Method Article

نموذج في المختبر لدراسة التمايز والتغيرات في الأوميكس المتعدد على الخلايا الظهارية في مجرى الهواء الفئران المحفزة بمستخلص دخان السجائر

DOI:

10.3791/67057

⸱

July 12th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 2Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, 3National Center for Respiratory Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف نموذجا في المختبر لعزل وتمييز الخلايا الظهارية في مجرى الهواء الفئران ، مع التركيز على تأقلمها مع مستخلص دخان السجائر المزمن (CSE). يمكن استخدام النموذج لتوصيف شامل للتأثير متعدد الأوميكس ل CSE ، والذي ربما يوفر نظرة ثاقبة للاستجابات الخلوية في ظل التعرض المزمن للدخان.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعزى مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) إلى حد كبير إلى التعرض لدخان التبغ. يعد التحقيق في كيفية تكيف الخلايا الظهارية في مجرى الهواء وظيفيا مع دخان التبغ أمرا بالغ الأهمية لفهم التسبب في مرض الانسداد الرئوي المزمن. كانت الدراسة الحالية لإنشاء نموذج في المختبر باستخدام الخلايا الظهارية في مجرى الهواء الأولي لتقليد التأثير الواقعي لدخان التبغ. على عكس خطوط الخلايا الراسخة ، تحتفظ الخلايا الأولية بخصائص شبيهة بالجسم الحي ، بما في ذلك أنماط النمو والشيخوخة والتمايز. تظهر هذه الخلايا استجابة التهابية حساسة وتمايز فعال ، وبالتالي تمثل عن كثب الظروف الفسيولوجية. في هذا النموذج ، تم استزراع الخلايا الظهارية الأولية في مجرى الهواء لمدة 28 يوما تحت واجهة الهواء والسائل مع التركيز الأمثل لمستخلص دخان السجائر (CSE) ، مما أدى إلى تحويل طبقة أحادية من الخلايا غير المتمايزة إلى ظهارة عمودية شبه طبقية ، مما يدل على تأقلم CSE. ثم تم تطبيق تحليلات شاملة متعددة الأوميكس لتوضيح الآليات التي يؤثر بها CSE على تمايز خلايا مجرى الهواء القاعدي. توفر هذه الأفكار فهما أعمق للعمليات الخلوية التي يقوم عليها تطور مرض الانسداد الرئوي المزمن استجابة للتعرض لدخان التبغ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) هو حالة رئوية غير متجانسة ذات خصائص معقدة ، في حين أن المرضى الذين يعانون من مرض الانسداد الرئوي المزمن يميلون تدريجيا إلى أن يكونوا أصغرسنا 1. التدخين ، وهو عامل خطر رئيسي لمرض الانسداد الرئويالمزمن 2 ، له تأثير عميق على الخلايا الظهارية في مجرى الهواء ، والتي تعمل كحاجز أولي ضد دخان التبغ. على الرغم من هذا الارتباط المعروف ، فإن الآليات التفصيلية التي يؤدي من خلالها دخان التبغ إلى تغييرات في الخلايا الظهارية في مجرى الهواء لا تزال غير مستكشفة بشكل كاف. يعد الفهم الشامل لهذه التغيرات الجزيئية أمرا ضروريا لتحديد علامات التشخيص المبكر والأهداف العلاجية لمرض الانسداد الرئوي المزمن.

لمعالجة هذه الفجوة ، قمنا بتطوير نموذج جديد في المختبر باستخدام الخلايا الظهارية في مجرى الهواء الفئران. تعرضت هذه الخلايا لتحفيز طويل الأمد باستخدام مستخلص دخان السجائر (CSE) ، مما مكننا من مراقبة التغيرات الخلوية الديناميكية واستكشاف التغيرات في الخلايا الظهارية في مجرى الهواء تحت تحفيز التبغ على المدى الطويل والآلية الأساسية. في هذا النموذج ، تم استخدام transwell لتوفير واجهة الهواء والسائل للخلايا الظهارية في مجرى الهواء ، وتم تحفيز مستخلص دخان السجائر في المرحلة المبكرة من تمايز الخلايا الظهارية حتى نهاية التمايز في 28 يوما. بحثت الدراسات السابقة فقط في التمايز والتحفيز قصير المدى للخلايا الظهارية في مجرى الهواء (هيمنة خط الخلية). كانت تقتصر على مسار تنظيمي واحد3،4،5،6. ومع ذلك ، فإن البروتوكول المقدم هنا يستخدم الخلايا الظهارية في مجرى الهواء الأولي للفأر ويحسن عملية استخراج الخلايا للحصول على نشاط خلوي أفضل من طرق زراعة الخلايا الظهارية في مجرى الهواء السابقة. يركز هذا النموذج على التغيرات في التمايز الخلوي جنبا إلى جنب مع التحليلات الشاملة للنسخ والبروتينات والتمثيل الغذائي وفوق الجينوم. باستخدام التألق المناعي والتقنيات المتقدمة متعددة الأوميكس ، كنا نهدف إلى توضيح الاستجابات الخلوية للخلايا الظهارية في مجرى الهواء للتعرض المزمن لدخان التبغ ، وبالتالي المساهمة في فهم أعمق للتسبب في مرض الانسداد الرئوي المزمن. يمكن استخدام هذا النموذج لاستكشاف التغيرات في نمط تمايز الخلايا الظهارية في مجرى الهواء وآليتها الناتجة عن التحفيز طويل المدى للملوثات المختلفة.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب البروتوكول العام 44 يوما ، بما في ذلك يوم واحد لإعداد الخلايا الظهارية في مجرى الهواء المعزولة من القصبة الهوائية للفئران ، و 15 يوما لتكاثر الخلايا ، و 28 يوما لتحفيز CSE في واجهة الهواء والسائل. يتم وضع جميع التجارب في غرفة SPF Barrier Animal Room التابعة لمركز التجارب الحيوانية بجامعة كابيتال الطبية وقد تمت مراجعتها والموافقة عليها من قبل لجنة التجارب على وأخلاقيات المختبر بجامعة كابيتال الطبية (AEEI-2020-100) لتلبية متطلبات إرشادات REACH7.

1. عزل الخلايا الظهارية في مجرى الهواء الأولي من القصبة الهوائية الفئران

  1. اعداد
    1. قم بإعداد وسط تمدد كامل من خلال الجمع بين 1 مل من مكمل 50x و 0.05 مل من مخزون الهيدروكورتيزون مع 48.95 مل من الوسط القاعدي للتمدد. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية ويستخدم في غضون 4 أسابيع.
    2. قم بإذابة 7.5 ملغ من البروتيناز و 5 ملغ من ديوكسي ريبونوكلياز I في 5 مل من F-12 من هام لتحضير محلول بروتيناز. قم بترشيحه لتعقيمه وتخزينه على حرارة 4 درجات مئوية واستخدمه في غضون 4 أسابيع.
    3. تحضير محاليل المضادات الحيوية بإضافة 0.05 مل من 100x بنسلين / ستربتومايسين و 0.01 مل من 500x جنتاميسين / أمفوتريسين إلى 5 مل من وسط التمدد الكامل ، PBS ، ومحلول بروتيناز (100 وحدة / مل بنسلين ، 100 وحدة / مل ستربتومايسين ، 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين و 0.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ب). يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية ويستخدم في غضون 4 أسابيع.
    4. تعقيم الأدوات الجراحية وإعداد خزانة السلامة البيولوجية لعزل الخلايا. في الوقت نفسه ، تأكد من أن معدات زراعة الخلايا القياسية جاهزة للاستخدام.
    5. قم بإعداد الأطباق المغلفة بالكولاجين في ذيل الفئران عن طريق إضافة كولاجين ذيل الفئران (100 ميكروغرام / مل في 0.02 نيوتن حمض الخليك) في أطباق استزراع 100 مم و 24 مم (0.05 مل / سم2). اتركيه مفتوحا طوال الليل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية للتعقيم.
  2. عزل الخلايا الظهارية في مجرى الهواء الأولي
    1. استخدم C57BL / 6 الفئران (6-8 أسابيع ، ذكر ، SPF) لعزل الخلايا الظهارية القصبة الهوائية. القتل الرحيم بجرعة زائدة من محلول الصوديوم بنتوباربيتال 1٪ (حوالي 200 مجم / كجم). استخدم خمسة فئران للحصول على إنتاجية كافية من الخلايا.
    2. تعقيم الماوس عن طريق الغمر في محلول الإيثانول 75 ٪ ، وليس غمر الأنف والفم في الكحول لمنع الكحول من التدفق إلى القصبة الهوائية.
    3. تشريح الماوس.
      1. استخدم الشفرات والملقط الجراحي ، وهي مجموعة واحدة من الأجهزة لقطع وفتح البشرة من الفك السفلي إلى تجويف البطن للماوس.
      2. استخدم مجموعة أخرى من الأدوات الجراحية لتمزيق الغدد الدرقية على كلا الجانبين وإزالة الروابط بين القصبة الهوائية والأنسجة العضلية المحيطة والمريء.
      3. بعد ذلك ، قم بقطع الصدر بعناية ، واستخدم الملقط للتعمق في تجويف الصدر ، وإخراج الرئة بأكملها ، والعثور على نهاية القصبة الهوائية.
    4. معالجة القصبة الهوائية.
      1. قطع القصبة الهوائية من غضروف الغدة الدرقية إلى فرع القصبة الهوائية الشعب الهوائية ووضعها في وسط تمدد ما قبل البرودة يحتوي على أربعة مضادات حيوية.
      2. هز الأنبوب لشطف أكبر قدر ممكن من الدم من سطح القصبة الهوائية ، واحتفظ به على الثلج ، ثم ابدأ الجراحة للفأر التالي.
    5. نقل جميع القصبات الهوائية التي تم جمعها إلى مخزن مؤقت قبل البرودة يحتوي على أربعة مضادات حيوية (200 وحدة / مل من البنسلين ، 200 وحدة / مل من الستربتومايسين ، 20 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، و 0.5 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين ب) للمعالجة المسبقة قبل الهضم.
    6. استخدم مجموعة من الأدوات الجراحية لإزالة الجلطات والأنسجة الأخرى من أسطح القصبة الهوائية ، ثم قم بتقطيعها إلى حجم 1 سم2 .
    7. احتضان أنسجة القصبة الهوائية في محلول بروتيناز عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
    8. بعد 40 دقيقة ، هز الأنبوب عدة مرات واستخدم مصفاة خلية 40 ميكرومتر لإزالة الأنسجة المتبقية. اشطف القصبة الهوائية المفرومة على مصفاة تحتوي على 5 مل من وسط التمدد ، وطرد مركزي معلق الخلية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية.
    9. أعد تعليق الخلايا التي تم الحصول عليها في 8 مل من وسط التمدد.
    10. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق ومقياس الدم.
    11. لوحة P0 تعليق الخلية على أطباق 100 مم (1 × 104 خلايا حية / سم2) مغلفة مسبقا بكولاجين ذيل الفئران ، وزرع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.

2. ثقافة التوسع ومرور الخلايا الظهارية في مجرى الهواء الأولي

  1. استبدل الوسط لثقافة الخلايا P0 كل 3 أيام حتى تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ -80٪ ، عادة في غضون 6 أيام. عند هذه النقطة ، يمكن أن تشكل الخلايا الظهارية القصبة الهوائية للفأر طبقة أحادية سليمة ذات مظهر مرصوف بالحصى (الشكل 1A-D).
  2. قم بتسخين كميات كافية من PBS ، ووسط التمدد الكامل ، ومجموعة تفكك الخلايا الخالية من المكونات الحيوانية (ACF) إلى 37 درجة مئوية.
  3. شطف الخلايا بلطف مع 3 مل من برنامج تلفزيوني.
  4. أداء التفكك الأنزيمي.
    1. أضف 3 مل من محلول التفكك الأنزيمي ACF إلى الطبق واحتضانه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد سحب العين، قم بإزاحة الخلايا برفق ونقل معلق الخلية إلى 3 مل من محلول تثبيط إنزيم ACF.
    2. كرر إضافة 3 مل من محلول التفكك الأنزيمي ACF واحتضانه مرة أخرى لمدة 5 دقائق لضمان أقصى انفصال للخلايا.
  5. أدر معلق الخلية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.
  6. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط التمدد.
  7. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق ومقياس الدم.
  8. لوحة P1 تعليق الخلية على عدة أطباق 100 ملم (5 × 104 خلايا حية / سم2) مغلفة مسبقا بكولاجين ذيل الفئران ، وزرع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.

3. التمايز وتحفيز CSE للخلايا الظهارية في مجرى الهواء الأولي في واجهة الهواء والسائل

  1. قم بتأكيد نوع الخلية.
    1. تحقق من الأصل الظهاري للخلايا المعزولة باستخدام مقايسة التألق المناعي (IFA) مع الأجسام المضادة ضد السيتوكيراتين. خلايا البذور على شرائح زجاجية مغلفة بكولاجين ذيل الفئران وتستخدم بارافورمالدهايد لإصلاحها لمدة 12 ساعة على الأقل بعد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80٪.
    2. اغسل الشرائح 3 مرات بمحلول PBS لمدة 5 دقائق واحتضانها بنسبة 3٪ BSA و 0.1٪ triton X-100 في محلول PBS في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة.
    3. احتضان الشرائح طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الجسم المضاد التجاري المضاد للسيتوكيراتين عند تخفيف 1: 500.
    4. في اليوم التالي ، اغسل الشرائح 3 مرات بمحلول PBS لمدة 5 دقائق واحتضانها بمحلول ثانوي للأجسام المضادة بتخفيف 1: 1000 في RT لمدة 2 ساعة في الظلام.
    5. بعد الحضانة ، اغسل الشرائح 3 مرات باستخدام PBS (5 دقائق لكل غسلة) ، وأضف DAPI بتخفيف 1: 1000 لهم. بعد الحضانة في RT لمدة 15 دقيقة ، اغسل الشرائح مرة واحدة باستخدام PBS لمدة 5 دقائق.
    6. راقب الشرائح تحت مجهر مضان وقارن أنماط التعبير بعنصر تحكم إيجابي (خط خلية A549) وعنصر تحكم سلبي (خط خلية Raw264.7) (الشكل 2).
  2. بذر الخلايا للتمايز.
    1. فصل خلايا P2 وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح سابقا ، وإعادة تعليق حبيبات الخلية في حجم مناسب من وسط التمدد لتسهيل طلاء 1 × 104 خلايا حية / سم2.
    2. ماصة 1 مل من تعليق الخلية على الغرفة القمية لإدراج غشاء البولي كربونات transwell. إلى المقصورة القاعدية للترانسويل ، أضف 1.5 مل من وسائط الانتشار.
  3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية وتغيير جميع الوسط بالكامل في الغرف القاعدية والقمية كل 3 أيام باستخدام وسط التمدد حتى يتم الوصول إلى التقاء. يستغرق هذا عادة 3-6 أيام.
  4. تحضير 50 مل من وسط التمايز الكامل بإضافة 5 مل من مكمل ALI 10x ، و 500 ميكرولتر من مكمل صيانة ALI ، و 100 ميكرولتر من محلول الهيبارين ، و 250 ميكرولتر من محلول مخزون الهيدروكورتيزون إلى 44.15 مل من وسط ALI القاعدي.
  5. إعداد CSE.
    1. قم بفقاعة سيجارة واحدة من خلال 12.5 مل من وسط التمايز ثم قم بترشيحها من خلال مرشح مسام 0.22 ميكرومتر لتحضير CSE. لضمان التوحيد القياسي بين التجارب ودفعات CSE ، قم بقياس الامتصاص عند 320 نانومتر على مقياس الطيف الضوئي وحدد الكثافة الضوئية (OD) من 1 على أنها 100٪ 8.
  6. استخدم وسط التمايز الذي يحتوي على تركيز مناسب من CSE لتحفيز الخلايا الظهارية في مجرى الهواء الأولي للكشف عن التأثيرات على تمايز الخلايا.
  7. اسمح للخلايا بالتمايز لمدة 28 يوما ، يتم خلالها تغيير وسائط الغرفة القاعدية ، ويتم غسل الجانب القمي مرتين في الأسبوع عن طريق إزالة وسائط الغرفة القمية واستبدال وسائط الغرفة القاعدية بوسط التمايز الذي يحتوي على التركيز المناسب ل CSE.
  8. تحليل الخلايا بعد التعرض.
    1. بعد التعرض لوسط التمايز الذي يحتوي على CSE ، احصد الخلايا وطافات الثقافة في أي وقت (أي 0-28 يوما) للكشف عن التغيرات المورفولوجية (أي مقايسة التألق المناعي (IFA) أو تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين (HE) أو للإجراءات التحليلية المعلوماتية الحيوية (أي علم النسخ ، البروتينات ، الأيض ، إلخ).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التمايز
تم تمييز الخلايا الظهارية في مجرى الهواء الفئران بنجاح بعد الاستزراع في واجهة الهواء السائل مع وسط تمايز لمدة 28 يوما. تم إثبات وجود الخلايا الهدبية والكأسية من خلال مقايسة التألق المناعي لأسيتيل علامة الأهداب α-توبولين (أخضر; الشكل 3 أ) وعلامة الخلية الكأسية Mucin5AC ، على التوالي 6 (أحمر ؛ الشكل 3 ب).

تحديد تركيز CSE لتمايز الخلايا
تحفيز الخلايا الظهارية المعزولة بتركيزات مختلفة من CSE لمدة 24 ساعة. أظهرت النتائج أن الخلايا الظهارية انخفضت في صلاحية الخلية عندما كان تركيز CSE أعلى من 6٪ (p <0.05 ، الشكل 4A). من أجل الحفاظ على نشاط الخلية تحت التحفيز طويل المدى ، تم استخدام وسائط الاستزراع التي تحتوي على 2٪ و 4٪ و 6٪ CSE لتحفيز تمايز الخلايا الظهارية لمدة 28 يوما. علاوة على ذلك ، أظهرت النتائج أنه مع زيادة تركيز CSE ، لم يكن هناك موت كبير للخلايا في الخلايا الظهارية (الشكل 4B) ، ولكن كان هناك تغيير تدريجي في عدد المقاومة عبر الغشاء بين الخلايا (TEER) (الشكل 4C) والخلايا المقشرة (الشكل 4D). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ انخفاض عام في الخلايا المتمايزة والخلايا المهدبة عندما تعرضت مزارع الخلايا الظهارية في مجرى الهواء بشكل مزمن ل CSE (الشكل 4E-H). لذلك ، تم اختيار وسط التمايز الذي يحتوي على 6٪ CSE لخلل تنظيم وظيفة الحاجز الظهاري وتقليل أعداد الخلايا المهدبة دون انخفاض في صلاحية الخلية مع تمييز الخلايا الظهارية لمدة 28 يوما.

تحليل متعدد الأوميكس
تم حصاد مجموعتين من الخلايا المحفزة بوسط تفاضلي يحتوي على 0٪ أو 6٪ CSE لمدة 28 يوما. تم استخراج إجمالي mRNA لتحليل النسخ. بعد إعداد المكتبة ، والتسلسل ، ومراقبة الجودة ، وقراءة رسم الخرائط للجينوم المرجعي ، والقياس الكمي للتعبير الجيني ، تم تحليل التعبير التفاضلي للجينات بين المجموعتين. تم استخدام حزمة clusterProfiler R لإجراء تحليل إثراء لأنطولوجيا الجينات (GO) للجينات التي أظهرت تعبيرا تفاضليا ، مع إجراء تعديلات لمراعاة تناقضات طول الجينات (الشكل 5 أ). تعمل موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) كقاعدة بيانات شاملة تسهل فهم وظائف وأدوار النظام البيولوجي المعقدة على مختلف المستويات ، بما في ذلك الخلوية والعضوية والبيئية ، من خلال دمج البيانات على المستوى الجزيئي المستمدة من مجموعات بيانات واسعة النطاق مثل تلك التي ينتجها التسلسل الجينومي والمنهجيات التجريبية عالية الإنتاجية (الشكل 5 ب). بالنسبة للبروتينات ، تم استخراج البروتينات الكلية من مجموعتين من الخلايا في 28 يوما بعد الثقافات ذات الوسائط التفاضلية التي تحتوي على 0٪ أو 6٪ CSE. بعد اختبار جودة البروتين ، وإزالة الملح ، والتحلل الأنزيمي للبروتين ، ووضع العلامات الكتلية الترادفية (TMT) على الببتيدات ، وفصل الكسور ، وتحليل LC-MS ، وتحديد البروتين ، وكمية البروتين ، يمكن تحديد البروتينات المعبر عنها بشكل تفاضلي بين مجموعتين. تم إجراء تحليل GO باستخدام برنامج interproscan مقابل قاعدة بيانات البروتين غير الزائدة (الشكل 6A) ، وتم استخدام KEGG لتحليل المسار (الشكل 6B). بالنسبة لعلم الأيض ، تم جمع طافات المزرعة من مجموعتين من الخلايا الظهارية في مجرى الهواء في 28 يوما بعد الثقافات ذات وسط التمايز الذي يحتوي على 0٪ أو 6٪ CSE. بعد تحليل HPLC-MS / MS وتحديد وقياس المستقلبات ، يمكن تعريف المستقلبات التفاضلية بين المجموعتين. تم استخدام قاعدة بيانات KEGG (الشكل 7A) وقاعدة بيانات الأيض البشري (الشكل 7B) وقاعدة بيانات Lipidmaps (الشكل 7C) لشرح جميع المستقلبات. تم استخدام قاعدة بيانات KEGG لتحليل وظائف هذه المستقلبات التفاضلية والمسارات الأيضية (الشكل 7D). بالنسبة لعلم الجينوم ، تم تنفيذ ATAC-seq كما تم الإبلاغ عنه سابقا9. تم استخراج النوى من مجموعتين من الخلايا في 28 يوما بعد الزراعة بوسط تفاضلي يحتوي على 0٪ أو 6٪ CSE ، وتم إعادة تعليق حبيبات النوى في مزيج تفاعل الترانسبوزاز Tn5. تم تحضين تفاعل التحويل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد إضافة محول ، وإعداد المكتبة ، وتقييم الجودة ، والتجميع ، والتسلسل ، يمكن تحديد علم اللاجين التفاضلي بين مجموعتين. يعكس تحليل التخصيب GO للجينات المرتبطة بالذروة التفاضلية بشكل مباشر التوزيع العددي للجينات المرتبطة بالذروة التفاضلية في عناصر GO المخصبة في العمليات البيولوجية والمكونات الخلوية والوظيفة الجزيئية (الشكل 8 أ). تم استخدام قاعدة بيانات KEGG لتحليل وظائف هذه الجينات والمسارات التفاضلية (الشكل 8B).

الجينات التي تشفر بروتينات الوصلات الضيقة
أظهرت بيانات النسخ أنه بعد التحفيز طويل المدى ل CSE ، كان هناك انخفاض في التعبير عن العديد من الجينات التي تشفر بروتينات الوصلة الضيقة ، بما في ذلك Cgn و Cldn2 و Cldn3 و Cldn8 و Cldn10 و Cldn20 و Cldn23 و Jam2 و Ocln (الشكل 9A) ، حيث تم تأكيد انخفاض التعبير عن Cldn3 و Ocln بواسطة Western-Blot والكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) (الأشكال 9B-E). تشير هذه البيانات إلى أن التعرض ل CSE يقلل بشكل ملحوظ من التعبير عن بروتينات الوصلة الضيقة للخلايا الظهارية في مجرى الهواء.

تعبير السيتوكين والكيموكين
بالإضافة إلى انهيار الوصلات الضيقة ، أظهرت النسخ أيضا أنه بعد التحفيز طويل المدى ل CSE ، زاد التعبير عن بعض السيتوكينات والكيموكينات ، بما في ذلك Cxcl5 و Csf3 و Il1a و Il34 و Ccl20 و Il33 ، لكن التعبير عن Ccl5 انخفض (الشكل 10A). أكد اختبار Luminex كذلك أن هناك تركيزات متزايدة من CXCL-5 و CSF-3 و IL-1α (الشكل 10B-D) ولكنها انخفضت CCL-5 (الشكل 10E) في طاف الخلايا الظهارية في مجرى الهواء الفئران. تشير هذه النتائج إلى أن التعرض ل CSE يعمل بشكل انتقائي على التعبير عن السيتوكينات والكيموكينات.

figure-results-1
الشكل 1: نمو الخلايا الطلائية في مجرى الهواء الأمي. (أ) تبدو الخلايا المعزولة حديثا مستديرة وشفافة. (ب) بحلول اليوم 2 بعد العزل، تشكلت الخلايا الموسعة في جزر خلوية صغيرة. ج: بحلول اليوم 4، تكون الجزر الخلوية الأكبر. (د) بحلول اليوم 6 ، أكثر من 90٪ اندماج مع مورفولوجيا الحصى. (تكبير 4x ؛ قضبان المقياس: 250 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مقايسة التألق المناعي لعلامات الخلايا الطلائية. تعبير السيتوكيراتين في الخلايا الظهارية في مجرى الهواء الأولي ، A549 (التحكم الإيجابي) ، و Raw264.7 (التحكم السلبي). نوى ملطخة ب DAPI (تكبير 63x ؛ قضبان المقياس: 40 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: مقايسة التألق المناعي لعلامات الخلايا المهدبة والكأسية. وكانت العلامات المستخدمة هي الأسيتيل (A) α-Tubulin و (B) Mucin 5AC لتأكيد خلايا الأهداب والخلايا الكأسية ، على التوالي (100 تكبير ؛ قضبان المقياس: 10 ميكرومتر في اللوحة A و 50 μm في اللوحة B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تأثير تركيزات CSE على الخلايا الطلائية. (أ) صلاحية الخلية عند 24 ساعة بتركيزات مختلفة من CSE. (ب) صلاحية الخلية في 28 يوما. (ج) قياس TEER. د: عدد الخلايا المقشرة. (ه-ح) التألق المناعي للخلايا الهدبية (الخضراء) والخلايا الكأسية (الأرجواني) عند تركيزات 0٪ و 2٪ و 4٪ و 6٪ CSE (تكبير 20x ؛ قضبان المقياس: 50 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تحليلات التخصيب GO وKEGG للتعبير الجيني. (أ) دلالة مصطلح GO في العملية الحيوية المخصبة، والمكون الخلوي، والوظيفة الجزيئية. (ب) نسبة الجينات المعبر عنها تفاضليا في مسارات KEGG. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: تحليل تعبير البروتين. (أ) مخطط شريط التخصيب GO يوضح تعبير البروتين التفاضلي. ب: تحليل مسار KEGG بناء على البروتينات المعبر عنها تفاضليا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: تحليل مسار KEGG المستقلب. (أ) شرح جميع المستقلبات باستخدام قاعدة بيانات KEGG. (ب) شرح جميع المستقلبات باستخدام قاعدة بيانات الأيض البشري. (ج) شرح جميع المستقلبات باستخدام قاعدة بيانات خرائط الدهون. (د) توزيع المستقلبات المعبر عنها تفاضليا في مسارات KEGG المختلفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 8: تحليل التعبير الجيني المرتبط بالذروة التفاضلية. (أ) مخطط شريطي للتخصيب GO يوضح تعبير البروتين التفاضلي. ب: تحليل مسار KEGG بناء على البروتينات المعبر عنها تفاضليا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9
الشكل 9: التعبير عن بروتين الوصلة الضيقة في الخلايا الطلائية في مجرى الهواء الفأر مع أو بدون تحفيز CSE. أ: الخريطة الحرارية للتعبير البروتيني للوصلة الضيقة في النسخة. (ب-ه) تم الكشف عن مستويات التعبير ل (B,C) Cldn3 و (D,E) Ocln في الخلايا الظهارية في مجرى الهواء بواسطة Western Blot والكيمياء الهيستولوجية المناعية ل Cldn3 و Ocln (80 تكبير؛ قضبان المقياس: 50 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-10
الشكل 10: تحليل تعبير السيتوكينات. أ: خريطة حرارية للنسخ لتعبير السيتوكينات. (ب-ه) مقايسة Luminex لمستويات CXCL-5 و CSF-3 و IL-1α و CCL-5 في الخلايا مع / بدون تحفيز CSE. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض الانسداد الرئوي المزمن هو مرض التهابي مزمن شائع. يؤدي التعرض لدخان التبغ إلى التهاب مزمن في مجرى الهواء ، وإعادة تشكيل مجرى الهواء ، وتدمير بنية الرئة ، وهو نتيجة تفاعل الخلايا الهيكلية المختلفة والخلايا المناعية10. باعتبارها الخط الأمامي للجهاز المناعي الفطري في الرئة ، تلعب الخلايا الظهارية الهوائية دورا مهما للغاية أثناء تطور المرض11. من وجهة النظر هذه ، فإن توضيح كيفية تغير الخلايا الظهارية وتنظيم خلايا المصب تحت تحفيز المواد الضارة هو مشكلة علمية تحتاج إلى حل عاجل.

في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن العديد من النماذج الحيوانية لمرض الانسداد الرئوي المزمن التي تغلبت على بعض القيود12. يمكن ملاحظة مستويات معتدلة من التهاب مجرى الهواء العدلات ، والتوقيع الالتهابي Th1 / Th17 ، وفرط إنتاج المخاط الملحوظ ، وزيادة إعادة تشكيل مجرى الهواء ، وانخفاض وظائف الرئة ، وتوسيع المساحات الهوائية في هذه النماذج. على الرغم من أن هذه النماذج تتطلب شهر واحد فقط لإنشاء تغييرات تشبه مرض الانسداد الرئوي المزمن ، إلا أن ما حدث في الفئران المعرضة لدخان السجائر في غضون شهر واحد لا يزال غير واضح. يتميز استخدام تحفيز CSE على المدى الطويل بإمكانية معايرته بسهولة أكبر ، مما يعني أن الخلايا الظهارية في مجرى الهواء يمكن أن تتعرض لأكبر قدر ممكن من التحفيز الشديد للسجائر دون الموت ، تماما مثل الخلايا الظهارية في مجرى الهواء لدى المدخنين. في هذه الحالة ، تعد مراقبة التغيرات المرضية الديناميكية التي تؤدي إلى التهاب مجرى الهواء وتكوين انتفاخ الرئة أمرا بالغ الأهمية لزيادة فهم التسبب في مرض الانسداد الرئوي المزمن المرتبط بالتدخين. لذلك ، أنشأنا نموذجا في المختبر لتقليد حالة الدخان وحاولنا مراقبة التغيرات الديناميكية أثناء تعرض CSE للخلايا الظهارية في مجرى الهواء. علاوة على ذلك ، فإن الخلايا الظهارية في مجرى الهواء المنقى نسبيا تجعل الدراسة متعددة الأوميكس أسهل من دراسة الأنسجة الكاملة ، والتي يمكن أن تساعدنا في العثور على الاستجابات الجزيئية والخلوية في تعرض الخلايا الظهارية في مجرى الهواء ل CSE وتحديد المسارات الرئيسية والأهداف العلاجية لمرض الانسداد الرئوي المزمن في الإنتاجية العالية.

هنا ، تم تكييف البروتوكول الذي يصف عزل الخلايا الظهارية القصبة الهوائية للفئران من بروتوكولات Hilaire et al.13 و You et al.14 مع بعض التعديلات. في البروتوكول المستخدم في هذه الدراسة ، تم نشر الخلايا الظهارية في مجرى الهواء الفأر وتمايزها في بنية طبقية زائفة تحتوي على خلايا مهدبة وكأسية باستخدام واجهة هواء سائلة ووسط يحتوي على CSE ، وبالتالي إنشاء نموذج تأقلم CSE مزمن. الأحداث التالية هي النقاط الرئيسية للنموذج الحالي.

بالنظر إلى أن خلع عنق الرحم يمكن أن يجهد الرقبة ميكانيكيا ويتلف الخلايا الظهارية جسديا ، ويمكن أن يؤثر تخدير هيدرات الكلورال أيضا على الشعب الهوائية ، تم استخدام الصوديوم البنتوباربيتال للقتل الرحيم15. أثناء العمليات الجراحية على الفئران ، يمكن أن يؤدي غمر الرقبة والمناطق السفلية فقط لمنع الكحول من دخول الأنف إلى زيادة صلاحية الخلايا الظهارية في مجرى الهواء16. أظهرت البيانات الأولية من الدراسة الحالية أن الخلايا الظهارية في مجرى الهواء التي تعرضت للتنبيب الرغامي أو غمر الكحول كانت منخفضة الصلاحية وفشلت في التوسع. بالإضافة إلى ذلك ، للحصول على الخلايا الظهارية في مجرى الهواء دون كريات الدم الحمراء ، يجب على المرء أن يكون حذرا في العمليات الجراحية لتجنب تلوث الدم عند عزل الشعب الهوائية الرئيسية.

حتى في الفئران الخالية من مسببات الأمراض ، استعمرت الشعب الهوائية ميكروبات كبيرة. تعد إضافة المضادات الحيوية المناسبة في وسط تمدد الخلايا الظهارية الأولية في مجرى الهواء P0 أمرا ضروريا لتجنب التلوث من مسببات الأمراض البكتيرية أو الفطرية. يضمن محلول كوكتيل من البنسلين والستربتومايسين والأمفوتريسين B والجنتاميسين17 بشكل فعال توسع الخلايا الظهارية في مجرى الهواء P0 في بيئة معقمة في المختبر . أظهرت التجارب الأولية أنه إذا لم يكن هناك تثبيط فعال للتلوث البكتيري ، فإن الخلايا الظهارية في مجرى الهواء P0 ستموت قبل الممر الأول.

في طرق الهضم ، تم اختبار كل من 4 درجات مئوية و 37 درجة مئوية. أشارت نتائج التجارب الأولية إلى أن الهضم في 37 درجة مئوية تفوق على 4 درجات مئوية من حيث كفاءة الوقت وصلاحية الخلية وإنتاجية الخلية.

قبل بذر الخلايا الظهارية ، تم إذابة كولاجين ذيل الفئران في حمض الخليك واستخدامه لطلاء طبق الاستزراع لتحسين التصاق الخلايا الظهارية18. ومع ذلك ، لا ينبغي أن تكون كثافة طلاء الكولاجين عالية جدا أو منخفضة جدا ؛ تفشل الكثافة غير الكافية في توفير ظروف الالتصاق كافية ، بينما تؤدي الكثافة المفرطة إلى بقايا بلورية على سطح الاستزراع.

الخطوة الحاسمة هي الحفاظ على المزيد من الخلايا الظهارية على قيد الحياة وتجنب تلوث الخلايا الليفية. لتحقيق ذلك ، نوصي بأن 1) استخدام مجموعة تفكك الخلايا الخالية من المكونات الحيوانية يمكن أن يعزل الخلايا الظهارية بلطف ويقلل من الضرر الخلوي غير الضروري و 2) استخدام الوسط التفاضلي الذي يحتوي على الهيدروكورتيزون يمكن أن يمنع نمو الخلايا الليفية ويعزز تكاثر الخلايا الظهارية.

كانت الثقافات التقليدية أحادية الطبقة المغمورة للخلايا الظهارية في مجرى الهواء عنصرا أساسيا في أبحاث الجهاز التنفسي والدراسات السمية. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لا ترقى إلى تكرار الخصائص المتمايزة للأنسجة الظهارية في مجرى الهواء بدقة كما هو موجود في الجسم الحي. لمعالجة هذا القيد ، اخترنا نموذجا بديلا لظهارة مجرى الهواء. يعتمد هذا النموذج على زراعة خلايا مجرى الهواء الأولية على سقالات غشائية صغيرة يسهل اختراقها ، مثل تلك التي توفرها أنظمة transwell ، في واجهة الهواء والسائل19. إن تعرض السطح القمي للهواء المحيط في إعداد ثقافة ALI هذا مفيد في تعزيز التمايز الخلوي ، وبالتالي محاكاة الظروف في الجسم الحي20 عن كثب.

إذا لم يكن التمايز فعالا ، فمن الأهمية بمكان تقييم الأسباب المحتملة. وهذا يشمل احتمال أن تكون الخلايا الظهارية في مجرى الهواء قد خضعت لتمرير مفرط ، مما قد يضر بقدرتها على التمايز. بالإضافة إلى ذلك ، من الضروري التأكد من التخلص تماما من المخاط وتراكم السوائل داخل الغرفة القمية أثناء عملية تبادل الوسائط كل أسبوعين ، لأن المحتوى المتبقي قد يعيق عملية التمايز.

في حين أن هذا النموذج يقدم بعض القيود ، إلا أنه يظل أداة قيمة للبحث. أحد القيود هو أن استخدام وسيط يحتوي على CSE لتحفيز الخلايا الظهارية في مجرى الهواء قد لا يكرر بشكل كامل الظروف في الجسم الحي التي تعاني منها الخلايا الظهارية في مجرى الهواء لدى المدخنين. بالإضافة إلى ذلك ، فإن صلاحية الخلايا الظهارية الهدبية المتمايزة في المختبر تقتصر عادة على شهر. على الرغم من هذه القيود ، يدمج النموذج بشكل فعال العديد من الجوانب الرئيسية: فهو يسهل دراسة تمايز الخلايا الظهارية في مجرى الهواء عند واجهة الهواء والسائل ، والتأقلم طويل الأجل مع CSE ، وتطبيق تحليل متعدد الأوميكس خلال إطار زمني معين. يوفر هذا النهج الشامل إطارا متطورا وشاملا للتحقيقات المستقبلية في الآليات الفسيولوجية والمرضية للخلايا الظهارية في مجرى الهواء. علاوة على ذلك ، فإنه يساعد في تحديد المؤشرات الحيوية المحتملة والأهداف العلاجية لأمراض مجرى الهواء. نأمل أن توفر تجربتنا معلومات مفيدة لأولئك الذين يرغبون في استخدام هذا النموذج للدراسات ذات الصلة.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82090013).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
محلول 100x البنسلين / الستربتومايسينGibco15140122
24 مم Transwell مع 0.4 & micro ؛ إدراج غشاء بوليستر مسام ، معقمBIOFILTCS016012
40 & micro ؛ مصفاة خلية mFalcon352340
500x Gentamicin / Amphotericin SolutionGibcoR01510
أسيتيلد &alpha ؛ -TubulinCST# 5335
Acetyl-&alpha Tubulin (Lys40) (D20G3) XP Rabbit mAb  ؛cellsignal# 5335
مجموعة تفكك الخلايا الخالية من المكونات الحيوانيةStemcell05426
الأجسام المضادة للسيتوكيراتينabcamab7753
السجائرMarlboro
Claudin3immunowayYT0949
Deoxyribonuclase I من البنكرياس البقريSigma-AldrichDN25
Deoxyribonuclase I من البنكرياس البقريSigmaDN25
Ham ' s F-12Sigma-AldrichN6658
Heparin Solution خلية جذعية07980
محلول مخزون الهيدروكورتيزونخلية جذعية07925
ميوسين 5ACabcamab212636
أوكلودينبروتينتك27260-1-AP
PBSCytosciCBS004S-BR500
محلول البنسلين والستربتومايسينجيبكو15140122
PneumaCult-ALI
الخلية الجذعية05002   ؛
PneumaCult-ALI 10x مكملخلية جذعية05003   ؛
مكمل صيانة PneumaCult-ALIStemcell05006
PneumaCult-Ex Plus 50x مكملغذائي خلية جذعية05042
خلية جذعيةمتوسطة أساسية PneumaCult-Ex Plus05041
Pronase ESigma-AldrichP5147
ذيل الجرذ الكولاجينCorning354236
تريبان بلوالخلية الجذعية07050   ؛
المتوسطة القاعدية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ritchie, A. I., Martinez, F. J. The challenges of defining early chronic obstructive pulmonary disease in the general population. Am J Respir Crit Care Med. 203 (10), 1209-1210 (2021).
  2. Caramori, G., Kirkham, P., Barczyk, A., Di Stefano, A., Adcock, I. Molecular pathogenesis of cigarette smoking-induced stable COPD. Ann N Y Acad Sci. 1340, 55-64 (2015).
  3. Leino, M. S., et al. Barrier disrupting effects of alternaria alternata extract on bronchial epithelium from asthmatic donors. PLoS One. 8 (8), e71278(2013).
  4. Benediktsdóttir, B. E., Arason, A. J., Halldórsson, S., Gudjónsson, T., Másson, M., Baldursson, Ó Drug delivery characteristics of the progenitor bronchial epithelial cell line VA10. Pharm Res. 30 (3), 781-791 (2013).
  5. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respir Res. 14 (1), 135(2013).
  6. Prytherch, Z., Job, C., Marshall, H., Oreffo, V., Foster, M., BéruBé, K. Tissue-specific stem cell differentiation in an in vitro airway model. Macromol Biosc. 11 (11), 1467-1477 (2011).
  7. Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: Reporting in vivo experiments: The ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
  8. Brekman, A., Walters, M. S., Tilley, A. E., Crystal, R. G. FOXJ1 prevents cilia growth inhibition by cigarette smoke in human airway epithelium in vitro. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (5), 688-700 (2014).
  9. Bajic, M., Maher, K. A., Deal, R. B. Identification of open chromatin regions in plant genomes using ATAC-seq. Methods Mol Biol. 1675, 183-201 (2018).
  10. Shaykhiev, R., Crystal, R. G. Early events in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Smoking-induced reprogramming of airway epithelial basal progenitor cells. Ann Am Thorac Soc. 11, Suppl 5 (Suppl 5) S252-S258 (2014).
  11. Raby, K. L., Michaeloudes, C., Tonkin, J., Chung, K. F., Bhavsar, P. K. Mechanisms of airway epithelial injury and abnormal repair in asthma and COPD. Front Immunol. 14, 1201658(2023).
  12. Zhou, J. -S., et al. Cigarette smoke-initiated autoimmunity facilitates sensitisation to elastin-induced COPD-like pathologies in mice. Eur Respir J. 56 (3), 2000404(2020).
  13. Lam, H. C., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air-liquid interface. J Vis Exp. (48), e2513(2011).
  14. You, Y., Brody, S. L. Culture and differentiation of mouse tracheal epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 123-143 (2012).
  15. Wandalsen, G. F., Lanza, F. deC., Nogueira, M. C. P., Solé, D. Efficacy and safety of chloral hydrate sedation in infants for pulmonary function tests. Rev Paul Pediatr. 34 (4), 408-411 (2016).
  16. Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells. Methods Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).
  17. Takagi, R., et al. How to prevent contamination with Candida albicans during the fabrication of transplantable oral mucosal epithelial cell sheets. Regen Ther. 1, 1-4 (2015).
  18. Culp, D. J., Latchney, L. R. Mucinlike glycoproteins from cat tracheal gland cells in primary culture. Am J Physiol. 265 (3), Pt 1 L260-L269 (1993).
  19. Cao, X., et al. Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 57 (2), 104-132 (2021).
  20. Bebök, Z., Tousson, A., Schwiebert, L. M., Venglarik, C. J. Improved oxygenation promotes CFTR maturation and trafficking in MDCK monolayers. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C135-C145 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Airway Epithelial CellsCigarette Smoke ExtractIn Vitro ModelMurine Airway CellsAir Liquid InterfaceCell DifferentiationMulti Omics AnalysisChronic Smoke ExposureImmunofluorescence AssayCOPD Pathogenesis

Related Articles