مقالة منهجية

إعداد نموذج معدل لإعادة تروية انسداد الشريان الدماغي الأوسط

2.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67060

⸱

مايو 31, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Foshan University, 2School of Medicine, Shaanxi University of International Trade and Commerce

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول عملية التحضير لإعادة تروية انسداد الشريان الدماغي الأوسط عبر الشريان السباتي المشترك.

الملخص

يعد نموذج إعادة ضخ انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO / R) أمرا بالغ الأهمية لفهم الآليات المرضية للسكتة الدماغية ولتطوير الأدوية. ومع ذلك ، من بين طرق النمذجة الشائعة الاستخدام ، غالبا ما تواجه طريقة كويزومي تدقيقا بسبب ربطها بالشريان السباتي المشترك (CCA) وعدم قدرتها على تحقيق التروية الكافية. وبالمثل ، تم انتقاد طريقة لونجا لفصل وربط الشريان السباتي الخارجي (ECA). تهدف هذه الدراسة إلى تقديم طريقة إعداد نموذج معدل تحافظ على سلامة ECA ، وتتضمن إدخال خياطة نايلون أحادية الشعيرات من خلال CCA ، وإصلاح شق CCA المربوط ، والحفاظ على إعادة التروية من CCA. تم تأكيد إعادة ضخ تدفق الدم باستخدام تصوير تدفق البقع بالليزر. أظهرت طرق التقييم مثل مقياس لونجا ، ودرجة الخطورة العصبية المعدلة ، وتلطيخ كلوريد ثلاثي فينيل تترازوليوم (TTC) ، ووضع العلامات المناعية للخلايا العصبية أن هذا النهج يمكن أن يؤدي إلى تلف الأعصاب الإقفارية المستقرة. هذا البروتوكول النموذجي المعدل MCAO / R بسيط ومستقر ، ويوفر إرشادات قيمة للممارسين في مجال نقص التروية الدماغية.

المقدمة

وفقا لمنظمة الصحة العالمية ، ظلت السكتة الدماغية السبب الرئيسي الثاني للوفاة في جميع أنحاء العالم على مدى العقد الماضي ، مع ارتفاع معدل الإصابة ، وارتفاع معدل الوفيات ، وارتفاع معدل الإعاقة 1,2. مع تقدم سكان العالم في السن ، من المتوقع أن يزداد معدل الإصابة بالسكتة الدماغية في البلدان النامية ، مما قد يصبح السبب الرئيسي للوفاة المبكرة والعجز لدى البالغين. بالإضافة إلى ذلك ، هناك اتجاه لحدوث السكتات الدماغية في سن أصغر3. كما أن فقدان القوى العاملة بعد السكتة الدماغية يضع عبئا ثقيلا على الأسر والمجتمع4. لذلك ، فإن تطوير علاجات آمنة وفعالة يشكل تحديا كبيرا في أبحاث السكتة الدماغية.

تعمل النماذج الحيوانية كأدوات حاسمة لدراسة الوقاية من الأمراض البشرية وعلاجها. تعتمد الترجمة الناجحة لاستراتيجيات علاج السكتة الدماغية على استنساخ وموثوقية النماذج الحيوانية للسكتة الدماغية 5,6. الشريان الدماغي الأوسط (MCA) هو موقع شائع للسكتة الدماغية السريرية ، مما يجعل نموذج MCAO أقرب نموذج للسكتة الدماغية البشرية. تم تفضيل نموذج MCAO ، الذي تم إعداده باستخدام طريقة الخياطة ، من قبل الباحثين بسبب مزايا مثل عدم حج القحف وسهولة التحكم في الوقت الإقفاري. تم استخدامه في أكثر من 40٪ من تجارب الحماية العصبية7. ومع ذلك ، على الرغم من مزاياه العديدة ، تظل التفاصيل التشغيلية لهذا النموذج موضوعا مثيرا للجدل للعديد من الباحثين.

بالنسبة لنموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط الناجم عن خياطة (MCAO) ، يحدث إعادة التروية عن طريق سحب الخيط. حاليا ، يتم استخدام طريقتين رئيسيتين لإدخال خياطة: طريقة كويزومي8 وطريقة لونغا9. في طريقة كويزومي ، يدخل الخيط إلى الشريان السباتي الداخلي (ICA) بشكل رئيسي من خلال شق الشريان السباتي المشترك (CCA) ، بينما في طريقة لونغا ، يمر عبر الشريان السباتي الخارجي المقطوع (ECA) إلى ICA. أثناء إعادة التروية ، تتطلب طريقة Koizumi ربط شق CCA بشكل دائم وتعتمد على دائرة Willis لإعادة التروية10. ومع ذلك ، تشير بعض الدراسات إلى أنه لا يمكن تحقيق إعادة التروية الفعالة فقط من خلال الإمداد التعويضي لدائرة ويليس بعد فقدان إمدادات CCA. علاوة على ذلك ، تظهر دائرة ويليس تباينا تشريحيا عاليا ، خاصة في الفئران C57Bl / 6 ، مما يزيد من تباين الاحتشاء ويقلل من موثوقية البيانات التجريبية. وبالتالي ، تم التشكيك في هذه الطريقة بشكل متزايد من قبل الباحثين11.

تتضمن طريقة لونجا إدخال خياطة من خلال ECA المقطوع ثم ربط الشريان السباتي الداخلي (ICA) بشكل دائم بمجرد سحب الخيط. هذا يحافظ على سالكية CCA ، مما يسمح بنضح الدم بنسبة تصل إلى 100٪ من القيم الأساسية. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة فصل الشريان السباتي الخارجي والفروع الشريانية الصغيرة ، أو قطعها ، أو تخثيرها كهربائيا ، مما يجعل الإجراء صعبا. كما أنه يعطل بنية تدفق الدم الكاملة للدماغ ، والتي تختلف عن حالة المريض السريرية12. الأهم من ذلك ، تشير الدراسات إلى أن قطع أو ربط ECA يمكن أن يسبب آفات نقص تروية في العضلات التي تتحكم في المضغ والبلع ، مما يؤثر على النظام الغذائي للحيوان ويؤدي إلى موت بعد العملية الجراحية والأضرار الحسية والحركية الشديدة في الفئران13،14.

ومن ثم، هناك حاجة ماسة إلى طريقة معدلة لإعداد النموذج لمعالجة هذه المسائل. تقدم هذه الدراسة طريقة نمذجة MCAO معدلة تعمل على إصلاح شق إدخال CCA وتحقق إعادة تروية فعالة. الإجراء بسيط وعملي وممكن ، مما يؤدي إلى تلف عصبي كبير وآفات احتشاء قابلة للتكرار ويوفر إرشادات قيمة للباحثين في السكتة الدماغية.

البروتوكول

تم إجراء البروتوكول التجريبي وفقا لإرشادات استخدام المختبر واللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها في جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (رقم السجل: 2019-DL-002). تم توثيق جميع بيانات البحوث الحيوانية باتباع إرشادات REACH (البحوث الحيوانية: الإبلاغ في تجارب الجسم الحي ). تم استخدام ذكور الفئران Sprague Dawley (SD) التي تزن 250 جم ± 20 جم وتتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع لهذه الدراسة. يتم سرد التفاصيل المتعلقة بالحيوانات والكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. إعداد

  1. تحفيز والحفاظ على التخدير العميق في الفئران باستخدام زوليتيل 50 (50 ملغ / كغ ، IM) وزيلازين هيدروكلوريد (40 ملغ / كغ ، IP). تأكد من الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 ± 0.5 درجة مئوية باستخدام مسبار مستقيمي متصل بوسادة تدفئة طوال العملية الجراحية. ضع مرهما بيطريا على عيون الفئران لمنعها من الجفاف.
  2. حلق الشعر من رأس وعنق الفئران. استخدم كريم مزيل الشعر لإزالة الفراء من الرأس والرقبة ، ثم اغسل الكريم بمحلول ملحي طبيعي. تطهير الجلد في موقع الجراحة عن طريق تطبيق الإيثانول والبوفيدون اليود ثلاث مرات باستخدام كرات القطن المعقمة.
  3. قم بعمل شق 2 سم في منتصف رأس الجرذ على طول اتجاه الخيط السهمي باستخدام مشرط ، وقم بإزالة العضلات التي تغطي الجمجمة بعناية.
  4. رقيقة الجمجمة على الجانب الإقفاري من الفئران باستخدام حفر الجمجمة. استخدم محلول ملحي عادي لتبريد وإزالة الحطام أثناء عملية الطحن. سجل تدفق الدم الأساسي للفئران باستخدام تصوير تباين البقع بالليزر (LSCI).
  5. ضع الإيثانول واليود البوفيدون ثلاث مرات على جلد الرقبة باستخدام كرات قطنية معقمة. قم بعمل شق 2 سم على طول خط الوسط من الرقبة باستخدام شفرة جراحية. استخدم المبعدات لسحب الجلد والغدد اللعابية بشكل جانبي ، وتعريض عضلات القص الترقوي الخشائي وعنق الرحم.
  6. افصل بين العضلات القصية الترقوية الخشائية وعنق الرحم لفضح المنطقة السباتية. تحديد تشريح الأوعية الدموية للشريان السباتي المشترك (CCA) والشريان السباتي الداخلي (ICA) والشريان السباتي الخارجي (ECA). بناء على تشريح الأوعية الدموية ، افصل CCA ، بالإضافة إلى ECA و ICA15 المشتقين من CCA.
    ملاحظة: يشير التركيب التشريحي للفأر إلى أن منطقة CCA مغطاة بشكل أساسي بالعضلات القصية الترقوية الخشائية وعنق الرحم ، مع ICA و ECA المستمدة من CCA. بعد الانفصال يكشف CCA ، يمكن رؤية شوكة على شكل Y على طول CCA ، تمثل ICA و ECA. كن حذرا حتى لا تتلف العصب المبهم ، الذي يعمل بالتوازي مع CCA.

2. انسداد مولودية الجزائر

  1. اربط عقدة سهلة الفك على الشريان السباتي الخارجي (ECA) والشريان السباتي المشترك (CCA) باستخدام خيط حرير 3-0 لمنع تدفق الدم مؤقتا. ضع مشبك وعاء على CCA على بعد حوالي 0.5 سم من العقدة الأولى.
    1. صبغ إبرة حقنة 5 مل باللون الأسود. قم بإنشاء ثقب صغير في CCA باستخدام الإبرة المصبوغة باللون الأسود وقم بتمييز الثقوب باللون الأسود.
  2. أدخل خيوط النايلون أحادية الشعيرات في CCA من خلال العلامة السوداء. افتح مشبك الأوعية الدموية ووجه سلك النايلون إلى الشريان السباتي الداخلي (ICA) حتى يتوقف بمقاومة طفيفة. شد العقدة الثانية بإحكام للحفاظ على خياطة النايلون أحادية الشعيرات في مكانها داخل الشريان ، مما يمنع الإزاحة من وضع الانسداد.
  3. لاحظ وقت نقص التروية في هذه المرحلة وقم بقياس قيمة تدفق الدم على الجانب الإقفاري باستخدام LSCI. تطبيق قطرات من بوبيفاكايين على جرح الرقبة للتسكين وإغلاق الجرح. قم بإزالة قناع التخدير والسماح للفأر بالتعافي.
    ملاحظة: إذا واجه خيط النايلون أحادي الشعيرات صعوبة في دخول ICA ، فسحبه قليلا وحاول إدخاله مرة أخرى.

3. إعادة ضخ MCAO

  1. بعد 90 دقيقة من نقص التروية ، أعد تخدير الفئران بالإيزوفلوران. قم بقياس تدفق الدم الدماغي من الجانب الإقفاري باستخدام LSCI وتأكد من عدم تحول خيوط النايلون أحادية الشعيرات.
  2. قم بفك العقد الموجودة على الشريان السباتي الخارجي (ECA) للسماح بإعادة تروية الدم. حرر العقدة على الشريان السباتي المشترك (CCA) ، وقم بتأمين خياطة الشعيرات الأحادية ، واسحب الخيط. ضع مشبكا وعائيا قبل خياطة الشعيرات الأحادية الثابتة لمنع النزيف.
  3. استبدل عقدة CCA الأولى بمشبك وعائي. استخدم الملقط لتدوير شق الوعاء بشكل جانبي (الشكل 1). ثبت الشق بملاقط واربطه باستخدام خيط 6-0 لإصلاح الشق. قم بإزالة مشبك الأوعية الدموية ، وتحقق من وجود تسربات ، وتأكد من إعادة التروية الكاملة (فيديو 1).
    ملاحظة: قم بإجراء الربط لإصلاح الشق لتجنب التثبيت المفرط للأوعية الدموية ، مما قد يؤدي إلى تضيق CCA.
  4. سجل قيم تدفق الدم القشري الدماغي باستخدام LSCI بعد ربط الشق لتأكيد نجاح عملية التروية. أغلق شق الرقبة بالغرز وقم بتطبيق 1،00،000 وحدة من البنسلين و 2 مل من المياه المالحة لمنع العدوى والجفاف.
  5. الحفاظ على الدفء حتى تستعيد الفئران وعيها. قدم طعاما طريا بعد الجراحة وراقب العلامات الحيوية للحيوانات.

4. تقييم وظيفة العصب وإصابة نقص تروية الدماغ

  1. بمجرد أن تستيقظ الفئران تماما ، سيتم تقييم وظيفتها العصبية من قبل باحثين غير مدركين للمجموعة الحيوانية. استخدم مقياس درجة لونغا (الجدول 1) ومقياس درجة الشدة العصبية المعدلة (mNSS) (الجدول 2) لتقييم الوظيفة العصبية لجميع الفئران.
  2. بعد 24 ساعة بعد الجراحة ، القتل الرحيم للفئران تحت التخدير الناجم عن الأيزوفلوران (4٪ إيزوفلوران عند 4 لتر / دقيقة أكسجين) عن طريق خلع عنق الرحم16 (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). شطف الدماغ بالماء المثلج لإزالة أي دم متبقي.
  3. قسم أنسجة المخ إلى 5 أقسام وصمة عار عليها مع TTC. التقط صورا لكلا جانبي شرائح أنسجة المخ ، وقم بقياس المنطقة الإقفارية للجانبين الأمامي والخلفي باستخدام برنامج Image J ، واحسب معدل الاحتشاء باستخدام الصيغة التالية:
    figure-protocol-1
    ملاحظة: يمثل S1 و S2 منطقة احتشاء الدماغ الأمامي القريب وجوانب جذع الدماغ القريبة من شرائح الدماغ ، على التوالي. يتم تصحيح منطقة الاحتشاء لكل شريحة دماغية باستخدام صيغة سوانسون ، حيث يمثل h سمك شريحة الدماغ. تسمح هذه الصيغة ، التي حددها المؤلف سابقا في البحثالسابق 17 ، بحساب أكثر دقة لحجم آفة الاحتشاء.
  4. تحليل البيانات باستخدام البرامج الإحصائية والرسوم البيانية لتقييم معدل نجاح النموذج واستقراره.
  5. استخدم طريقة التألق المناعي لتسمية الخلايا العصبية القشرية في الفئران ، مما يزيد من التحقق من صحة الضرر العصبي الناجم عن هذه الطريقة. بعد 24 ساعة من نقص التروية في الفئران ، تم إجراء نضح القلب باستخدام PBS المبرد مسبقا للحصول على أنسجة المخ.
  6. تضمين وتجميد أنسجة المخ في أقسام. استخدم الأجسام المضادة العصبية مثل العلامة العصبية غير الناضجة Doublecortin (DCX) 18 ، وعلامة النواة العصبية Neuronal Nuclei (NeuN) 18 ، والعلامة المتغصنة للخلايا العصبية البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة -2 (MAP-2) 19. مراقبة التعبير عن الخلايا العصبية الإقفارية باستخدام المجهر البؤري بالليزر.

النتائج

أظهر تصوير تدفق البقع بالليزر أنه قبل انسداد خياطة النايلون أحادية الشعيرات ، كان هناك تدفق دم وفير في منطقة الشريان الدماغي الأوسط (MCA) ، وتم تسجيل قيم تدفق الدم الأساسية للفئران. بعد انسداد MCA ، انخفضت قيمة تدفق الدم على الجانب الإقفاري من الدماغ بسرعة. قبل سحب الخيط ، تم إعادة فحص قيم تدفق الدم على الجانب الإقفاري للتأكد مما إذا كان الخيط يسد MCA. أشارت النتائج فقط إلى تغيير طفيف في تدفق الدم. عند سحب الخيط ، تعافى نضح تدفق الدم بسرعة (الشكل 2). يظهر الفيديو 1 أيضا نبض الملء القوي للشريان السباتي المشترك ، مما يشير إلى أن هذه الطريقة يمكن أن تحقق نضح تدفق الدم الكافي بعد نقص التروية الدماغية.

كشفت نتائج نتائج نتائج نتائج الوظائف العصبية (الشكل 3) أنه بالمقارنة مع مجموعة الجراحة الوهمية ، كانت درجة لونجا للمجموعة النموذجية 1.80 ± 0.27 (p < 0.05) ، وكانت درجة mNSS 7.4 ± 0.89 (p < 0.05). تشير هذه الدرجات إلى أن نموذج انسداد / إعادة تروية الشريان الدماغي الأوسط (MCAO / R) الذي تم إعداده باستخدام هذه الطريقة أدى إلى تلف عصبي كبير. يوضح الفيديو 2 السلوك المميز لفئران المجموعة النموذجية التي تدور أثناء الزحف ، وهي سمة مميزة للإصابة الناجمة عن السكتة الدماغية ، مما يؤكد صحة هذه الطريقة.

أظهر تلطيخ TTC أن معدل الاحتشاء في فئران المجموعة النموذجية كان 5.58 ± 1.79 (p < 0.05) ، مع تأثير منطقة الاحتشاء بشكل أساسي على المخطط والقشرة ، وظل حجم الاحتشاء مستقرا نسبيا. يوضح تلطيخ التألق المناعي فقدان الخلايا العصبية القشرية بعد نقص التروية (الشكل 4). تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن هذه الطريقة يمكن أن تنشئ نموذجا مستقرا ل MCAO / R مناسبا لتقييم فعالية الدواء قبل السريري.

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي لربط موصل CCA. تشير الدائرة الصفراء إلى نقطة الإدخال وموقع ربط القابس السلكي ، بينما يشير موضع الربط (السهم الأصفر) إلى مكان ربط الشريان السباتي المشترك (CCA) بالسلك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: صور تدفق الدم للبقع بالليزر في أوقات الفئران على الجانب الإقفاري قبل وبعد الانسداد وقبله وبعده. (أ) صور تدفق الدم الدماغي للفئران، حيث تشير المناطق الزرقاء إلى انخفاض قيم تدفق الدم، وتشير المناطق الحمراء إلى ارتفاع قيم تدفق الدم. قضبان المقياس: 200 مم. (ب) التغيرات في نقص التروية الدماغية في الجرذان ، معروضة كمتوسط ± الانحراف المعياري ، مع حجم عينة n = 5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: نتائج منطقة الاحتشاء ودرجات الوظائف العصبية في المجموعة الوهمية والمجموعة النموذجية. (أ) يصور تلطيخ TTC المناطق المحتشدة من أنسجة المخ في كل من المجموعة الوهمية والمجموعة النموذجية، حيث تشير المناطق البيضاء إلى احتشاء الأنسجة والمناطق الحمراء التي تشير إلى الأنسجة الطبيعية. (ب) يتم عرض النتائج الكمية لدرجات Longa و mNSS ، بالإضافة إلى معدل الاحتشاء. يشار إلى الدلالة الإحصائية مقارنة بالمجموعة الوهمية ب * p < 0.05 ، مع حجم عينة n = 5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: نتائج إصابة الخلايا العصبية القشرية في المجموعة الوهمية والمجموعة النموذجية. التعبير عن NeuN (A) و DCX (B) و MAP-2 (C) في الخلايا العصبية القشرية. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: رسم تخطيطي لانسداد MCA وإعادة التروية بواسطة Koizumi و Longa والطريقة المعدلة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

اختبارات المحرك / قوي>النقاط
رفع الفئران من الذيل3
1 انثناء الطرف الأمامي
1 انثناء الطرف الخلفي
1 تحرك الرأس > 10 درجات إلى المحور الرأسي خلال 30 ثانية
وضع الفئران على الأرض3
0 المشي العادي
1 عدم القدرة على المشي بشكل مستقيم
2 الدوران نحو الجانب المحوري
3 السقوط إلى الجانب paretic
الاختبارات الحسية2
1 اختبار تحديد المستوى (اختبار بصري ولمسي)
2 اختبار التحسس العميق (إحساس عميق ، دفع المخلب ضد حافة الطاولة إلى
تحفيز عضلات الأطراف)
اختبارات توازن الشعاع6
0 يوازن مع وضعية ثابتة
1 يمسك جانب العارضة
2 يعانق الشعاع ويسقط طرف واحد من العارضة
3 يعانق الشعاع ويسقط طرفان من العارضة ، أو يدور على العارضة (>60 ثانية)
4 محاولات للتوازن على العارضة لكنها تسقط (>40 ثانية)
5 محاولات لتحقيق التوازن على العارضة ولكنها تسقط (>20 ثانية)
6 يسقط: لا توجد محاولة لتحقيق التوازن أو التمسك بالشعاع (<20 ثانية)
ردود الفعل حركات غائبة وغير طبيعية4
1 منعكس صيوان (هز الرأس عند لمس الصماخ السمعي)
1 منعكس القرنية (وميض العين عند لمس القرنية برفق بالقطن)
1 رد الفعل المفاجئ (استجابة المحرك لضوضاء قصيرة من التقاط ورق الحافظة
1 النوبات ، الرمع العضلي ، خلل التوتر العضلي
الحد الأقصى للنقاط18

الجدول 1: درجة الشدة العصبية المعدلة.

درجات زيا لونغا
نقاطعَرَض
0 نقطةلا عجز عصبي
1 نقطةخفيف: غير قادر على تمديد مقدمة القدم اليمنى تماما عند رفع الذيل
2 نقطةمعتدل: دوائر إلى اليمين / اليسار عند المشي
3 نقاطشديد: يتراجع إلى اليمين / اليسار عند المشي
4 نقاطغير قادر على المشي بشكل عفوي مع فقدان الوعي

الجدول 2: درجات زيا لونغا.

فيديو 1: الخطوات الرئيسية لإصلاح أربطة شق CCA أثناء إعادة التروية في الفئران. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو 2: مقاطع فيديو سلوكية للفئران التي تخضع ل MCAO / R. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

المناقشة

نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) الناجم عن خياطة نايلون أحادية الشعيرات هو الطريقة الأكثر شيوعا المستخدمة لإعداد نماذج MCAO. تم اعتماد هذا النهج على نطاق واسع في الدراسات قبل السريرية واكتسب اعترافا من العديد من الممارسين بسبب بساطته ، وعدم الحاجة إلى حج القحف ، والحد الأدنى من الصدمات الجراحية ، والقدرة على تحقيق التروية.

هناك نوعان من التقنيات الجراحية الكلاسيكية للخيوط داخل اللمعة MCAO: طريقة كويزومي8 وطريقة لونغا9. يكمن الاختلاف الرئيسي بين هذه الطرق في كيفية إدخال الخيط لسد MCA. في طريقة كويزومي ، يتم إدخال الخيط من خلال شق الشريان السباتي المشترك (CCA) في الشريان السباتي الداخلي (ICA). يتم طلاء الواجهة الأمامية للخياطة بالسيليكون لمنع نقطة البداية ل MCA. على العكس من ذلك ، في طريقة Longa ، يتم إدخال الخيط في ICA من خلال الشريان السباتي الخارجي المقطوع (ECA). يتم توسيع الواجهة الأمامية للخياطة إلى شكل كروي لمنع نقطة بداية MCA (الشكل 5). أثناء إعادة التروية ، يتم سحب الخيط برفق لاستعادة تدفق الدم.

تتضمن طريقة لونجا إدخال الخيط في الشريان السباتي الداخلي (ICA) من خلال الشريان السباتي الخارجي المقطوع (ECA). تتطلب هذه العملية فصل وفصل ECA ، وكذلك فصل وإزالة الفروع الصغيرة ، والتي يتم قطعها بعد ذلك باستخدام قلم التخثير الكهربائي لمنع النزيف. وبالتالي ، تتطلب هذه الطريقة عملية دقيقة ودقيقة. علاوة على ذلك ، فإن الطرف المتبقي القصير من ECA المقطوع يمكن أن يجعل من السهل على الخيط أن ينزلق أثناء الإدخال ، مما يزيد من تعقيد الإجراء. هذا التحدي واضح بشكل خاص عند إعداد نموذج فأر لنقص التروية الدماغية ، لأنه غالبا ما يتطلب استخدام المجهر لضمان الدقة ، مما يزيد من التعقيد العام للعملية.

يكمن الشاغل الأساسي لطريقة كويزومي في ربط الشريان السباتي المشترك (CCA) ، مما يؤدي إلى إعادة ضخ تعويضية لأنسجة المخ على الجانب الإقفاري فقط من خلال دائرة ويليس. CCA هو فرع مهم من قوس الأبهر من القلب ويعمل كشريان رئيسي يمد تدفق الدم الدماغي. لذلك ، فإن نموذج نقص التروية الدماغية الذي تم إنشاؤه بواسطة طريقة Koizumi غالبا ما يعاني من حالة نقص التروية. لا يقتصر نقص التروية هذا على منطقة الشريان الدماغي الأوسط ولكنه يمتد إلى نصف الكرة الإقفاري بأكمله على نفس الجانب. حتى بعد 35 يوما من النمذجة ، لا تعود قيمة تدفق الدم إلى خط الأساس ، مما يشير إلى أنه ينبغي اعتبار طريقة كويزومي نموذجا إقفاريا مع نقص التروية المزمن بدلا من نموذج نقص التروية10.

في المقابل ، يمكن أن تحقق طريقة لونجا قيمة تدفق دم تبلغ 100٪ في MCAO / R. ومع ذلك ، من الأهمية بمكان ملاحظة أن تحقيق إعادة الاستقناء الكامل لا يعني بالضرورة أنه يجب التخلي عن طريقة كويزومي. عند التفكير في الترجمة السريرية ، قد تكون طريقة Koizumi أكثر ملاءمة للمرضى الذين يعانون من إعادة الاستقناء البطيئة التلقائية بعد انسداد الشريان. ومع ذلك ، فإن هذه الظاهرة نادرة نسبيا في الممارسة السريرية. نسبة صغيرة فقط من مرضى السكتة الدماغية يستوفون معايير انحلال الخثرة ويتلقون علاجا فعالا خلال فترة العلاج20,21. علاوة على ذلك ، لا يحقق بعض المرضى إعادة توعية كاملة حتى بعد العلاج بالتخثر22. وبالتالي ، يمكن استخدام طريقة Koizumi لمحاكاة ظروف هؤلاء المرضى.

من ناحية أخرى ، تسمح طريقة Longa للأوعية بإعادة الاستقناء بسرعة بعد الانسداد ، مما يجعلها أكثر ملاءمة لمحاكاة المرضى الذين يتلقون علاجا فعالا للتخثر أو استئصال الخثرة في الممارسة السريرية. لمحاكاة المرضى الذين لم يخضعوا للعلاج بالتخثر ، قد يوفر نموذج نقص التروية الدماغية الدائم الذي أعدته طريقة كويزومي انسدادا أكثر اكتمالا وإجراء جراحيا أبسط.

يمكن أن تؤدي طريقة لونجا لإحداث انسداد / إعادة ضخ الشريان الدماغي الأوسط (MCAO / R) إلى إصابة أكثر أهمية في إعادة التروية عن طريق الحفاظ على إعادة استقناء الأوعية الدموية المشتقة من الشريان السباتي المشترك (CCA)23،24. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن الشريان السباتي الخارجي (ECA) يحتاج إلى قطع وربط دائم أثناء طريقة لونجا ، مما يعطل بنية تدفق الدم الكاملة للدماغ ولا يتوافق مع المرضى السريريين. علاوة على ذلك ، فإن الشرايين اللسانية والفكية والقذالية هي فروع ECA13. وبالتالي ، فإن قطع أو ربط ECA بشكل دائم يمكن أن يسبب اضطرابات الأكل والشرب ، مما يؤدي إلى فقدان الوزن25. أشارت الدراسات السابقة إلى أن وفيات الفئران بعد نمذجة MCAO ترجع في المقام الأول إلى عدم كفاية تناول الطعام أو الماء بدلا من الإصابة الإقفارية الدماغية14,26. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يقلل ربط ECA من تدفق الدم في شبكية العين ويحفز تلف الشبكية في شكل موت الخلايا27.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن أهم مؤشر لأبحاث السكتة الدماغية هو حجم الاحتشاء. ومع ذلك ، فقد ثبت أن حجم الاحتشاءات التي تسببها طريقة الخياطة له انحراف معياري كبير ، حتى بعد بروتوكولات جراحية وجمع بيانات صارمة. في التقارير السابقة ، ارتبط حجم الاحتشاء بدرجة إعادة التروية28 ، ويعتمد إعادة ضخ نموذج السكتة الدماغية الذي أعدته طريقة كويزومي على دوران ويليس29،30،31. ومع ذلك ، فقد ثبت أن دورة ويليس لها تباين تشريحي مرتفع ، خاصة في الفئران C57Bl / 6 ، حيث قد تفتقر 90٪ من إلى واحد أو اثنين من الشرايين الخلفية المتصلة32 ، وهو المحدد الرئيسي للتباين العالي في الإصابة الإقفارية33. لذلك ، فإن الحفاظ على نضح CCA يمكن أن يقلل من تباين حجم الاحتشاء34. أفيد أن متوسط معامل التباين في حجم الاحتشاء في تجارب السكتة الدماغية كان 29.5٪ 31 ، مما ساهم في انخفاض القوة الإحصائية لتجارب السكتة الدماغية. كما أنه يشكل تحديا كبيرا لاكتشاف الأدوية المحتملة. هذا بلا شك يزيد من تكلفة التطوير والترجمة السريرية ويمكن أن يؤدي إلى فقدان الباحثين للأدوية الفعالة المحتملة. كما أنه يزيد من عدد التي سيتم تضمينها في التحليل الإحصائي للتجربة ، مما ينتهك مبدأ 3R لأخلاقيات.

لذلك ، في هذه الدراسة ، تم تعديل طرق النمذجة لضمان سلامة بنية تدفق الدم في أنسجة المخ والتروية الكافية بعد نقص التروية الدماغية. تشمل التعديلات الرئيسية خطوتين: (1) إدخال الخيط في CCA باستخدام إبرة حقنة سعة 5 مل بدلا من إجراء شق صغير. هذه الخطوة تقلل من شق CCA وأكثر ملاءمة لربط الشق ؛ (2) سحب الخيط واستخدام خيوط حريرية أدق لربط فتحة إبرة CCA ، دون التأثير على نضح تدفق الدم في CCA. بالطبع ، يتطلب هذا أيضا عملية جراحية دقيقة ، ولكنه يختلف عن إدخال الخيط عبر ECA. تحافظ هذه الطريقة على سلامة بنية تدفق الدم الدماغي مع السماح بإعادة تدفق الدم بالكامل من خلال CCA ، مما يجعل إجراء التشغيل أبسط ويقلل من تباين حجم الاحتشاء. استخدم بعض الباحثين طرقا بحثية مماثلة لإصلاح الشقوق باستخدام غراء الأنسجة ، ولكن هذا لديه القدرة على تجلط الدم ، مما سيؤدي إلى تأثيرات لا يمكن السيطرة عليها. ويستغرق وقتا أطول لتثبيت شق25.

في الختام ، توفر هذه الدراسة نهجا معدلا لإعداد نموذج نقص التروية الدماغية الذي يسمح بنضح الدم الكافي بعد سحب الفتيل ويمكن أن يؤدي إلى أحجام احتشاء قابلة للتكرار بشكل كبير وتلف عصبي. توضح جميع النتائج المذكورة أعلاه أن الطريقة المعدلة مجدية وقابلة للتكرار وقد توفر مرجعا للممارسين لإعداد نماذج لتسهيل الترجمة السريرية الفعالة للأدوية الإقفارية الدماغية.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82173781 و 82373835) ، ومشروع أبحاث ما بعد الدكتوراه (BKS212055) ، ومشروع الابتكار العلمي والتكنولوجي لمكتب فوشان للعلوم والتكنولوجيا (2320001007331) ، ومؤسسة قوانغدونغ للبحوث الأساسية والتطبيقية (2019A1515010806) ، والمشاريع الميدانية الرئيسية (التصنيع الذكي) للجامعات العامة في مقاطعة قوانغدونغ (2020ZDZX2057) ، ومشاريع البحث العلمي (الابتكار المميز) من جنرال الجامعات في مقاطعة قوانغدونغ (2019KTSCX195).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نظام التخدير الحيوانيRayward Life Technology Co.، LtdR500IE
الحافظ على درجة حرارةRayward Life Technology Co.، Ltd69020
Cy3 الجسم المضادالثانوي ووهان Saiweier Biotechnology Co.، LtdGB21303
DAP1 الأجسام المضادةووهان Saiweier Biotechnology Co.، LtdG1012
DCX الأجسامالمضادةووهان Saiweier التكنولوجيا الحيوية المحدودةGB13434
مصل الماعزBeyotime Biotechnology Co.، LTDC0265
GraphPad PrismGraphPad SoftwareGraphPad Prism 8.0
ImageJالمعاهد الوطنية للصحةImageJ برنامج
IsofluranRayward Life Technology Co.، LtdR510-22
ليزر بقع الدم نظام تصوير التدفقRayward Life Technology Co.، LtdPeriCam PSI NR
MAP-2 الجسم المضادووهان Saiweier Biotechnology Co.، LtdGB11128
حفر جمجمة مصغرة باليدRayward Life Technology Co.، Ltd87001
خياطة أحادية الشعيراتRayward Life Technology Co.، Ltd250-280g
NeuN الأجسام المضادةWuhan Saiweier التكنولوجيا الحيوية المحدودةGB11138
OCT عامل التضمينBIOSHARPBL557A
البنسلين الصوديومChengdu Kelong الكيميائية المحدودة17121709-2
حل استرجاع المستضد السريع للأقسام المجمدةBeyotime Biotechnology Co.، LTDP0090
SD الفئرانSPF (بكين) التكنولوجيا الحيوية المحدودة.250-280 جرام
تريتون X-100Beyotime التكنولوجيا الحيوية المحدودةST795
TTCتشنغدو كيلونج الكيميائية المحدودة2019030101

المراجع

  1. Paul, S., Candelario-Jalil, E. Emerging neuroprotective strategies for the treatment of ischemic stroke: An overview of clinical and preclinical studies. Exp Neurol. 335, 113518(2021).
  2. Feigin, V. L., Owolabi, M. O. Pragmatic solutions to reduce the global burden of stroke: a World Stroke Organization-Lancet Neurology Commission. Lancet Neurol. 22 (12), 1160-1206 (2023).
  3. Putaala, J. Ischemic Stroke in Young Adults. Continuum (Minneapolis, Minn). 26 (2), 386-414 (2020).
  4. Girotra, T., Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. A contemporary and comprehensive analysis of the costs of stroke in the United States. J Neurol Sci. 410, 116643(2020).
  5. Howells, D. W., et al. Different strokes for different folks: The rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia. JCBFM. 30 (8), 1412-1431 (2010).
  6. Matur, A. V., et al. Translating animal models of ischemic stroke to the human condition. Transl Stroke Res. 14 (6), 842-853 (2023).
  7. O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Ann Neurol. 59 (3), 467-477 (2006).
  8. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema 1. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Nosotchu. , 1-7 (1986).
  9. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  10. Faber, J. E., Moore, S. M., Lucitti, J. L., Aghajanian, A., Zhang, H. Sex differences in the cerebral collateral circulation. Transl Stroke Res. 8 (3), 273-283 (2017).
  11. Justić, H., et al. Redefining the Koizumi model of mouse cerebral ischemia: A comparative longitudinal study of cerebral and retinal ischemia in the Koizumi and Longa middle cerebral artery occlusion models. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (11), 2080-2094 (2022).
  12. Li, Y., et al. Comparison of cerebral microcirculation perfusion in rat models of middle cerebral artery occlusion prepared through common carotid artery insertion and external carotid artery insertion. CJTER. 27 (11), 1683-1691 (2023).
  13. Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).
  14. Trueman, R. C., et al. A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).
  15. Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovasc Res. 114 (2), 291-299 (2018).
  16. Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovasc Res. 118 (3), 814-827 (2022).
  17. Ma, R., et al. Animal models of cerebral ischemia: A review. Biomed Pharmacother. 131, 110686(2020).
  18. Belayev, L., et al. Docosanoids promote neurogenesis and angiogenesis, blood-brain barrier integrity, penumbra protection, and neurobehavioral recovery after experimental ischemic stroke. Mol Neurobiol. 55 (8), 7090-7106 (2018).
  19. Guo, H., et al. Carthamin yellow improves cerebral ischemia-reperfusion injury by attenuating inflammation and ferroptosis in rats. Int J Mol Med. 47 (4), 52(2021).
  20. Chia, N. H., et al. Determining the number of ischemic strokes potentially eligible for endovascular thrombectomy: a population-based study. Stroke. 47 (5), 1377-1380 (2016).
  21. Henninger, N., Fisher, M. Extending the time window for endovascular and pharmacological reperfusion. Transl Stroke Res. 7 (4), 284-293 (2016).
  22. Zhang, P. L., et al. Use of Intravenous thrombolytic therapy in acute ischemic stroke patients: evaluation of clinical outcomes. Cell Biochem Biophys. 72 (1), 11-17 (2015).
  23. Morris, G. P., et al. A comparative study of variables influencing ischemic injury in the Longa and Koizumi methods of intraluminal filament middle cerebral artery occlusion in mice. PLOS One. 11 (2), e0148503(2016).
  24. Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. J Neurosci Methods. 249, 99-105 (2015).
  25. Dittmar, M. S., et al. The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model. Exp Neurol. 195 (2), 372-378 (2005).
  26. Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (6), 2084-2097 (2017).
  27. Ogishima, H., et al. Ligation of the pterygopalatine and external carotid arteries induces ischemic damage in the murine retina. Invest Ophth Vis Sci. 52 (13), 9710-9720 (2011).
  28. Irvine, H. J., et al. Reperfusion after ischemic stroke is associated with reduced brain edema. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1807-1817 (2018).
  29. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: Size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
  30. Dirnagl, U., Dirnagl, U. Bench to bedside: The quest for quality in experimental stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (12), 1465-1478 (2006).
  31. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: A meta-analysis. Sci Rep. 6, 21086(2016).
  32. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  33. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: Evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J Cereb Blood Flow Metab. 18 (5), 570-579 (1998).
  34. Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice. Dis Model Mech. 10 (7), 931-938 (2017).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

common TTC

مقالات ذات صلة