مقالة منهجية

توصيف الصفائح الدموية المخثرة عن طريق قياس التعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة من الصفائح الدموية البشرية المنقاة

1.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67042

⸱

نوفمبر 29, 2024

 ,  , 
1French Reference Centre for Inherited Platelet Disorders, University Hospital of Bordeaux, 2Department of Haematology, University Hospital of Bordeaux, 3Inserm U1034, Biology of Cardiovascular Disease

في هذه المقالة

ملخص

تم ربط تكوين الصفائح الدموية المخثرة بزيادة خطر تجلط الدم. يتم تقديم بروتوكول دقيق لعزل الصفائح الدموية المغسولة عن دم الإنسان ، يهدف إلى تحديد التعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة ، وهي سمات مميزة للصفائح الدموية المخثرة.

الملخص

تعمل الصفائح الدموية المنشطة على تعزيز التخثر بشكل أساسي عن طريق تعريض فوسفوليبيد فوسفاتيديل سيرين (PS) على أسطح الغشاء الخارجي وإطلاق الحويصلات الدقيقة التي تعبر عن PS والتي تحتفظ ببنية الغشاء الأصلية والمكونات السيتوبلازمية لخلاياها الأصلية. يسهل الوصول إلى الفوسفاتيديل سيرين ربط عوامل التخثر الرئيسية ، مما يؤدي إلى تضخيم الكفاءة التحفيزية لإنزيمات التخثر بشكل كبير ، بينما يعمل إطلاق الحويصلات الدقيقة كوسيط محوري للإشارات بين الخلايا. تلعب الصفائح الدموية المخثرة دورا مهما في تثبيت الجلطة أثناء الإرقاء ، وترتبط نسبتها المتزايدة في مجرى الدم بزيادة خطر تجلط الدم. لقد ثبت أيضا أن الحويصلات الدقيقة للصفائح الدموية غنية بعوامل النمو التي تعزز التئام الجروح والتعديل الالتهابي. يشكل تحليل التعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة باستخدام قياس التدفق الخلوي تحديات كبيرة بسبب صغر حجمها والعدد المحدود من الأحداث الإيجابية لعلامات الاهتمام. على الرغم من التقدم الكبير في العقد الماضي ، لا تزال طرق تقييم التعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة قيد التقدم. لسوء الحظ ، لا يوجد بروتوكول واحد قابل للتطبيق عالميا ، ويجب تقييم عدة عوامل لتحديد المنهجية الأنسب لكل تطبيق محدد. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لعزل الصفائح الدموية المغسولة عن دم الإنسان ، متبوعا بتنشيط الكولاجين و / أو الثرومبين ، لقياس التعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة التي تميز الصفائح الدموية المخثرة. تم تصميم هذا البروتوكول لتسهيل التحضير الأولي للبلازما الغنية بالصفائح الدموية وعزل الصفائح الدموية المغسولة. أخيرا ، يتم تحديد التعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، مما يتيح تحديد الصفائح الدموية المخثرة.

المقدمة

يعد تكوين مادة تخثر الصفائح الدموية أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على الإرقاء1،2،3. تتضمن هذه العملية التعبير عن الدهون الفوسفورية الناجمة عن ناهض على غشاء الصفائح الدموية ، وهو أمر ضروري لتجميع مجمعات التيناز والبروثرومبيناز1،3،4. بعد تنشيط الصفائح الدموية ، يتم أيضا إطلاق الحويصلات الدقيقة للصفائح الدموية بشكل مستمر 5,6. الحويصلات الدقيقة (قطرها من 50 نانومتر إلى أكثر من 1 ميكرومتر) تغلف كل من بنية الغشاء والمكونات السيتوبلازمية للخلايا الأصلية7،8. تعتبر الحويصلات الدقيقة وسطاء مهمين للإشارات بين الخلايا9،10 وكذلك مستودعات لعوامل النمو التي تعزز التئام الجروح والتعديل الالتهابي11،12. كما تم اقتراح أن تكون الحويصلات الدقيقة أكثر تخثر من 50 إلى 100 مرة من الصفائح الدموية المنشطة13. والجدير بالذكر أن الأدلة الحديثة تشير إلى أن الصفائح الدموية المخزنة يتم تنشيطها ، مما يؤدي إلى إنتاج الحويصلات الدقيقة - وهذا له تداعيات محتملة على ممارسة العلاج بنقل الصفائح الدموية. مدة التخزين الممتدة للحويصلات الدقيقة ونشاط التخثر المتزايد يجعلها بديلا واعدا للصفائح الدموية في تطبيقات نقلالدم 14.

تم إجراء ابتكارات منهجية لتقييم تكوين مواد تخثر الصفائح الدموية بشكل مباشر وغير مباشر في كل من الظروف الصحية والمرضية4،14،15. قدمت تقييمات التعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة باستخدام الصفائح الدموية المنقاة بيانات جديدة حول كيفية اضطراب استجابات تكثر الصفائح الدموية في الأمراض البشرية المتنوعة1،4. يفتح هذا المجال البحثي المتنامي أيضا آفاقا للتدخلات العلاجية1،4. ومع ذلك ، فإن عزل وتحليل الصفائح الدموية المنقاة من الدم يستغرق وقتا طويلا ، ويتطلب معدات مختبرية متخصصة ، وبالتالي ، فهي غير قابلة للتكيف حاليا مع التشخيص السريري الروتيني16 ، 17. يعد تحليل التعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة أمرا صعبا أيضا نظرا لصغر حجمها وعدد الأحداث الإيجابية لعلامات الاهتمام18،19.

كان قياس التدفق الخلوي ، الذي يستفيد من ربط الفلورسنت Annexin-V ، حجر الزاوية في تقييم تعبير PS على الصفائح الدموية والحويصلات الدقيقة منذ إنشائها قبل عقدينمن الزمن 20. لقد اكتسب قبولا واسع النطاق في فحص الصفائح الدموية والحويصلات الدقيقة المخثرة21،22. لذلك ، يتم تقديم بروتوكول محسن هنا يمكن استخدامه لعزل الصفائح الدموية المنقاة من عينات الدم باستخدام التقنية التي طورتها مجموعة Cazenave23 ، والتوصيف اللاحق للتعرض للفوسفاتيديل سيرين وإطلاق الحويصلات الدقيقة عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد تنشيط الصفائحالدموية 24. سيسهل هذا البروتوكول مزيدا من الدراسة والتوصيف المتعمق للصفائح الدموية المخثرة في المجموعات السريرية ذات الأهمية.

البروتوكول

يتبع البروتوكول الإرشادات وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في مستشفى جامعة بوردو. تم الحصول على عينات الدم من متطوعين أصحاء قدموا موافقة مستنيرة ، وتمت معالجة هذه العينات وفقا للبروتوكولات المؤسسية. تم استبعاد المتبرعين الذين تناولوا أي مواد يمكن أن تؤثر على وظيفة الصفائح الدموية إذا تم تناول هذه المواد في غضون 10 أيام قبل التجارب. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المتطوعين الأصحاء لجمع دمائهم ونشر بياناتهم. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. جمع الدم وإعداد الصفائح الدموية المغسولة

  1. جمع الدم الوريدي المحيطي في أنابيب تجميع تحتوي على مضاد التخثر النشط ثلاثي سترات الصوديوم مع حامض الستريك وسكر العنب (ACD) بعد التخلص من أول 3 مل.
  2. بعد التجميع ، اقلب الأنبوب برفق لخلط الدم مع ACD واترك الخليط يرتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل الطرد المركزي.
  3. عد الصفائح الدموية باستخدام عداد خلوي آلي قبل الطرد المركزي لتحديد السرعة الصحيحة للطرد المركزي (الجدول 1). قم بإعداد البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) عن طريق الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) دون استخدام الفرامل لتحسين استعادة الصفائح الدموية.
    ملاحظة: ستنتج هذه الخطوة ثلاث طبقات في العينة: الطبقة العليا التي تحتوي على البلازما والصفائح الدموية وجزء صغير من خلايا الدم البيضاء. طبقة وسطى غنية بخلايا الدم البيضاء ؛ وطبقة سفلية تتكون من خلايا الدم الحمراء. انقل البلازما الغنية بالصفائح الدموية بعناية من الطبقة العليا إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل لتجنب التلوث بخلايا الدم الحمراء والبيضاء.
  4. أضف إلى PRP 1 مل من ACD-A (انظر الجدول 2) و 6.25 ميكرولتر من الأبيراز لكل 9 مل.
    ملاحظة: يعمل الأبيراز ، بتركيز 0.02 وحدة / مل ، على تحلل آثار ATP أو ADP التي تفرزها الصفائح الدموية ، وبالتالي منع إزالة حساسية مستقبلات الصفائح الدموية ADP والحفاظ على شكل الصفائحالدموية 25. يمكن أيضا تضمين مثبط البروستاسيكلين PGI2 (0.5 ميكرومتر) مع الأبيراز لمنع تنشيط الصفائح الدموية.
  5. تحضير حبيبات الصفائح الدموية عن طريق الطرد المركزي عند RT عند 1100 × جم لمدة 10 دقائق. استنشاق المادة الطافية التي تحتوي على البلازما الفقيرة للصفائح الدموية (PPP) باستخدام طريقة لطيفة ، مثل ماصة باستور ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول الغسيل (انظر الجدول 3 والجدول 4). قم بتجانس برفق باستخدام ماصة ، ثم أضف 3-4 مل إضافية من محلول الغسيل.
    ملاحظة: يتم تقليل مستوى الكالسيوم لمنع التخثر بعوامل الجلطة الموجودة في البلازما. في هذه المرحلة ، تمت إزالة البلازما الفقيرة بالصفائح الدموية تماما ، مما يمنع تكوين الجلطة وتنشيط الصفائح الدموية عن طريق إنتاج الثرومبين.
  6. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند RT عند 1100 × جم لمدة 10 دقائق. شفط المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول الغسيل. انقل 150 ميكرولتر من تعليق الصفائح الدموية إلى أنبوب سعة 1.5 مل لعد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي. ثم أعد تعليق الحبيبات ب 3-4 مل من محلول الغسيل.
  7. قم بإجراء الطرد المركزي النهائي عند 1100 × جم لمدة 10 دقائق (عند RT). استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الصفائح الدموية في حجم المخزن المؤقت للتفاعل (انظر الجدول 5 والجدول 6) لتحقيق تركيز نهائي قدره 5 × 1011 صفيحة / لتر.
  8. اترك الصفائح الدموية المغسولة ترتاح لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التجارب للسماح للمثبطات المتبقية بالتآكل ولكي تتأقلم الصفائح الدموية مع المخزن المؤقت.

2. إعداد الفحص

  1. تحضير جميع ناهضات وفلوروكرومات في المخزن المؤقت للتفاعل. أضف 5 ميكرولتر من الثرومبين إلى 45 ميكرولتر من المخزن المؤقت (التخفيف 1:10) و 5 ميكرولتر من الأيونوفور إلى 495 ميكرولتر من المخزن المؤقت (التخفيف 1: 500).
    1. بالنسبة للمقايسات الداخلية ، قم بقياس الصفائح الدموية غير المنشطة مقابل تلك المعالجة بناهضات مفردة ومزدوجة. أضف ، في كميات مختلفة ، 100 ميكرولتر من الصفائح الدموية المغسولة عند 50 × 109 الصفائح الدموية / لتر إلى: (1) 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل ، (2) 3 ميكرولتر من الكولاجين غير المخفف (التركيز النهائي 30 ميكروغرام / مل) ، (3) 10 ميكرولتر من الثرومبين المخفف مسبقا (0.5 وحدة دولية / مل) ، (4) 3 ميكرولتر من الكولاجين غير المخفف + 10 ميكرولتر من الثرومبين المخفف مسبقا ، و (v) 10 ميكرولتر من الأيونوفور المخفف مسبقا (التركيز النهائي 2 ميكرومتر) ، وهو معروف بزيادة مستويات الكالسيوم داخل الخلايا بشكل مباشر كما لوحظسابقا 26.
      ملاحظة: العلاج بأيونوفور الكالسيوم ، مثل A23187 أو الأيونوميسين ، أمر بالغ الأهمية لأنه يحفز تدافع غشاء الفوسفوليبيد على نطاق واسع وتحسين إخراج PS.
    2. رج كل قطعة يدوية برفق واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: قد تسمح الحضانة الناهضة الأطول (30 دقيقة) بتمييز أفضل بين مجموعات الصفائح الدموية أثناء عملية تحليل قياس التدفق الخلوي.
  2. أضف 5 ميكرولتر من Annexin-V FITC غير المخفف إلى كل أنبوب دقيق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في الظلام.
    ملاحظة: يمكن أيضا تضمين جسم مضاد أحادي النسيلة ضد أحد المستقبلات الخاصة بالصفائح الدموية ، GPIX (CD42b) أو αIIb integrin (CD41 ، GPIIb) ، لتحديد خلايا الصفائح الدموية بشكل أفضل.
  3. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل لإيقاف العملية والمضي قدما في تحليل العينة باستخدام مقياس التدفق الخلوي.

3. توصيف الصفائح الدموية والحجريصلات الدقيقة المخثرة عن طريق قياس التدفق الخلوي (FC)

ملاحظة: لتحليل وظيفة الصفائح الدموية الموثوق به ، استخدم أداة قياس التدفق الخلوي (FC) التي تم تكوينها وفقا للمعاييرالمعمول بها 27. يجب أن يكون الجهاز قادرا على اكتشاف التشتت الأمامي (FSC) وإشارة مضان واحدة على الأقل. اضبط كاشفات التشتت الضوئي والمضان على الكسب اللوغاريتمي. قم بتخفيف العينات بشكل مناسب ل FC لضمان حساب الصفائح الدموية الفردية فقط بسرعة الحصول على البيانات المنخفضة.

  1. اضبط مقياس التدفق الخلوي على معدل تدفق "بطيء" مع عتبة لا تقل عن 10,000 حدث من الصفائح الدموية. مراقبة انبعاث التألق باستخدام مرشح تمرير ل FITC.
  2. قم ببوابة مجموعة الصفائح الدموية باستخدام التشتت الأمامي (FSC). افحص الصفائح الدموية والحويصلات الدقيقة التي تم إطلاقها وفقا لأحجامها. استخدام مخططات الكثافة لتحديد الصفائح الدموية والحويصلات الدقيقة التي تم إطلاقها لكل من الصفائح الدموية المريحة والمحفزة. تحليل كل مجموعة سكانية مسورة بشكل مستقل.
  3. يميز الصفائح الدموية المخثرة وفقا لمحور FL1. ضع القطع السالب في أقصى يمين مجموعة الصفائح الدموية في حالة الراحة (أي في وجود المخزن المؤقت للتفاعل). بعد تنشيط الصفائح الدموية ، صنف جميع الأحداث المترجمة على يمين هذا القطع على أنها صفائح ضفائح تعرض الفوسفاتيديل سيرين.
  4. يميز الحويصلات الدقيقة ، كونها أصغر من الصفائح الدموية ، من خلال خصائص تشتت الضوء الفريدة. اضبط القطع عند أدنى قيمة FSC لوحظت في مجموعة الصفائح الدموية المريحة. بعد التنشيط ، صنف أي أحداث إيجابية للفوسفاتيديل سيرين تقع تحت هذه العتبة على أنها حويصلات دقيقة.
    ملاحظة: ضع في اعتبارك الاختلاف الفردي في حجم الصفائح الدموية عن طريق ضبط القطع إذا لزم الأمر. تأكد من وجود أقل من 1٪ من الحويصلات الدقيقة في حالة الراحة.

النتائج

يتم القياس الكمي للصفائح الدموية والحويصلات الدقيقة المسببة للتخثر باستخدام تلطيخ الملحق الخامس ، مع تسجيل ما لا يقل عن 50,000 حدث لكل عينة. كما هو مذكور في الخطوة 2.2 ، تم أخذ قياسات الصفائح الدموية الأساسية من عينات محتضنة بمخزن مؤقت للتفاعل ، كما هو موضح في الشكل 1 أ. تم قياس أحجام الصفائح الدموية باستخدام قيمة التشتت الأمامي المتوسط (FSC). بينما يتأثر FSC بعوامل مختلفة ، إلا أنه يظل وكيلا شائعا لتقدير حجم الخلية ، بما في ذلك الصفائح الدموية. تم استخدام مخططات كثافة المساحة (الشكل 1 أ) لتحديد الصفائح الدموية المريحة والحويصلات الدقيقة التي تم إطلاقها وبوابة البوابة الداخلية.

في حالة الصفائح الدموية غير المنشطة ، عرض أقل من 2.9٪ فوسفاتيديل سيرين (PS) على النحو المحدد بواسطة تلطيخ الملحق الخامس. عند تنشيط الصفائح الدموية المغسولة إما بالكولاجين وحده أو بالتزامن مع الثرومبين أو أيونوفور الكالسيوم ، كان هناك ارتفاع ملحوظ في التعرض لمتلازمة PS. أدى الكولاجين وحده إلى زيادة بنسبة 26.7٪ في الصفائح الدموية الإيجابية ل PS. كان للثرومبين تأثيرات طفيفة على التعرض ل PS (9.1٪) ، ولكن عندما يرتبط بالكولاجين ، فإنه يزيد من نسبة الصفائح الدموية المعرضة ل PS إلى 36.2٪. كمرجع ، أدى العلاج بالأيونوفور 2 ميكرومتر إلى تحول 49.6٪ من الصفائح الدموية إلى تحثر الدم.

يوضح الشكل 1 أن النسبة الأساسية للحويصلات الدقيقة من الصفائح الدموية المغسولة في فرد سليم كانت ضئيلة (0.3٪). في حين أن الثرومبين والكولاجين زادا إلى الحد الأدنى من تكوين الحويصلات الدقيقة ، إلا أنه فقط مع الجمع بين الكولاجين والثرومبين زاد تكوين الحويصلات الدقيقة بشكل كبير (الشكل 1 د ؛ 11.4٪). أدت إضافة 2 ميكرومتر من الأيونوفور إلى تعرض 44.0٪ من الحويصلات الدقيقة المتكونة من الصفائح الدموية للتحكم ل PS.

يوفر الشكل 2 معلومات تتعلق بالتباين والتكرار والاستنساخ المتوقع من هذه العملية.

figure-results-1
الشكل 1: التعرض ل PS وتكوين الحويصلة الدقيقة في الصفائح الدموية المريحة والمنشطة. كانت الصفائح الدموية إما نشطة أو غير نشطة (Rerest) (A) ، مع 30 ميكروغرام / مل من الكولاجين (B) ، مع 0.5 U / mL thrombin (C) ، مع مجموعات من الكولاجين والثرومبين (D) مع 2 ميكرومتر أيونوفور. تعرض المخططات النقطية التمثيلية حجم الصفائح الدموية (مبعثر أمامي (سجل FSC)) مقابل ربط الملحق V. تحدد الخطوط الأفقية والرأسية (E) السكان سالبين الصفائح الدموية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: قابلية تكرار وتكرار التعرض ل PS وتكوين الحويصلة الدقيقة بعد الحضانة باستخدام الأيونوفور. تحليل التعرض ل PS وتكوين الحويصلات الدقيقة بعد الحضانة إما ب 2 ميكرومتر أو 5 ميكرومتر من الأيونوفور في الصفائح الدموية المغسولة ، المعالجة أو غير المعالجة بالسترات (مخلب الكالسيوم): (أ) من 4 ضوابط صحية مختلفة ؛ (ب) من عنصر تحكم صحي واحد تكرر 5 مرات ؛ و (ج) من اثنين من أدوات التحكم الصحية التي أعدها فنيان مختلفان. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تعداد الصفائح الدموية في الدم الكامل (109 لكل مل )قوى الطرد المركزي النسبية (ز)
<3070
30-50100
51-100130
101-150200
151-300250
301-600290
>600340

الجدول 1: قوى الطرد المركزي النسبية لتحضير البلازما الغنية بالصفائح الدموية فيما يتعلق بعدد الصفائح الدموية في الدم الكامل.

الكاشفمبلغ
أحادي هيدرات حامض الستريك (C6H8O7. H2O ، 38 ملم)8 جرام
ثنائي هيدرات سترات ثلاثي الصوديوم (Na3C6H5O7.2 H2O ، 61 مللي مولار)180 جرام
الجلوكوز (ج6ساعات12درجةمئوية 6 ، 136 م)24.6 جرام
لا ينبغي تعديل درجة الحموضة في المحلول. احتفظ بالمحلول عند 4 درجات مئوية.

الجدول 2: تحضير محلول مائي سعة 1 لتر من حمض السترات وسكر العنب (ACD).

الكاشفمبلغ
أحادي هيدرات حامض الستريك (C6H8O7. H2O ، 36 ملم)7.56 جرام
كلوريد الصوديوم (103 مل)6 جرام
هيدروكسيد الصوديوميوم4 جرام
MgCl2.6H 2O (1 ملم)0.203 جرام
اضبط الرقم الهيدروجيني عند 6.5. احتفظ بالمحلول عند 4 درجات مئوية.

الجدول 3: تحضير محلول مخزون عازلة الغسيل.

الكاشفمبلغ
30٪ ألبومين مصل البقر (BSA)583 ميكرولتر
كلوريد التيكلوريد2 ، 0.25 م400 ميكرولتر
الجلوكوز40 مجم
بيراز31.5 ميكرولتر

الجدول 4: تحضير محلول مؤقت سعة 50 مل من محلول الغسيل من محلول المخزون.

الكاشفمبلغ
كلوريد الصوديوم (137 ملم)8 جرام
KCl (2.7 مل)0.2 جرام
MgCl2.6H 2O (1 ملم)0.203 جرام
هيبس (5 مل)1.19 غ
NaHCO3 (12 ملم)1 جرام
NaH2PO 4.2H 2O ؛ 0.3 ملي0.05 جرام
اضبط الرقم الهيدروجيني عند 7.4. احتفظ بالمحلول عند 4 درجات مئوية.

الجدول 5: تحضير محلول مخزون المخزن المؤقت للتفاعل.

الكاشفمبلغ
30٪ ألبومين مصل البقر (BSA)167 ميكرولتر
كلوريد التيكلوريد2 ، 0.25 م400 ميكرولتر
الجلوكوز50 ملغ

الجدول 6: تحضير محلول مؤقت سعة 50 مل من عازلة التفاعل من محلول المخزون.

المناقشة

سلطت الدراسات الحديثة على الصفائح الدموية المخثرة الضوء على تغيراتها خلال العديد من الأمراض1،28،29 ، مما يؤكد أهمية تحليلها التفصيلي وتوصيفها30،31،32. في حين أن الاختبارات السريرية الحالية لتقييم تكوين أولي التخثر للصفائح الدموية محدودة ، فقد كان هناك ارتفاع كبير في الاهتمام السريري على مدى العقدين الماضيين. على سبيل المثال ، يشارك TMEM16F scramblase المعتمد على الكالسيوم (ANO6) في التعرض لتخثر الفوسفاتيديل سيرين (PS)33. ترتبط متغيرات TMEM16F بمتلازمة سكوت33،34،35 ، وهو اضطراب نزيف نادر يتميز بضعف تدافع الدهون الفوسفورية وانخفاض توليد الثرومبين في الصفائح الدمويةالمنشطة 36. علاوة على ذلك ، ترتبط مستويات الصفائح الدموية المرتفعة بالتخثر والسكتات الدماغية ومرض الشريان التاجي ، مما يثير الاهتمام بالعلاجات للحد من نشاط تخثر الصفائحالدموية 37. من بين الطرق المتاحة حاليا لتقييم تكوين الصفائح الدموية المخثرة ، يعد تقييم التعرض للسمويس الجذعية عن طريق ربط الملحق الخامس وإطلاق الحويصلات الدقيقة أحد أكثر الطرقاستخداما 38،39.

يتيح البروتوكول الموضح هنا عزل الصفائح الدموية المنقاة من قبل الإنسان وتوصيف الصفائح الدموية المخثرة عن طريق قياس التعرض ل PS وإطلاق الحويصلة الدقيقة باستخدام قياس التدفق الخلوي. من الأهمية بمكان نصح المتطوعين الأصحاء بالامتناع عن الأدوية التي قد تؤثر على وظيفة الصفائح الدموية لمدة 10 أيام على الأقل قبل أخذ عينات الدم. يتطلب جمع الدم عناية لتجنب صدمة الوريد أو التدفق البطيء بشكل مفرط ، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى توليد الثرومبين وتنشيط الصفائح الدموية. لا ينصح باستخدام الدم المضاد للتخثر بسترات الصوديوم لتحضير الصفائح الدموية المغسولة ، حيث يمكن أن يؤدي الكالسيوم المتبقي إلى توليد الثرومبين وتنشيط الصفائح الدموية أثناء الطردالمركزي 17. يحتوي الدم المضاد للتخثر ACD على درجة حموضة 6.5 وتركيز أعلى للسترات يبلغ 22 مليمول / لتر مقارنة بدرجة حموضة الدم المضادة للتخثر بالسترات 7.5 و 13 مليمول / لتر تركيز سترات17. يمنع الرقم الهيدروجيني الحمضي وانخفاض تركيز الكالسيوم خارج الخلية في الدم المضاد للتخثر ACD تراكم الصفائح الدموية24. يعد تقليل توليد الثرومبين أثناء عملية التجميع أمرا ضروريا. يوصى باستخدام بزل الوريد غير الرضحي باستخدام إبرة 21 جم على الأقل لمنع الركود الوريدي أو الضغط المفرط. بالإضافة إلى ذلك ، يجب التخلص من المليلتر البضعة الأولى من الدم لتجنب التلوث بعوامل الأنسجة وكميات ضئيلة من الثرومبين17. يعد تقليل الوقت بين بزل الوريد ومعالجة العينات أمرا ضروريا أيضا ، حيث قد يؤدي تخزين الدم لفترات طويلة إلى تنشيط الصفائح الدموية ، وبالتالي زيادة التعرض ل PS وإطلاق الحويصلةالدقيقة 40. يجب إيلاء اهتمام خاص أثناء إجراء تحضير الصفائح الدموية بأكمله لمنع التنشيط المسبق للصفائح الدموية تلقائيا ، والذي يمكن أن يحدث أثناء عملية التحضير نفسها41،17. علاوة على ذلك ، فإن عزل الصفائح الدموية المنقاة يتطلب تجنب التلوث بخلايا الدم الأخرىبعناية 17. يتضمن ذلك شفط المادة الطافية تماما بعد الطرد المركزي للصفائح الدموية لضمان تحضير نظيف. نظرا لأن الحبيبات عادة ما تكون مرئية وملتصقة بإحكام بجدار الأنبوب, يمكن شفط المادة الطافية بسهولة باستخدام طرف الماصة.

أثناء خطوات غسل الطرد المركزي ، يتم تعليق الصفائح الدموية في مخزن مؤقت يحاكي الظروف الفسيولوجية. يؤدي استخدام الصفائح الدموية المغسولة في مخزن مؤقت فسيولوجي إلى عزلها عن مضادات التخثر والبلازما ، وبالتالي منع القطع الأثرية بوساطة الثرومبين. في حين أن البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) هي طريقة سريعة للحصول على تركيزات عالية من الصفائح الدموية ، فإن استخدامها في الدراسات الوظيفية محدود بسبب تغيرات الأس الهيدروجيني التي يسببها مضادات التخثر ومحتوى الكالسيوم والبروتين خارج الخلية في البلازما ، والتي يمكن أن تؤثر على تنشيط الصفائحالدموية 17. علاوة على ذلك ، فإن المستويات العالية من PS المتولدة أثناء تنشيط الصفائح الدموية ستكون كافية لتعزيز تجميع مجمعات تخثر البلازما ، وانفجار الثرومبين اللاحق ، وتكوين الجلطة في PRP ، مما يجعل النتائج التجريبية غير قابلة للتفسير. في المقابل ، يوصى بإعادة التعليق في مخزن مؤقت يحتوي على الأبيراز للحفاظ على وظيفة الصفائح الدموية عن طريق منع إزالة التحسس لمستقبلات البيورينرجيك من خلال تحلل ATP و ADP42،43. على الرغم من أن خطوات الطرد المركزي والغسيل المتكررة تتطلب مزيدا من الوقت ، إلا أن تعليق الصفائح الدموية المغسولة المحضرة بهذه الطريقة يوفر ميزة ثبات أكبر (5-8 ساعات) مقارنة بمستحضرات البلازما الغنية بالصفائح الدموية المضطربة ، والتي تكون مستقرة لمدة لا تزيد عن 1-3 ساعات23.

توضح هذه الدراسة جدوى وبساطة القياس الكمي للحويصلات الدقيقة عن طريق قياس التدفق الخلوي. ومع ذلك ، يمكن أن يضيع إنتاج الحويصلات الدقيقة في حطام وضوضاء الماكينة. لذلك ، من الأهمية بمكان التأكد من أن مقياس التدفق الخلوي قد خضع لتنظيف مكثف وأن المخازن المؤقتة المستخدمة لا تحتوي على أي جزيئات ملوثة قد تؤدي إلى خلفية عالية أثناء تحليل قياس التدفق الخلوي. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مقاييس التدفق الخلوي المتخصصة ذات القدرات للكشف عن الجسيمات الصغيرة لتحديد تكوين الحويصلة الدقيقة. كما تمت دراسة ارتباط Annexin-V المسمى بالفلورسين كدالة لمحتوى PS الغشائي ، مما يسلط الضوء على الدور الحاسم لتركيزات الكالسيوم الكافية في المخزن المؤقت لربط Annexin-V واستجابة الصفائح الدموية للتخثر44.

البيانات التي تدعم استقرار عينات الصفائح الدموية بمرور الوقت نادرة حاليا. عالجت العديد من المختبرات هذه المشكلة عن طريق تثبيت العينات من خلال إضافة محلول مثبت ، مثل المخزن المؤقت المحتوي على الفورمالديهايد. تتميز إضافة مثبت لعينات الصفائح الدموية التي تم جمعها حديثا بالحفاظ على العينات لتحليلها لاحقا. ومع ذلك ، يمكن أن يتسبب تثبيت الفورمالديهايد في زيادة ربط الملحق الخامس بشكل مصطنع. روشات وآخرون أظهر أن تثبيت الصفائح الدموية بمحلول فورمالديهايد منخفض التركيز وخالي من الكالسيوم لا يغير نسبة الصفائح الدموية الموجبة للملحقالخامس 45. ومع ذلك ، يجب على الباحثين الذين يحتاجون إلى التثبيت تحسين بروتوكولهم المحدد للتأكد من أنه لا يتسبب في نتائج متغيرة بشكل مصطنع. خلاف ذلك ، يجب معالجة العينات على الفور.

هناك مسار آخر قد يؤدي أيضا إلى التعرض ل PS يتضمن موت الخلايا المبرمج الجوهري ، وهي عملية معروفة بتنظيم عمر الصفائح الدموية في الدورةالدموية 46. يؤدي تنشيط بروتينات BAK و BAX المؤيدة لموت الخلايا المبرمج إلى تنشيط الكاسباز ، مما يعزز إضفاء PS على الخارج ، مما يؤدي إلى إزالة الصفائح الدموية في الجسم الحي . في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح استخدام علامة أخرى لسطح الصفائح الدموية ، P-selectin / CD62P ، بالإضافة إلى Annexin-V ، للتمييز بين مواد التخثر والصفائح الدمويةالمبرمجة 47. من المتوقع أن تكون الصفائح الدموية المتخثرة إيجابية لكل من علامات PS و P-selectin ، في حين أن الصفائح الدموية موت الخلايا المبرمج موجبة للملحق V ولكنها سالبة بالنسبة ل P-selectin. ومع ذلك ، فإن الوقت هو أيضا عامل تمييز بين الصفائح الدموية المتخثرة والخلايا المبرمج47. يعد توليد الصفائح الدموية المخلوطة في المختبر عملية سريعة ، في حين أن موت الخلايا المبرمج الجوهري هو عملية أبطأ ، حيث تستغرق48 ساعة. في هذا السياق ، ليس من الضروري استخدام علامات إضافية لتقييم الصفائح الدموية المخثرة ، مما يبسط الطريقة. تحدث الزيادات المستمرة في تكوين الصفائح الدموية Ca2+ داخل الخلايا وتكوين الصفائح الدموية المتخثرة في غضون بضع دقائق مع ناهضات قوية جدا ، مثل الأيونوفور أو التنشيط المشترك مع الكولاجين والثرومبين ، في حين أن مثبط BCL-XL (أو BH3 المقلد) يؤدي إلى تكوين الصفائح الدموية المبرمجة عن طريق تنشيط BAK و BAX المؤيدة لموت الخلايا المبرمج ، مما يتسبب في نفاذية الغشاء الخارجي للميتوكوندريا ، وإطلاق السيتوكروم C ، وتنشيط كاسباسي49.

في الختام ، يسهل البروتوكول الموصوف هنا عزل الصفائح الدموية المنقاة وتوصيفها اللاحق لنشاط التخثر باستخدام معدات المختبر القياسية وقياس التدفق الخلوي. يمهد هذا الإجراء الطريق للبحث المستقبلي حول الصفائح الدموية المخثرة في عينات دم المرضى ، مع التطبيقات المحتملة في الممارسة السريرية ، مثل تشخيص متلازمة سكوتالنادرة 50.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(CD42b ، GPIX) APCBeckman CoulterB13980
ACD-A أنابيب جمع الدمBD Vacutainer366645
Annexin-V FITCBD Pharmingen560931
Apyrase Grade VIISigma-AldrichA6410
Bovine Serum Albumin 30٪Sigma-AldrichA9576
CaCl2 ، < / sub>0.25MSigma-AldrichC3881
حامض الستريك أحادي الهيدراتMerck5949-29-1
كولاجين & nbsp ؛ستاغو86924
الجلوكوز سيجما ألدريتشG8270
هيبس  سيجما ألدريتشH3375
الأيونوفور Calbiochem / VWR100105
KCl & nbsp ؛Merck7447-40-7
MgCl2Sigma-AldrichM0250
NaCl VWR27810.295
هيدروكسيد الصوديوم  ميرك1.06498
كربونات هيدروجين الصوديومMerck6329NaHCO3
Thrombin Hyphen BiomedEZ 006 A
ثلاثي الصوديوم سيترات ثنائي الهيدرات Sigma-AldrichG8270Na3C6H5O7*2H2O
α IIb إنتجرين (CD41 ، GPIIb) PC7بيكمان كولتر6607115

المراجع

  1. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  2. Agbani, E. O., Hers, I., Poole, A. W. Platelet procoagulant membrane dynamics: A key distinction between thrombosis and hemostasis. Blood Adv. 7 (8), 1615-1619 (2022).
  3. Veuthey, L., Aliotta, A., Bertaggia Calderara, D., Pereira Portela, C., Alberio, L. Mechanisms underlying dichotomous procoagulant COAT platelet generation-A conceptual review summarizing current knowledge. Int J Mol Sci. 23 (5), 2536(2022).
  4. Bourguignon, A., Tasneem, S., Hayward, C. P. M. Update on platelet procoagulant mechanisms in health and in bleeding disorders. Int J Lab Hematol. 44 Suppl 1, 89-100 (2022).
  5. Suades, R., Padró, T., Vilahur, G., Badimon, L. Platelet-released extracellular vesicles: The effects of thrombin activation. Cel lMo lLife Sci. 79 (3), 190(2022).
  6. Dai, Z., et al. Platelets and platelet extracellular vesicles in drug delivery therapy: A review of the current status and future prospects. Front Pharmacol. 13, 1026386(2022).
  7. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science (New York, N.Y.). 367 (6478), eaau6977(2020).
  8. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  9. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: Mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell communsignal. 19 (1), 104(2021).
  10. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  11. Eustes, A. S., Dayal, S. The role of platelet-derived extracellular vesicles in immune-mediated thrombosis. Int J Mol Sci. 23 (14), 7837(2022).
  12. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. Shedding light on the cell biology of platelet-derived extracellular vesicles and their biomedical applications. Life. 13 (6), 1403(2023).
  13. Sinauridze, E. I., et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost. 97 (3), 425-434 (2007).
  14. Cai, Z., et al. Platelet-derived extracellular vesicles play an important role in platelet transfusion therapy. Platelets. 34 (1), 2242708(2023).
  15. Chaudhary, P. K., Kim, S., Kim, S. An insight into recent advances on platelet function in health and disease. Int J Mol Sci. 23 (11), 6022(2022).
  16. Tyagi, T., et al. A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences. Nat Cardiovasc Res. 1 (3), 223-237 (2022).
  17. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  18. Perez, G. I., et al. Phosphatidylserine-exposing Annexin A1-positive extracellular vesicles: Potential cancer biomarkers. Vaccines. 11 (3), 639(2023).
  19. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), e52484(2015).
  20. Dachary-Prigent, J., Freyssinet, J. M., Pasquet, J. M., Carron, J. C., Nurden, A. T. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: A flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood. 81 (10), 2554-2565 (1993).
  21. Abaeva, A. A., et al. Procoagulant platelets form an α-granule protein-covered "cap" on their surface that promotes their attachment to aggregates. J Biol Chem. 288 (41), 29621-29632 (2013).
  22. Fager, A. M., Wood, J. P., Bouchard, B. A., Feng, P., Tracy, P. B. Properties of procoagulant platelets: defining and characterizing the subpopulation binding a functional prothrombinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (12), 2400-2407 (2010).
  23. Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. Platelet aggregation: A tool for clinical investigation and pharmacological study. Methodology. Ann Biol Clin. 41 (3), 167-179 (1983).
  24. Han, P., Ardlie, N. G. The influence of pH, temperature, and calcium on platelet aggregation: Maintenance of environmental pH and platelet function for in vitro studies in plasma stored at 37 degrees C. Br J Haematol. 26 (3), 373-389 (1974).
  25. Ardlie, N. G., Perry, D. W., Packham, M. A., Mustard, J. F. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), 1021-1023 (1971).
  26. Kang, J. K., et al. Increased intracellular Ca2+ concentrations prevent membrane localization of PH domains through the formation of Ca2+-phosphoinositides. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (45), 11926-11931 (2017).
  27. Frelinger, A. L., et al. Consensus recommendations on flow cytometry for the assessment of inherited and acquired disorders of platelet number and function: Communication from the ISTH SSC Subcommittee on Platelet Physiology. J Thromb Haemost. 19 (12), 3193-3202 (2021).
  28. Khattab, M. H., et al. Increased procoagulant platelet levels are predictive of death in COVID-19. GeroScience. 43 (4), 2055-2065 (2021).
  29. Denorme, F., Campbell, R. A. Procoagulant platelets: Novel players in thromboinflammation. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (4), C951-C958 (2022).
  30. Gianazza, E., et al. Platelets in healthy and disease states: From biomarkers discovery to drug targets identification by proteomics. Int J Mol Sci. 21 (12), 4541(2020).
  31. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood. J VisExp. (119), (2017).
  32. Alberca, R. W., et al. Platelet-based biomarkers for diagnosis and prognosis in COVID-19 Patients. Life. 11 (10), 1005(2021).
  33. Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F. Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).
  34. Boisseau, P., et al. A new mutation of ANO6 in two familial cases of Scott syndrome. Br J Haematol. 180 (5), 750-752 (2018).
  35. Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., Bevers, E. M. Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome. Blood. 117 (16), 4399-4400 (2011).
  36. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1636 (2), 119-128 (2004).
  37. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: Generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  38. Reddy, E. C., Rand, M. L. Procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets in vitro and in vivo. Front Cardiovasc Med. 7, 15(2020).
  39. Reddy, E. C., et al. Analysis of procoagulant phosphatidylserine-exposing platelets by imaging flow cytometry. Res Pract Thromb Haemost. 2 (4), 736-750 (2018).
  40. Magnette, A., Chatelain, M., Chatelain, B., Ten Cate, H., Mullier, F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: Guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 14, 49(2016).
  41. Schoenfeld, H., Muhm, M., Doepfmer, U., Exadaktylos, A., Radtke, H. Platelet activity in washed platelet concentrates. Anesth Analg. 99 (1), 17-20 (2004).
  42. Koessler, J., et al. Role of purinergic receptor expression and function for reduced responsiveness to adenosine diphosphate in washed human platelets. PLoS ONE. 11 (1), e0147370(2016).
  43. Baurand, A., et al. Desensitization of the platelet aggregation response to ADP: Differential down-regulation of the P2Y1 and P2cyc receptors. Thromb Haemost. 84 (3), 484-491 (2000).
  44. Alberio, L., et al. Delayed-onset of procoagulant signalling revealed by kinetic analysis of COAT platelet formation. Thromb Haemost. 117 (06), 1101-1114 (2017).
  45. van Kruchten, R., et al. Both TMEM16F-dependent and TMEM16F-independent pathways contribute to phosphatidylserine exposure in platelet apoptosis and platelet activation. Blood. 121 (10), 1850-1857 (2013).
  46. Rochat, S., Alberio, L. Formaldehyde-fixation of platelets for flow cytometric measurement of phosphatidylserine exposure is feasible. Cytometry A. 87 (1), 32-36 (2015).
  47. Josefsson, E. C., Ramström, S., Thaler, J., Lordkipanidzé, M. COAGAPO study group Consensus report on markers to distinguish procoagulant platelets from apoptotic platelets: communication from the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (8), 2291-2299 (2023).
  48. Choo, H. J., Kholmukhamedov, A., ChengZing, Z., Shawn, J. Inner mitochondrial membrane disruption links apoptotic and agonist-initiated phosphatidylserine externalization in platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (8), 1503-1512 (2017).
  49. Johnson, L., Pearl Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  50. Montague, S. J. Comprehensive functional characterization of a novel ANO6 variant in a new patient with Scott syndrome. J Thromb Haemost. S1538 - 7836 (24), 00127-00132 (2024).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة