة مناسبا لفهم حساب الدوائر العصبية المشاركة في حاسة الشم والمعلومات المكانية في مهمة السلوك المعقدة المتمثلة في التنقل في عمود الرائحة2،14،15،16. تلعب منطقة CA1 من الحصين دورا في الملاحة المكانية وهي ضرورية لإنشاء خريطة معرفية للبيئة من أجل التنقل الفعال17،18. يعد تسجيل إشارات الكالسيوم باستخدام منظار صغير طريقة قيمة للتحقيق في الخلايا العصبية CA1 التي تشفر المعلومات المكانية أثناء التنقل في عمود الرائحة.

تجمع هذه التقنية بين مزايا تقنية المنظار المصغر لتسجيل إشارات الكالسيوم GCaMP مع الدور الراسخ للحصين CA1 في الملاحة المكانية لفهم أفضل لكيفية دفع الدوائر العصبية للسلوكيات المعقدة19. بدلا من ذلك ، يمكن للطرق التي تستخدم الفحص المجهري ثنائي الفوتون تسجيل الخلايا العصبية CA19،20 ، الأمر الذي يتطلب فأرا ثابتا على الرأس ويقيد إمكانية التحرك بحرية للتنقل في عمود الرائحة21. تسمح التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية في المجال المحلي للخلايا العصبية CA1 بالتحقيق في الفئران التي تتحرك بحرية والتي تتنقل في أعمدة الرائحة22. ومع ذلك ، تفرض الإشارات الكهربائية للمجال المحلي قيودا على تقدير الإطلاق داخل الخلايا عن طريق عزل إشارات الوحدة الواحدة من خلال تقنيات الفرز السنبلية. تسمح إشارات المنظار المصغر بتحديد عائد الاستثمار المرتبط مباشرة بإشارات الكالسيوم داخل الخلايا بطريقة موثوقة10،11 للتحقيق في الحسابات العصبية بدقة الخلية الواحدة بدقة. توفر تقنية Miniscope فرصة فريدة لفهم كيفية تشفير منطقة CA1 للمعلومات المكانية بناء على إشارات الرائحة بشكل أفضل.

علاوة على ذلك ، تبحث هذه التقنية في كيفية معالجة مجموعات عصبية معينة لمعلومات الرائحة للملاحة والعلاقة بين أنماط النشاط العصبي واتخاذ القرار أثناء تتبع عمود الرائحة. يمكن أن تساهم هذه الطريقة في فهم أفضل لكيفية معالجة الدماغ للرائحة والمعلومات المكانية. بينما توفر المناظير المصغرة دقة خلية واحدة لتسجيل دماغ الفأر الذي يتحرك بحرية ، فإنها تتطلب جراحة متخصصة وخبرة في تحليل البيانات. في هذه الورقة ، نقدم بروتوكولا شاملا لمساعدة الباحثين على المرور بكل خطوة للتحقيق في الآليات العصبية للملاحة في عمود الرائحة.

تعد مهمة التنقل في الرائحة إطارا واعدا لدراسة الترميز العصبي وذاكرة إشارة الرائحة المكانية في الفئران. تشير نتائج المقالة إلى أنه من الممكن فك تشفير مسار الفأر الذي يتنقل في عمود الرائحة بناء على إشارات الكلسيوم العصبية في dCA1. يعد فهم دور إشارات الكالسيوم dCA1 في التنقل بين عمود الرائحة خطوة حاسمة لكسر أساس الدائرة العصبية للملاحة الموجهة بالرائحة في بيئات واقعية13،14.

البروتوكول

أجريت الدراسات على ذكور وإناث Thy1-GCaMP6f تتراوح أعمارهم بين 3-6 أشهر23. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في الحرم الجامعي الطبي بجامعة كولورادو أنشوتز وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة. تم تكييف الإجراءات الجراحية لزرع عدسة GRIN (القسم 1) ووضع الصفيحة الأساسية (القسم 2) من الأعمال السابقة9،24،25،26،27،28،29.

1. الجراحة التجسيمية لزرع عدسة GRIN في الحصين

  1. ارتد قفازات معقمة وغطاء رأس وقناع جراحي ومعطف مختبر.
  2. استخدم الظروف المعقمة أثناء جميع جراحات البقاء على قيد الحياة. تعقيم جميع المعدات الجراحية عن طريق التعقيم.
  3. ضع ستائر معقمة حول منطقة الجراحة.
  4. قم بتخدير الفأر عن طريق وضعه في حجرة الحث بنسبة 3٪ من الأيزوفلوران لمدة 10 دقائق.
  5. تحقق مما إذا كان الفأر يتوقف عن الحركة ويخضع للتخدير العميق ، ويتم تأكيده عن طريق الضغط على المخلب الخلفي لاختبار منعكس المخلب الخلفي.
  6. قم بتبديل تدفق الأيزوفلوران إلى مخروط الأنف (الملف التكميلي 1).
  7. تأكد من أن نظام تخدير الأيزوفلوران منخفض التدفق للفئران (جدول المواد) يحتوي على وسادة درجة الحرارة مضبوطة على إعدادات الحرارة المنزلية ، وتأكد من ضبط مصدر البخار على ضغط خارجي.
  8. ضع الماوس المخدر في الأداة التجسيمية الرقمية (جدول المواد). ضع الأسنان الأمامية للفأر في شريط العض وضع مخروط الأنف أمام الأنف لضمان تدفق الأيزوفلوران وتثبيت الرأس في مكانه. اضبط مستوى التخدير على ما بين 2٪ -3٪ وفقا لمنعكس المخلب بعد القرص (الشكل 2 أ).
  9. ضع قضبان الأذن بالماوس في الأذنين وشدها. تأكد من أن رأس الماوس أفقي ولا يتحرك جنبا إلى جنب أو لأعلى ولأسفل. عندما يكون الرأس آمنا ، تأكد من أن الضغط الخفيف لأسفل على الجمجمة لا يتسبب في انزلاق الجمجمة أسفل قضبان الرأس.
  10. ضع مسبار درجة الحرارة في المستقيم وقم بلصق السلك على ذيل الماوس لتجنب الحركة. اضبط درجة حرارة الوسادة للحفاظ على درجة حرارة المستقيم عند 37 درجة مئوية.
  11. أضف مرهم العيون إلى العينين لمنع جفاف الهواء الضار.
  12. احلق الشعر عندما يكون الرأس ثابتا وتحت تدفق الأيزوفلوران الذي يوفره مخروط الأنف لمنع الحركة. احلق الشعر فوق الرأس باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية ، ثم قم بإزالة أي شعر متبقي باستخدام مزيل الشعر وأدوات تطبيق خشبية معقمة ذات رؤوس قطنية (الشكل 2 ب).
  13. اجعل مجال التشغيل معقما عن طريق مسح فروة الرأس باستخدام قضيب خشبي معقم برأس قطني مع الإيثانول والبيتادين ثلاث مرات لكل منهما.
  14. حقن 0.1 مل من الليدوكائين المخدر الموضعي تحت الجلد (S.Q.) تحت الجلد بين العينين والأذنين بإبرة 29 جم. هذا سيجعل فقاعة. انتظر بضع دقائق قبل قطع الجلد بالمقص.
  15. باستخدام تقنية النصائح فقط ، اسحب الجلد لأعلى بعناية باستخدام الملقط واستخدم مقصا صغيرا لإزالة جزء دائري من الجلد. امتصاص أي دم بقطعة قطن معقمة.
  16. بمجرد توقف النزيف ، نظف الجمجمة ببيروكسيد الهيدروجين (5٪) باستخدام قطعة قطن معقمة. تأكد من سهولة التعرف على معالم العظام ، بما في ذلك الخيط السهمي وتقاطع خياطة البرغماتية لتمييز البريجما ، بعد هذا الإجراء.
  17. تأكد من أن الجمجمة مسطحة بالنسبة للجهاز التجسيمي عن طريق التأكد من أن خيوط بريجما ولاجدا في نفس إحداثيات Z بالضبط. قم بذلك عن طريق وضع إبرة في ذراع المتلاعب والتحقق مما إذا كان طرف الإبرة في نفس إحداثيات Z عند لمس كلتا الغرزتين. خلاف ذلك ، اضبط زاوية الرأس عن طريق تحريك شريط العض في لوحة Z وتكرار الإجراء حتى تصبح المهارة في وضع مسطح.
  18. قم بتوصيل ماصة بجهاز المعالج الدقيق الذي يحمل إبرة لتطبيق حبر الوشم. ضع علامة على الجزء العلوي من بريجما.
  19. صفر إحداثيات المناولة الدقيقة على بريجما والانتقال إلى الإحداثيات أعلاه CA1 في الحصين الأيمن (متوسط جانبي +1.8 مم من بريجما ، الأمامي الخلفي -2.4 مم من بريجما)2. هذا هو الموقع الذي اختاره رادفانسكي ودومبيك لدراسة التنقل الافتراضي لتدرج الرائحة في الفئران 18,30. قم بحفر انبعاج دائم صغير بقطر 1 مم بعناية باستخدام مثقاب (جدول المواد) عند 10000 دورة لإحداث انبعاج دائم في الجزء العلوي من الموقع المستهدف (الشكل 2 ج).
  20. استخدم مثقاب الأسنان لفتح ثقب دائري بقطر 1.5 مم للسماح بزرع عدسة GRIN بقطر 1 مم وطول 4 مم في الدماغ (جدول المواد) (الشكل 2 د).
  21. ثقب الجافية والقشرة عن طريق إدخال إبرة 23 جم في منتصف الثقب وتحريك الإبرة إلى الدماغ ببطء (~ 0.1 مم / دقيقة) حتى تصل إلى عمق 1.25 مم تحت الجافة. قم بإزالة الإبرة ببطء من الدماغ (~ 0.1 مم / دقيقة). استخدم مسحات قطنية معقمة ومحلول ملحي لتنظيف الدم.
  22. استخدم حامل عدسة GRIN من جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس مصمم خصيصا بطرفين من الماصات الدقيقة سعة 1 مل مقطوعة لتناسب بعضهما البعض (حامل عدسة GRIN، جدول المواد) (الشكل 2E، F).
    1. قم بتوصيل حامل عدسة GRIN بجهاز المعالجة الدقيقة وقم بتشغيل الشفاط المتصل بالماصة لتثبيت عدسة GRIN. يثبت ضغط الهواء الناتج عن شفط الهواء عدسة GRIN في مكانها.
    2. استخدم عدسة GRIN بطول 4 مم وقطر 1 مم. ازرع عدسة GRIN ببطء في القشرة حتى تصل إلى عمق -1.25 مم تحت الجافية.
  23. ضع قطرة من لاصق الأنسجة السائلة (جدول المواد) في ثقب الجمجمة الدائري لإغلاق الفتحة. انتظر بضع دقائق حتى يجف.
  24. قم بإعداد الأسمنت اللاصق السريع - راتنج الميثاكريلات المتوافق حيويا - (جدول المواد) على قاعدة عدسة GRIN لإغلاقها بشكل دائم على الجمجمة. انتظر بضع دقائق واتركه يجف.
  25. قم بإيقاف تشغيل الشفاط لتحرير حامل عدسة GRIN وإزالته ببطء من أعلى عدسة GRIN التي يتم توصيلها بشكل دائم بالجمجمة في هذه المرحلة.
  26. ضع شريط الرأس في الجزء العلوي من الجمجمة ، مع توسيط الفتحة الموجودة على عدسة GRIN (الشكل 2G-I) (الملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3).
  27. ضع الأسمنت اللاصق سريع الجفاف (جدول المواد) بعناية حول قاعدة عدسة GRIN لإغلاق نافذة الجمجمة وربط قضيب الرأس بالجمجمة. ضع الأسمنت اللاصق المجفف (جدول المواد) في منتصف قضيب الرأس وعلى الجانبين لإبقائه مثبتا بإحكام على الجمجمة. تأكد من أنه جاف تماما. تأكد من عدم وضع الأسمنت اللاصق فوق عدسة GRIN ؛ خلاف ذلك ، سيؤدي ذلك إلى تدهور المسار البصري بشكل دائم وحظر الصورة.
  28. ضع قطرة من لاصق السيليكون منخفض السمية (جدول المواد) فوق عدسة GRIN للحماية من التلف المادي.
  29. قم بإيقاف تشغيل Isoflurane
  30. قم بمراقبة الرعاية الفورية بعد الجراحة حتى يستيقظ من التخدير.
    1. خذ العناية بعد الجراحة حتى الشفاء التام من الجراحة من خلال مراقبة الفئران بحثا عن علامات الألم. لا تعيد الذي خضع لعملية جراحية إلى صحبة الأخرى.
    2. راقب لفترة وجيزة الحركة حول القفص ، والأكل والشرب ، وردود الفعل الطبيعية للتعامل مع القبضة للتأكد من أنهم لا يتعرضون للألم أو الإجهاد.
    3. إذا ظهرت على علامات تلف عصبي أو تلف شديد في الأنسجة ، فقم بالقتل الرحيم لها على الفور.

2. وضع اللوح الأساسي للمنظار المصغر

ملاحظة: تبدأ إجراءات تثبيت رأس الفأر بعد أسبوعين من تعافي تماما من الجراحة. يبدأ إجراء تصوير dCA1 بعد 3 أسابيع من الجراحة بعد أن يتعافى تماما وتصبح إشارة GCaMP6f مرئية بقوة. يتم تثبيت لوحة أساسية أعلى عدسة GRIN للوصول البصري إلى مضان dCA1 GCaMP6f من خلال عدسة GRIN باستخدام منظار مصغر. استخدم هذا البروتوكول الإصدار المصغر 4 -V4 (Miniscope V4; جدول المواد).

  1. ابدأ في تثبيت رأس الماوس لمدة 10 دقائق عن طريق تثبيت قضيب الرأس بمشابك قرصة لتأقلم الماوس على أن يتم إصلاح الرأس بعد أسبوعين من الجراحة.
  2. قم بإصلاح رأس الماوس بعد 3 أسابيع من الجراحة لوضع الصفيحة الأساسية.
  3. قم بإرفاق منظار مصغر بحامل مطبوع ثلاثي الأبعاد مرفق في معالج دقيق (جدول المواد) مرفق في معالج دقيق (الشكل 3 أ ، ب).
  4. قم بإزالة لاصق السيليكون (جدول المواد) بعناية من أعلى العدسة باستخدام ملاقط دقيقة وقم بتنظيف سطح عدسة GRIN باستخدام مسح العدسة.
  5. قم بتأمين اللوح الأساسي المرفق بالمنظار المصغر مع شد برغي التثبيت على جانب اللوح الأساسي (جدول المواد) (الشكل 3C ، D).
  6. حرك نهاية المنظار المصغر حتى تصل إلى 100 ميكرومتر فوق عدسة GRIN.
  7. استخدم أشرطة التمرير لتكوين إعدادات المنظار المصغر في برنامج المنظار المصغر (جدول المواد) باتباع الخطوات من 2.8 إلى 2.10.
  8. انقر فوق شريط تمرير الطاقة في البرنامج للتحكم في الطاقة والاحتفاظ بها حوالي 10٪.
  9. انقر فوق شريط تمرير معدل الاستحواذ واحتفظ به حول 10 هرتز.
  10. يحتوي المنظار المصغر v4 على عدسة ترطيب كهربائي يمكن استخدامها للتركيز البؤري الدقيق. انقر فوق شريط تمرير التركيز البؤري لضبطه على 50٪ لإبقاء عدسة التبول الكهربائي في منتصف النطاق البؤري.
  11. استخدم البرنامج لعرض الجزء العلوي من عدسة GRIN. من الممكن رؤية الشكل الدائري لعدسة GRIN على الشاشة.
  12. اجعل المنظار المصغر أقرب إلى عدسة GRIN عن طريق ضبط الموضع المحوري باستخدام أداة المعالجة الدقيقة ومراقبة الصورة باستخدام الكمبيوتر.
    1. بمجرد أن يصبح الجزء العلوي من عدسة GRIN مرئيا ، استخدم التركيز الدقيق لأعلى ولأسفل على المعالج الدقيق للوصول إلى أفضل مستوى بؤري لتصور ومضات الخلايا. استخدم الإعداد الزائف δF / F0 في البرنامج للتحقق مرة أخرى من جودة ومضات الخلية.
    2. اضبط التركيز للسماح بأكبر عدد ممكن من الخلايا في مجال الرؤية بأعلى شدة مضان يمكن تحقيقها. في هذه المرحلة ، تأكد من أن الأوعية الدموية في بؤرة التركيز.
  13. قد يحدث أن الفأر لا يحتوي على إشارات كالسيوم عابرة - ومضات. في هذه الحالة ، تجنب الخطوات التالية (14-16) وتحقق من الماوس مرة أخرى في الأسابيع المقبلة للتحقق مرة أخرى مما إذا كانت إشارات الكالسيوم العابرة تحدث.
    ملاحظة: يمكن اتخاذ قرار بالقتل الرحيم للفأر إذا لم تحدث إشارات الكالسيوم العابرة بعد شهرين من الجراحة.
  14. بمجرد تحسين التركيز ، قم ببناء جدار من الأسمنت اللاصق السريع بعناية بين الجمجمة وأسفل الصفيحة الأساسية. احرص على عدم تثبيت المنظار المصغر على اللوح الأساسي واحرص على عدم وضع أي أسمنت على الجزء العلوي من عدسة GRIN.
  15. بمجرد أن يجف الأسمنت ، قم بإزالة المسمار اللولبي وقم بإزالة المنظار المصغر بعناية من اللوح الأساسي باستخدام المعالج الدقيق.
  16. استخدم غطاء لوحة القاعدة لحماية عدسة GRIN.

3. بناء ساحة الرائحة

ملاحظة: تحدد هذه الطريقة ساحة الرائحة الآلية بناء على تصميم كونور وآخرون 13 و Gumaste et al.14. يمكن العثور على التجميع الكامل في الرابط الموجود في جدول المواد (الملف التكميلي 4).

  1. قم ببناء غرفة بأبعاد 50 سم (طول) × 50 سم (عرض) × 25 سم (ارتفاع) مع جدارين من الأكريليك ، وسقف أكريليك ، وأرضية بيضاء من البولي فينيل كلوريد (PVC) ، وجدارين فريدين في الأمام والخلف يسهل تدفق الهواء (الشكل 4 أ).
  2. قم بتثبيت طرف شفط الهواء في الجزء الخلفي من الساحة بتصميم مدبب ومروحة كمبيوتر متصلة لسحب الهواء خارج الغرفة. استخدم مقبضا ماديا لضبط تعديل عرض نبضة المروحة (PWM) لتنظيم معدل تدفق الهواء.
    ملاحظة: يتكون هيكل قرص العسل المطبوع ثلاثي الأبعاد من جدران للأمام والخلفي من ساحة الرائحة لتسهيل التدفق الرقائقي للهواء مع الاحتفاظ بالماوس داخل10. يحتوي جدار قرص العسل في مقدمة الساحة على توهج خارجي لاستقبال كميات كبيرة من الهواء بطريقة غير مزعجة.
  3. قم بإعداد نظام توصيل المياه لتقديم مكافأة المياه عبر بدع بسيطة تحتوي على محرك متدرج Nema 17 مقترن بحقنة. يسمح برنامج تشغيل القدم الصغير A4988 بالتحكم الدقيق في الحجم الموزع (https://github.com/dougollerenshaw/syringe_pump ، الشكل 4 ب).
  4. قم بإعداد نهاية مدخل الهواء مع 4 مجموعات من مصادر الرائحة المقترنة بفوهات توصيل المياه ، مع وضع كل مجموعة على بعد 10 سم على طول المحور x لتحديد "الممرات" التي سيتنقل فيها للحصول على مكافأة مائية (الشكل 4C ، D).
  5. قم بتثبيت نظام توصيل الرائحة الذي تديره صمامات الملف اللولبي المتصلة بالأنابيب وزجاجات الرائحة (الشكل 4 د).
    ملاحظة: يتم تشغيل الصمامات باستخدام لوحة ترحيل في ترتيب يضمن تدفق الهواء النظيف أو الهواء المعطر في جميع الأوقات ، وأن حارة واحدة أو ممرات صفرية يمكن أن تستقبل هواء معطر في أي وقت. تتم إدارة مجموعة من خمسة صمامات لولبية 12 فولت باستخدام لوحة ترحيل تحتوي على 4 مرحلات. عندما يتم ضبط جميع المرحلات الأربعة على "إيقاف التشغيل" ، يكون صمام الهواء النظيف مفتوحا افتراضيا. عند فتح أي صمام رائحة واحد ، يتم إغلاق صمام الهواء النظيف تلقائيا. تتم إدارة حالة لوحة الترحيل باستخدام المخرجات الرقمية من وحدة التحكم في اردوينو الأساسية. توفر مضخة هواء حوض السمك من الدرجة الاستهلاكية الهواء الذي يقتصر على 20 مل / دقيقة باستخدام منظم تدفق الهواء اليدوي. باستخدام سلسلة من الأنابيب والمقسمات ذات القطر الداخلي 1/16 بوصة ، يوفر خط الإمداد هواء نظيفا لكل من صمامات الملف اللولبي. تضمن صمامات الفحص قبل وبعد الرائحة اتجاه تدفق الهواء. يندمج خط الهواء النظيف مع خطوط الرائحة قبل دخول الساحة لضمان تطهير الهواء المعطر عند إغلاق خطوط الرائحة.
  6. قم بتركيب كاميرا رقمية سريعة فوق الساحة لمراقبة سلوك (جدول المواد).
    ملاحظة: تتم مراقبة سلوك عند 60 هرتز باستخدام كاميرا رقمية واحدة سريعة مثبتة فوق الساحة (جدول المواد). تم تركيب عدسة C-Series ذات البعد البؤري الثابت مقاس 3.5 مم عبر محول حامل C/CS، القادر على التقاط الساحة بأكملها (العدسة البؤرية، جدول المواد).
  7. استخدم كود python مخصص لإدارة أجهزة ساحة الرائحة (جدول المواد). يدمج البرنامج الكاميرا وجميع الأجهزة اللازمة لإعداد المعلمات التجريبية والحصول على البيانات التجريبية (جدول المواد).
  8. قم بإعداد جهاز كمبيوتر متصل بلوحة تطوير Teensy 4.0 لتوفير وسائل توصيل الرائحة والمياه بوساطة الكمبيوتر (أجهزة وبرامج Odor Arena ، جدول المواد).
  9. قم بإعداد الكاميرا الرقمية لتصدير إشارة الساعة عند تسجيل إطارات الفيديو. تستخدم الإشارة للمزامنة اللاحقة مع المنظار المصغر باستخدام لوحة واجهة USB (جدول المواد) ، والتي تسجل إشارات المزامنة من كلا النظامين.
    ملاحظة: أثناء التجربة، يقوم برنامج الاكتساب المخصص أيضا بإنشاء ملف أحداث يحتوي على الأحداث التجريبية المهمة وإطار الكاميرا الذي وقع عليه الحدث. يتم أيضا إنشاء ملف الطوابع الزمنية لتحديد أي إطارات تم إسقاطها ، وهو حدث نادر (برنامج Odor Arena ، جدول المواد).

4. قياس سرعة الهواء للعمود باستخدام كاشف التأين الضوئي (PID) (الشكل 5)

ملاحظة: تكتشف هذه الطريقة المسار الزمني لعمود الرائحة من خلال PID الذي يعرض الرائحة الغازية لضوء فوق بنفسجي عالي الكثافة يؤين جزيئات الرائحة. يكتشف إخراج الجهاز جزيئات الرائحة في عمود الرائحة. تسمح هذه التقنية بتقدير سرعة الهواء في ساحة الرائحة من خلال مقارنة التأخير للكشف عن وجود الروائح التي تنتقل عبر موقعين باستخدام PID.

  1. ضع PID مصغر سريع الاستجابة على مسافتين مختلفتين. موقع واحد قريب ، وموقع آخر على بعد -10 سم - من مصدر الرائحة.
  2. قم بتغيير مفتاح GAIN في اللوحة الأمامية لوحدة تحكم PID إلى الموضع x5.
  3. قم بتغيير مفتاح PUMP في اللوحة الأمامية لوحدة التحكم PID لوضع مرتفع.
  4. تحقق من ضوء حالة الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) الذي يظهر خرج المستشعر (الجهد) في اللوحة الأمامية لوحدة التحكم في حالة عدم وجود روائح.
  5. قم بتبديل OFFSET لمقياس الجهد لتصفير خرج الجهد في حالة عدم وجود الروائح.
  6. قم بتشغيل صمام الرائحة في ساحة الرائحة.
  7. قم بقياس التأخير في اكتشاف عمود الرائحة باستخدام PID في كل موقع بعد فتح الصمام. يمكن تنفيذ هذا الإجراء في وضع عدم الاتصال عن طريق تسجيل إخراج PID وإخراج الصمام المسجل بواسطة ساحة الرائحة (تشغيل الرائحة) في وقت واحد باستخدام لوحة واجهة (جدول المواد).
  8. اقسم الفرق في التأخيرات في كل موقع على الفرق في المسافة بين PIDs لحساب سرعة الهواء للعمود.

5. فأر التدريب السلوكي في ساحة الرائحة (الشكل 6)

ملاحظة: يصف هذا القسم مهمة سلوكية مقتبسة من Findley et al.4. الفأر مقيد بالماء في اليوم السابق لتحفيز البحث عن مكافأة مائية. يتنقل الفأر في عمود الرائحة (الشكل 6 ب) باتجاه صنبور ماء يقع عند مصدر إطلاق الرائحة للحصول على تقوية للماء (3 قطرات من 10 ميكرولتر يتم تسليمها عند 1 هرتز). خلال فترة التدريب ، يتم الحفاظ على الماوس تحت قيود المياه من خلال الوصول إلى ما يصل إلى 2 مل في اليوم. تتم مراقبة وزن جسم الماوس خلال فترة تقييد الماء ويجب ألا يقل عن 85٪ من وزن الجسم الأصلي. يتلقى الفأر ما يقرب من 1 مل من الماء يوميا أثناء التدريب في ساحة الرائحة ويستكمل ب 1 مل إضافي من الماء يوميا في القفص بعد التدريب. يبقى الماوس تحت قيود الماء لمدة أقصاها 72 ساعة. يكتشف البرنامج المخصص (جدول المواد) موقع الماوس في الوقت الفعلي (60 هرتز) باستخدام تقنية طرح الخلفية البسيطة وترجمة الكائن الثنائي الحجم. يقوم المستخدم يدويا بتعيين حدود الممر ، وحدود المنزل (موقع بدء الماوس في الجزء الخلفي من الساحة) ، وحدود الهدف (بالقرب من مصدر الرائحة في المقدمة). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمستخدم أن يقرر كيف يستخدم البرنامج هذه الحدود. على سبيل المثال ، قد يصدر المستخدم الروائح فقط عندما يكون الماوس خلف حدود المنزل. لكي يحصل الماوس على مكافأة ، قد يطلب منه المستخدم البقاء داخل الممر المعطر أثناء انتقاله إلى الهدف (مصدر الرائحة). بمجرد أن يعبر الماوس الحدود المستهدفة ، قد يحصل على مكافأة. ومع ذلك ، أثناء التدريب ، يتم تعديل أي من هذه المتطلبات ببساطة عن طريق تحرير ملف "yaml" مصمم ليكون لا يحتاج إلى شرح وسهل الاستخدام.

  1. أولا ، قم بتدريب الماوس على بدء التجارب عن طريق الانتقال إلى الجزء الخلفي من الساحة (يعرف بأنه جزء من الساحة يبعد 40 سم عن الجانب الذي يتدفق فيه الهواء إلى الغرفة). انتظر حتى يذهب الماوس إلى الجزء الخلفي من الساحة ، ثم قم بتوصيل الرائحة والماء يدويا في ممر عشوائي واحد. دع الفأر يجد المصدر ويشرب الماء.
    1. كرر الإجراء عدة مرات لإنشاء ارتباط بين الرائحة والماء (الشكل 6 أ ، ب). بمجرد أن يتعلم الماوس بدء التجارب ، استخدم البرنامج الآلي لتوصيل الروائح.
  2. قم بتدريب الماوس على القيام بمهمة التنقل في الرائحة ذات المسارين باستخدام البرنامج المخصص الآلي. في هذه المهمة ، اختر بشكل عشوائي أحد منفذي الرائحة لتوصيل الرائحة وتقوية الماوس بالماء عند وصوله إلى فوهة الماء حيث يتم توصيل الرائحة. استخدم هذا البروتوكول رائحة أسيتات إيزوأميل المخفف بنسبة 1٪ في الزيوت المعدنية.
    ملاحظة: يكمل الماوس جلسة من حوالي 20 تجربة للملاحة في عمود الرائحة في حوالي 40 دقيقة. يقوم الماوس بإجراء جلسة واحدة في اليوم. يحقق الماوس المدرب نسبة مئوية من التنقل الصحيح فوق الاختيار العشوائي في نهاية الجلسة (> 65٪ من الخيارات الصحيحة). يجب أن يحقق الماوس معيار > 65٪ من الخيارات الصحيحة في مهمة التنقل في الرائحة ذات المسارين بعد 3 إلى 5 جلسات من التدريب.

6. تسجيل التألق العرضي للفأر الذي يتحرك بحرية في ساحة الرائحة

ملاحظة: تصف الطريقة تسجيل النشاط العصبي لخلايا الطبقة الهرمية (SP) في CA1 الظهري عن طريق تصوير مستشعر الكالسيوم المشفر وراثيا GCaMP6f المعبر عنه في فئران Thy19 عن طريق التصوير المصغر واسع المجال أثناء مهمة الملاحة في عمود الرائحة ثنائي الفوهة (الفيلم التكميلي 1 ، والفيلم التكميلي 2). تستغرق جلسة التصوير النموذجية 40 دقيقة ، مما يسمح للماوس بإكمال ما يقرب من 20 تجربة للتنقل عبر الرائحة. تسجل هذه التقنية الفأر لعدة أشهر.

  1. قم بإصلاح الماوس ، ضع المنظار المصغر في الجزء العلوي من اللوح الأساسي باستخدام أداة المعالجة الدقيقة وشد المسمار اللولبي.
  2. اضبط عدسة التبول الكهربائي للعثور على المستوى البؤري الأمثل مع أكبر عدد من الخلايا ذات أعلى شدة مضانة.
  3. اضبط طاقة المنظار المصغر للحصول على النطاق الديناميكي الأمثل مع نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية دون تشبع. حقق ذلك عن طريق تصوير CA1 الظهري في الفئران Thy1-GCaMP6f بقوة مصغرة تم ضبطها حوالي 30٪ بمعدل اكتساب 30 هرتز.
  4. حرر الماوس داخل ساحة الرائحة مع توصيل المنظار المصغر باللوحة الأساسية.
  5. ابدأ الاستحواذ باستخدام لوحة الواجهة لتسجيل إخراج منطق الترانزستور والترانزستور (TTL) للكاميرا الرقمية الموجودة في الجزء العلوي من الساحة وإشارة TTL من المنظار المصغر للمزامنة اللاحقة بين إطارات الفيديو السلوكية و GCaMP6f. تسجل الكاميرا الرقمية عند 60 هرتز ، ويسجل المنظار المصغر عند 30 هرتز.
  6. ابدأ في تسجيل المنظار المصغر والأفلام السلوكية وقم بتشغيل البرنامج الآلي لمهمتين للتنقل في رائحة الفوهة.

7. المعالجة المسبقة للبيانات

ملاحظة: تستخدم هذه الطريقة مسار MATLAB لمعالجة البيانات. الكود متاح على GitHub (برنامج المزامنة ، جدول المواد). يستخدم NoRMCorre31 لتصحيح الحركة ، ويستخدم EXTRACT32 للعثور على عائد الاستثمار مع إشارات مضان متغيرة بمرور الوقت تم الإبلاغ عنها على أنها تغيرات في التألق يتم تطبيعها بواسطة التألق بين عابرات الكالسيوم (δF / F0).

  1. قم بمزامنة البيانات الوصفية لساحة الرائحة وإطارات الكاميرا الرقمية وإطارات المنظار المصغر باستخدام إشارات المزامنة المسجلة بواسطة لوحة الواجهة عن طريق تشغيل كود MATLAB Synchronize_Files_JOVE.m ، المتوفر على GitHub.
  2. قم بإجراء تصحيح الحركة لإطارات المنظار المصغر المتزامنة باستخدام NoRMCorre (برنامج تصحيح الحركة ، جدول المواد).
  3. أوجد عائد الاستثمار بإشارات δF / F0 المتغيرة بمرور الوقت باستخدام EXTRACT (برنامج استخراج ROI ، جدول المواد).
  4. افصل البيانات إلى تجارب (برنامج التزامن ، جدول المواد).
  5. قم بتسمية كل إصدار تجريبي إما على أنه نتيجة أو خطأ بناء على سلوك التنقل الصحيح أو الخاطئ للماوس على التوالي.
  6. استخدم مجموعة السلوك ومرصد المسار العصبي (BENTO) 33 لتصور السلوك وعائد الاستثمار لكل تجربة منفصلة (الشكل 7 أ ، ب ، والفيلم التكميلي 3).

8. تحليل البيانات - فك تشفير الموضع المكاني من إشارات الدماغ

ملاحظة: تستخدم هذه الطريقة التعلم الآلي لفك تشفير مواضع الماوس X و Y في الساحة من عائد الاستثمار dCA17. رمز MATLAB متاح (برنامج فك تشفير إشارات الدماغ ، جدول المواد) في https://github.com/restrepd/drgMiniscope.

  1. أدخل ملف الإخراج EXTRACT.mat وملف البيانات الوصفية لساحة الرائحة إلى البرنامج drgDecodeOdorArenav2.m. يوفر مستودع GitHub هذين الملفين على سبيل المثال (برنامج المزامنة ، جدول المواد):
    dFF_file='20220804_FCM22_withodor_miniscope_sync
    _L1andL4_ncorre_ext.mat';
    arena_file='20220804_FCM22withodor_odorarena_L1
    andL4_sync.mat';
    ملاحظة: يقوم drgDecodeOdorArenav2.m بإنشاء مجموعة بيانات مقسومة على البيانات داخل التجربة التي تحتوي على إشارات عائد الاستثمار والبيانات الوصفية (مواضع X و Y للماوس ، وموقع صنبور الرائحة ، وتوصيل المياه ، وما إلى ذلك) لكل تجربة. يحلل الكود أيضا فك تشفير البيانات بين التجارب. يستخدم الكود fitrnet لتدريب شبكة عصبية اصطناعية ببيانات δF / F0 لجميع عائد الاستثمار لجميع التجارب باستثناء واحدة للتنبؤ بمواضع X و Y والتنبؤ بموضع التجربة التي تم استبعادها باستخدام إجراء ترك واحد.
  2. تقوم الشبكة العصبية بإرجاع موضعي X و Y كإخراج. استخدم الشبكة العصبية المدربة لعمل تنبؤات. استبعدت المدخلات التجارب التي لم يتم استخدامها لتدريب الشبكة على التنبؤ بمواضع X و Y للماوس في الساحة من عائد الاستثمار (الشكل 8 أ ، ب).

النتائج

يسمح استخدام هذا الإجراء بتصور وتسجيل عابرات مضان dCA1 GCaMP6f في الفئران التي تتنقل في ساحة الرائحة للعثور على مصدر الروائح (الشكل 6 أ ، ب ، الفيلم التكميلي 1 ، والفيلم التكميلي 2). يتم تصحيح الصور الفلورية بالحركة باستخدام NoRMCorre ، ويتم استخدام EXTRACT لاستخراج عائد الاستثمار. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح التسجيل باستخدام لوحة واجهة بمزامنة إشارات δF / F0 من عائد الاستثمار مع أحداث توصيل الرائحة والمياه في ساحة الرائحة (الشكل 7 أ) ، وكذلك مع حركة الماوس في ساحة الرائحة (الشكل 7 ب ، والفيلم التكميلي 3). تتضمن النتيجة التمثيلية للفأر الذي يتنقل في عمود الرائحة عددا كبيرا من عابرات الكالسيوم أثناء المهمة (الشكل 7 أ ، ب). بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن فحص كيفية محاذاة استجابات الكالسيوم مع وجود الرائحة ومكافأة الماء (الشكل 7 أ). يوفر تصور التجارب الفردية باستخدام BENTO معلومات حول استجابات الكالسيوم في مراحل مختلفة من التجربة ، بما في ذلك بدء التجربة ، واتخاذ القرار ، والتنقل ، والشرب ، والعودة إلى الجزء الخلفي من الساحة (الشكل 7 ب). نقلت الطريقة رؤى قيمة فيما يتعلق بالعلاقة بين استجابات الكالسيوم CA1 وسلوك الفئران أثناء مهمة الملاحة الموجهة نحو الرائحة.

يمكن أن توفر تسجيلات PID معلومات مهمة حول عمود الرائحة وسرعة الهواء للعمود. تظهر النتيجة التمثيلية زيادة في استجابة PID بعد فتح الصمام لتحرير عمود الرائحة داخل ساحة الرائحة (الشكل 5 أ). علاوة على ذلك ، ينتج عن البروتوكول فك تشفير مواضع X و Y للماوس من إشارات δF / F0 لعائد الاستثمار dCA1 (الشكل 8). تتنبأ هذه التقنية بالموقع المكاني للفأر أثناء مهمة الملاحة ذات عمود الرائحة بناء على استجابات CA1 ، وهو أمر وثيق الصلة بفهم أفضل لكيفية معالجة الخلايا العصبية CA1 للرائحة والمعلومات المكانية. يعد فك تشفير مسار الفأر من إشارات الكالسيوم العصبية في dCA1 أمرا مهما لأنه يكشف كيف تمثل الخلايا العصبية في CA1 الظهرية خريطة معرفية للرائحة والمعلومات المكانية لأداء المهمة المعقدة المتمثلة في التنقل في عمود الرائحة. تم توسيع الطريقة لتشمل عائد استثمار مختلف يتصرف حصريا كخلايا مكانية وخلايا أخرى تستجيب لتحفيز الرائحة. يمكن تأكيد فك التشفير الناجح لمسار الفأر من إشارات المجموعة العصبية من خلال الارتباط القوي بين التنبؤ بفك التشفير ومواضع X و Y الحقيقية للفأر.

figure-results-1
الشكل 1: خط أنابيب الدراسة. (أ) تتكون الجراحة التجسيمية من زرع عدسة GRIN في طبقة CA1 من الحصين وغطاء أمامي على الجمجمة لتثبيت الرأس للفأر. (ب) يتم وضع صفيحة أساسية في الجزء العلوي من عدسة GRIN للسماح بالوصول بصريا إلى مضان الخلايا العصبية CA1 باستخدام منظار مصغر. (ج) يتم تدريب الماوس على مهمة الملاحة في عمود الرائحة. (د) تسجيل الحركة الحرة لسلوك الفأر والخلايا العصبية CA1 التي تتنقل في عمود الرائحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: الجراحة التجسيمية. (أ) ضع الفأر المخدر في الجهاز التجسيمي. اضبط مستوى التخدير بين 2 إلى 3٪ وفقا لذلك مع استجابة منعكس مخلب القرص (ب) حلق الشعر فوق الرأس. (ج) قم بحفر انبعاج دائم صغير بعناية باستخدام مثقاب لإحداث انبعاج دائم في الجزء العلوي من الموقع المستهدف. (د) استخدم مثقاب الأسنان لفتح ثقب دائري بقطر 1.5 مم للسماح بزرع عدسة GRIN بقطر 1 مم وطول 4 مم في الدماغ. (ه) قم بتوصيل حامل عدسة GRIN بجهاز المعالجة الدقيقة وقم بتشغيل الشفاط المتصل بالماصة لتثبيت عدسة GRIN. (و) زرع عدسة GRIN ببطء في القشرة حتى تصل إلى عمق -1.25 مم تحت مادة الجافية. (ز) رأس ثابت توضيحي بعد الوفاة يظهر صفيحة الرأس واللوحة الأساسية المثبتة على الجمجمة بعدسة GRIN المزروعة. (ح) التصوير المقطعي المحوسب بعد الوفاة للرأس الذي يوضح قضيب الرأس في الجزء العلوي من الجمجمة وعدسة GRIN المزروعة داخل الجمجمة. (ط) تصميم لوحة الرأس لتثبيت رأس الماوس. في هذا التصوير غير مغصب لتسهيل تحسين التصور التشريحي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: وضع لوحة قاعدة المصغر. (أ) حامل مصغر مطبوع ثلاثي الأبعاد مقترنا بمناور دقيق. (ب) منظار صغير متصل بحامله. (ج) ربط الصفيحة الأساسية بالمنظار المصغر. (د) شد المسمار المثبت لتثبيت اللوح الأساسي على المنظار المصغر. يتم تحرير برغي التثبيت بعد تثبيت اللوح الأساسي على جمجمة الماوس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4. بناء ساحة الرائحة. (أ) غرفة شفافة ساحة الرائحة. هناك كاميرا رقمية علوية لتسجيل سلوك الماوس. (ب) تتحكم المحركات المتدرجة المقترنة بالمحاقن في توصيل المياه لمكافأة الماوس. (ج) منظر من داخل ساحة الرائحة يظهر هيكل قرص العسل يستخدم لإنتاج تدفق رقائقي وأربعة خطوط توصيل للرائحة. (د) نظام توصيل الرائحة ، بما في ذلك الأنابيب والصمامات وزجاجات الروائح التي يتم عرضها من خارج ساحة الرائحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تسجيل عمود الرائحة. (أ) عمود الرائحة المسجل باستخدام كاشف التأين الضوئي (PID). المتوسط (أزرق غامق) ± الانحراف المعياري (أزرق فاتح) لخمسة آثار PID لعمود رائحة ينتشر بسرعة 4.23 سم / ثانية في ساحة الرائحة. مصدر رائحة على بعد 2 سم من أرضية ساحة الرائحة. يوفر رأس المستشعر الخاص ب PID إشارة جهد لتركيز الغاز في عمود الرائحة. (ب) التسجيل بالليزر لعمود الرائحة مع تدفق غير محدود بسرعة 20 سم / ثانية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: التدريب السلوكي للفأر. (أ) يتعلم الفأر التنقل نحو عمود الرائحة المنبعث على الممر الأيمن. يتعلم الفأر بدء التجربة بالذهاب إلى الجزء الخلفي من ساحة الرائحة ، ويقرر جانبا للتنقل نحو عمود الرائحة ، ويشرب مكافأة مائية. (ب) يتعلم الفأر التنقل نحو عمود الرائحة المنبعث على الممر الأيسر. يكافأ الماوس بالرائحة إذا كان ينتقل إلى الممر الصحيح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: المعالجة المسبقة للبيانات. (أ) آثار الكالسيوم المتزامنة مع أحداث ساحة الرائحة للعديد من التجارب. تبدأ كل تجربة بمفرجة توصيل الرائحة باللون الأحمر ، وتنتهي التجارب بمكافأة بنبض توصيل المياه باللون الأزرق. تظهر آثار الكالسيوم δF / F0 (بدون وحدة) لكل عائد استثمار باللون الأسود. يشير كل سطر إلى عائد الاستثمار. يتم استخدام لوحة واجهة لتسجيل مخرجات TTL للكاميرا العلوية في ساحة الرائحة والكاميرا المصغرة لمزامنة الإطارات. يستخدم NorMCorre لتصحيح ضوضاء الحركة من إطارات المنظار المصغر ويستخدم EXTRACT للعثور على عائد الاستثمار واستخراج آثار الكالسيوم δF / F0. (ب) تجربة فردية تمثيلية لفأر يتنقل في عمود. لوحظ التصور المتزامن للسلوك المتزامن (اللوحة اليسرى) و δF / F0 آثار الكالسيوم (اللوحة اليمنى) من كل عائد استثمار لتجربة واحدة مع BENTO. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 8. فك تشفير موضع الماوس من إشارات CA1. فك تشفير موضع X و Y للماوس من عائد الاستثمار CA1. يظهر التنبؤ بفك التشفير باللون الأزرق ويظهر الموضع الحقيقي لأرض الماوس باللون الأحمر. ترتبط الآثار المتوقعة ارتباطا وثيقا بالحقيقة الأرضية. (أ) فك تشفير مواضع X من عائد الاستثمار (معامل ارتباط بيرسون = 0.88). (ب) فك تشفير مواضع Y من عائد الاستثمار (معامل ارتباط بيرسون = 0.88). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيلم التكميلي 1: مثال تمثيلي للإطارات السلوكية والمصغرة المتزامنة للفأر الذي يتنقل نحو عمود رائحة في الممر الأيسر. (أ) الإطارات السلوكية للفأر يرتدي منظارا صغيرا ويتنقل داخل ساحة الرائحة. (ب) إطارات المنظار المصغرة للفأر تظهر عابرات الكالسيوم الخام المسجلة من خلال عدسة GRIN. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.

الفيلم التكميلي 2: مثال تمثيلي للإطارات السلوكية والمصغرة المتزامنة للفأر الذي يتنقل نحو عمود رائحة في الممر الأيمن. (أ) الإطارات السلوكية للفأر يرتدي منظارا صغيرا ويتنقل داخل ساحة الرائحة. (ب) إطارات المنظار المصغرة للفأر تظهر عابرات الكالسيوم الخام المسجلة من خلال عدسة GRIN. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.

الفيلم التكميلي 3: عرض BENTO للبيانات المعالجة لسلوك الماوس وإشارات الدماغ. اللوحة اليسرى: يتنقل الماوس نحو الممر الأيمن في الساحة. يتم عرض التعليقات التوضيحية للسلوك بألوان مختلفة. اللوحة اليمنى: δF / F0 إشارات الكالسيوم لحركة الماوس. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.

الملف التكميلي 1: NoseconeRender.png. ملف لمخروط الأنف المطبوع ثلاثي الأبعاد لإجراء تخدير الأيزوفلوران. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: HeadbarRender.png. ملف لشريط الرأس لتثبيت الماوس. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: HeadbarTechnicalDrawing.png. ملف لشريط الرأس لتثبيت الماوس. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: ArenaFig_Draft2.tiff. تخطيط مفصل لساحة الرائحة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

يحدد هذا البروتوكول بدقة خطوات تسجيل الخلايا المكانية والخلايا المستجيبة للرائحة في منطقة dCA1 من الحصين للفئران التي تتنقل في عمود الرائحة. تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول الجراحة التجسيمية ، ووضع اللوح الأساسي المصغر ، وبناء منطقة الرائحة ، وفحص العمود في ساحة الرائحة ، والتدريب السلوكي ، وتسجيل المنظار المصغر للماوس الذي يتحرك بحرية ، والمعالجة المسبقة للبيانات ، وتحليل البيانات. بالإضافة إلى ذلك ، يشرح البروتوكول عملية فك تشفير مسار الماوس من تسجيلات dCA1.

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في الجراحة التجسيمية في اتباع الإحداثيات المتعلقة بالبريجما لوضع عدسة GRIN في المكان الصحيح. يتمثل أحد قيود الطريقة في التأخير بين الجراحة والوقت اللازم لبدء مراقبة إشارات GCaMP6f ، والتي يمكن أن تستغرق 2-4 أسابيع. يجب أن يكون الماوس جاهزا للاستخدام بعد هذه الفترة الحرجة. يتمثل الاختلاف بين البروتوكول الحالي والبروتوكولات السابقة24،25،26،27 في استخدام الفئران Thy1-GCaMP6f التي تعبر بالفعل عن GCaMP6f في CA1 بدلا من حقن فيروس AAV-GCaMP6f في الحصين. يوفر الوقت أثناء الجراحة ولا يتطلب وقتا للانتظار للتعبير عن فيروس AAV في الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، لا يشفط هذا البروتوكول الدماغ ويستخدم الأيزوفلوران بدلا من الكيتامين / الزيلازين ، مما يوفر تحكما أفضل في الجرعة لمنع الجرعات الزائدة. أحد قيود الطريقة هو الانحراف البصري لعدسة GRIN ، مما يحد من مجال الرؤية. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة لوضع اللوح الأساسي في إبقاء عدسة التبول الكهربائي في المركز لمنع وجود قيود في ضبط اللوحة Z بعد تثبيت اللوح الأساسي على الرأس. أحد القيود المفروضة على بناء ساحة الرائحة هو تعقيد النظام ، والذي قد يستغرق عدة أشهر وقد يتطلب مساعدة مهندس. أحد قيود التدريب السلوكي هو أن الفئران قد تفضل جانبا واحدا من ساحة الرائحة على الجانب الآخر. تتمثل إحدى طرق التغلب على هذه المشكلة في التجارب البديلة التي تكافئ الماوس على التنقل نحو الممرات اليمنى واليسرى.

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة لفحص العمود في الحفاظ على محاذاة إبرة PID مع مصدر الرائحة لاكتشاف مسار العمود. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في تسجيل المنظار المصغر الماوس الذي يتحرك بحرية في التأكد من أن السلك المحوري الصغير لا يتشابك أثناء المهمة ، والذي يمكن منعه باستخدام مبدل. يمكن استخدام بالونات الهيليوم لمنع السلك المحوري الصغير من القدوم أمام الماوس. من الأهمية بمكان أن تقوم المعالجة المسبقة للبيانات بمزامنة نبضات TTL للكاميرا العلوية الرقمية لساحة الرائحة والكاميرا المصغرة. بالنسبة لإجراء EXTRACT ، يوصى باستخدام معالجة غير سالبة لاستخراج إشارات عائد الاستثمار و δF / F0 بشكل أفضل. ينتج عن EXTRACT فحصا بصريا لآثار كل عائد استثمار لاستبعاد الآثار السيئة. من الأهمية بمكان فك تشفير مواضع X و Y للماوس من عائد الاستثمار للحصول على مجموعة بيانات كبيرة مع مئات العصور لتدريب الشبكة العصبية الاصطناعية بشكل أفضل.

تتمثل أهمية طريقة التسجيل التي تتحرك بحرية فيما يتعلق بالطرق الحالية الثابتة بالرأس في دراسة سلوك الماوس في سياق ذو صلة من الناحية الإثيولوجية مع حركة الرأس المناسبة للتنقل في عمود رائحة معقد. هذه الطريقة قابلة للتطبيق للتحقيق في الدور الديناميكي للخلايا العصبية dCA1 في الملاحة المعقدة ذات الرائحة الكريهة. علاوة على ذلك ، لا يقتصر الإجراء على الحصين أو الشم. تشمل التطبيقات المحتملة الأخرى لهذه التقنية دراسة دور مناطق الدماغ المختلفة والطرائق الحسية ، بما في ذلك التطبيقات الممكنة في الملاحة المرئية باستخدام مصابيح LED للإشارة إلى الممرات المكافأة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة في تجارب الحلقة المغلقة في الوقت الفعلي حيث يؤدي فك تشفير الكالسيوم العصبي من السكان إلى تحفيز عصبي أو ردود فعل حسية20،34،35،36.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (NIH UF1 NS116241 و NIH R01 DC000566) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF BCS-1926676). يشكر المؤلفون أندرو سكالون للمساعدة في إنشاء غرفة Odor Arena.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Arduino MicroArduinoMicro
متوافق حيويا Methacrylate ResinParkellS380C & B-Metabond لاصق Luting الأسمنت
فك تشفير إشارات الدماغ البرمجياتCU Anschutzhttps://github.com/restrepd/drgMiniscope
مثقاب الأسنانOsadaLHP-6AZ210015
صندوق حفر الأسنانOsadaXL-23030000 دورة في الدقيقة أداة
تجسيمية رقميةStoelting51730DAuster Stereotaxic Instument, #51904 ذراع مناور رقمي, 3-محاور, وظيفة إضافية, LEFT 
مثقابFST أدوات العلومالدقيقة 19007-05قطر الطرف 0.5 مم
كاميرا رقميةسريعة Edmund OpticsBFS-U3-63S4CFLIR Blackfly S
عدسة بؤريةEdmund OpticsC-Series3.5 مم
عدسة GRINInscopix1050-0045951 مم وطول 4 مم
عدسة GRINUCLAhttp://miniscope.org/index.php/Surgery_Protocol
لاصق الأنسجة السائلة3M1469CVetbond Tissue لاصق
نظام تخدير منخفض التدفق للفئرانكينت العلميةSomnoSuitehttps://www.kentscientific.com/products/somnosuite/
سيليكون منخفض السميةWPI & ndash ؛ أدوات الدقة العالميةKwik-sil
miniPID ControllerASI & ndash ؛ شركة أورورا العلميةنموذج 200Bالاستجابة مصغرة كاشف التأين
الضوئي مصغر V4 حاملUCLANAhttps://github.com/Aharoni-Lab/Miniscope-v4/tree/master/Miniscope-v4-Holder
Miniscope V4LabmakerNAhttps://www.labmaker.org/products/miniscope-v4
Miniscope Base Plate V2LabmakerNAhttps://www.labmaker.org/products/miniscope-v4-base-plates-variant-2-pack-of-10
Miniscope DAQ-QT برنامجUCLAhttps://github.com/Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software/wiki
Motion CorrectionCU Anschutzhttps://github.com/restrepd/drgMiniscope
Odor Arena Hardware مخصصنموذجثلاثي الأبعادhttps://www.dropbox.com/scl/fo/lwtpqysnpzis32mhrx3cd/ADomsxyhxu42sqDmTBl2O6k?rlkey=b3l4809eradundt5l3iz0gq74& ؛
dl = 0
Odor Arena SoftwareCUAnschutzhttps://github.com/wryanw/odorarena
Odorant Isoamyl AcetateAldrich Chemical Co06422AXمخفف بنسبة 1٪ في الزيت المعدني عديم الرائحة
RHD USB Interface BoardIntan TechnologiesC3100توقف المنتج. بدلا من ذلك ، استخدم لوحة أخرى مكافئة.
ROI استخراج البرمجياتCU Anschutzhttps://github.com/restrepd/drgMiniscope
Sutter MicromanipulatorSutter Instrument CompanyMP-285
برنامج التزامنCU Anschutzhttps://github.com/fsimoesdesouza/Synchronization
Thy1-GCaMP6f الفئرانمختبر جاكسونIMSR_JAX 028281C57BL / 6J-Tg (Thy1-GCaMP6f)GP5.12Dkim / J)
قطر حامل شركة لاصق سريع Software

المراجع

  1. Adoff, M. D., Climer, J. R., Davoudi, H., Marvin, J. S., Looger, L. L., Dombeck, D. A. The functional organization of excitatory synaptic input to place cells. Nat Commun. 12 (1), 3558(2021).
  2. Radvansky, B. A., Oh, J. Y., Climer, J. R., Dombeck, D. A. Behavior determines the hippocampal spatial mapping of a multisensory environment. Cell Rep. 36 (5), 109444(2021).
  3. Lewis, S. M., et al. Plume dynamics structure the spatiotemporal activity of mitral/tufted cell networks in the mouse olfactory bulb. Front Cell Neurosci. 15, 633757(2021).
  4. Findley, T. M., et al. Sniff-synchronized, gradient-guided olfactory search by freely moving mice. ELife. 10, e58523(2021).
  5. Gire, D. H., Kapoor, V., Arrighi-Allisan, A., Seminara, A., Murthy, V. N. Mice develop efficient strategies for foraging and navigation using complex natural stimuli. Curr Biol. 26 (10), 1261-1273 (2016).
  6. Liu, A., Papale, A. E., Hengenius, J., Patel, K., Ermentrout, B., Urban, N. N. Mouse navigation strategies for odor source localization. Front Neurosci. 14, 218(2020).
  7. Tariq, M. F., et al. Using head-mounted ethanol sensors to monitor olfactory information and determine behavioral changes associated with ethanol-plume contact during mouse odor-guided navigation. eNeuro. 8 (1), (2021).
  8. Rigolli, N., Reddy, G., Seminara, A., Vergassola, M. Alternation emerges as a multi-modal strategy for turbulent odor navigation. ELife. (11), e76989(2022).
  9. Ma, M., et al. Sequential activity of CA1 hippocampal cells constitutes a temporal memory map for associative learning in mice. Curr Biol. 34 (4), 841-854 (2024).
  10. Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nat Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
  11. Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: Past, present and future. Front Cell Neurosci. 13, 141(2019).
  12. Flusberg, B. A., et al. High-speed, miniaturized fluorescence microscopy in freely moving mice. Nat Methods. 5 (11), 935-938 (2008).
  13. Connor, E. G., McHugh, M. K., Crimaldi, J. P. Quantification of airborne odor plumes using planar laser-induced fluorescence. Exp Fluids. 59 (9), 137(2018).
  14. Gumaste, A., et al. A Comparison between mouse, in silico, and robot odor plume navigation reveals advantages of mouse odor tracking. eNeuro. 7 (1), (2020).
  15. Gumaste, A., et al. Behavioral discrimination and olfactory bulb encoding of odor plume intermittency. ELife. 13, e85303(2024).
  16. Marin, A. C., Schaefer, A. T., Ackels, T. Spatial information from the odour environment in mammalian olfaction. Cell Tissue Res. 383 (1), 473-483 (2021).
  17. Eichenbaum, H. The role of the hippocampus in navigation is memory. J Neurophysiol. 117 (4), 1785-1796 (2017).
  18. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  19. Wirtshafter, H. S., Disterhoft, J. F. In vivo multi-day calcium imaging of CA1 hippocampus in freely moving rats reveals a high preponderance of place cells with consistent place fields. J Neurosci. 42 (22), 4538-4554 (2022).
  20. Mizuta, K., Sato, M. Multiphoton imaging of hippocampal neural circuits: techniques and biological insights into region-, cell-type-, and pathway-specific functions. Neurophotonics. 11 (3), 033406(2024).
  21. Radvansky, B. A., Dombeck, D. A. An olfactory virtual reality system for mice. Nat Commun. 9 (1), 839(2018).
  22. Almeida-Santos, A. F., et al. Social isolation impairs the persistence of social recognition memory by disturbing the glutamatergic tonus and the olfactory bulb-dorsal hippocampus coupling. Sci Rep. 9 (1), 473(2019).
  23. Dana, H., et al. Thy1-GCaMP6 transgenic mice for neuronal population imaging in vivo. PLoS One. 9 (9), e108697(2014).
  24. Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. Stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging. J Vis Exp. (176), e63049(2021).
  25. Hsiao, Y. -T., Wang, A. Y. -C., Lee, T. -Y., Chang, C. -Y. Using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice. J Vis Exp. (172), e62611(2021).
  26. Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Curr Protoc Neurosci. 86 (1), e56(2019).
  27. Guo, D., Gürkan Özer, A., Uusisaari, M. Y. In vivo calcium imaging in mouse inferior olive. J Vis Exp. (172), e62222(2021).
  28. Yun, M., Shin, J., Jung, M. W. Protocol for calcium imaging of dorsal and ventral CA1 neurons in head-fixed mice. STAR Protoc. 4 (3), 102439(2023).
  29. Yun, M., Hwang, J. Y., Jung, M. W. Septotemporal variations in hippocampal value and outcome processing. Cell Rep. 42 (2), 112094(2023).
  30. Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties. Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).
  31. Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. J Neurosci Methods. 291, 83-94 (2017).
  32. Inan, H., et al. Fast and statistically robust cell extraction from large-scale neural calcium imaging datasets. bioRxiv. , (2021).
  33. Segalin, C., et al. The mouse action recognition system (MARS) software pipeline for automated analysis of social behaviors in mice. ELife. 10, e63720(2021).
  34. Chen, Z., et al. A hardware system for real-time decoding of in vivo calcium imaging data. ELife. (12), e78344(2023).
  35. Xue, F., et al. Multi-region calcium imaging in freely behaving mice with ultra-compact head-mounted fluorescence microscopes. Natl Sci Rev. 11 (1), nwad294(2024).
  36. Tabourin, L., Bretzner, F., Galstian, T. Towards a mini-endoscope design with spatially selective excitation and imaging. Biomed Opt Express. 15 (3), 1750-1760 (2024).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تصوير الكالسيومالمنطقة CA1 في الحصينالملاحة في سحابة الرائحةفئران GCaMP6fالتصوير بعدسات GRINتصحيح الحركةنشاط المجموعة العصبيةكاشف التأين الضوئيفك تشفير المسار المكاني
منظار صغير يسجل إشارات الكالسيوم في الحصين للفئران التي تتنقل في عمود الرائحة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.