مقالة منهجية

توليد وزراعة الفئران الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية والخلايا العصبية القشرية

DOI:

10.3791/67078

⸱

يوليو 26, 2024

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Microbiology & Immunology, University of Saskatchewan

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية المشتركة التي تم إنشاؤها من الخلايا العصبية الأولية المعزولة من أجنة الفئران في الأيام الجنينية 15-16 والخلايا الدبقية الصغيرة الأولية المتولدة من أدمغة الفئران حديثي الولادة في أيام ما بعد الولادة 1-2.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الدبقية الصغيرة هي بلاعم مقيمة في الأنسجة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، تؤدي العديد من الوظائف التي تدعم صحة الخلايا العصبية وتوازن الجهاز العصبي المركزي. هم مجموعة كبيرة من الخلايا المناعية المرتبطة بنشاط مرض الجهاز العصبي المركزي ، واعتماد الأنماط الظاهرية التفاعلية التي من المحتمل أن تسهم في إصابة الخلايا العصبية أثناء الأمراض العصبية المزمنة مثل التصلب المتعدد (MS). لا تزال الآليات المتميزة التي تنظم بها الخلايا الدبقية الصغيرة وظيفة الخلايا العصبية والبقاء على قيد الحياة أثناء الصحة والمرض محدودة بسبب التحديات في حل التفاعلات المعقدة في الجسم الحي بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية والعوامل البيئية الأخرى في الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي ، فإن النهج في المختبر للاستزراع المشترك للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية يظل أداة قيمة لدراسة التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة. هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية والخلايا العصبية من الفئران والمشاركة في استزراعها. على وجه التحديد ، تم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة بعد 9-10 أيام في المختبر من ثقافة دبقية مختلطة تم إنشاؤها من متجانسات الدماغ المشتقة من الفئران الوليدية بين أيام ما بعد الولادة 0-2. تم عزل الخلايا العصبية من القشرة الدماغية لأجنة الفئران بين الأيام الجنينية 16-18. بعد 4-5 أيام في المختبر ، تم زرع الخلايا العصبية في 96 لوحة بئر ، تليها إضافة الخلايا الدبقية الصغيرة لتشكيل الثقافة المشتركة. يعد التوقيت الدقيق أمرا بالغ الأهمية لهذا البروتوكول حيث يحتاج كلا النوعين من الخلايا إلى الوصول إلى مرحلة النضج التجريبي لإنشاء الثقافة المشتركة. بشكل عام ، يمكن أن تكون هذه الثقافة المشتركة مفيدة لدراسة تفاعلات الخلايا العصبية الدبقية الصغيرة ويمكن أن توفر قراءات متعددة ، بما في ذلك الفحص المجهري المناعي ، والتصوير الحي ، وكذلك فحوصات الحمض النووي الريبي والبروتين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الدبقية الصغيرة هي بلاعم مقيمة في الأنسجة تسهل المراقبة المناعية والتوازن في الجهاز العصبي المركزي (CNS)1،2،3. وهي تنشأ من الخلايا السلفية لكيس الكريات الحمر التي تستعمر الدماغ أثناء التطور الجنيني4،5،6 ويتم الحفاظ عليها طوال فترة حياة الكائن الحي من خلال التجديد الذاتي ، والذي ينطوي على الانتشار وموت الخلايا المبرمج7. في الحالة المستقرة ، تشعبت الخلايا الدبقية الصغيرة أثناء الراحة وتشارك في مراقبة الأنسجة8،9،10.

تعبر الخلايا الدبقية الصغيرة عن العديد من مستقبلات سطح الخلية ، والتي تمكنها من الاستجابة السريعة للتغيرات في الجهاز العصبي المركزي11,12 وتعزيز الاستجابات الالتهابية في حالة حدوث عدوى أو إصابة الأنسجة 12,13,14 ، وكذلك أثناء الأمراض التنكسية العصبية 9,15 ، مثل التصلب المتعدد (MS)16,17. تعبر الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا عن مستقبلات لمختلف الناقلات العصبية والببتيدات العصبية18،19،20 ، مما يشير إلى أنها قد تستجيب أيضا للنشاط العصبي وتنظمه21،22. في الواقع ، تتفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية في أشكال مختلفة من الاتصال ثنائي الاتجاه 8,23 مثل التفاعلات المباشرة بوساطة بروتينات الغشاء أو التفاعلات غير المباشرة من خلال العوامل القابلة للذوبان أو الخلايا الوسيطة23,24.

على سبيل المثال ، يمكن للناقلات العصبية المختلفة التي تفرزها الخلايا العصبية تعديل النشاط العصبي أو الالتهابي للخلايا الدبقية الصغيرة25،26،27. بالإضافة إلى ذلك ، تساعد التفاعلات المباشرة بين الخلايا العصبية والدبقية الصغيرة في الحفاظ على الخلايا الدبقية الصغيرة في حالة الاستتباب28. على العكس من ذلك ، يمكن للتفاعلات المباشرة للخلايا الدبقية الصغيرة مع الخلايا العصبية تشكيل الدوائر العصبية29 والتأثير على الإشارات العصبية30،31،32. نظرا لأن اضطرابات هذه التفاعلات تحفز فرط استثارة الخلايا العصبية30 وتفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة33,34 ، فإن التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة غير المنظمة متورطة كعامل مساهم في الأمراض العصبية33,35. في الواقع ، تم وصف الأمراض الذهانية23,26 والأمراض التنكسية العصبية لإظهار تفاعلات الخلايا الدبقية الصغيرة المختلةوظيفيا 33. في حين أن هذه الملاحظات تسلط الضوء على أهمية التواصل بين الخلايا العصبية الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي ، فإن الآليات المحددة لكيفية تنظيم هذه التفاعلات للوظائف الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية في الصحة والمرض غير معروفة نسبيا.

داخل بيئة معقدة مثل الجهاز العصبي المركزي ، يمكن أن تؤثر عوامل بيئية متعددة على التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة ، مما يحد من القدرة على دراسة التفاعلات الخلوية العابرة في الجسم الحي. هنا ، نقدم نظام زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر والذي يمكن استخدامه لدراسة التفاعلات الخلوية المباشرة بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية. يصف هذا البروتوكول توليد الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية والخلايا العصبية من قشرة الفئران حديثي الولادة بين أيام ما بعد الولادة 0-2 وأيام الفئران الجنينية 16-18 ، على التوالي. ثم يتم استزراع الخلايا العصبية والدبقية الصغيرة في 96 لوحة بئر لإجراء تجارب عالية الإنتاجية في المصب. استخدمنا هذا النهج سابقا لإثبات أن البلعمة الدبقية الصغيرة تحمي الخلايا العصبية من موت الخلايا بوساطة الفوسفاتيديل كولينالمؤكسد 37 ، مما يشير إلى أن هذه الطريقة يمكن أن تساعد في فهم أدوار الخلايا الدبقية الصغيرة في سياق التنكس العصبي والتصلب العصبي المتعدد. وبالمثل ، قد تكون الثقافات المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة مفيدة أيضا للتحقيق في تأثير الحديث المتبادل بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية في سياقات أخرى مثل الالتهابات الفيروسية38 أو إصابة الخلايا العصبية وإصلاحها39. بشكل عام ، تمكن أنظمة الزراعة المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر الباحثين من دراسة التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة في بيئة قابلة للتلاعب والتحكم ، والتي تكمل النماذج في الجسم الحي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إيواء جميع المستخدمة في هذه الدراسة والتعامل معها بموافقة لجنة رعاية الجامعية (UACC) بجامعة ساسكاتشوان والمجلس الكندي لرعاية (CCAC). أيام ما بعد الولادة 0-2 CD1 تم استخدام ذكور وإناث الفئران والأيام الجنينية 16-18 (E16-18) من الفئران الحوامل CD1 لهذه الدراسة. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية

ملاحظة: من الأهمية بمكان تحديد وقت الثقافات الدبقية والعصبية المختلطة بحيث تنضج الخلايا الدبقية الصغيرة وجاهزة للحصاد في غضون 2 أيام بعد أن يتم زرع الخلايا العصبية في لوحة 96 جيدا.

  1. اعداد
    1. وسائط الاستزراع الدبقية الكاملة قبل التسخين ، والتي تشمل وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع نسبة عالية من الجلوكوز مع مصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 10٪ ، و 50 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين مع 2.92 مجم / مل من L-glutamine ، و 1 مللي متر بيروفات الصوديوم ، و 1x من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 20 mM من HEPES في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    2. أضف 5 مل من 10 ميكروغرام / مل بولي-إل-أورنيثين (PO) هيدروبروميد إلى كل دورق T-75. قم بتدوير القارورة برفق للتأكد من أن PO يغطي الجزء السفلي من القارورة بالكامل. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ لمدة 1 ساعة على الأقل.
      ملاحظة: خطوة الطلاء هذه مطلوبة لتسهيل التصاق الخلايا بقوارير T-75.
  2. عزل الأدمغة من الفئران حديثي الولادة P0-P2
    ملاحظة: تعقيم جميع أدوات التشريح والحفاظ على عقم الكواشف. ضمان الالتزام بتقنيات التعقيم طوال الوقت.
    1. قبل البدء في التشريح ، قم برش سطح العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول أو رذاذ التطهير حيث سيتم التشريح. قم بإعداد مجهر التشريح ووضع طبق بتري تحت المجهر. صب 20 مل من وسائط L-15 من Leibovitz في طبق بتري. حافظ على غطاء طبق بتري أثناء عدم استخدام المجهر لتقليل التلوث.
    2. ضع عدة طبقات من المناشف الورقية ورش المناشف الورقية جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بإعداد أدوات التشريح (مقص التشريح ، وزوج من الملقط الدقيق ، وملقط الأنسجة) عن طريق رشها جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول ووضع الأدوات على المناشف الورقية.
    3. نقل أيام ما بعد الولادة 0-2 الماوس على المناشف الورقية ورش الماوس جيدا مع الإيثانول 70 ٪. قطع رأس الماوس باستخدام مقص التشريح (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
    4. أثناء إمساك الرأس برفق ، قم بإنشاء شق خط الوسط في الجمجمة بدءا من الرقبة إلى الأنف. قشر الجمجمة مرة أخرى بملقط الأنسجة للكشف عن الدماغ.
    5. باستخدام ملقط الأنسجة ، أخرج الدماغ برفق عن طريق إدخال الملقط تحت الدماغ ورفع الدماغ من الرأس. ضع الدماغ على الفور في طبق بتري الذي يحتوي على 20 مل من وسائط ليبوفيتز L-15.
    6. تحت مجهر التشريح ، قم بإزالة جذع الدماغ والسحايا بعناية باستخدام زوج من الملقط الدقيق. اجمع الأدمغة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 5 مل من وسائط L-15 من Leibovitz.
  3. تفكك الدماغ والبذر والحفاظ على ثقافة الخلايا الدبقية المختلطة
    ملاحظة: نفذ جميع الخطوات اللاحقة في خزانة السلامة البيولوجية.
    1. فرم الأدمغة إلى حوالي 1 مم2 قطعة بشفرة مشرط معقمة يمكن التخلص منها. انقل الأدمغة المفرومة بعناية إلى أنبوب معقم جديد سعة 50 مل.
    2. إلى الأدمغة المفرومة ، أضف تركيزا نهائيا قدره 0.25٪ تربسين واحتضن الأنسجة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. كل 2-3 دقائق ، امزج المحلول عن طريق قلب الأنبوب برفق للمساعدة في تفكك الأنسجة.
    3. من حاضنة CO2 بنسبة 5٪ ، قم بنقل قوارير T-75 التي تحتوي على 5 مل من PO إلى خزانة السلامة الحيوية. تخلص من الفموي واشطف القوارير 3 مرات بمحلول عازل معقم 1x فوسفات (PBS). تأكد من شطف القوارير جيدا لأن الفموي الزائد سام للخلايا.
    4. نقل الأنسجة المهضومة من حمام مائي 37 درجة مئوية إلى خزانة السلامة الحيوية. أضف 5 مل من وسائط الاستزراع الدبقية الكاملة لتحييد التربسين. امزج معلق الأنسجة برفق باستخدام ماصة سعة 10 مل.
    5. ضع مصفاة خلية شبكية معقمة من النايلون 70 ميكرومتر على أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل وبلل الشبكة عن طريق سكب ما يقرب من 5 مل من L-15. صب بعناية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية. قم بإزالة المكبس من حقنة معقمة سعة 1 مل ، وطحن الأنسجة في الشبكة باستخدام المكبس للتخلص من كتل الأنسجة ، وتوليد تعليق خلية متجانس.
    6. بشكل دوري ، صب ما يقرب من 5 مل من وسائط L-15 من Leibovitz في شبكة النايلون 70 ميكرومتر واستمر في طحن الأنسجة على الشبكة باستخدام مكبس حقنة سعة 1 مل. عندما يبقى القليل من الأنسجة المرئية على الشبكة ، تخلص من الشبكة وضع تعليق الخلية جانبا.
    7. امزج تعليق الخلية عن طريق سحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل. لكل دورق ، أضف كميات متساوية من تعليق الخلية يحتوي على 1-2 دماغ مع وسائط زراعة الدبقية إلى حجم نهائي يبلغ 15 مل.
    8. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ طوال الليل. في اليوم التالي ، اغسل القوارير مرتين باستخدام 1x PBS المعقم لإزالة الخلايا غير المتصلة والحطام.
    9. أضف 15 مل من وسائط الاستزراع الدبقية الكاملة الطازجة إلى الاستزراع واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪. بعد 3 أيام، قم بتغيير نصف الوسائط باستخدام 10 مل من وسائط الاستزراع الدبقية الطازجة مع 40 نانوغرام/مل من عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (MCSF).
      ملاحظة: بعد ذلك، يستعاض عن نصف الوسائط ب 10 مل من وسائط الاستزراع الدبقي الطازجة مع استكمال 40 نانوغرام/مل من MCSF كل 3 أيام. يتم الحفاظ على الثقافة لمدة 8-10 أيام قبل حصاد الخلايا الدبقية الصغيرة.

2. ثقافة الخلايا العصبية الأولية

  1. اعداد
    1. ذوبان الجليد B-27 زائد الملحق من B-27 بالإضافة إلى نظام الثقافة العصبية. ما قبل التسخين العصبي القاعدي بالإضافة إلى الوسط من B-27 بالإضافة إلى نظام الثقافة العصبية ، 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ، ومصل بقري الجنين المعطل بالحرارة (FBS) عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    2. قم بتغطية قوارير T-25 ب 5 مل من 10 ميكروغرام / مل PO واحتضان القوارير لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 37 درجة مئوية. إعداد الأدوات واللوازم للتشريح.
      ملاحظة: تسهل خطوة الطلاء هذه التصاق الخلايا بقوارير T-25.
  2. عزل الدماغ عن أجنة الفئران E16-E18
    ملاحظة: تعقيم جميع أدوات التشريح والحفاظ على عقم الكواشف. ضمان الالتزام بتقنيات التعقيم طوال الوقت.
    1. قبل البدء في التشريح ، قم برش سطح العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول أو رذاذ التطهير حيث سيتم التشريح. قم بإعداد مجهر التشريح ووضع طبق بتري تحت المجهر. صب 20 مل من 1x HBSS في طبق بتري. حافظ على غطاء طبق بتري أثناء عدم استخدام المجهر لتقليل التلوث.
    2. ضع عدة طبقات من المناشف الورقية ورش المناشف الورقية جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بإعداد أدوات التشريح (مقص زنبركي ، وزوج من الملقط الدقيق ، وملقط الأنسجة) عن طريق رشها جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول ووضع الأدوات على المناشف الورقية.
    3. تخدير الفأر الحامل بين أيام الحمل 16-18 باستخدام الأيزوفلوران والقتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
    4. ضع الماوس على ظهره على قطعة من منشفة ورقية مبللة بالإيثانول بنسبة 70٪. تطهير منطقة البطن مع 70 ٪ من الإيثانول. ارفع جلد أسفل البطن بملقط الأنسجة وقم بإجراء شق على شكل حرف V من هذه النقطة إلى القفص الصدري السفلي بمقص تشريح.
    5. أمسك قرون الرحم التي تحتوي على الأجنة بملقط الأنسجة وقم بإزالة الأجنة برفق من تجويف البطن. تطهير لفترة وجيزة قرون الرحم التي تحتوي على الأجنة مع الإيثانول 70 ٪.
    6. تشريح جنين واحد من كيسه الفردي في وقت واحد. باستخدام مقص الربيع ، قم بإنشاء شق خط الوسط في الجزء العلوي من الجمجمة ، بدءا من الجزء الخلفي من الرقبة إلى الأنف. ثم ارفع الجمجمة بعيدا عن موقع الشق للكشف عن الدماغ. استخرج الدماغ برفق باستخدام ملقط الأنسجة وانقل الدماغ إلى طبق بتري 10 سم يحتوي على 15 مل من 1x HBSS.
    7. تحت مجهر التشريح ، قم بإزالة جذع الدماغ والسحايا بعناية على جانبي قشرة الدماغ باستخدام زوج من الملقط الدقيق. انقل قشرة الدماغ إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من 1x HBSS وضعه على الجليد.
  3. تفكك الدماغ وبذر الخلايا العصبية القشرية في زراعة الخلايا
    ملاحظة: نفذ جميع الخطوات اللاحقة في خزانة السلامة البيولوجية.
    1. فرم الأدمغة إلى حوالي 1 مم2 قطعة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل بشفرة مشرط معقمة يمكن التخلص منها. انقل الأدمغة المفرومة إلى أنبوب مخروطي معقم جديد سعة 50 مل.
    2. أضف التربسين إلى الأنبوب بتركيز نهائي قدره 0.25٪. اغمر الأنبوب في حمام ماء ساخن 35-38 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة واخلط الأنبوب برفق لتجانس الأنسجة كل 2-3 دقائق.
    3. أخرج الأنبوب من حمام الماء الساخن. قم بسحب معلق الأنسجة برفق لأعلى ولأسفل لمزيد من فصل الخلايا ، ثم أضف 0.5 مل من FBS المعطل بالحرارة إلى التعليق المتجانس لتحييد نشاط التربسين. تجنب فقاعات الهواء لتقليل السمية للخلايا العصبية.
    4. ضع مصفاة خلية شبكية معقمة من النايلون 70 ميكرومتر على أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل وبلل الشبكة بإضافة ما يقرب من 5 مل من الوسائط العصبية القاعدية. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلايا الشبكية المصنوعة من النايلون 70 ميكرومتر. باستخدام مكبس حقنة سعة 1 مل ، قم بطحن الأنسجة برفق في مصفاة الخلية. صب بشكل دوري حوالي 5 مل من 1x HBSS مع الاستمرار في الطحن لغسل مصفاة الخلية.
    5. جهاز طرد مركزي الأنبوب المخروطي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. خلال هذا الوقت ، قم بتخفيف مكمل B-27 plus في الوسائط العصبية القاعدية بالإضافة إلى التركيز النهائي 1x لاستخدامه كوسائط عصبية قاعدية كاملة.
    6. تخلص من PO في قوارير T-25 واشطف القوارير ثلاث مرات باستخدام 5 مل من 1x PBS.
    7. صب بعناية لإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية عن طريق سحب 2-3 مل من الوسائط العصبية القاعدية الكاملة لأعلى ولأسفل برفق. حدد تركيز الخلية وإجمالي عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم وأزرق التريبان. توقع ما يصل إلى 1.0 × 107 خلايا لكل جنين.
    8. صفيحة الخلايا في قوارير T-25 المغلفة ب PO مع ما يقرب من 2.0 × 107 خلايا لكل قارورة في 5 مل من الوسائط العصبية القاعدية الكاملة. احتضان زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
    9. قم بإجراء تغيير نصف الوسائط كل 2-3 أيام عن طريق استبدال 2.5 مل من الوسائط من قارورة الثقافة بوسائط عصبية قاعدية كاملة طازجة.

3. الثقافة المشتركة للخلايا العصبية الأولية والخلايا الدبقية الصغيرة

ملاحظة: يجب القيام بجميع الخطوات اللاحقة في خزانة معقمة للسلامة الأحيائية.

  1. زرع الخلايا العصبية في 96 لوحة بئر
    1. أضف 100 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل PO لكل بئر واحتضان القوارير لمدة 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية لتغطية الآبار ب PO. اغسل اللوحة ب 1x PBS 3 مرات قبل بذر الخلايا واستنشاق أي سائل متبقي بعد الغسيل الأخير.
    2. يتم حصاد الخلايا العصبية المزروعة في قوارير T-25 للثقافة المشتركة بعد 2-5 أيام في الثقافة. استبدل الوسائط ب 5 مل من محلول Versene 1x مع 0.25٪ تربسين و 1 مجم / مل DNase I لفصل الخلايا العصبية عن القارورة. ضع القوارير داخل الحاضنة لمدة 5-6 دقائق للهضم وقم بتدوير القارورة برفق كل 2-3 دقائق للمساعدة في انفصال الخلايا.
    3. أخرج القارورة من الحاضنة وتحقق مما إذا كانت الخلايا منفصلة تحت المجهر. أضف 0.5 مل من FBS المعطل بالحرارة لتحييد التربسين و DNase I. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. اغسل القارورة ب 5 مل من الوسائط العصبية القاعدية الكاملة مرة واحدة لزيادة الخلايا العصبية المجمعة. اجمع كل الخلايا في نفس الأنبوب المخروطي سعة 15 مل.
    4. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق في 2-3 مل من الوسائط العصبية القاعدية الكاملة.
    5. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وأضف وسائط عصبية قاعدية كاملة لتحقيق تركيز نهائي قدره 7.5 × 105 خلايا عصبية / مل. قم بزرع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر في لوحة 96 بئرا المطلية ب PO للحصول على 7.5 × 104 خلايا عصبية / بئر. من المتوقع أن ينتج 5-6 ملايين خلية عصبية لكل قارورة.
    6. احتضان الخلايا العصبية في لوحة 96 بئرا بين عشية وضحاها. أضف 100 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية الكاملة إلى كل بئر في اليوم التالي.
      ملاحظة: بمجرد أن تظهر الخلايا العصبية نموا مناسبا لعملية الخلايا العصبية (حوالي اليوم 3-4 بعد البذر في 96 صفيحة جيدة) ، فإنها تكون جاهزة للاستزراع المشترك مع الخلايا الدبقية الصغيرة.
  2. العزلة والثقافة المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة
    1. بين 8-10 أيام من زراعة الخلايا الدبقية المختلطة ، اجمع الخلايا الدبقية الصغيرة عن طريق غسل قوارير T-75 برفق باستخدام وسائط استزراع الدبقية في كل قارورة باستخدام ماصة سعة 10 مل ، ونقل الخلايا والوسائط إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. اغسل القوارير مرة أخرى باستخدام وسائط استزراع الدبقية الطازجة سعة 10 مل لفصل الخلايا الدبقية الصغيرة الإضافية عن القوارير وجمع الوسائط. من المتوقع أن يكون العائد 7.5 × 105 الخلايا الدبقية الصغيرة لكل قارورة.
    2. أضف 20 مل من وسائط الاستزراع الدبقية الطازجة المكملة ب 20 نانوغرام / مل MCSF لكل دورق. يمكن حصاد الخلايا الدبقية الصغيرة مرة أو مرتين أكثر إذا تم الحفاظ على ثقافة الدبقية المختلطة.
    3. جهاز طرد مركزي لجمع الخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات برفق في 2 مل من الوسائط العصبية القاعدية الكاملة.
    4. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم والتريبان الأزرق. أضف وسائط عصبية قاعدية كاملة إلى تركيز نهائي قدره 2.5 × 105 خلايا / مل.
    5. من صفيحة الثقافة العصبية المكونة من 96 بئرا ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية وأضف 100 ميكرولتر من 2.5 × 105 خلايا / مل تعليق خلية إلى البذور 2.5 × 104 الخلايا الدبقية الصغيرة لكل بئر من 7.5 × 104 الخلايا العصبية. احتضان المزرعة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ للسماح للخلايا الدبقية الصغيرة بالاستقرار. يمكن الآن استخدام الثقافة المشتركة للتجارب النهائية.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر مخطط انسيابي يوضح الخطوات الرئيسية لثقافة الخلايا الدبقية المختلطة للخلايا الدبقية الصغيرة في الشكل 1 أ. بشكل عام ، من المتوقع وجود خلايا متناثرة وحطام خلوي مفرط في اليوم الأول (الشكل 1 ب). بحلول اليوم 4 ، يجب ملاحظة زيادة عدد الخلايا ، خاصة مع توليد الخلايا النجمية الملتصقة ، كما يتضح من مورفولوجيتها الممدودة (الشكل 1C). يمكن ملاحظة عدد قليل من الخلايا الدبقية الصغيرة فوق الخلايا النجمية أو كخلايا مستديرة صغيرة تطفو في الوسائط. بحلول اليوم 8 ، ستشكل طبقة متقاربة من الخلايا النجمية الطبقات الملتصقة بالخلايا ، بينما ستظهر الخلايا الدبقية الصغيرة كخلايا مستديرة ومشرقة شبه متصلة بالخلايا النجمية أو تطفو في الوسائط (الشكل 1 د). إذا كانت كثافة الخلايا الدبقية الصغيرة منخفضة بحلول اليوم 8 ، فقد يتم تحضين الثقافة لأيام إضافية قبل الحصاد.

يوضح الشكل 2 أ مخططا انسيابيا يوضح الخطوات الرئيسية للمزرعة العصبية. في الثقافة الصحية ، سوف تلتصق الخلايا العصبية وتشكل عمليات عصبية بعد 1-3 أيام في المختبر (الشكل 2 ب). وبالمثل ، عند زرع الخلايا العصبية في صفيحة 96 بئرا ، ستظهر مستديرة في البداية ، ولكن بحلول اليوم 3 ، يجب أن تصبح الخلايا العصبية ملتصقة وتشكل عمليات عصبية تتصل بالخلايا العصبية المجاورة (الشكل 2C). على العكس من ذلك ، ستحتوي مزارع الخلايا العصبية غير الصحية على كتل خلوية وحطام خلوي ، والتي يمكن أن تنجم عن نقص تفكك الخلايا أو سوء التعامل مع الخلايا العصبية (الشكل 2 د).

يوضح الشكل 3 أ مخططا انسيابيا يوضح الخطوات الرئيسية لبروتوكول الزراعة المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة. بعد إضافة 2.5 × 104 الخلايا الدبقية الصغيرة إلى 7.5 × 104 الخلايا العصبية ، يجب أن تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة المستديرة والكبيرة في الأعلى أو بين الخلايا العصبية والعمليات العصبية (الشكل 3 ب). لمزيد من التصور للثقافة المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة ، تم تمييز الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية وحدها أو في الثقافة المشتركة بجزيء محول ربط الكالسيوم المتأين 1 (IBA-1 ، أحمر) وتوبولين βIII (TUJ1 ، أخضر) الأجسام المضادة37 للفحص المجهري المناعي (الشكل 3C-F).

عملية زراعة الخلايا: تعليق خلية واحدة من قشرة الفئران. الخطوات الموضحة في الرسم التخطيطي ؛ صور مجهرية.
الشكل 1: نظرة عامة على زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية. (أ) مخطط انسيابي للخطوات الرئيسية في توليد ثقافة الخلايا الدبقية المختلطة. (ب-د) صور مجهرية تمثيلية ساطعة المجال 10x لثقافة الدبقية المختلطة في اليوم 1 (ب) واليوم 4 (ج) واليوم 8 (د). قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخطط عملية الثقافة العصبية. تحضير الخلايا الجنينية للفأر والتصوير في T25 ، لوحات 96 بئرا.
الشكل 2: نظرة عامة على زراعة الخلايا العصبية الأولية. أ: مخطط انسيابي للخطوات الرئيسية في توليد الخلايا العصبية. (ب) صور مجهرية تمثيلية ساطعة المجال 10x تظهر الخلايا العصبية المزروعة في قوارير T-25. (ج) مجهر مجال ساطع 10 أضعاف من الخلايا العصبية المزروعة في صفيحة مكونة من 96 بئرا. د: مجهر مجال ساطع 10 أضعاف لمجموعة عصبية غير صحية في صفيحة مكونة من 96 بئرا. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

سير عمل عزل الخلايا الدبقية الصغيرة وتحليل الفحص المجهري. تعرض صور التألق المناعي علامات خلوية.
الشكل 3: نظرة عامة على الثقافة المشتركة بين الخلايا الدبقية الصغيرة. (أ) مخطط انسيابي للخطوات الرئيسية للاستزراع المشترك بين الخلايا الدبقية الصغيرة. (ب) صور مجهرية تمثيلية ساطعة المجال 10 مرات للثقافة المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة في 96 لوحة بئر. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. (C ، D) صور مجهرية مناعية تمثيلية للخلايا العصبية وحدها (C) ، الخلايا الدبقية الصغيرة وحدها (D) ، اليوم 2 للخلايا العصبية وزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة (E) ، أو 12 يوما من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة (F) في لوحة 96 بئرا. يتم تمييز الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية ب IBA-1 (أحمر) وتوبولين βIII (أخضر) ، على التوالي. النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). تم الحصول على صور التألق المناعي باستخدام هدف غمر الماء 25x ، 0.8 NA باستخدام مجهر مضان واسع المجال. قضبان المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة بروتوكولا لعزل وزراعة الخلايا العصبية الأولية للفأر والدبقية الصغيرة الأولية ، والتي تستخدم لاحقا لإنشاء ثقافة مشتركة بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية يمكن استخدامها لدراسة كيفية تنظيم تفاعلات الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية لصحتها الخلوية ووظيفتها. يمكن أن يوفر هذا النهج البسيط نسبيا والذي يمكن الوصول إليه رؤى مهمة حول الآليات والنتائج الوظيفية لتفاعلات الخلايا العصبية الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي.

لتحقيق ثقافة مشتركة مثالية ، تتطلب العديد من الجوانب الحاسمة في هذا البروتوكول عناية إضافية. أثناء عزل الدماغ (الخطوتان 1.2.6 و 2.2.7) ، يجب إزالة السحايا العالقة على سطح كل من الأدمغة الجنينية وما بعد الولادة تماما قبل جمع الأنسجة. مثل بروتوكولات الغراء العصبي الأخرى ، قد تؤدي الإزالة غير الكاملة للسحايا إلى تلوث زراعة الخلايا بالخلايا البطانية أو الخلايا المشتقة من الدم40،41،42. بالإضافة إلى ذلك ، عند زراعة الخلايا العصبية الأولية (الخطوتان 2.3.7 و 3.1.4) ، من الضروري إنشاء تعليق أحادي الخلية وتجنب كتل الخلايا قبل زرع الخلايا العصبية في قوارير أو 96 صفيحة بئر. لن تلتصق المجاميع العصبية بشكل صحيح في الثقافة وستؤدي إلى إجهاد عصبي مفرط وموت الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي العلاج الموسع للخلايا العصبية باستخدام التربسين عند محاولة فصلها عن قوارير T-25 إلى موت الخلايا غير المرغوب فيه (الخطوة 3.1.2). للتخفيف من ذلك ، يمكن زرع الخلايا العصبية مباشرة في 96 لوحة بئر بكثافة الخلايا المطلوبة بعد الانفصال عن الأدمغة الجنينية (الخطوة 2.3.7). علاوة على ذلك ، في هذا البروتوكول ، تم اختيار نسبة الخلايا العصبية 3: 1: microglia لتمثل جزئيا كمية مرتفعة من الخلايا الدبقية الصغيرة التي قد تكون موجودة في البيئة المكروية للجهاز العصبي المركزي أثناء الالتهاب العصبي. بدلا من ذلك ، يمكن تعديل نسبة الخلايا في الثقافة المشتركة حسب الحاجة التجريبية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تمديد النقطة الزمنية المحددة للخلايا العصبية المشتركة إذا كان المرء يهدف إلى تقييم الحالات العصبية الأكثر نضجا.

والجدير بالذكر أنه عند فصل الخلايا العصبية من قوارير T-25 إلى 96 صفيحة بئر ، فإن استخدام التربسين وحده قد يؤدي إلى تفكك غير كامل وتشكيل كتل خلوية بدلا من ثقافة أحادية الطبقة في 96 لوحة بئر (الشكل 2D). لمعالجة هذه المشكلة ، يمكن فصل الخلايا العصبية عن قارورة T-25 باستخدام محلول Versene 1x يحتوي على 1 مجم / مل DNase I. تشمل العوامل الأخرى التي تساهم في تراكم الخلايا العصبية وتقليل الصلاحية التثليج غير الكامل لتعليق الخلية ، أو عدم كفاية تحييد التربسين باستخدام FBS المعطل بالحرارة ، أو الطرد المركزي المفرط ، أو تكوين حبيبات الخلايا لفترات طويلة. لذلك ، فإن ضمان تفكك الأنسجة السليم وتوليد تعليق خلية واحدة أمر بالغ الأهمية لإنشاء ثقافة صحية للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية.

يهدف هذا البروتوكول إلى تلخيص التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة في المختبر لفهم الأهمية الوظيفية لتفاعلاتها في الجهاز العصبي المركزي بشكل أفضل. في حين تم تطوير أنواع أخرى من أنظمة الاستزراع المشترك ، مثل زراعة مجموعات الخلايا الفردية على أسطح مختلفة للسماح بالعلاج المستقل لمجموعتين من الخلايا43,44 ، يتيح نظام الثقافة المختلطة هذا الاتصال المباشر والوثيق للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك ، عند الحفاظ عليه بشكل صحيح من خلال نصف تغييرات الوسائط كل 3 أيام ، يمكن أن يظل نظام الثقافة المختلطة هذا صحيا من 12 يوما (الشكل 3F) إلى 3 أسابيع محتملة ، مما يسمح بإجراء دراسات طويلة الأجل لتفاعلات الخلايا العصبية الصغيرة45.

في حين أن البساطة النسبية لنظام الاستزراع المشترك مفيدة لإمكانية الوصول ، فإن أحد القيود الرئيسية لهذا النهج هو أن ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد لا تمثل بشكل كامل بيئة أنسجة الجهاز العصبي المركزي. في الواقع ، يظهر أن الثقافة الثلاثية للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية والخلايا النجمية تحاكي الاستجابة الالتهابية العصبية في الجسم الحي بشكل أكثر موثوقية من الخلايا الدبقية الصغيرة أو الثقافة المشتركة للخلايا العصبية النجمية46,47. علاوة على ذلك ، فإن التطورات الأخيرة في أنظمة الدماغ العضوية مع الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الدبقية الأخرى ، بما في ذلك الخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن ، هي أكثر ملاءمة لدراسة بنية الأنسجة ثلاثية الأبعاد (3D) وتفاعلات الجهاز العصبي المركزي48. وبالمثل ، يظهر نظام الزراعة ثلاثية الأبعاد البشري 3D الذي يضم الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية فعالا في نمذجة حالة مرض الزهايمر49. قد تكون الثقافات المشتركة الأخرى للخلايا الدبقية الصغيرة البشرية أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية بدراسات الأمراض التنكسية العصبية. على سبيل المثال ، قد تكون الثقافة المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية الحركية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان50 مفيدة لدراسة أمراض مثل التصلب الجانبي الضموري51. ومع ذلك ، نظرا للوفرة النسبية والتكلفة المنخفضة لتوليد الخلايا العصبية الأولية والدبقية الصغيرة من الفئران ، فإن تقييم الثقافة المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة في 96 بئرا يمكن أن يكون نهجا عالي الإنتاجية لدراسة الآليات والآثار الوظيفية للتفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة. قد تشمل المقايسات النهائية استخدام التصوير الخلوي الحي لتحديد التغيرات الوظيفية الخلوية في الوقت الفعلي ، وتسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد تغيرات النسخ الخلوي ، والفحص المجهري المناعي لتحديد تغيرات النمط الظاهري الخلوي ، وقياس الطيف الكتلي لتحديد التغيرات الخلوية والبروتينية ، أو مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم واللطخة الغربية لقياس البروتين المفرز في المادة الطافية للثقافة المشتركة.

نظرا لأن الخلايا الدبقية الصغيرة هي وسطاء مهمون لصحة الجهاز العصبي المركزي وأمراضه ، يمكن أيضا استخدام هذه الثقافة المشتركة للتحقيق في تأثير الجزيئات والمركبات المرتبطة بالمرض على الاتصال ثنائي الاتجاه بين الخلايا الدبقية الصغيرة. في سياق مرض التصلب العصبي المتعدد ، قد تلعب الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة دورا مدمرا ، مما يساهم في تفاقم علم الأمراض52,53. على سبيل المثال ، قد تفرز السيتوكينات المؤيدة للالتهابات وأنواع الأكسجين التفاعلية ، وكذلك تعزيز تنشيط الخلايا النجمية45. قد يساعد هذا البروتوكول في زيادة استجواب الدور الضار للخلايا الدبقية الصغيرة من خلال علاج الخلايا الدبقية الصغيرة في الثقافة المشتركة مع السيتوكينات الالتهابية الموجودة في مرض التصلب العصبي المتعدد وتقييم نتائج صحة الخلايا العصبية. بدلا من ذلك ، تم استخدام هذه الثقافة المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة لإظهار التأثير الوقائي للخلايا الدبقية الصغيرة على الخلايا العصبية استجابة للفوسفاتيديل كولين المؤكسد ، وهو منتج مؤكسد تم اكتشافه في MS54. علاوة على ذلك ، فإن موت الخلايا المبرمج العصبي يعيد تشكيل التعبير الجيني للخلايا الدبقية الصغيرة أثناء التطور من خلال تعزيز بقاء الخلايا الدبقية الصغيرة والبلعمة55. لذلك ، قد يساعد هذا البروتوكول أيضا في تحديد تأثير موت الخلايا العصبية على النمط الظاهري للخلايا الدبقية الصغيرة ووظيفتها.

باختصار ، يصف هذا البروتوكول توليد وزراعة الخلايا العصبية الأولية المشتقة من الفئران والخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر. يمكن أن تكون الثقافة المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة التي تم إنشاؤها في 96 بئرا نهجا عالي الإنتاجية لاستجواب آليات ووظيفة تفاعلات الخلايا الدبقية الصغيرة مع الخلايا العصبية في سياق صحة الجهاز العصبي المركزي ومرضه ، بما في ذلك مرض التصلب العصبي المتعدد.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر JP بدعم التمويل من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا وكلية الطب بجامعة ساسكاتشوان. تقر YD بدعم التمويل المقدم من صندوق بدء التشغيل لكلية الطب بجامعة ساسكاتشوان ، ومنحة اكتشاف مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (RGPIN-2023-03659) ، ومنحة MS Canada Catalyst (1019973) ، ومنحة مؤسسة ساسكاتشوان للبحوث الصحية (6368) ، ومنحة قادة المستقبل لمؤسسة Brain Canada في منحة أبحاث الدماغ الكندية. تم إنشاء الشكل 1 أ والشكل 2 أ والشكل 3 أ باستخدام BioRender.com.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق بتري 10 سم  فيشر 07-202-011معقم
1x VerseneGibco15040-066
B-27 Plus نظام الثقافة العصبية  Gibco A3653401
مجهر تشريحVWR
DNase IRoche11284932001
Dulbecco ' s معدل النسر المتوسط (DMEM)Gibco11960-044
مصل الأبقار الجنينية ThermoFisher Sci12483-020
HBSS (10x)Gibco14065-056
مقياس الدمHausser Scientific1475
HEPES   ؛ThermoFisher Sci15630080
Leibovitz' s L-15 متوسط (1x) فيشرالعلمي   ؛21083027
عامل تحفيز مستعمرة البلاعم  Peprotech315-02
Micro-CorpsRWDF11020-11
أحماض أمينية غير أساسيةCytivaSH3023801
PBS (10x)ThermoFisher SciAM9625
البنسلين ستربتومايسين الجلوتامين (100x)Gibco103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide   ؛SigmaP3655-100MG
بيروفات الصوديوم (100 ملم) مقصزنبركي Gibco11360-070
RWDS11008-42
ريشة شفرة جراحية08-916-5D
قوارير معقمة T-25فيشر10-126-9
قوارير T-75   ؛فيشر13-680-65
ملقط الأنسجةCodman30-4218معقمة / معقمة
RWDS12052-10معقم / معقم
تريبان أزرق   ؛Thermofisher Sci 15250-061
التربسين (2.5٪)ThermoFisher Sci15090046
مجهر التألق المناعيواسع المجال Zeiss
معقمة / معقمة معقمة / معقمة مقص مناديل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. J Immunol Res. 2017, 1-12 (2017).
  2. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  3. Ginhoux, F., Prinz, M. Origin of microglia: Current concepts and past controversies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (8), a020537(2015).
  4. Dermitzakis, I., et al. Origin and emergence of microglia in the CNS-an interesting (hi)story of an eccentric cell. Curr Issues Mol Biol. 45 (3), 2609-2628 (2023).
  5. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  6. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  7. Askew, K., et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 18 (2), 391-405 (2017).
  8. Vidal-Itriago, A., et al. Microglia morphophysiological diversity and its implications for the CNS. Front Immunol. 13, 997786(2022).
  9. Wendimu, M. Y., Hooks, S. B. Microglia phenotypes in aging and neurodegenerative diseases. Cells. 11 (13), 2091(2022).
  10. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  11. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  12. Zhao, J. F., et al. Research progress on the role of microglia membrane proteins or receptors in neuroinflammation and degeneration. Front Cell Neurosci. 16, 831977(2022).
  13. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The role of microglia in central nervous system immunity and glioma immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
  14. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198(2020).
  15. Doens, D., Fernández, P. L. Microglia receptors and their implications in the response to amyloid β for Alzheimer's disease pathogenesis. J Neuroinflammation. 11 (1), 48(2014).
  16. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  17. Fischer, M. T., et al. NADPH oxidase expression in active multiple sclerosis lesions in relation to oxidative tissue damage and mitochondrial injury. Brain. 135 (3), 886-899 (2012).
  18. Marinelli, S., Basilico, B., Marrone, M. C., Ragozzino, D. Microglia-neuron crosstalk: Signaling mechanism and control of synaptic transmission. Semin Cell Dev Biol. 94, 138-151 (2019).
  19. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  20. Carniglia, L., et al. Neuropeptides and microglial activation in inflammation, pain, and neurodegenerative diseases. Mediators Inflamm. 2017, 5048616(2017).
  21. Zhao, S., Umpierre, A. D., Wu, L. J. Tuning neural circuits and behaviors by microglia in the adult brain. Trends Neurosci. 47 (3), 181-194 (2024).
  22. Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: New roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
  23. Haidar, M. A., et al. Crosstalk between microglia and neurons in neurotrauma: An overview of the underlying mechanisms. Curr Neuropharmacol. 20 (11), 2050-2065 (2022).
  24. Cserép, C., Pósfai, B., Dénes, Á Shaping neuronal fate: Functional heterogeneity of direct microglia-neuron interactions. Neuron. 109 (2), 222-240 (2021).
  25. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  26. Eyo, U. B., Wu, L. J. Bidirectional microglia-neuron communication in the healthy brain. Neural Plast. 2013, 456857(2013).
  27. Strosznajder, J. B., Czapski, G. A. Glutamate and GABA in microglia-neuron cross-talk in Alzheimer's disease. Int J Mol Sci. 22 (21), 11677(2021).
  28. Lyons, A., et al. CD200 ligand-receptor interaction modulates microglial activation in vivo and in vitro A role for IL-4. J Neurosci. 27 (31), 8309-8313 (2007).
  29. Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: Actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends Neurosci. 36 (4), 209-217 (2013).
  30. Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nat Neurosci. 24 (1), 19-23 (2021).
  31. Chen, Z., et al. Microglial displacement of inhibitory synapses provides neuroprotection in the adult brain. Nat Commun. 5 (1), 4486(2014).
  32. Cantaut-Belarif, Y., et al. Microglia control the glycinergic but not the GABAergic synapses via prostaglandin E2 in the spinal cord. J Cell Biol. 216 (9), 2979-2989 (2017).
  33. Szepesi, Z., Manouchehrian, O., Bachiller, S., Deierborg, T. Bidirectional microglia-neuron communication in health and disease. Front Cell Neurosci. 12, 323(2018).
  34. Chamera, K., Trojan, E., Szuster-Głuszczak, M., Basta-Kaim, A. The potential role of dysfunctions in neuron-microglia communication in the pathogenesis of brain disorders. Curr Neuropharmacol. 18 (5), 408-430 (2020).
  35. Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: Mechanism and potential therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 359(2023).
  36. Brisch, R., et al. The role of microglia in neuropsychiatric disorders and suicide. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 272 (6), 929-945 (2022).
  37. Dong, Y., et al. Oxidized phosphatidylcholines found in multiple sclerosis lesions mediate neurodegeneration and are neutralized by microglia. Nat Neurosci. 24 (4), 489-503 (2021).
  38. Alvarez-Carbonell, D., et al. Cross-talk between microglia and neurons regulates HIV latency. PLoS Pathog. 15 (12), e1008249(2019).
  39. Lorenzen, K., et al. Microglia induce neurogenic protein expression in primary cortical cells by stimulating PI3K/AKT intracellular signaling in vitro. Mol Biol Rep. 48 (1), 563-584 (2021).
  40. Güler, B. E., Krzysko, J., Wolfrum, U. Isolation and culturing of primary mouse astrocytes for the analysis of focal adhesion dynamics. STAR Protoc. 2 (4), 100954(2021).
  41. Tomassoni-Ardori, F., Hong, Z., Fulgenzi, G., Tessarollo, L. Generation of functional mouse hippocampal neurons. Bio Protoc. 10 (15), e3702(2020).
  42. Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2.7), (2006).
  43. Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-culture of neurons and microglia. Curr Protoc Toxicol. 74, 11.24.1-11.24.17 (2017).
  44. Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 155(2020).
  45. Carroll, J. A., Foliaki, S. T., Haigh, C. L. A 3D cell culture approach for studying neuroinflammation. J Neurosci Methods. 358, 109201(2021).
  46. Baxter, P. S., et al. Microglial identity and inflammatory responses are controlled by the combined effects of neurons and astrocytes. Cell Rep. 34 (12), 108882(2021).
  47. Luchena, C., et al. A neuron, microglia, and astrocyte triple co-culture model to study Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci. 14, 844534(2022).
  48. Park, J., et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 21 (7), 941-951 (2018).
  49. Vahsen, B. F., et al. Human iPSC co-culture model to investigate the interaction between microglia and motor neurons. Sci Rep. 12 (1), 12606(2022).
  50. Giacomelli, E., et al. Human stem cell models of neurodegeneration: from basic science of amyotrophic lateral sclerosis to clinical translation. Cell Stem Cell. 29 (1), 11-35 (2022).
  51. Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
  52. Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: relationship to neurodegeneration and therapeutics. J Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).
  53. Dong, Y., Lozinski, B. M., Silva, C., Yong, V. W. Studying the microglia response to oxidized phosphatidylcholine in primary mouse neuron culture and mouse spinal cord. STAR Protoc. 2 (4), 100853(2021).
  54. Anderson, S. R., et al. Neuronal apoptosis drives remodeling states of microglia and shifts in survival pathway dependence. eLife. 11, e76564(2022).
  55. Harry, G. J., McPherson, C. A. Microglia: Neuroprotective and neurodestructive properties. Handbook of Neurotoxicity. , 109-132 (2014).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA

مقالات ذات صلة