يوضح هذا البروتوكول استئصال الخلايا العصبية الفردية بالليزر في يرقات ذبابة الفاكهة السليمة. تمكن هذه الطريقة من دراسة تأثير تقليل المنافسة بين الخلايا العصبية في الجهاز العصبي النامي.
مقالة منهجية
الاجتثاث بالليزر للخلايا في يرقات ذبابة الفاكهة السليمة يكشف عن منافسة متشابكة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يصف البروتوكول الاجتثاث أحادي الخلية العصبية بنظام ليزر 2 فوتون في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ليرقات ذبابة الفاكهة الميلانية السليمة. باستخدام هذه الطريقة غير الغازية ، يمكن التلاعب بالجهاز العصبي النامي بطريقة خاصة بالخلية. يمكن استخدام تعطيل تطور الخلايا العصبية الفردية في الشبكة لدراسة كيف يمكن للجهاز العصبي تعويض فقدان المدخلات المشبكية. تم استئصال الخلايا العصبية الفردية على وجه التحديد في نظام الألياف العملاقة لذبابة الفاكهة ، مع التركيز على اثنين من الخلايا العصبية: الألياف العملاقة قبل المشبكية (GF) والخلايا العصبية الحركية tergotrochanteral بعد المشبكي (TTMn). يتشابك GF مع TTMn المماثل ، وهو أمر بالغ الأهمية لاستجابة الهروب. الاجتثاث واحد من GFs في الدماغ 3الثالثة instar ، مباشرة بعد GF يبدأ النمو المحوري ، يزيل الخلية بشكل دائم أثناء تطوير الجهاز العصبي المركزي. يتفاعل GF المتبقي مع الجار الغائب ويشكل طرفا متشابك خارج الرحم إلى TTMn المقابل. هذا الطرف غير النمطي المتماثل ثنائيا يعصب كلا من TTMns ، كما يتضح من اقتران الصبغة ، ويدفع كلا الخلايا العصبية الحركية ، كما يتضح من المقايسات الفيزيولوجية الكهربية. باختصار ، يوضح استئصال خلية عصبية واحدة منافسة متشابكة بين زوج ثنائي من الخلايا العصبية التي يمكن أن تعوض عن فقدان خلية عصبية واحدة واستعادة الاستجابات الطبيعية لدائرة الهروب.
المقدمة
الاستئصال بالليزر هو أداة مفضلة لتشريح الدوائر العصبية في مجموعة واسعة من الكائنات الحية. تم تطويره في أنظمة وراثية نموذجية مثل الديدان والذباب ، وقد تم تطبيقه في جميع أنحاء المملكة الحيوانية لدراسة بنية ووظيفة وتطور الجهاز العصبي1،2،3. هنا ، تم استخدام استئصال الخلايا العصبية المفردة للتحقيق في كيفية تفاعل الخلايا العصبية أثناء تجميع الدائرة في ذبابة الفاكهة. نظام الهروب من الذبابة هو دائرة مفضلة للتحليل لأنه يحتوي على أكبر الخلايا العصبية وأكبر نقاط الاشتباك العصبي في الذبابة البالغة ، وقد تم تمييز الدائرة بشكل جيد في العقود الماضية4. الدور الذي تلعبه التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا العصبية في تجميع دائرة الألياف العملاقة هو نقطة محورية في هذا البحث.
نوع واحد من التفاعل الذي كان نقطة محورية في علم الأعصاب منذ عمل Hubel و Wiesel في ستينيات القرن العشرين هو "المنافسة متشابك"5,6. في هذا البروتوكول ، تم استخدام الاستئصال بالليزر لإعادة النظر في دور المنافسة من خلال الاجتثاث أحادي الخلية في نظام الألياف العملاقة (GFS) لذبابة الفاكهة ، حيث يمكن اكتشاف الأسس الجزيئية للظواهر.
كان استئصال الخلايا العصبية في الذبابة النامية صعبا لعدة أسباب ، بما في ذلك تصور الخلايا العصبية المستهدفة ، ودقة طريقة الاجتثاث ، وبقاء العينة. للتغلب على هذه المشاكل في GFS ، تم استخدام نظام UAS / Gal47 لتسمية الخلايا العصبية ذات الأهمية ، وتم استخدام مجهر ثنائي الفوتون لإزالة الألياف العملاقة قبل المشبكية أو الخلايا العصبية الحركية بعد المشبكي (TTMn).
في هذه الدراسة ، لتحديد الدور الذي تلعبه الخلايا العصبية الثنائية المجاورة في ضبط الاتصال المشبكي والقوة المشبكية في GFS ، تم حذف أحد الأزواج الثنائية من الخلايا العصبية (إما GF قبل المشبكي أو الخلايا العصبية الحركية بعد المشبكي) قبل تطور العذراء مباشرة. في هذه المرحلة التنموية ، لم يكتمل تكوين محور GF8. ثم تم فحص بنية GF ووظيفة الدائرة المشبكية في البالغين ، مع إيلاء اهتمام خاص لإخراج GF المتبقي.
البروتوكول
كانت جميع المستخدمة في البروتوكول من نوع ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر. لا توجد قضايا أخلاقية تحيط باستخدام هذا النوع. لم يكن التخليص الأخلاقي ضروريا للقيام بهذا العمل. يتم سرد تفاصيل أنواع ذبابة الفاكهة والكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.
1. تربية ذبابة الفاكهة واختيار المرحلة اليرقية الصحيحة
- اختر خط برنامج تشغيل Gal4 الذي يقود التعبير في الخلايا المراد اجتثاثها وأعد تجميعه مع أو عبره إلى خط مراسل UAS-GFP. رفع الذباب على طعام الذباب القياسي عند 25 درجة مئوية.
ملاحظة: بالنسبة لاستئصال الألياف العملاقة (GF) ، تمت إعادة دمج R91H05-Gal4 أو A307-Gal4 مع UAS-GFP. تم استخدام ShakB (القاتل) -GAL4 المعاد دمجه مع UAS-GFP لاستئصال TTMn (انظر جدول المواد). - حدد اليرقات التي بدأت في الظهور من الطعام والزحف إلى جانب قارورة الطعام. هذه اليرقات في مرحلة التجوال ، وهي المرحلة المفضلة لإجراء استئصال خلايا GF.
ملاحظة: يمكن إجراء الاستئصال في أي مرحلة من مراحل اليرقات. كانت المرحلة اليرقية الأخيرة مهمة للتلاعب في تطور GFS لأنه يمكن التعرف بسهولة على أجسام خلايا GF في الدماغ ، لكن محاور GF لم تقم بإجراء اتصالات بأهدافها في هذه المرحلة.
2. تحضير يرقة 3 الثالثة
ملاحظة: تم تخدير اليرقات باستخدام طريقة مشابهة ل Burra et al.9. للحفاظ على أوقات الإجراء قصيرة ، قم بإعداد يرقة واحدة فقط في كل مرة. التعرض القصير للمخدر سيعزز بقاء التجارب10.
- تحضير طبق زجاجي مع غطاء مناسب بإحكام. ضع كرة قطنية في الطبق ، وتحت غطاء دخان ، أضف حوالي 3-5 مل من إيثيل الأثير (سائل خطير قابل للاشتعال ، معطف مختبر ، قفازات ، نظارات واقية). غطي الطبق بالغطاء.
- جمع يرقات 3فرد من قوارير الذباب. فيمرحلة اليرقات الثالثة ، تترك اليرقات وسط الطعام وتزحف على طول جانب قارورة الطعام11.
- تأكد من أن اليرقات لا تزال تتحرك ولم تبدأ في تكوين puparium. اليرقات الثابتة وتظهر تقصيرا في الجسم تبدأ في الجرو وغير مناسبة للاستئصال. التقط اليرقات بفرشاة رسم صغيرة.
ملاحظة: تبدأمرحلة اليرقات الثالثة بعد الذوبان الثاني عند 72 ساعة من التطور (بعد وضع البيض) ، وتستمر حتى تكوين puparium عند 120 ساعة للذباب الذي يتم تربيته عند 25 درجة مئوية.
- تأكد من أن اليرقات لا تزال تتحرك ولم تبدأ في تكوين puparium. اليرقات الثابتة وتظهر تقصيرا في الجسم تبدأ في الجرو وغير مناسبة للاستئصال. التقط اليرقات بفرشاة رسم صغيرة.
- نقل يرقة واحدة في وعاء صغير مفتوح. ضع الحاوية في الطبق الزجاجي مع إيثيل الأثير وأغلق الطبق بإحكام. عند فتح الطبق الزجاجي ، ضعه تحت أنبوب التنفس أو في غطاء الدخان لمنع الأبخرة من الهروب.
- على فترات 30 ثانية ، قم بإزالة الغطاء مع اليرقة من الطبق وتحقق من اليرقة للتنقل تحت مجهر التشريح. سيتم تجميد اليرقة بشكل عام في غضون 1 دقيقة. بمجرد توقف خطافات الفم عن الوخز ، تكون اليرقة جاهزة للتركيب. تخلص من أي يرقات لم يتم تجميدها بالكامل بعد 3 دقائق.
ملاحظة: يمكن استخدام الجزء العلوي من الغطاء المقلوب لأنبوب الطرد المركزي الدقيق (الغطاء الذي تمت إزالته من الأنبوب) كحاوية.
- على فترات 30 ثانية ، قم بإزالة الغطاء مع اليرقة من الطبق وتحقق من اليرقة للتنقل تحت مجهر التشريح. سيتم تجميد اليرقة بشكل عام في غضون 1 دقيقة. بمجرد توقف خطافات الفم عن الوخز ، تكون اليرقة جاهزة للتركيب. تخلص من أي يرقات لم يتم تجميدها بالكامل بعد 3 دقائق.
3. تصاعد اليرقات على الشرائح للاجتثاث
- ضع اليرقة المخدرة على شريحة مجهر زجاجي. غمر اليرقة في قطرة من محلول الحشرات المالحة. سيؤدي ذلك إلى غسل بعض بقايا الطعام التي قد تلتصق باليرقة.
- تحت مجهر التشريح ، قم بإزالة معظم المياه المالحة بمنديل ورقي. ضع الجانب الظهري لليرقة لأعلى لاستئصال GF أو الجانب البطني لأعلى لاستئصال TTMn. خفض ببطء غطاء زجاجيانزلاق على اليرقة. أضف محلول ملحي إلى جانب غطاء الغطاء لملء الفراغ بين الشريحة الزجاجية وقسيمة الغطاء.
- لاستئصال GF ، تحقق من وضع الدماغ تحت التكبير العالي على مجهر التشريح. تأكد من أن الدماغ مستلق ومرئي من خلال بشرة. في كثير من الأحيان ، سيتم تغطية الدماغ بالأنسجة الدهنية ، مما يجعل التصور واستئصال الخلايا مستحيلا.
- لإزاحة أي نسيج دهني يغطي الدماغ ، ضع ضغطا طفيفا على غطاء الغطاء بالملقط وحرك غطاء الغطاء من جانب إلى آخر. إذا لم يكن بالإمكان نقل الأنسجة الدهنية بعيدا عن الدماغ بهذه الطريقة ، فاستخدم يرقة مختلفة بدلا من ذلك.
4. تحديد موقع الخلايا المستهدفة
ملاحظة: تم تركيب نظام الفوتون المتعدد المستخدم في هذه الدراسة على مجهر مستقيم. تم استخدام برنامج خاص بالنظام للتحكم في إعدادات الاستحواذ والتحفيز بالليزر. تم تجهيز النظام بمصدر ضوء التألق لتحديد موقع العينات. كانت العدسة الموضوعية عبارة عن عدسة غمر بالماء مع تكبير 25x ، ومسافة عمل طويلة 2 مم ، و NA من 1.10.
- ضع العينة على مرحلة المجهر متعدد الفوتونات واستخدم مرشح GFP لتحديد موقع العينة في وضع التألق. بالنسبة لاستئصال GF ، يمكن تحديد أجسام الخلايا في الدماغ ، كما هو موضح في الشكل 1A ، C ، D. بالنسبة لاستئصال TTMn ، يمكن تحديد مجموعة من أربع خلايا من الجانب البطني في الحبل العصبي البطني (VNC) ، كما هو موضح في الشكل 1A ، B. عند الانتهاء من التركيز ، قم بتوسيط الخلايا في مجال الرؤية وانتقل إلى وضع 2 فوتون.
5. إعداد معلمات الاجتثاث
- اضبط إعدادات الليزر وكسب الكاشف لعرض الخلايا المعبرة عن GFP باستخدام الماسح الضوئي Galvano. يعمل الطول الموجي البالغ 870 نانومتر بشكل أفضل لتصور إشارة GFP. توسيط الخلية في مجال الرؤية.
- استخدم منطقة دائرية ذات أهمية (ROI) لتحديد منطقة الاستئصال. تأكد من أن عائد الاستثمار يغطي معظم سطح الخلية (الشكل 1E ، G).
- قم بإعداد بروتوكول الاجتثاث في البرنامج. قم بتعيين إطار واحد للاكتساب ، ثم التحفيز ، متبوعا بإطار اكتساب آخر.
- ابدأ إعداد طاقة ليزر التحفيز بقيمة أقل (10٪ -20٪) وقم بتشغيل بروتوكول التحفيز. يمكن التعرف على الاجتثاث الناجح من خلال دائرة واضحة في وسط سوما الخلية في موقع عائد الاستثمار وزيادة في التألق المحيط بعائد الاستثمار (الشكل 1F).
- إذا لم ينجح الاجتثاث وقام فقط بتبييض الخلية (الشكل 1H) ، فقم بزيادة طاقة الليزر بزيادات قدرها 5٪ أو عدد الحلقات واحدة تلو الأخرى وقم بتشغيل البروتوكول مرة أخرى. كانت طاقة الليزر المطبقة بين 10٪ و 40٪ للنظام المستخدم في البروتوكول.
ملاحظة: تعتمد إعدادات طاقة الليزر للاستئصال بشكل كبير على مدى عمق الخلايا الموجودة في الأنسجة وعوامل أخرى مثل طي البشرة. إذا كانت الخلايا ساطعة ومرئية بوضوح ، فستكون طاقة الليزر في الطرف الأدنى من النطاق. ستختلف طاقة الليزر لكل نظام اعتمادا على طراز الليزر وعمر الليزر.
- إذا لم ينجح الاجتثاث وقام فقط بتبييض الخلية (الشكل 1H) ، فقم بزيادة طاقة الليزر بزيادات قدرها 5٪ أو عدد الحلقات واحدة تلو الأخرى وقم بتشغيل البروتوكول مرة أخرى. كانت طاقة الليزر المطبقة بين 10٪ و 40٪ للنظام المستخدم في البروتوكول.
الشكل 1: تحديد الخلايا العصبية للاستئصال بالليزر في يرقات ذبابة الفاكهة L3 السليمة. (أ) رسم تخطيطي لموقع سوما الألياف العملاقة (GF) في الدماغ ومجموعة الخلايا العصبية الحركية التي تحتوي على الخلايا العصبية الحركية tergotrochanteral (TTMn) في الحبل العصبي البطني (VNC). (B) الإسقاط الأقصى لشدة تعبير القيادة shakB (القاتل) -Gal4 ل GFP في اليرقات VNC. يشار إلى خط الوسط بالخط المنقط. تشير الدائرة إلى مجموعة الخلايا العصبية التي تحتوي على TTMn والتي تستهدف الاستئصال بالليزر. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. (C) منظر إسقاط جزئي لدماغ اليرقات يعبر عن GFP تحت سيطرة A307-Gal4. تشير الدائرة إلى GF soma المستهدفة للاستئصال بالليزر. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. (د) الإسقاط الأقصى لشدة الدماغ مع R91H05-Gal4 الذي يقود UAS-GFP. يمكن التعرف على كل من GFs (الدوائر) حسب الموقع والشكل والحجم. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. (E) GF سوما عرض موسع قبل الاجتثاث بالليزر. تشير الدائرة الأرجوانية إلى المنطقة المستهدفة للاستئصال بالليزر. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. (F) GF سوما عرض موسع بعد تسليم طاقة الليزر الموضعية والاستئصال الناجح. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. (G) GF سوما عرض موسع قبل الاجتثاث بالليزر. تشير الدائرة الأرجوانية إلى المنطقة المستهدفة للاستئصال بالليزر. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. (H) GF سوما عرض موسع بعد تسليم طاقة الليزر الموضعية والاستئصال غير الناجح (التبييض). شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. استعادة اليرقات
- بعد استئصال الخلية بنجاح ، قم بإزالة الغطاء والتقط اليرقات برفق من الشريحة باستخدام فرشاة الرسم. ضع اليرقات في قارورة طعام. ستبدأ اليرقات في الزحف مرة أخرى في غضون 30 دقيقة.
ملاحظة: إبقاء وقت الإجراء قصيرا يحسن معدلات بقاء. من خلال الخبرة ، يمكن إجراء التجربة في أقل من 10 دقائق. - استمر في تربية اليرقات في الظروف القياسية حتى تغلق من غلاف العذراء.
7. اختبار وظائف GFS في الذباب البالغ
ملاحظة: يتم شرح الخطوات التالية بالتفصيل في Allan and Godenschwege12 و Augustin et al.13.
- اختبار الذباب البالغ في سن 2-5 أيام بعد الإغلاق. تخدير الذباب بثاني أكسيد الكربون2 وتركيبه على شمع الأسنان عن طريق دفع الساقين إلى الشمع. انشر الأجنحة بزاوية 90 درجة ثبتها في مكانها بالشمع. تأمين الرأس عن طريق دفع خرطوم في الشمع.
- ضع أسلاك التحفيز في كلتا العينين ، وسلكا أرضيا في البطن ، وأقطاب تسجيل زجاجية في عضلات القفز (TTMs) على كل جانب.
- تحفيز دائرة GF بمحفزات واحدة لقياس زمن استجابة كلتا العضلتين. تحفيز الدائرة مع 100 هرتز و 200 هرتز من المنبهات ، على التوالي ، لقياس التردد التالي لكلتا العضلات.
8. تشريح ووضع العلامات على نظام الألياف العملاقة للتصوير متحد البؤر
ملاحظة: تم تفصيل تشريح الجهاز العصبي المركزي الذبابة وحقن الصبغة في Boerner و Godenschwege14.
- قم بإزالة الذبابة برفق من شمع الأسنان بالملقط وانقلها إلى طبق بتري مبطن بالمطاط الصناعي السيليكوني تحت نطاق تشريح.
- قم بإزالة الأرجل والأجنحة والخرطوم بالمقص واستخدم دبابيس الحشرات لتأمين الجانب الظهري للذبابة لأعلى في طلاء المطاط الصناعي.
- قم بعمل شق جانبي على طول خط الوسط من منتصف البطن ، عبر الصدر بأكمله ، وحتى الرقبة ، وربط الصدر بالرأس. فتح ذبابة مع دبابيس الحشرات. إزالة الأعضاء والغدد من الذبابة دون الإضرار بالجهاز العصبي.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن حقن محاور GF بالأصباغ لتسمية GFs والخلايا العصبية المقترنة كهربائيا13. - قم بإزالة كبسولة الرأس من الرأس لكشف الدماغ.
9. الكيمياء المناعية للجهاز العصبي
- بعد تشريح الجهاز العصبي المركزي ، ثبت الذبابة في 4٪ PFA في PBS لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). يغسل لمدة 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني في RT (3 مرات).
- امنع العينة لمدة 1 ساعة عند RT في 3٪ BSA في PBS بمحلول منظف 0.5٪.
- احتضان لمدة 2-3 ليال عند 4 درجات مئوية في 3٪ BSA في PBS مع محلول منظف 0.3٪ ومضاد للأرانب GFP (1: 500). يغسل لمدة 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني في RT (6 مرات).
- احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني مع مكافحة الأرانب اليكسا 488. يغسل لمدة 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني في RT (6 مرات).
- قم بتجفيف العينات بسلسلة إيثانول تصاعدية (50٪ ، 70٪ ، 90٪ ، 100٪ إيثانول) لمدة 10 دقائق لكل خطوة. إزالة دبابيس وتقليم البطن وعضلات الطيران. انقل بقية الصدر الذي يحتوي على الجهاز العصبي إلى شريحة وقم بتغطيته بوسط تصاعد مثل ساليسيلات الميثيل. ضع غطاء على العينة وأغلقها بطلاء الأظافر.
- تخيل الجهاز العصبي على مجهر متحد البؤر لتحليل تشريح محطة GF.
النتائج
يمكن استخدام هذه الطريقة للتلاعب بتطوير شبكات عصبية محددة في الجهاز العصبي لذبابة الفاكهة. كان سؤال البحث الأساسي هنا هو تكوين اتصالات متشابكة. مكنت إزالة GF قبل المشبكي أو TTMn بعد المشبكي من التحقيق في تكوين المشابك التفاعلي في هذا المشبك المركزي والآليات الجزيئية الحاسمة لوظيفة المشبكي وتطوره. كما هو موضح في البروتوكول ، تم إجراء استئصال الخلايا بالليزر لأحد GFs أو أحد TTMns ، وتم تحليل التأثيرات على المشبك بعد تطور العذراء في الذبابة البالغة.
للتأكد من أن الإجراء ليس له تأثير سلبي على بقاء ، تم إجراء عمليات استئصال وهمية بالتوازي. بالنسبة للعمليات الوهمية ، تم التعامل مع بنفس الطريقة التي تعامل بها التجارب ، ولكن تم تسليم نبضات الليزر بقوة ليزر تبلغ 0٪. في 82.4 ٪ من الحالات ، تطورت من الاجتثاث وهمية إلى الذباب البالغ. تمكنت GFs من الذباب الوهمي من الاستجابة بزمن انتقال أقل من 1 مللي ثانية واتباع تحفيز 100 هرتز ل 79.3٪ من المحفزات. كان تشريح GF لا يمكن تمييزه عن الذباب غير المعالج.
لكل تجريبي ، تم التحقق من الاجتثاث تشريحيا. في التي تم استئصالها من GF ، تم حقن GF غير المستأصل بالصبغة وتصويره (انظر أدناه). إذا كان محور عصبي GF واحد فقط مرئيا في الضام العنقي (CvC) ، فقد افترض استئصال GF الآخر. يمكن أيضا التحقق من الاجتثاث من خلال عدم وجود سوما تحمل علامة GFP على الجانب المستأصل من الدماغ (الشكل 2 أ ، الدائرة). لتقييم الاجتثاث TTMn ، تم تحليل إشارة GFP في VNC للبالغين حيث يمكن التعرف بسهولة على TTMn soma و dendrite. تم التعرف بسهولة على غياب TTMn على جانب واحد بسبب فقدان السوما والتشعبات (الشكل 2B ، الدائرة).
لاختبار وظيفة GFS في الذباب المعالج ، تم تسجيل إمكانات متشابكة من عضلات القفز12,13 ، والتي تعصبها TTMn ، (الشكل 3A). تشكل GFs مشبكا كهربائيا كيميائيا مختلطا مع التغصنات الإنسيةTTMn 15. طرف GF غير متفرع ويظهر انحناءا جانبيا نموذجيا يعارض تغصنات TTMn في المنطقة المشبكية (الشكل 3D ، الشكل 4A رأس السهم). في الذباب المتحكم فيه ، يعصب كل GF الخلايا العصبية المتحركة المماثلة حصريا. في التسجيلات من ألياف TTM ، تم تقييم قوة الاتصال من خلال تحليل زمن الاستجابة عند تحفيز 1 هرتز والتردد التالي عند تحفيز 100 هرتز (الشكل 3B ، C). أظهر الذباب الضابط متوسط زمن استجابة أقل من 1 مللي ثانية ويمكن أن يتبع تحفيزا 100 هرتز ل 78.1٪ من المحفزات (الشكل 3 ب). بعد إجراء التسجيلات الفسيولوجية ، تم تشريح العينة للكشف عن الجهاز العصبي المركزي و GFs ، والتي تم حقنها بالصبغة بمزيج من TRITC-Dextran و Neurobiotin. يسمي جزيء ديكستران الكبير محور GF وطرفه ولكنه لا يمر عبر تقاطعات الفجوة. يمكن أن يعبر Neurobiotin تقاطعات الفجوة بين GF و TTMn ، وتم اكتشاف إشارة Neurobiotin في التشعبات بعد المشبكية (الشكل 3E ، F ، رؤوس الأسهم). أكد اقتران صبغة Neurobiotin هذا اقتران كهربائي بين الخلايا العصبية. يمكن أيضا اكتشاف Neurobiotin في العديد من الخلايا العصبية الأخرى في VNC المتصلة من خلال تقاطعات الفجوة إلى GF16 (الشكل 3E ، F).
تم إجراء نفس الاختبارات الفسيولوجية والتشريحية بعد استئصال GF واحد في L3. يظهر محور معظم (13/15) من GFs المتبقية في ذباب الاجتثاث انقساما في الطرف إلى فرعين: أحدهما في الموقع المماثل المعتاد والآخر يعبر خط الوسط إلى موضع متماثل مقابل GF السليم (الشكل 3G ، السهم). كان كل فرع مقترنا بالصبغة بأحد التشعبات TTMn (الشكل 3H ، I ، رؤوس الأسهم). أكدت التسجيلات الفسيولوجية من TTMs هذا الاتصال المشبكي ل GF واحد بكلا TTMns ، على الرغم من أنه أضعف من المعتاد. كان زمن استجابة TTM أكبر من 1 مللي ثانية لكلا الجانبين ، وكانت الترددات التالية عند 100 هرتز 37.1٪ ل TTMn المماثل ل GF السليم و 28٪ ل TTM المقابل (الشكل 3C).
نظرا لأن استئصال GF واحد تسبب في تعصيب GF المتبقي لكل من الخلايا العصبية المستهدفة ، فإن التجربة التالية تهدف إلى مراقبة استجابة GFs المجاورة عندما يفتقر المرء إلى خلية عصبية حركية مستهدفة طبيعية مماثلة. في هذه التجربة ، تم حذف أحد الخلايا العصبية بعد المشبكي ، وتم تقييم تشريح ووظيفة TTMn المتبقية بالإضافة إلى مورفولوجيا محطات GF. عند تصور كل من TTMns و GFs في التحكم البالغة ، كانت منطقة الاتصال المشبكي المفترض مرئية بوضوح (الشكل 4 أ ، رؤوس الأسهم). تم وضع كل تغصنات TTMn الإنسية على الطرف قبل المشبكي GF المماثل. كانت الإسقاطات الصغيرة للتشعبات TTMn من كلا الجانبين تلامس خط الوسط (الشكل 4C ؛ أقحم). كان اقتران الصبغة مع Neurobiotin مرئيا بشكل ملحوظ في كل من TTMn (الشكل 4D ، رؤوس الأسهم).
عندما تم إزالة TTMn واحد ، تم تغيير مورفولوجيا التغصنات الإنسية TTMn المتبقية. امتدت الزوائد الشجيرية الإنسية في هذه العينات فرعا طويلا وسميكا عبر خط الوسط (الشكل 4I ، K ؛ الأسهم الصفراء). بالإضافة إلى ذلك ، امتدت الإسقاطات الرقيقة نحو كلا طرفي GF إلى الأمام (الشكل 4E ، G ؛ رؤوس الأسهم الصفراء). أظهر GF ، المماثل ل TTMn ، تشريحه المعتاد مع إسقاط طرفي على طول تغصنات TTMn.
كانت استجابة GF "اليتيمة" التي تفتقر إلى الخلايا العصبية الحركية المستهدفة ذات أهمية أساسية. في معظم الحالات (61.5٪ من) ، أظهر GF اليتيم طرفا منقسما مع طرف واحد على الجانب المماثل والطرف الآخر يعبر خط الوسط ويبرز نحو التغصنات TTMn المقابلة (الشكل 4J ، الأسهم). كانت هذه الفروع المتقاطعة من GF دائما أصغر من تلك التي شوهدت في التجربة التكميلية عندما تم استئصال GF المجاور (الشكل 3F). اتصلت المحطة المماثلة بفرع TTMn الذي امتد عبر خط الوسط (الشكل 4I ، السهم الأصفر). في 23٪ من العينات ، عبرت GF اليتيمة خط الوسط (الشكل 4F ، السهم) وعرضت على طول أحد الفروع الأمامية TTMn (الشكل 4E ، رؤوس الأسهم الصفراء) وكانت مقترنة بالصبغة مع TTMn المتبقية (الشكل 4H ، رأس السهم).
لوحظ نمطان ظاهريان آخران في ذباب الاجتثاث TTMn (الشكل 4M). في واحد من أصل 13 ذبابة ، قام كلا GFs بالانحناء الطبيعي وبقيا على جانبي الجهاز العصبي. في حالة أخرى ، أظهر GF اليتيم النمط الظاهري اللانهائي ، حيث لم يصنع GF اليتيم محطة طرفية وتوقف قبل المنطقة التي ينحني فيها عادة. بالنسبة لجميع الأنماط الظاهرية الأربعة ، كانت تسجيلات TTM على جانب TTMn السليم قابلة للمقارنة مع فسيولوجيا النمط البري (WT) مع زمن استجابة أقل من 1 مللي ثانية والتردد التالي عند 100 هرتز عند 100٪ أو ما يقرب من 100٪. يمكن أن تسمح إزالة هدف واحد لكلا GFs بمشاركة TTMn الهدف المتبقي. في معظم الحالات ، سيقوم كلا GFs بإجراء اتصال مع TTMn المتبقية. بشكل عام ، سوف يعرض GF اليتيم محطة ثنائية. في الذباب المتحكم ، لن تعبر GFs خط الوسط أبدا. ومع ذلك ، في حوالي 85 ٪ من ذباب الاجتثاث TTMn ، عبر GF واحد خط الوسط للاتصال TTMn المقابل. لم يؤثر تعصيب TTMn واحد بواسطة اثنين من GF على الوظيفة المشبكية سلبا.
من الجدير بالذكر أن غياب GF المجاور له تأثير أكبر من غياب الخلايا العصبية الحركية المستهدفة. الطرف الثنائي الذي تم تشكيله في غياب GF المقابل أكبر بكثير وأكثر وظيفية بشكل واضح من التغييرات عند إزالة الهدف.
الشكل 2: أمثلة على عمليات الاستئصال الناجحة في الجهاز العصبي المركزي للبالغين. (أ) الإسقاط الأقصى لشدة دماغ ذبابة بالغة بعد استئصال اليرقات GF. يتم تشغيل GFP (الأخضر) بواسطة A307-GAL4. تشير الدائرة إلى المنطقة التي يكون فيها GF المستأصل مفقودا. يشير رأس السهم إلى GF المتبقي معبرا عن GFP على الجانب الآخر من الدماغ. تم ملء GF مع TRITC-Dextran (أحمر). يندفع المحور العصبي خلفيا في اتجاه VNC. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. (ب) الإسقاط الأقصى للكثافة ل VNC بالغ حيث تم استئصال TTMn واحد في L3. يعبر TTMn المتبقي (رأس السهم) عن GFP تحت برنامج التشغيل shakB (القاتل). يشار إلى منطقة TTMn المفقودة بواسطة الدائرة. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: يتسبب استئصال اليرقات لألياف عملاقة واحدة (GF) في التفرع الثنائي للطرف قبل المشبكي للطرف المشبكي ل GF المتبقي. (أ) رسم تخطيطي للإعداد التجريبي لاختبار بنية ووظيفة نظام الألياف العملاقة البالغة (GFS). يقيس قطب التسجيل زمن الوصول والتردد التالي لمخرجات الخلايا العصبية الحركية tergotrochanteral (TTMn) في عضلات tergotrochanteral (TTM) عند تحفيز الدماغ في السليم. بعد تشريح الجهاز العصبي ، تم حقن الصبغة في محاور GF في الضام العنقي (CvC). (ب، ج) تتبع عينة لزمن انتقال استجابة TTM والتردد التالي عند 100 هرتز (يمثل n عدد TTM المسجل من كل موقف مع متوسط زمن الوصول والتردد التالي المعروض). (ب) تظهر الضابطة التي تحتوي على اثنين من GFs سليمة زمن انتقال TTM أقل من 1 مللي ثانية والترددات التالية قريبة من 100٪ عند 100 هرتز. (ج) GF الوحيد المتبقي في المستأصلة يعصب كلا من TTMns. زمن الانتقال لكل من TTMns أطول من عناصر التحكم ، وبعد 100 هرتز ، ينخفض التردد بشكل ملحوظ. (مد-طاء) أقصى كثافة إسقاط لمكدسات الصور متحدة البؤر ل GFs المملوءة بالأصباغ. تم حقن TRITC-Dextran (D ، G ، F ، I باللون الأحمر) و Neurobiotin (E ، H ، F ، I باللون الرمادي). يمكن أن يعبر Neurobiotin تقاطعات الفجوة بين GF و TTMn ، مع تسمية الخلايا العصبية بعد المشبكي. تشير الخطوط المنقطة إلى خط الوسط. (د) تشريح GF النموذجي لحيوانات التحكم مع الانحناء الطرفي. (ه، و) يقوم Neurobiotin بتسمية العديد من الخلايا العصبية بعد المشبكية المقترنة كهربائيا ب GFs. يشار إلى التشعبات TTMn الموسومة بشكل متشابك بواسطة رؤوس الأسهم. (G) بعد الاجتثاث ، ينمو GF المتبقي طرفا إضافيا (سهما) ، والذي يعبر خط الوسط لتعصيب TTMn المقابل. (H ، I) كل من TTMn (رؤوس الأسهم) مقترنة بالصبغة بنفس GF. قضبان المقياس: 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4. يؤدي استئصال اليرقات لخلية عصبية حركية ثلاثية (TTMn) إلى تعصيب TTMn المتبقي بواسطة كلا الألياف. (أ-ل) كانت الإسقاطات القصوى للكثافة لمكدسات الصور متحدة البؤر ل TTMns الموسومة ب GFP (أخضر) تحت سيطرة shakB (قاتلة) -Gal4 وكانت GFs مملوءة بصبغة TRITC-Dextran (أرجواني) و Neurobiotin (أحمر). يشير الخط المنقط إلى خط الوسط للجهاز العصبي. (أ-د) عينات التحكم مع كل من TTMns سليمة. تجعل GFs طرفها النموذجي ينحني بعيدا عن خط الوسط للاتصال ب TTMn (A ، B) ، ويتصل كل GF ب TTMn واحد. تلتقي التشعبات TTMn عند خط الوسط (C). كل GF عبارة عن صبغة مقترنة ب TTMn (D ، رؤوس الأسهم البيضاء). (ه-ح) تم إلغاء TTMn الأيسر. التغصنات الإنسية لمشاريع TTMn المتبقية عبر خط الوسط (G ، السهم الأصفر). يعبر GF اليتيم خط الوسط (السهم الأبيض) في المنطقة المشبكية ويتصل بالتغصنات TTMn المقابلة (E ، F). GFs عبارة عن صبغة مقترنة ب TTMn المتبقية (H ، رأس السهم). (I-L) مثال على النمط الظاهري GF آخر حيث تم حذف TTMn الأيسر. التغصنات الإنسية لمشاريع TTMn المتبقية عبر خط الوسط (I و K ، السهم الأصفر). GF اليتيم الأيسر يجعل محطة ثنائية. أحد الفروع يعرض بشكل معاكس ، والآخر يبقى مماثلا (J ، الأسهم) للاتصال ب TTMn. قضبان المقياس: 20 ميكرومتر. (M) رسم تخطيطي للأنماط الظاهرية الأربعة المختلفة GF المرصودة في الاجتثاث TTMn. n يشير إلى عدد في كل فئة. بالنظر إلى المتوسطات ذات الخطأ المعياري لزمن انتقال استجابة TTM والتردد التالي (FF) عند 100 هرتز لجانب TTMn السليم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
المناقشة
أثبت الاجتثاث الخلوي باستخدام مجهر 2 فوتون أنه طريقة ناجحة للغاية لمعالجة تطور الدائرة العصبية في ذبابة الفاكهة. نظرا لأن هذه الطريقة غير جراحية ، فإنها تسبب الحد الأدنى من الضرر للحيوان. تدعم البيانات فائدة هذا التلاعب الخاص بالخلية للدوائر المعروفة.
كان من الأهمية بمكان لنجاح الاجتثاث اختيار سائق Gal4 الأنسب. نظرا لأن GFS تمت دراسته جيدا ، فقد تم وصف العديد من خطوط تشغيل Gal4 المحددة7. معظم برامج تشغيل Gal4 مقيدة للغاية ولكن لا يزال يتم التعبير عنها في العديد من الخلايا العصبية الأخرى. كان أحد التحديات هو تحديد الخلايا المستهدفة في السليم بشكل موثوق. بالنسبة للحيوانات التي تحمل ملصق GFP مرئيا بوضوح ، يمكن إجراء الاجتثاث بطاقة ليزر منخفضة وغالبا ما يتطلب تجربة واحدة فقط. في التي كانت الأنسجة الدهنية تغطي الدماغ أو كان تعبير GFP ضعيفا ، يتطلب حذف الخلايا المستهدفة طاقة ليزر أعلى وحلقات متعددة من التعرض لليزر. كانت أجسام خلايا GF تقع على عمق حوالي 100 ميكرومتر من الجانب الظهري للدماغ. بالنسبة للتجارب التي توجد فيها الخلايا المستهدفة على عمق أعمق، قد يكون من المفيد إجراء عملية الاستئصال في مراحل اليرقات المبكرة عندما يكون الجهاز العصبي أصغر.
في التجارب السابقة في المختبر ، تم استكشاف طرق مختلفة لاستئصال الخلايا. أدى استخدام نظام UAS / Gal4 لدفع التعبير عن السموم أيضا إلى حذف خلايا عصبية معينة. ومع ذلك ، من الأصعب بكثير التحكم في حذف الخلايا المفردة وتجنب التأثيرات غير المستهدفة. الصعوبة الأخرى هي التحكم في التوقيت الدقيق لحدث حذف الخلية. مكن استئصال الخلايا بالليزر من التحكم الدقيق في الموقع المستهدف وتوقيت الحذف ، ولكن لا تزال هناك بعض التحديات التي يجب التغلب عليها قبل إتقان الطريقة والوصول إلى معدلات نجاح تزيد عن 80٪ (بقاء والاستئصال الناجح للخلايا). تأثر معدل بقاء سلبا بالتعرض الطويل لإثير الإيثيل وأوقات الإجراءات الطويلة. أظهرت الدراسات أنه يمكن تحقيق معدلات بقاء عالية للتشرنق (78٪) و eclosion للبالغين (67٪) لمدة 3.5 دقيقة من تعرض يرقات ذبابة الفاكهة L3 إلى EthylEther 10. سيضمن التعرض لمدة 3.5 دقيقة أن غير قادر على الحركة لمدة تصل إلى 8 ساعات. لاستئصال الخلايا بالليزر ، يجب أن تكون غير متحركة لمدة 30 دقيقة أو أقل. لذلك ، يمكن الاحتفاظ بوقت التعرض لإثير الإيثيل أقل بكثير من 3.5 دقيقة. في معظم الحالات ، كانت اليرقات غير متحركة تماما في غضون 1 دقيقة.
تظهر نتائج الاجتثاث بالليزر أنه يمكن استئصال GF بشكل نظيف ، ويتم تقييم التأثير على GF المجاور المقابل بسهولة. كانت نتيجة الاجتثاث واضحة ومتسقة. في 13 من أصل 15 عملية استئصال أحادية الخلية ، يظهر شركاء GF المتبقون محطة ثنائية لم يسبق رؤيتها في الضابطة. يمكن التعرف بسهولة على هذه المحطة المتماثلة ثنائيا ، والفرع المقابل غير المعتاد مشابه في الحجم للطرف العادي ويقترن بالصبغة بالخلية العصبية الحركية المستهدفة المقابلة. يقترن الطرف الثنائي بالصبغة لكل من الخلايا العصبية الحركية المستهدفة ويعمل بشكل وحشي تقريبا في معظم العينات ، مما يقود كلا من الهدف العادي المماثل وكذلك الخلايا العصبية الحركية المستهدفة المقابلة مع زمن انتقال والترددات التالية بالقرب من قيم التحكم.
توفر التجربة التكميلية ، وهي استئصال أحادي الجانب للخلية العصبية الحركية المستهدفة ، مقارنة مثيرة للاهتمام. غالبا ما تظهر الخلايا العصبية الحركية المتبقية نموا شجيريا تفاعليا ، مما يمد العملية عبر خط الوسط إلى الفضاء الذي يشغله عادة الجار المحذوف. على الرغم من أن هذا التغصن ليس كبيرا مثل المحذوف ، إلا أنه يوضح رد فعل مشابه لفقدان GFs لرفيقها الثنائي. في المقابل ، يستجيب GF الذي لا هدف له الآن بشكل متواضع فقط للهدف الغائب ، مما يوسع العمليات البسيطة عبر خط الوسط وعلى طول تغصنات الخلايا العصبية الحركية المتبقية. تتناقض هذه الاستجابة المتواضعة بشكل حاد مع استجابة GF الدراماتيكية ل GF المتماثل الثنائي المفقود ، حيث يتم تشكيل طرف كبير مقابل لاستكمال الطرف العادي وتشكيل محطة ثنائية.
تم إجراء تجربة استئصال موازية مؤخرا على مدخلات ما قبل المشبكي إلى GF في الدماغ ، حيث تم الكشف عن نوع مماثل من "المنافسة" على الفضاء المشبكي17. المدخلات البصرية إلى GF بلاط الكبيبة حيث تصل الخلايا العصبية الإسقاط البصري (VPN) إلى تغصنات GF. يوضح حذف مجموعة واحدة من الشبكات الافتراضية الخاصة (في هذه الحالة وراثيا) أن الشبكات الافتراضية الخاصة المتبقية تتولى وتعصب بعض المساحة المشبكية للجار الغائب وتنتج انتعاشا فسيولوجيا تعويضيا للاستجابة البصرية للمحفزات التي تلوح في الأفق. عندما يتم حذف الوافدين الأوائل ، يشغل الوافدون المتأخرون مساحة ولم يعودوا مشغولين. التشابه الظاهري الرئيسي مع العمل الحالي هو الدور الواضح الذي يلعبه الإشغال المادي في تحديد التوازن بين المدخلات المختلفة. يبدو أن أطراف الإخراج لاثنين من GFs تتنافس مع بعضها البعض على الفضاء المشبكي المادي.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم إجراء تجارب على مجهر 2 فوتون في معهد FAU Stiles-Nicholson Brain Imaging Core المتقدم للخلايا. نود أن نشكر مبادرة علوم الحياة كوكب المشتري على الدعم المالي.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| بروتين الفلورسنت الأخضر المضاد ، الأرنب | فيشر Scientific | A11122 | 1: 500 تركيز |
| Apo LWD 25x / 1.10W الهدف | نيكون | MRD77220 | الغمر في الماء مسافة عمل طويلة |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | سيجما | B4287-25G | |
| Chameleon Ti: Sapphire Vision II كرة | قطنية متماسكة | ||
| بالليزر جينيسي Scientific | 51-101 | ||
| Dextra ، Tetramethylrhodamine ، 10،000 ميجاوات ، Lysine Fixable (fluoro-Ruby) | وصفة Fisher Scientific | D1817 | |
| ذبابة الفاكهة الملحية | من Gu and O'Dowd ، 2006 | ||
| إيثيل الأثير | فيشر Scientific | E134-1 | الخطر ، طباب السائل القابل للاشتعال |
| ب (وصفة بلومنجتون) | LabExpress | 7001-NV | |
| ميثيل ساليسيلات | فيشر Scientific | O3695-500 | |
| أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل | Eppendorf | 22363204 | |
| غطاء مجهر زلة 18x18 # 1.5 | فيشر Scientific | 12-541A | |
| ناقل التتبع العصبي | مختبرات | SP-1120 | |
| نيكون A1R مجهر متعدد الفوتون | نيكون | على حامل FN1 microsope عمودي | |
| NIS عناصر أبحاث متقدمة | اقتناء وتحليل | البيانات نيكون | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | T353-500 | |
| PBS (ملح الفوسفات) | كواشف فيشر الحيوية | BP2944-100 | أقراص |
| R91H05-Gal4 | مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة | 40594 | |
| shakB (قاتل) -GAl4 | مركز ستوك بلومنجتون ذبابة الفاكهة | 51633 | |
| شريحة زجاجية مجهر Superfrost | فيشر Scientific | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | منظف | 422355000 | علمي |
| فيشر UAS-10xGFP | بلومنجتون ذبابة الفاكهة مركز الأسهم | 32185 |
المراجع
- Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
- Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92(2014).
- Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
- Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint. J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).
- Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens. J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae. Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), 5453(2010).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. (47), e2412(2011).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), e3080(2011).
- Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
- Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), 0346(2018).
- Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
