Method Article

طريقة متكاملة لصياغة Optrodes الفيزيولوجية الكهربية المرنة والمريحة للتسجيل متعدد المناطق في الجسم الحي

DOI:

10.3791/67071

⸱

November 21st, 2024

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medical Neurobiology and MOE Frontiers Center for Brain Science, Institutes of Brain Science, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد طورنا نهجا مبسطا وفعالا من حيث التكلفة لتصنيع الأقطاب الكهربائية وأجرينا تسجيلات للإشارات عبر مناطق متعددة في الفئران التي تتحرك بحرية. مكن استخدام علم البصريات الوراثي ، جنبا إلى جنب مع الفيزيولوجيا الكهربية متعددة المناطق وتسجيل إشارة الكالسيوم ، من الكشف عن الأنشطة العصبية عبر المناطق في نموذج إشعال النوبات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الصرع هو اضطراب عصبي يتميز بإفرازات غير طبيعية متزامنة تشمل مناطق متعددة من الدماغ. تسهل الآفات البؤرية انتشار إشارات الصرع من خلال الدوائر العصبية المرتبطة بها. لذلك ، يعد التسجيل في الجسم الحي لإمكانات المجال المحلي (LFP) من مناطق الدماغ الحرجة أمرا ضروريا لفك تشفير الدوائر المشاركة في انتشار النوبات. ومع ذلك ، فإن الطرق الحالية لتصنيع الأقطاب الكهربائية وزرعها تفتقر إلى المرونة. هنا ، نقدم جهازا مفيدا مصمما للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية (LFPs وتخطيط كهربية الدماغ [EEG]) عبر مناطق متعددة. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بدمج التلاعب البصري الوراثي وتسجيل إشارات الكالسيوم بسلاسة مع تسجيل LFP. لوحظت إفرازات قوية بعد التفريغ في عدة مناطق منفصلة أثناء نوبات الصرع ، مصحوبة بزيادة إشارات الكالسيوم. يقدم النهج المستخدم في هذه الدراسة استراتيجية مريحة ومرنة للتسجيلات العصبية المتزامنة عبر مناطق مختلفة من الدماغ. إنه يحمل القدرة على تطوير البحث حول الاضطرابات العصبية من خلال توفير رؤى حول الملامح العصبية لمناطق متعددة متورطة في هذه الاضطرابات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الصرع هو حالة عصبية شائعة تتميز بنوبات متكررة تظهر على شكل تشنجات واضطرابات حسية وفقدان الوعي1. الآليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة وراء الصرع معقدة وتشمل مناطق دماغية متعددة مترابطة2،3. ألقت التطورات الحديثة في التصوير العصبي الضوء على الشبكات واسعة النطاق المشاركة في الصرع4،5. ومع ذلك ، فإن فهم الدوائر المعقدة وآليات الشبكة الكامنة وراء توليد الصرع وانتشاره لا يزال محدودا ، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم كفاية التطبيق لتقنيات التسجيل العصبي متعددة المناطق6. لذلك ، فإن تطوير طريقة مرنة ومتكاملة قادرة على مراقبة النشاط العصبي في وقت واحد عبر مناطق الدماغ المتباينة أمر حتمي.

يتم إجراء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية لالتقاط النوبات وتحديد وجود الصرع7. باستثناء تسجيل النشاط الفيزيولوجي الكهربي ، هناك تركيز متزايد على نشاط الكالسيوم الدقيق لمجموعات عصبية معينة في دراسات الصرع8،9. دفعت التطورات في تخليق مؤشر الكالسيوم وتصميمات المسبار المختلفة الباحثين إلى اعتماد القياس الضوئي للألياف لالتقاط التغيرات في النشاط العصبي والمواد العصبية داخل الدماغ10،11. تكمل الطريقتان المستقلتان للكشف عن النشاط العصبي ، وهما الفيزيولوجيا الكهربية وتسجيل القياس الضوئي للألياف ، بعضهما البعض ، مما يسهل فهما أكثر شمولا للعمليات العصبية الديناميكية.

بالإضافة إلى ذلك ، يعد التسجيل المتزامن وتعديل النشاط العصبي أمرا محوريا لاكتساب رؤى حول عمل الدماغ على مستوى الشبكة والخلوي. يمكن هذا النهج الباحثين من مراقبة عمليات الدماغ المعقدة ومعالجتها في الوقت الفعلي. برزت علم الوراثة البصرية كأداة لا غنى عنها لاستكشاف الإشارات العصبية ، نظرا لقدرتها المميزة على التحفيز الانتقائي أو التثبيط12. على الرغم من التطبيقات الواسعة النطاق للتسجيل الفيزيولوجي الكهربي متعدد المواقع في علم الأعصاب13 ، إلا أن تكامل التسجيل الفيزيولوجي الكهربي متعدد المناطق مع القياس الضوئي للألياف والتلاعب البصري الوراثي لا يزال محدودا. والأهم من ذلك ، أن الطرق الحالية لتصنيع وزرع أقطاب كهربائية متعددة المناطق تفتقر إلى المرونة14. تعيق هذه القيود قدرتنا على تشريح وظائف وتفاعلات دوائر محددة عبر مناطق متعددة. هنا ، نقدم نهجا فعالا من حيث التكلفة ومريحا متعدد المناطق في الجسم الحي يلقي الضوء على العمليات العصبية عبر المناطق في النوبات التي يسببها الإشعال والاضطرابات العصبية والنفسية الأخرى.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حصل هذا البروتوكول على موافقة لجنة رعاية واستخدامه في جامعة فودان وتم إجراؤه وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي صممها دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تم تنفيذ جميع التدابير الممكنة لتقليل عدد المستخدمة في هذه الدراسة. يتم تضمين الوقت اللازم لتنفيذ كل خطوة في الخطوات المعنية.

1. تحضير الأقطاب الكهربائية (الشكل 1)

  1. قم بقص طول مناسب من سلك التنغستن (~ 20 مم) وحرق طبقة العزل في أحد طرفيها لفضح سلك التنغستن (1.6-2 مم). ثني الطرف الآخر من السلك على شكل "L" (انظر الشكل 1 أ ، ~ 1 دقيقة)
  2. ضع الطرف "L" لسلك التنغستن بعناية على الألياف الضوئية (انظر الشكل 1 ب ، ~ 1 دقيقة).
    ملاحظة: يجب أن يكون سلك التنغستن أطول بمقدار 0.2-0.4 مم من طرف الألياف الضوئية.
  3. اغمس قطرة من المادة اللاصقة وقم بتطبيقها على واجهة الألياف الضوئية وسلك التنغستن (انظر الشكل 1C ، ~ 1 دقيقة). بسبب التوتر السطحي للسائل ، سوف يعلق سلك التنغستن على الألياف الضوئية.
  4. ضع المادة اللاصقة مرة واحدة واتركها تجف. ثم ضع طبقة ثانية. سيؤدي ذلك إلى تشديد الرابطة بين سلك التنغستن والألياف الضوئية (انظر الشكل 1C ، ~ 1 دقيقة).
    ملاحظة: أثناء عملية التطبيق ، يجب توخي الحذر لمنع المادة اللاصقة من التدفق إلى طرف الألياف الضوئية ، لأن ذلك قد يؤثر على نفاذيتها.
  5. في زاوية الشكل "L" ، استخدم مادة لاصقة لربط قاعدة الألياف الضوئية وسلك التنغستن معا بشكل وثيق (~ 1 دقيقة).
    ملاحظة: تضمن مساحة التلامس المتزايدة والتصلب الكروي للقطرة اللاصقة رابطة ثابتة بين الألياف الضوئية وسلك التنغستن.
  6. استخدم اللحام لإنشاء اتصال بين سلك التنغستن ودبوس الموصل الأنثوي (انظر الشكل 1D ، ~ 3 دقائق لكل منهما)
    ملاحظة: نظرا لأن سلك التنغستن ليس حساسا للحرارة ، يمكن زيادة معدل نجاح اللحام إلى ما يقرب من 100٪ بواسطة غلاف معدني مصمم عن طريق قطع موقع فتحة الدبوس لتوحيد المكونين جسديا. بعد ذلك ، يضمن اللحام الذي يملأ الغلاف اتصالا مستقرا بين سلك التنغستن المدرج والدبوس.
  7. وفقا للتصميم التجريبي ، قم بلحام العدد المطلوب من الأبترودات (انظر الشكل 1E ، ~ 10 دقائق)
    ملاحظة: تم استخدام ثلاثة أوبترودات في هذه الدراسة.
  8. اقطع السلك المطلي بالمينا بالطول المناسب (~ 30 مم) وحرق العزل على كلا الطرفين. لف أحد طرفي السلك المطلي بالمينا حول قاعدة المسمار وقم بلحامه. قم بتوصيل الطرف الآخر من السلك المطلي بالمينا بدبابيس الموصل الأنثوي عبر مكواة لحام ، ليكون بمثابة تسجيل EEG ووصلة أرضية لقطب الجمجمة (انظر الشكل 1F ، ~ 5 دقائق)
    ملاحظة: نظرا لمرونة السلك المطلي بالمينا ، فمن الملائم توصيل الجمجمة ودبابيس الموصل الأنثوي. يعد اللحام بعد لف السلك المطلي بالمينا حول المسمار أكثر موثوقية من اللحام المثبت على السطح.
  9. ضع مادة لاصقة تذوب على الساخن على مجموعة دبوس الموصل الأنثوي لتغليف الموصل الأنثوي والتأكد من أن وصلات اللحام مغلفة بالكامل. أثناء تصلب المادة اللاصقة الذائبة على الساخن ، قم بتشكيل المادة اللاصقة باستخدام لوح بلاستيكي لتقليل إشغال المساحة أثناء الزرع (انظر الشكل 1F ، ~ 3 دقائق)
    ملاحظة: نظرا لمخاطر الحروق المحتملة المرتبطة باستخدام الغراء المذاب على الساخن ، يعتبر لاصق AB بديلا أكثر أمانا.
  10. بعد ذلك ، استخدم مقياس شدة الضوء ومقياس رقمي متعدد لقياس اللمعان والتوصيلية. عند اجتياز هذه الاختبارات ، يكون الإعداد جاهزا للاستخدام (انظر الشكل 1G ، ~ 2 دقيقة)
    ملاحظة: عند العمل بالليزر ، ارتد دائما نظارات واقية مناسبة للطول الموجي المحدد وقوة ضوء الليزر. مطلوب ألياف عالية الجودة لنقل ما لا يقل عن 80٪ من الضوء من نهاية سلك التصحيح إلى طرف الألياف القابلة للزرع. بالإضافة إلى ذلك ، تم قياس المقاومة من طرف سلك التنغستن إلى فتحة رأس الدبوس بنطاق مقبول من 1-5 Ω.
  11. قبل الاستخدام ، اغمر الأقطاب الكهربائية المحضرة في 75٪ كحول لمدة 15 دقيقة ، ثم انقلها إلى محلول ملحي معقم (~ 16 دقيقة).
    ملاحظة: لا يؤثر الوزن الإجمالي لجهاز القطب المغلف (0.6701 ± 0.01123 جم ، ن = 4) على نشاط الفئران. يتم تعقيم الأقطاب الكهربائية مسبقا باستخدام تعقيم البلازما.

2. بروتوكول زرع القطب الكهربائي (الشكل 2)

  1. قم بتخدير الفئران بالأيزوفلوران (2٪ -4٪) وقم بتثبيتها في جهاز تجسيمي (انظر الشكل 2 أ ، ~ 2 دقيقة). استخدم مرهم العين على عيون الفأر لمنع الجفاف أثناء التخدير. يوضع الليدوكائين على الجلد حول محيط الشق القحفي وحقن تحت الجلد من الكاربروفين بجرعة 5 ملغ/كغ.
    ملاحظة: يتم تأكيد التخدير المناسب من خلال عدم وجود منعكس صحيح وفقدان الاستجابة لقرص إصبع القدم. بالنسبة للإجراءات الجراحية المطولة ، يكون استخدام مخدر عن طريق الحقن أكثر ملاءمة.
  2. بعد تثبيت في الجهاز التجسيمي ، قم بقص فروة الرأس على طول حافة الجمجمة وامسح سطح الجمجمة بنسبة 75٪ كحول لفضح مواضع البريجما واللامدا (انظر الشكل 2 ب ، ~ 3 دقائق).
    ملاحظة: يشمل إجراء ما قبل الجراحة قص الشعر وتطهير موقع الجراحة والتعقيم المسبق للأدوات والأدوات الجراحية.
  3. قم بتسوية الدماغ وحفر ثقوب (~ 0.8 مم) فوق مناطق الاهتمام (ROI) باستخدام مثقاب دقيق. حقن الفيروسات ذات الصلة بمضخة حقنة (انظر الشكل 2C - F ، ~ 20 دقيقة).
    ملاحظة: يتم عرض معلومات مفصلة حول الفيروسات وعائد الاستثمار في هذه الدراسة في جدول المواد والشكل 3.
  4. أمسك الأبترودات بحامل وحرك طرفها إلى نقطة بريجما ، واضبط هذا الموضع على أنه "صفر". باستخدام نقطة بريجما كإحداثي مرجعي ، انقل أوبترودات إلى المناطق المستهدفة (انظر الشكل 2G ، ~ 3 دقائق). ضع optrodes 0.3 مم فوق موقع حقن الفيروس.
    ملاحظة: في استراتيجية الزرع الرأسي ، يبلغ الحد الأدنى للمسافة بين القطبين حوالي 2 مم ، اعتمادا على سمك غلاف الألياف البصرية والقطر الخارجي للطويق. يمكن استخدام طريقة الإدراج بزاوية للتسجيل المتزامن من المناطق القريبة.
  5. بعد إدخال الألياف البصرية في مناطق الدماغ المقابلة ، ضع كمية صغيرة من لاصق الأنسجة حولها لتغطية الأنسجة المكشوفة. ثم ، قم بتطبيق مادة لاصقة إضافية وقليل من الأسمنت للأسنان بالتتابع. بعد أن يصلب الأسمنت السني ، حرر الحامل بعناية (انظر الشكل 2H ، ~ 5 دقائق).
  6. قبل كل عملية زرع مرجعية جديدة ، قم بإجراء إعادة المعايرة ، والتي تتضمن تكرار الخطوة 2.4 (انظر الشكل 2I).
    ملاحظة: لكل عملية زرع ، ضع المرجع عند بريجما كنقطة "صفر".
  7. بعد زرع جميع الفتحات ، قم بحفر الثقوب خلف نقطة لامدا ل "الأرض" وفوق القشرة المخية الحديثة ل "مخطط كهربية الدماغ" باستخدام مثقاب دقيق (~ 1 دقيقة).
    ملاحظة: يجب أن يتطابق حجم الفتحة المحفورة (~ 1.1 مم) مع قطر المسمار.
  8. أدخل مسامير الجمجمة في الفتحة الموجودة فوق القشرة وخلف نقطة لامدا (انظر الشكل 2J ، ~ 5 دقائق).
    ملاحظة: تستخدم براغي الجمجمة لتسجيل مخطط كهربية الدماغ والتأريض ، على التوالي.
  9. قم بتنظيم أسلاك التنغستن والأسلاك المطلية بالمينا بحيث يتم وضعها فوق منطقة الزرع وعدم تعرضها خارج الجمجمة. قم بتأمين موضع الموصل الأنثوي باستخدام حامل (انظر الشكل 2K ، ~ 2 دقيقة).
  10. املأ موقع الزرع بأسمنت الأسنان لضمان اتصال مستقر بين جهاز القطب الكهربائي والجمجمة. قم بتغليف الأسلاك الداخلية ، مع ترك فتحات إدخال الموصل الأنثوي مكشوفة للاتصال بالمسرح (انظر الشكل 2L ، ~ 6 دقائق).
  11. بعد تصلب الأسمنت للأسنان ، ضع اليود على الجلد حول محيط فروة الرأس المكشوفة ثم ضع على وسادة تدفئة (~ 1 دقيقة).
    ملاحظة: تأكد من عدم ترك دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. يجب الحفاظ على الظروف المعقمة طوال جراحة البقاء على قيد الحياة.
  12. تطبيق المضادات الحيوية والمسكنات لدعم التعافي بعد الجراحة.
    ملاحظة: لا يتم إعادة إدخال التي خضعت لعملية جراحية إلى صحبة الأخرى حتى تتعافى تماما. تم إعطاء حقن داخل الصفاق من سيفترياكسون الصوديوم (180 مجم / كغ) ، وحقن تحت الجلد من الكاربروفين (5 مجم / كغ) ، وتم وضع جل الليدوكائين على الجروح الجراحية يوميا لمدة 3 أيام. يطلب من البقاء على قيد الحياة لفترة محددة لإكمال الاختبار السلوكي. بعد ذلك ، سيتم قتلهم رحيما باستخدام 4٪ -5٪ من الأيزوفلوران ، يليه التروية وتقسيم الأنسجة لتقييم العدوى الفيروسية ومواقع زرع القطب.

3. بروتوكول للتسجيل في الجسم الحي الدماغ

  1. قبل إجراء تسجيل الإشارات والاختبار السلوكي (اختبار المجال المفتوح)15 ، تأكد من أن الماوس يخضع لفترة 3 أيام من المناولة اللطيفة لتأقلمه مع البيئة.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم وضع الفئران في حقل مفتوح (42 سم × 42 سم) للتنقل بحرية ، مما يسمح لنا بمراقبة سلوك النوبات.
  2. بعد تخدير الفئران بالأيزوفلوران (2٪ -4٪) ، قم بتوصيل الألياف الضوئية بالتتابع بترتيب موقع التسجيل قبل إدخال المسرح.
  3. اضبط نبضة الضوء 635 نانومتر مع دورة عمل 10٪ على 20 هرتز. قم بإعداد تحفيز الضوء لمدة 10 ثوان (200 نبضة) أثناء التسجيل. اضبط الكثافة عند أطراف الألياف الضوئية على 3 ميجاوات.
  4. استخدم نظام القياس الضوئي للألياف لتسجيل فترة الاختبار السلوكي لإشارات Gcamp6m بمعدل أخذ عينات يبلغ 30 هرتز × 470 نانومتر قناة LED.
  5. سجل إشارات الكالسيوم و LFPs و EEG في وقت واحد تحت التحفيز البصري الوراثي ، جنبا إلى جنب مع الأداء السلوكي المقابل (انظر الشكل 3).
  6. استخدم وضع علامات على مزامنة إشارة منطق الترانزستور والترانزستور (TTL) لضمان الاتساق الزمني في البيانات المسجلة.

4. معالجة البيانات

  1. تحميل بيانات القياس الضوئي إلى برنامج MATLAB. بعد ذلك ، استخدم الترميز المخصص (الملف التكميلي 1) لتغيير اتجاه إشارة الكالسيوم.
  2. حدد التغيرات في شدة التألق بالمعادلة (1):
    ΔF / F = (Ft - F0) / F0 (1)
    حيث يمثل Ft قيم مضان إشارة الكالسيوم في الوقت الفعلي ، ويشير F0 إلى متوسط شدة مضان خط الأساس قبل الحدث.
  3. استيراد البيانات الفيزيولوجية الكهربية ، بمعدل أخذ عينات من 1000 هرتز ، إلى MATLAB (الملف التكميلي 2).
  4. تنسيق عرض إشارات الكالسيوم والبيانات الفيزيولوجية الكهربية بمحاذاة مع العلامات المتزامنة.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بدمج علم البصريات الوراثي مع التسجيل الفيزيولوجي الكهربي متعدد المناطق وتصوير الكالسيوم لمراقبة النشاط العصبي عبر مناطق الدماغ المختلفة أثناء نوبات البصريات الوراثية. لهذا الغرض ، تم حقن فيروس مرتبط بالغدة (AAV) يعبر عن ChrimsonR تحت سيطرة محفز CaMKIIα (AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry) 16 في موقع الصرع الكلاسيكي ، القشرة الكمثرية (ROI 1) 17 ، في القوارض. بالإضافة إلى ذلك ، تم حقن AAV-hsyn-Gcamp6m18 في ثلاث مناطق (عائد الاستثمار 1-3 ، كما هو موضح في الشكل 3 أ). بعد ذلك ، تم زرع أوبترودات مصنوعة حسب الطلب في هذه المناطق ، وتم زرع أقطاب كهربائية لمخطط كهربية الدماغ في الجمجمة المقابلة (الشكل 3 ب).

تم التعبير عن ChrimsonR و Gcamp6m بشكل كبير في مناطق الدماغ المستهدفة (الشكل 3C) بعد 4 أسابيع. أظهرت الفئران سلوكيات نوبة معممة بعد تحفيز ضوئي قصير لمدة 10 ثوان عند 20 هرتز لتنشيط الخلايا العصبية الإيجابية ChrimsonR. قمنا بجمع أنشطة الكالسيوم وإشارات LFP من عائد الاستثمار في الفئران التي تتحرك بحرية من خلال استخدام تقنيات القياس الضوئي متعدد الألياف والفيزيولوجيا الكهربية المتزامنة (الشكل 3 د). تم استنباط التصريفات القوية بعد التفريغ ، جنبا إلى جنب مع الزيادات الملحوظة في أنشطة Ca2+ ، في هذه المناطق عن طريق التحفيز البصري الوراثي القصير (الشكل 3E). لوحظت استجابة 30 هرتز في المنطقة المحفزة للبصر ، ناتجة عن تنشيط البروتينات البصرية الوراثية عبر ضوء أزرق LED بتردد أخذ عينات قدره 30 هرتز. أظهرت هذه النتائج التسجيل الموثوق به لاستجابات إشارات الفيزيولوجيا الكهربية والكالسيوم المتزامنة عبر مناطق متعددة تحت التحفيز البصري الوراثي.

figure-results-1
الشكل 1: تصميم تخطيطي للمرجعية المرنة. (أ) تحضير أسلاك التنغستن والألياف الضوئية على شكل حرف "L". (ب) تم وضع الألياف الضوئية وأسلاك التنغستن على الشريط اللاصق. (ج) تم لصق الألياف الضوئية وسلك التنغستن معا باستخدام الغراء. (د ، ه) تم لحام أسلاك التنغستن بالموصل. (و) تم لحام البراغي بالموصل ، وتم تغليف الموصل بمادة لاصقة تذوب ساخنة. (ز) أجريت عمليات تفتيش للجودة على مجموعة المرجع النهائي. يمثل G ثقب القطب الأرضي. يمثل R ثقبا للقطب المرجعي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: سير عمل جراحة الزرع. (أ) تم تأمين الفأر على جهاز تجسيم. (ب) تمت إزالة فروة الرأس ، وتم الكشف عن الجمجمة بشكل كاف. (ج) تم توصيل أنبوب زجاج الحقن بالمضخة. (د) تم ضبط رأس الفأر إلى وضع أفقي. (ه، و) تم حفر ثقوب وحقن الفيروس. (ز) أمسك الحامل بالمرجع. (ح) تم زرع المرجع في منطقة ذات صلة وتثبيته بأسمنت الأسنان. (I) إعادة ضبط موضع الصفر قبل كل عملية زرع. (J) تم زرع أقطاب مخطط كهربية الدماغ بعد زرع المرجعية. G / R: تم تقصير القطب الأرضي والقطب المرجعي في مواضع الدبوس. (ك) تم ترتيب الأسلاك بالترتيب ، وتم إصلاح الموصل. (ل) تم لف جهاز القطب الكهربائي وتثبيته بأسمنت الأسنان. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: في الجسم الحي تسجيل الفيزيولوجيا الكهربية المتزامنة والكالسيوم. (أ) التصميم التجريبي للحقن الفيروسي. (ب) المخطط التجريبي لزرع المرجع الخارجي. (ج) تظهر الصور متحدة البؤر تعبير الفيروس في المناطق المستهدفة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (د) تخطيطي للتحفيز البصري الوراثي ، والفيزيولوجيا الكهربية المتزامنة ، وتسجيل الكالسيوم في حالة تتحرك بحرية. (ه) الآثار التمثيلية لإشارات الكالسيوم (أعلى) ، وإشارات LFP (الوسطى) ، ومخطط كهربية الدماغ (أسفل) ، ومخططات طياف الطاقة المقابلة. الخط الأحمر: 10 ثوان خفيفة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: ملفات الترميز لإشارة الكالسيوم. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: ملفات الترميز لإشارة LFP. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، استخدمنا جهاز optrode عصامي لتسجيل الإشارات العصبية في الجسم الحي عبر مناطق متعددة. تم التحقق من جدوى هذا النظام للتحفيز البصري الوراثي المتزامن وتسجيل إشارة الكالسيوم والتسجيل الفيزيولوجي الكهربي. طريقة تحضير القطب الموصوفة هنا فعالة وفعالة من حيث التكلفة. وفقا للتصميم التجريبي ، يمكننا تسجيل الإشارات من مناطق الدماغ ذات الصلة. يسمح الترتيب الاستراتيجي للأوبتروديس بالاستخراج المحتمل للمعلومات الوفيرة من مناطق متعددة عبر الدماغ. يوفر تكامل نماذج الكشف متعدد الوسائط فرصا لتشريح الدوائر العصبية المعقدة ، وتوضيح العلاقات بين مناطق الدماغ.

في البيانات التمثيلية لهذه الدراسة ، تم تسجيل إشارات الكالسيوم والإشارات الفيزيولوجية الكهربية من الخلايا العصبية واسعة الطيف لمنطقة الدماغ المحلية بأكملها في وقت واحد. بعد التقدم في تكنولوجيا بناء المعدلة وراثيا19،20 ، يسمح الجمع بين Cre-mice و FlpO-mice مع فيروس Gcamp للتعبير عن تسجيل النشاط العصبي من خلايا عصبية معينة. ومن ثم ، تسمح لنا هذه الطريقة بفك تشفير استجابات الخلايا العصبية المحددة عبر مناطق الدماغ المختلفة من خلال هذه الأساليب المتكاملة. بالإضافة إلى ذلك ، ستكون الأساليب التحليلية المتنوعة مفيدة في تحليل الإشارات الفيزيولوجية الكهربية والكالسيوم التي تم جمعها من مناطق متعددة في الدماغ. على سبيل المثال ، يمكن استخدام تحليل التماسك وتحليل سببية جرانجر للحصول على خصائص اتصال نظرية جديدة بين مناطق الدماغالمختلفة 21،22،23. إلى جانب ذلك ، تساعد التطورات في تقنيات تتبع الدوائر في كشف الروابط الهيكلية بين مناطق الدماغ24. عززت هذه التقنيات المتكاملة فهم الاستجابات المرتبطة عبر مناطق الدماغ المختلفة وأحدثت ثورة في فهم الاتصال والتفاعل في الدوائر والشبكات.

في هذه الدراسة ، استخدمنا نمذجة إشعال البصريات الوراثية للصرع. لا يوفر علم البصريات الوراثي دقة زمنية أعلى فحسب ، بل يوفر أيضا خصوصية خلية محسنة مقارنة بالتحفيز الكهربائي في نموذج إشعال الصرع25،26. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يتيح توصيل الضوء وتسجيل الكالسيوم من خلال نفس الألياف الضوئية. ستكمل اكتشافات النشاط متعدد المناطق والتعديلات البصرية الوراثية طرق التدخل في الصرع ذات الحلقة المغلقة ، مما يسمح بالتدخلات التنظيمية عبر مناطق متعددة من الدماغ عن طريق التعديل المثبط ، وبالتالي تعزيز التأثيرات المضادة للصرع27،28. من المهم أيضا دمج هذه الأجهزة مع تقنيات التعديل العصبي الأخرى الحالية للكشف عن الألم المزمن وتدخله في الحلقةالمغلقة 29،30. إلى جانب ذلك ، قد يمتد هذا النهج إلى اضطرابات عصبية أخرى مثل اضطرابات النوم31 ومرض الزهايمر ، حيث تتطلب ظواهر مثل تذبذبات 40 هرتز ومعالجة المعلومات بعد المدخلات الحسية توضيحا عبر تسجيل متعدد المناطق في الجسم الحي 32. لذلك ، فإن تطبيق هذا النهج متعدد الأوجه بمهارة سيعمق فهمنا للتفاعلات بين مناطق متعددة ويوفر رؤى قيمة للعلاجات الدقيقة في الأمراض المختلفة.

توجد قيود في طريقة الكشف عن المرجع الإيجابي هذه ، والتي يمكن تحسينها في البحث المستقبلي. بينما تم الحصول على إشارات LFP بسهولة ، ظل الكشف عن أنشطة الارتفاع صعبا مع الطريقة الحالية33. نحن نهدف إلى استبدال سلك التنغستن بأقطاب كهربائية مرنة متعددة القنوات. يجب النظر بعناية في سمك الألياف وسلامة لاصق الغراء.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة للإفصاح عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31871085) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في شنغهاي (21ZR1407300) ، ومشروع العلوم والتكنولوجيا الرئيسي لبلدية شنغهاي (2018SHZDZX01) ، ومختبر ZJ ، ومركز شنغهاي لعلوم الدماغ والتكنولوجيا المستوحاة من الدماغ.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
8-32 محولPlexonمخصصطلب توصيل الموصل الأنثوي ومرحلة
الرأس AAV-CaMKII & alpha ;-ChrimsonR-mcherryTaitool BioscienceS0371-94 × 1012< / sup> VG / mL   ؛
AAV-hsyn-Gcamp6mTaitool BioscienceS0471-94 × 1012< / sup> VG / mL & nbsp ؛
DAPISigma236276Titered 1: 500
أسمنت الأسنانNew Century Dental430205
نظام التسجيلات الفيزيولوجية الكهربيةPlexonOmniplex
سلك مطلي بالميناN / Aالقطر المطلوب حسب الطلب= 0.2 مم
موصل أنثىN / Aمطلوب حسب الطلب1.25 مم الملعب
GlueLoctite45282
ليزرتشانغتشون للصناعات الجديدةBH81563635 نانومتر & nbsp ؛
MATLABMathWorksR2021b
MicrodrillRWD78001
قياس ضوئي للألياف متعددة القنواتThinkerTechFPS-SS-MC-LED
الألياف الضوئيةXi'an BogaoL-200UMحدد طول الألياف المناسب بناء على عمق مناطق الدماغ المستهدفة.
سلك التنغستن المطلي ب PFAAM795500عارية 0.002 بوصة ؛ مطلي 0.0040 "
عداد الطاقةThorlabsPM100D
Stereotaxic FxrameRWD68807
لاصقالأنسجة 3M1469SB
نظام :

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Devinsky, O., et al. Epilepsy. Nat Rev Dis Primers. 4, 18024(2018).
  2. Piper, R. J., et al. Towards network-guided neuromodulation for epilepsy. Brain. 145 (10), 3347-3362 (2022).
  3. Bertram, E. H. Neuronal circuits in epilepsy: Do they matter. Exp Neurol. 244, 67-74 (2013).
  4. Goodman, A. M., Szaflarski, J. P. Recent advances in neuroimaging of epilepsy. Neurotherapeutics. 18 (2), 811-826 (2021).
  5. Caciagli, L., Bernhardt, B. C., Hong, S. J., Bernasconi, A., Bernasconi, N. Functional network alterations and their structural substrate in drug-resistant epilepsy. Front Neurosci. 8, 411(2014).
  6. Dai, Y., et al. In vivo microelectrode arrays for detecting multi-region epileptic activities in the hippocampus in the latent period of rat model of temporal lobe epilepsy. Micromachines (Basel). 12 (6), 659(2021).
  7. Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A. Electrophysiological biomarkers of epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 334-346 (2014).
  8. Grienberger, C., Giovannucci, A., Zeiger, W., Portera-Cailliau, C. Two-photon calcium imaging of neuronal activity. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 67(2022).
  9. Akerboom, J., et al. Optimization of a gcamp calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  10. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive gcamp calcium indicators for imaging neural populations. Nature. 615 (7954), 884-891 (2023).
  11. Wu, Z., Lin, D., Li, Y. Pushing the frontiers: Tools for monitoring neurotransmitters and neuromodulators. Nat Rev Neurosci. 23 (5), 257-274 (2022).
  12. Vierock, J., et al. Bipoles is an optogenetic tool developed for bidirectional dual-color control of neurons. Nat Commun. 12 (1), 4527(2021).
  13. Luo, W., et al. Acquiring new memories in neocortex of hippocampal-lesioned mice. Nat Commun. 13 (1), 1601(2022).
  14. Armstrong, C., Krook-Magnuson, E., Oijala, M., Soltesz, I. Closed-loop optogenetic intervention in mice. Nat Protoc. 8 (8), 1475-1493 (2013).
  15. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The open field test for measuring locomotor activity and anxiety-like behavior. Methods Mol Biol. 1916, 99-103 (2019).
  16. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  17. Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Front Neural Circuits. 9, 27(2015).
  18. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  19. Birling, M. C., Dierich, A., Jacquot, S., Herault, Y., Pavlovic, G. Highly-efficient, fluorescent, locus directed cre and flpo deleter mice on a pure c57bl/6n genetic background. Genesis. 50 (6), 482-489 (2012).
  20. Huang, T., et al. Identifying the pathways required for coping behaviours associated with sustained pain. Nature. 565 (7737), 86-90 (2019).
  21. Likhtik, E., Stujenske, J. M., Topiwala, M. A., Harris, A. Z., Gordon, J. A. Prefrontal entrainment of amygdala activity signals safety in learned fear and innate anxiety. Nat Neurosci. 17 (1), 106-113 (2014).
  22. Tavares, L. C. S., Tort, A. B. L. Hippocampal-prefrontal interactions during spatial decision-making. Hippocampus. 32 (1), 38-54 (2022).
  23. Lu, Y., et al. Optogenetic dissection of ictal propagation in the hippocampal-entorhinal cortex structures. Nat Commun. 7, 10962(2016).
  24. Liu, Q., Wu, Y., Wang, H., Jia, F., Xu, F. Viral tools for neural circuit tracing. Neurosci Bull. 38 (12), 1508-1518 (2022).
  25. Christenson Wick, Z., Krook-Magnuson, E. Specificity, versatility, and continual development: The power of optogenetics for epilepsy research. Front Cell Neurosci. 12, 151(2018).
  26. Paschen, E., et al. Hippocampal low-frequency stimulation prevents seizure generation in a mouse model of mesial temporal lobe epilepsy. Elife. 9, e54518(2020).
  27. Gummadavelli, A., Zaveri, H. P., Spencer, D. D., Gerrard, J. L. Expanding brain-computer interfaces for controlling epilepsy networks: Novel thalamic responsive neurostimulation in refractory epilepsy. Front Neurosci. 12, 474(2018).
  28. Vandekerckhove, B., et al. Technological challenges in the development of optogenetic closed-loop therapy approaches in epilepsy and related network disorders of the brain. Micromachines (Basel). 12 (1), 38(2020).
  29. Li, Z. J., Zhang, L. B., Chen, Y. X., Hu, L. Advancements and challenges in neuromodulation technology: Interdisciplinary opportunities and collaborative endeavors. Sci Bull (Beijing). 68 (18), 1978-1982 (2023).
  30. Zhang, Q., et al. A prototype closed-loop brain-machine interface for the study and treatment of pain. Nat Biomed Eng. 7 (4), 533-545 (2023).
  31. Varela, C., Wilson, M. A. Mpfc spindle cycles organize sparse thalamic activation and recently active ca1 cells during non-rem sleep. Elife. 9, e48881(2020).
  32. Adaikkan, C., et al. Gamma entrainment binds higher-order brain regions and offers neuroprotection. Neuron. 102 (5), 929-943.e8 (2019).
  33. Muthmann, J. O., et al. Spike detection for large neural populations using high density multielectrode arrays. Front Neuroinform. 9, 28(2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Electrophysiological OptrodesIn Vivo RecordingLocal Field PotentialMulti Region RecordingOptogenetic StimulationCalcium SignalingFiber PhotometryEEG RecordingNeural Circuit AnalysisEpilepsy Models

Related Articles