مقالة منهجية

نموذج في المختبر يدمج صلابة الركيزة وتدفقها لدراسة استجابات الخلايا البطانية

DOI:

10.3791/67081

⸱

يوليو 19, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Chemical Engineering Department, Northeastern University, 2Bioengineering Department, Northeastern University, 3Laboratoire de BioMécanique et BioIngénierie (BMBI), UMR CNRS, Sorbonne Universités, Université de Technologie of Compiègne (UTC), 4Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 5Neuroscience Department, Albert Einstein College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتصنيع وتوصيف ركيزة قائمة على الجيلاتين قابلة للضبط لزراعة الخلايا البطانية الوعائية (ECs) في ظل ظروف تدفق الأوعية الدموية ذات الصلة. يكرر سطح المحاكاة الحيوية هذا كلا من الحالات الفسيولوجية والمرضية ، مما يتيح دراسة القوى الميكانيكية على سلوك EC وتعزيز فهمنا لصحة الأوعية الدموية وآليات المرض.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم نموذجا مبتكرا في المختبر يهدف إلى التحقيق في الآثار المشتركة لصلابة الأنسجة وإجهاد القص على وظيفة الخلايا البطانية (EC) ، والتي تعتبر ضرورية لفهم صحة الأوعية الدموية وظهور أمراض مثل تصلب الشرايين. تقليديا ، استكشفت الدراسات تأثيرات إجهاد القص وصلابة الركيزة على ECs ، بشكل مستقل. ومع ذلك ، يجمع هذا النظام المتكامل بين هذه العوامل لتوفير محاكاة أكثر دقة للبيئة الميكانيكية للأوعية الدموية. الهدف هو فحص النقل الميكانيكي EC عبر مستويات تصلب الأنسجة المختلفة وظروف التدفق باستخدام ECs البشرية. نقوم بتفصيل بروتوكول توليف الهلاميات المائية الجيلاتين ميثاكريلات (GelMA) مع صلابة قابلة للضبط وبذرها مع ECs لتحقيق التقارب. بالإضافة إلى ذلك ، نصف تصميم وتجميع غرفة تدفق فعالة من حيث التكلفة ، تكملها محاكاة ديناميكيات الموائع الحسابية ، لتوليد ظروف تدفق فسيولوجية تتميز بالتدفق الصفحي ومستويات إجهاد القص المناسبة. يتضمن البروتوكول أيضا وضع العلامات الفلورية للفحص المجهري متحد البؤر ، مما يتيح تقييم استجابات EC لكل من امتثال الأنسجة وظروف التدفق. من خلال إخضاع ECs المستزرعة لمحفزات ميكانيكية متكاملة متعددة ، يتيح هذا النموذج إجراء تحقيقات شاملة في كيفية تأثير عوامل مثل ارتفاع ضغط الدم والشيخوخة على وظيفة EC وأمراض الأوعية الدموية بوساطة EC. ستكون الأفكار المكتسبة من هذه التحقيقات مفيدة في توضيح الآليات الكامنة وراء أمراض الأوعية الدموية وفي تطوير استراتيجيات علاج فعالة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب البطانة ، التي تبطن السطح الداخلي للأوعية الدموية ، دورا محوريا في الحفاظ على صحة الأوعية الدموية. تعتبر الخلايا البطانية (ECs) أساسية لتنظيم وظائف القلب والأوعية الدموية المختلفة ، بما في ذلك التحكم في نغمة الأوعية الدموية ، والنفاذية الانتقائية ، والإرقاء ، والنقل الميكانيكي1،2. ربطت الأبحاث بقوة بين ضعف المفوضية الأوروبية والدور الأساسي في تطور تصلب الشرايين. والجدير بالذكر أن ECs تواجه قوى ميكانيكية متنوعة في الواجهات حيث تتفاعل مع تدفق الدم وأنسجة الأوعية الدموية الأساسية 3,4. ربطت العديد من الدراسات اختلال وظيفي في EC بالتغيرات غير الطبيعية في العوامل الميكانيكية داخل بيئة الأوعية الدموية ، مثل إجهاد قص السوائل الناتج عن تدفق الدم وصلابة الأنسجة5،6،7.

ومع ذلك ، فقد حظيت الأبحاث السابقة باهتمام محدود في فهم الآثار المشتركة لصلابة الأنسجة وإجهاد القص على وظيفة EC. لتعزيز القدرة على ترجمة نتائج البحوث إلى علاجات فعالة لتصلب الشرايين وأمراض القلب والأوعية الدموية الأخرى ، من الضروري تحسين النماذج الخلوية المستخدمة في هذا المجال. تم إحراز تقدم كبير في إضفاء الطابع الإنساني على النماذج الخلوية من خلال استخدام ECs البشرية وتعريضها إما لإجهاد القص أو ركائز بمستويات صلابة متفاوتة8،9،10. ومع ذلك ، فإن اعتماد وصقل النماذج الخلوية التي تدمج بيئات التدفق الديناميكية مع ركائز EC التي تمتلك خصائص صلابة قابلة للتعديل قد تقدمت ببطء. يكمن التحدي في ابتكار ركائز EC غير منتفخة لمنع التغيرات في معلمات التدفق داخل قناة التدفق مع تسهيل زراعة أحاديات EC سليمة وملتصقة جيدا. يمكن لنموذج في المختبر قادر على التغلب على هذه العقبات أن يسهل إجراء تحقيقات أكثر فعالية في كيفية تأثير ارتفاع ضغط الدم والشيخوخة وظروف التدفق بشكل تعاوني على النقل الميكانيكي للمفوضية الأوروبية ، وصحة الأوعية الدموية ، وفي النهاية تطور تصلب الشرايين. تم تطوير طرق مختلفة لتطبيق إجهاد القص على الخلايا مع التحكم في صلابة الركيزة ، بما في ذلك الألواح الدوارة وأجهزة الموائع الدقيقة. في طريقة اللوحة الدوارة ، يتم وضع الخلايا بين لوحين ويتم تطبيق إجهاد القص من خلال الحركة الدورانية للألواح. هذه الطريقة أقل تعقيدا وتوفر نموذجا سريعا ؛ ومع ذلك ، فإنه يعاني من تباين إجهاد القص المكاني ، مع إجهاد القص الصفري في المركز والحد الأقصى لإجهاد القص في المحيط11.

من ناحية أخرى ، تمثل أجهزة الموائع الدقيقة الجيل الجديد من الأدوات مع القدرة على التحكم في صلابة الركيزة وظروف التدفق. هذه الأنظمة مناسبة لمحاكاة الأوعية الدموية الدقيقة تحت ظروف التدفق الصفحي. ومع ذلك ، فإن دراسة تصلب الشرايين بمثل هذه الأجهزة أمر غير عملي ، حيث يحدث تصلب الشرايين في الأوعية الكبيرة ذات التدفق المضطرب11. تهدف هذه الورقة إلى المساهمة في مجال البحث النقدي لدراسات EC من خلال تقديم نظام فعال من حيث التكلفة قادر على فحص آثار مستويات الصلابة المتفاوتة في ركائز EC في ظل ظروف تدفق مختلفة. يدمج النظام ركائز ذات صلابة مختلفة لمحاكاة الأوعية الدموية المرضية والفسيولوجية. يحدد هذا البروتوكول طريقة إنشاء الهلاميات المائية القائمة على الجيلاتين بدون مستويات تورم وتصلب تبلغ 5 كيلو باسكال و 10 كيلو باسكال ، مما يمثل الصلابة الفسيولوجية والمرضية ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، تم تفصيل بناء غرفة تدفق لوحة متوازية قادرة على دمج هذه الركائز. تم استخدام ديناميكا الموائع الحسابية (CFD) لتقييم إجهاد القص وظروف التدفق. تم وصف تحضير الهلاميات المائية لثقافة EC وتنفيذ تجربة تدفق لمدة 6 ساعات ، تليها مناقشة حول التلوين المناعي بعد التجربة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تخليق GelMA

  1. تحضير محلول 0.2 M من كربونات الصوديوم اللامائية ومحلول 0.2 M من بيكربونات الصوديوم.
  2. امزج 46 مل من محلول بيكربونات الصوديوم مع 15 مل من محلول كربونات الصوديوم وأضف 139 مل من الماء منزوع الأيونات (DI). اضبط الرقم الهيدروجيني على 9.5 باستخدام 0.1 M NaOH و HCl إذا لزم الأمر.
  3. أضف 10 جم من النوع A ، 300 بلوم جيلاتين من جلد الخنزير إلى 100 مل من المخزن المؤقت لكربونات بيكربونات بتركيز 10٪ وزن / حجم.
  4. قم بإذابة الجيلاتين باستخدام حمام مائي 55 درجة مئوية مع تقليب المحلول عند 700 دورة في الدقيقة باستخدام محرك مغناطيسي. بمجرد إذابته بالكامل ، اضبط الرقم الهيدروجيني لمحلول الجيلاتين على 9.5 باستخدام 0.1 M NaOH.
  5. لبدء الميثاكريل ، أضف 938 ميكرولتر من أنهيدريد الميثاكريليك (MAH) بالتنقيط إلى المحلول. تحسين التوزيع الأولي ل MAH في محلول الجيلاتين عن طريق حقنه في مواقع مختلفة ، بما في ذلك أعماق مختلفة ومسافات شعاعية من المركز.
  6. لف وعاء التفاعل بورق الألمنيوم لمنع التعرض للضوء. حافظ على درجة الحرارة عند 55 درجة مئوية وحرك المحلول عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة لإكمال التفاعل (الشكل 1 أ)12.
    ملاحظة: يتوقف التفاعل عند درجة حموضة أقل من 7.4.
  7. تحضير كأس زجاجية سعة 2 لتر تحتوي على 1.8 لتر من الأسيتون، وكأس زجاجية سعة 0.6 لتر تحتوي على 0.3 لتر من الأسيتون.
  8. أضف محلول GelMA الناتج بالتنقيط إلى الدورق سعة 2 لتر مع التقليب عند 200 دورة في الدقيقة للحث على هطول الأمطار13. لزيادة جمع المنتج المترسب إلى أقصى حد ، ضع قضيبا أو ملعقة من الفولاذ المقاوم للصدأ كموقع نواة لتسهيل النقل.
  9. انقل المنتج من الدورق الأكبر إلى الدورق الأصغر واتركه لمدة 10 دقائق قبل الانتقال إلى خطوة التجفيف. يجب أن يظهر GelMA المترسب كألياف بيضاء.
  10. اجمع المنتج على ورق ماص ، وجففه في فرن مفرغ من الهواء في درجة حرارة الغرفة (RT) ، وقم بتخزينه في -20 درجة مئوية حتى استخدامه مرة أخرى.
    ملاحظة: يمكن العثور على تفاصيل إضافية حول التوصيف الكيميائي للمنتج عبر الرنين المغناطيسي النووي للبروتون (1H NMR) في عمل منشور مسبقا8.

2. تملح الزجاج

ملاحظة: يوفر توصيل الهلاميات المائية بالشرائح الزجاجية سطحا مستويا ومستويا ، مما يسهل المناولة ويضمن الاستقرار تحت ضغط القص المشتق من التدفق. يعد تشغيل الزجاج باستخدام ميثاكريلات البروبيل 3 (تريميثوكسي سيليل) ضروريا لتعزيز خصائص السطح وتمكين الارتباط التساهمي للهلاميات المائية أثناء عملية البلمرة.

  1. قطع شرائح المجهر العادي بدقة (سمك 1 مم) إلى قطع مماثلة لأبعاد الهيدروجيل النهائية باستخدام قاطع زجاجي. اغسل الشرائح المقطوعة بالصابون لإزالة الملوثات السطحية والحطام الذي قد يعيق معالجة السطح الزجاجي.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر ، صوتنة الشرائح الزجاجية لمدة 5 دقائق في الإيثانول ، ثم جففها في الهواء.
  2. تحضير محلول 0.5 ٪ من 3- (تريميثوكسيسيليل) بروبيل ميثاكريلات في الإيثانول المطلق. تحضير محلول حمض الخليك الجليدي 10 ٪ في الماء DI. امزج المحاليل لتحقيق تركيز نهائي من حمض الخليك الجليدي بنسبة 3٪.
    ملاحظة: يمكن تحضير محلول حمض الأسيتيك الجليدي بكميات كبيرة وتخزينه.
  3. قم بتنظيم الشرائح الزجاجية في وعاء زجاجي لضمان عدم انسداد الأسطح الزجاجية. صب المحلول الناتج على الشرائح الزجاجية واحتفظ بها لمدة 5 دقائق تقريبا على الروك عند 80 دورة في الدقيقة حتى يكتمل التفاعل. تأكد من تعديل جانبي الشرائح الزجاجية عن طريق إزالة أي فقاعات هواء محاصرة.
  4. بعد اكتمال التفاعل ، استنشق المحلول واغسل الشرائح الزجاجية بالإيثانول 2x. جفف الشرائح في الهواء وقم بتخزينها في الظلام في RT.
    ملاحظة: تحتفظ الشرائح الزجاجية بتعديلها لمدة 1 شهر في ظل هذه الظروف.

3. إعداد هيدروجيل

  1. تصنيع الهلاميات المائية باستخدام طريقة بلمرة الجذور الحرة التي يسببها الأكسدة والاختزال.
    1. قم بتجميع قوالب Polytetrafluoroethylene (PTFE) المكونة من قطعتين بعمق مناسب وفتح نوافذ 10 مم2 لتشكيل الركيزة النهائية. ضع في اعتبارك انكماشا بنسبة 25٪ في ارتفاع الهيدروجيل بعد البلمرة أثناء عملية التصميم. تأكد من أن القوالب مسطحة ومثبتة بإحكام في الألواح السفلية والعلوية لمنع التسرب.
      ملاحظة: أبعاد القالب المصممة أكبر بنسبة 10٪ عن قصد من حجم الهيدروجيل المقصود. يخدم هذا التصميم أغراضا متعددة: فهو يمنع تلف الجوانب عند فصل القالب ، ويعزز تساوي سطح الهيدروجيل عن طريق دفع الشوائب أو الفقاعات إلى الجوانب ، ويعوض الانكماش المتوقع بنسبة 25٪ بعد التوازن بسبب تأثير syneresis ، حيث تقوم الهلاميات المائية المتشابكة للغاية بصد الماء بعد التوازن ، مما يتسبب في الانكماش. يتم تحديد مقدار الانكماش في البروتوكول8.
    2. لضمان أن يكون للهلاميات المائية سطح متساو وارتفاع ثابت ، قم بتعليق الشرائح الزجاجية المعدلة من اللوحة العلوية للقالب ، مما يسمح بفتحة ضيقة لحقن محلول البوليمر. استخدم غطاء زجاجي لتعليق الشرائح الزجاجية المعدلة (الشكل 1 ب).
    3. لإنشاء زجاج الغطاء ، قم بقطع الزجاج المجهري العادي بنسبة 20٪ أكبر من القالب. نعلق اثنين من الفواصل إلى الجانبين أقصر. احسب سمك الفاصل على النحو التالي:
      سمك الفاصل = 1.33 × سمك الجل النهائي + 1 (سمك الزجاج المعدل) - عمق القالب
    4. ضع طبقة رقيقة من شحم مانع للتسرب متوافق مع الخلايا على الجوانب الأطول من زجاج الغطاء ، على نفس الوجه حيث يتم توصيل الفواصل.
    5. قم بتوصيل الشريحة الزجاجية المعدلة بزجاج الغطاء بين الفواصل.
    6. ضع زجاج الغطاء على القالب بحيث تجلس الفواصل على القالب ويمتد الزجاج المعدل إلى القالب. يوفر هذا الإعداد خلوصا يبلغ 1.33 من ارتفاع الهيدروجيل النهائي بين الزجاج المعدل وأسفل القالب.
    7. قم بإذابة GelMA في ماء DI عند 4٪ و 10٪ وزن / وزن لمدة 5 كيلو باسكال و 10 كيلو باسكال ، على التوالي ، وضعه في حمام مائي 45 درجة مئوية.
      ملاحظة: GelMA عبارة عن بوليمر حساس للحرارة والحفاظ على درجة حرارة المحلول عند 45 درجة مئوية يمنع التصلب قبل البلمرة ويقلل من لزوجة المحلول ، وهو أمر بالغ الأهمية لتصنيع الهلاميات المائية المسطحة.
    8. أضف TEMED (24 mM لهيدروجيل 5 kPa ، 6.25 mM ل 10 kPa hydrogel) إلى محلول البوليمر واخلطه جيدا.
      ملاحظة: لا يبدأ TEMED وحده في البلمرة ، لذا تأكد من تحضير القوالب والماصات والمحاليل قبل المتابعة.
    9. أضف APS (24 مللي متر لهيدروجيل 5 كيلو باسكال ، 24.5 مللي متر لهيدروجيل 10 كيلو باسكال) إلى محلول GelMA واخلطه جيدا.
      ملاحظة: إضافة APS يبدأ البلمرة ، وقد تتشكل الهلاميات المائية بسرعة ، مما يتطلب اتخاذ إجراء فوري لمنع الهلاميات المائية المعيبة. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول قياسات الصلابة في العملالمنشور سابقا 8.
    10. ماصة بعناية الحل الناتج للفتحة بين الشريحة الزجاجية المعلقة والقالب في RT والسماح لها بالتشابك. تدفع القوة الشعرية محلول البوليمر إلى القالب. تجنب إضافة فقاعات إلى المواد الهلامية وتوقف عن السحب عندما تبقى كمية صغيرة من المحلول في طرف الماصة.
      ملاحظة: أثناء البلمرة ، تتفاعل مجموعات الميثاكريلات من GelMA مع بقايا الميثاكريلات على الشرائح الزجاجية المعدلة ، مما يؤدي إلى الارتباط الكيميائي للهيدروجيل بالزجاج.
    11. بعد 15 دقيقة ، يكتمل التفاعل. افصل الركيزة عن القالب باستخدام أداة حادة ، مثل الإبرة ، وحرك الركيزة بعيدا عن زجاج الغطاء لفصلها.
    12. انقل الهلاميات المائية إلى 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في طبق بتري 100 مم مختوم بغشاء بلاستيكي واتوازن عند 37 درجة مئوية لإزالة المواد المتفاعلة والمنتجات الثانوية المتبقية.
    13. نظرا لأن الهيدروجيل أكبر قليلا من الأبعاد النهائية ، قم بقص أي هلام زائد على الجانبين لمطابقة الأبعاد المطلوبة لنافذة غرفة التدفق.
    14. استخدم غرفة التدفق للتحقق من أبعاد الهيدروجيل. تأكد من أن الهيدروجيل يتناسب بشكل صحيح مع غرفة التدفق دون وجود فجوات بين الهيدروجيل والقالب أو أي عيوب قد تؤثر على أنماط التدفق. إذا كانت هناك مخالفات في الشكل قد تؤثر على نمط التدفق في غرفة التدفق ، مما يؤدي إلى سلوك الخلية الضار ، فاحفظ الهيدروجيل للظروف الثابتة.
    15. نقل أربعة الهلاميات المائية إلى طبق بتري يحتوي على 1x PBS للتعقيم.
  2. تعقيم هيدروجيل كما هو موضح أدناه باستخدام 70 ٪ من الإيثانول.
    1. تحضير 25 ٪ ، 50 ٪ ، و 70 ٪ حلول الكحول للجفاف هيدروجيل التدريجي.
      ملاحظة: إذا لم يتم إجراء الجفاف التدريجي ، فقد تتقلص الهلاميات المائية الأكثر صلابة وتتكسر ، بينما قد تتشكل التجاعيد على سطح الهلاميات المائية الأكثر نعومة.
    2. نضح محلول 1x PBS من طبق بتري الذي يحتوي على الهلاميات المائية. أضف محلول إيثانول بنسبة 25٪ إلى كل طبق بتري لغمر الهلاميات المائية 5 كيلو باسكال و 10 كيلو باسكال لمدة 15 دقيقة.
    3. نضح محلول الكحول 25 ٪. أضف محلول كحول بنسبة 50٪ إلى كل طبق بتري لغمر الهلاميات المائية 5 كيلو باسكال و 10 كيلو باسكال لمدة 15 دقيقة.
    4. نضح محلول الكحول 50 ٪. أضف محلول كحول بنسبة 70٪ إلى كل طبق بتري ، مع غمر الهلاميات المائية 5 كيلو باسكال و 10 كيلو باسكال لمدة 5 دقائق. ضع طبق بتري على شاكر عند 100 دورة في الدقيقة.
    5. اترك الهلاميات المائية 5 كيلو باسكال مغمورة لمدة 40 دقيقة والهلاميات المائية 10 كيلو باسكال لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: لوحظ أن الهلاميات المائية 5 كيلو باسكال أكثر عرضة للتلوث مقارنة بالهلاميات المائية 10 كيلو باسكال.
    6. انقل العينات إلى صفيحة ذات 6 آبار في خزانة السلامة البيولوجية واغسل الهلاميات المائية 2x-3x باستخدام برنامج تلفزيوني معقم.

4. طلاء الهلاميات المائية

  1. تحضير محلول جيلاتين 60 ميكروغرام / مل عن طريق إذابة 3 ملغ من الجيلاتين في 50 مل من PBS المعقم (1x مع المغنيسيوم وملح الكالسيوم). سخني المحلول في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو حتى يذوب الجيلاتين بالكامل.
  2. مرشح معقم محلول الطلاء باستخدام مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر. نضح محلول 1x PBS من كل لوحة بئر وأضف محلول الجيلاتين إلى كل بئر ، مما يضمن تغطية كاملة لكل هيدروجيل. لتقليل مخاطر التلوث ، أضف 40 وحدة / مل من البنسلين و 10 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين إلى محلول الطلاء.
  3. احتضان كل لوحة بئر في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 45 دقيقة. اغسل الهلاميات المائية بمحلول 1x PBS.
  4. نضح برنامج تلفزيوني وإضافة وسائط زراعة الخلايا.
  5. لمدة لا تزيد عن يومين ، احتفظ بالهلاميات المائية في وسط زراعة الخلايا واحتضانها في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 حتى بذر الخلايا.
    ملاحظة: على الرغم من خصائص ارتباط الخلايا الممتازة للفيبرونيكتين ، إلا أن هناك قلقا بشأن استخدامه بسبب إيداع ECs للفيبرونيكتين الداخلي في حالات تصلب الشرايين ، مما قد يؤدي إلى استجابة التهابية. لتجنب استجابات الخلايا المحفزة كيميائيا ، نمتنع عن استخدام الفبرونيكتين. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر Orr et al. أن طلاء الفبرونيكتين ، مقارنة بطلاء الكولاجين I ، ينظم جينات تصلب الشرايين. على وجه التحديد ، لاحظوا زيادة مستويات التعبير لجزيء الالتصاق بين الخلايا 1 (ICAM-1) ، وجزيء التصاق الخلايا الوعائية 1 (VCAM-1) ، والعامل النووي-κB (NF-κB) 14.

5. خلايا البذر على الركائز

  1. قم بإعداد تعليق الخلية باتباع بروتوكولات الانفصال المتاحة وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم8.
  2. استنشاق الوسائط تماما من الهلاميات المائية. أضف 50000 خلية / سم 2 لكل عينة. أضف حجما مناسبا من تعليق الخلية إلى كل عينة لمنع تجاوز سعة الخلية.
    ملاحظة: الركائز الأكثر صلابة أكثر كارهة للماء. لذلك ، قلل الوقت بين الخطوات لتحسين قابلية البلل وتشتت تعليق الخلية على سطح الركيزة.
  3. احتضان الهلاميات المائية المصنفة بالخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة ساعتين. أضف وسائط زراعة الخلايا إلى العينات بمجرد ربط الخلايا بالمواد الهلامية.

6. تصنيع غرفة التدفق

ملاحظة: نهج تصميم غرفة التدفق فعال من حيث التكلفة ويتطلب الحد الأدنى من الخبرة للتصنيع والاستخدام.

  1. استخدم بولي (ميثيل ميثاكريلات) لتصنيع الغرفة لتقييم جودة التدفق بصريا ، وسلامة الهيدروجيل تحت ضغط القص ، ودراسات العلامات الحيوية المحتملة في الوقت الفعلي أثناء تجارب التدفق. تم إنشاء تصميم الغرفة باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD). تم تقديم غرفة التدفق للحصول على براءة اختراع ، ولا يمكن الكشف عن تفاصيل حول هذا الجهاز في البروتوكول الحالي.
  2. التقييم الحسابي لظروف التدفق في غرفة التدفق
    1. قم بتجميع المكونات الفردية لغرفة التدفق المصممة (. SLDPRT) لإنشاء إعداد الغرفة النهائي.
    2. ارسم خطا على طول الخط المركزي للتدفق عرضيا لسطح الهيدروجيل لتحليل إجهاد القص. أغلق فتحات المدخل والمخرج لتحديد حجم التحكم المغلق.
    3. افتح محاكاة التدفق من علامة التبويب الوظائف الإضافية في برنامج CAD. في علامة التبويب محاكاة التدفق ، افتح ميزة المعالج لإدخال الخصائص. حدد نظام الوحدة واضبط الضغط ووحدات الضغط على داين / سم2.
    4. تحقق من تدفق السوائل والجاذبية في الميزات المادية. ضبط الجاذبية على -9.8 في مكون Z ؛ يجب أن تكون مكونات X و Y صفرا.
    5. اختر داخلي لنوع التحليل في المعالجة الهندسية. حدد الماء كسائل افتراضي.
      ملاحظة: افترض أن الوسط يتصرف مثل الماء.
    6. اختر رقائقي ومضطرب لنوع التدفق. حدد الجدار على أنه جدار ثابت الحرارة وخشونة سطح الإدخال في حالة الجدار.
    7. اضبط درجة الحرارة على 37.5 درجة مئوية (310.65 كلفن) في الظروف الأولية. حدد المجال الحسابي في مشاريع محاكاة التدفق، مع التأكد من أنه يغطي حجم التحكم بالكامل.
    8. حدد جميع الجدران التي تتفاعل مع السائل لتحديد المجال الفرعي للسائل. في حالة الحدود، قم بتعيين السطح الداخلي لغطاء المدخل كتدفق حجم المدخل وحدد معدل التدفق (Q) والتدفق المنتظم. بعد ذلك ، قم بتعيين السطح الداخلي لختم غطاء المخرج كضغط ثابت.
    9. تحديد حجم الشبكة العالمية استنادا إلى الموارد الحسابية المتاحة. اضغط على تشغيل لبدء المحاكاة.
    10. عند الانتهاء ، راجع النتائج المرجوة ، بما في ذلك مخططات إجهاد القص ومحاكاة التدفق.
    11. كرر الخطوات من 6.2.8 إلى 6.2.10 بمعدلات تدفق مختلفة لحساب إجهاد القص المطبق بمعدلات مختلفة. استخدم تحليل الانحدار لإنشاء علاقة إجهاد معدل التدفق والقص.
    12. تقييم تحمل النظام للتغيرات في أبعاد الهيدروجيل لتعزيز واقعية المحاكاة.

7. تشغيل تدفق رقائقي موحد

  1. بعد زراعة الخلايا على الهلاميات المائية 5 كيلو باسكال و 10 كيلو باسكال ، تأكد من التقاء الطبقة الأحادية للخلية في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 . يجب تحقيق طبقة أحادية من الخلايا على كل هيدروجيل.
  2. تعقيم المكونات القابلة للتعقيم لنظام غرفة تدفق اللوحة المتوازية (مسامير الفولاذ المقاوم للصدأ ، والملعقة ، والملقط ، والحشية ، وخزان الوسائط) بدورة الأوتوكلاف بالجاذبية لمدة 30 دقيقة. تعقيم الأجزاء الأخرى (مكونات الأكريليك وسدادة / مخمدات الخزان) مع التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
  3. قم بتجميع جهاز غرفة التدفق في خزانة السلامة البيولوجية. تأمين عينات هيدروجيل في الجهاز ، وضمان التوحيد. استخدم حشوا متساويا في الحجم مع الهلاميات المائية في حالة توفر عدد غير كاف من العينات للتدفق.
  4. بلل السطح الداخلي للغرفة وأسطح الهيدروجيل مسبقا لتقليل تكوين الفقاعات ومنع جفاف الخلايا أثناء التجميع.
  5. أضف وسائط كافية إلى خزان المدخل ، مما يسمح بتدفق 20٪ -30٪ من الوسائط إلى خزان المخرج عند التجميع. أغلق خزان المدخل بإحكام باستخدام مخمد / مانع تسرب.
    ملاحظة: يؤدي تراكم الضغط في خزان المدخل إلى تدفق التدفق، وأي تسرب للهواء يغير معدلات التدفق. تحقق من وجود عيوب مانعة للتسرب إذا تشكلت فقاعات في الأنبوب الخارجي.
  6. اضبط مخمد المخرج على الضغط الجوي لتحديد فرق الضغط. ضع الجهاز والخزاناتفي حاضنة CO 2 37 درجة مئوية ، 5٪. قم بتوصيل أنبوب الجهاز بمضخة تمعجية موضوعة خارج الحاضنة (الشكل 1C).
  7. قم بتشغيل المضخة لبدء تطبيق 3.6 داين / سم2. قم بزيادة معدل التدفق تدريجيا بمقدار 2 مل / دقيقة (على سبيل المثال ، الوصول إلى 85 مل / دقيقة من 65 مل / دقيقة بعد 10 دقائق) حتى تطبيق حوالي 8 داين / سم2.
  8. زيادة معدل التدفق بمقدار 2.5 مل / دقيقة حتى تصل إلى 12 داين / سم2 من إجهاد القص.
    ملاحظة: اترك وقتا للخلايا للتكيف مع الحالة الديناميكية ، حيث قد تؤدي الزيادات السريعة في معدل التدفق إلى فصل الخلايا وتلف الطبقة الأحادية.
  9. بعد 6 ساعات ، أوقف التدفق ، وأخرج الجهاز من الحاضنة ، وقم بتفكيك غرفة التدفق. بعد ذلك ، نقل عينات هيدروجيل إلى لوحة ستة آبار.
  10. اغسل العينات باستخدام برنامج تلفزيوني بارد وإما أن تصلح الخلايا للتلطيخ المناعي أو تحللها لعزل البروتين.

8. إعداد Immunostaining للفحص المجهري متحد البؤر مع تكبير عالي

ملاحظة: لزيادة كفاءة الدراسة ، تم تطوير طريقة لتلطيخ أجزاء صغيرة من الهلاميات المائية ، مما يتيح فحص أهداف بيولوجية متعددة في عينة واحدة.

  1. تحضير لكمات الخزعة أو أدوات القطع المفضلة بأقطار 3 أو 4 مم.
  2. استخدم صندوق طرف ماصة كغرفة تلطيخ. رطب الحجرة للتحكم في تبخر محلول التلوين أثناء الحضانة الممتدة عن طريق وضع منشفة ورقية مبللة في الجزء السفلي من صندوق طرف الماصة.
  3. تقليل استهلاك الأجسام المضادة عن طريق إنشاء تجمعات حلول صغيرة للعينات الفردية. قم بتغطية رف صندوق الأطراف بغشاء شفاف ، واضغط برفق على الفيلم مقابل فتحات الحامل بطرف الإصبع لعمل الدمامل. املأ الدمامل ب 70 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  4. انقل هيدروجيل فردي إلى طبق بتري فارغ وقم بقصه باستخدام لكمة خزعة أو أداة قطع مفضلة. استخدم المجهر لقطع مساحة عينة تمثيلية. قطع اسطوانة هلام كاملة لتجنب مشاكل الفحص المجهري متحد البؤر.
  5. ضع عينات الهيدروجيل المقطوعة في الدمامل التي تم إنشاؤها في الخطوة 8.3. أداء تلطيخ اتباع البروتوكولالقياسي 15. بعد غسل التلوين النهائي ، احصل على ورقة مطاط السيليكون التي تتناسب مع سمك الهيدروجيل.
    ملاحظة: يفضل استخدام ورقة ذات جانب لاصق واحد لتحسين الختم. في هذه الدراسة ، تم تلطيخ ألياف الأكتين باستخدام جسم مضاد ثانوي فلوري مترافق مع Phalloidin عند تخفيف 1:20.
  6. قطع ورقة المطاط إلى مربعات 15 مم × 15 مم. قم بثقب ثقب 6 مم باستخدام لكمة الخزعة أو أداة القطع المفضلة.
  7. قم بإنشاء حاوية عينة عن طريق ربط المطاط بغطاء مجهري (رقم 1.5). أضف 10 ميكرولتر من وسائط التركيب الرطبة إلى الدمامل بينما لا تزال العينة موجودة واحتضانها في الظلام لمدة 10-15 دقيقة.
    ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة ، احتوت وسائط التركيب على 0.9 ميكروغرام / مل من 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) لتقصير بروتوكول التلطيخ.
  8. أخرج العينة من حجرة التلوين وضعها في الحاوية التي تم إنشاؤها في الخطوة 8.7. ضع 1-2 ميكرولتر من وسائط التركيب أعلى العينة.
    ملاحظة: تؤثر كمية وسائط التركيب على جودة الصورة عند التكبير العالي. يمكن أن تؤدي وسائط التركيب الزائدة أو غير الكافية إلى الإضرار بوضوح الصورة.
  9. ضع غطاء آخر في الأعلى واضغط برفق للتأكد من ملامسة العينة للزجاج. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام حتى التصوير المجهري.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 1 الإعداد التجريبي ، ويحدد عملية تخليق GelMA من خلال تفاعل ميثاكريل. ثم تم استخدام المنتج الناتج لتصنيع ركيزة الهيدروجيل ، التي تم زرع ECs عليها. بعد ذلك ، تم إدخال الخلايا في غرفة التدفق لتجربة تدفق 6 ساعات عند 12 داين / سم2.

1تم استخدام التحليل الطيفي H NMR لتقييم نجاح تفاعل الميثاكريل (الشكل 2A). أكد وجود مجموعة ميثيل عند 1.9 جزء في المليون وقمة فينيلية بين 5.4-5.6 جزء في المليون في GelMA نجاح الميثاكريل. بالإضافة إلى ذلك ، يشير الانخفاض في ذروة اللايسين عند 3 جزء في المليون في GelMA إلى استهلاك بقايا اللايسين ، والتي يتم استبدالها بمخلفات الميثاكريلات12،13،16. تم تقييم صلابة الهلاميات المائية GelMA باستخدام اختبار الانضغاط ، والذي أظهر أن معامل الضغط زاد مع تركيزات GelMA (الشكل 2B). تم استخدام الهلاميات المائية المكونة من 4٪ و 8٪ (وزن / حجم) GelMA لتقليد صلابة المصفوفة الفسيولوجية (5 كيلو باسكال) والمرضية (10 كيلو باسكال) ، على التوالي8.

تم تصميم غرفة التدفق لتكون فعالة من حيث التكلفة ولسهولة التعقيم ، من خلال استخدام بوليمر الأكريليك المقاوم للأشعة فوق البنفسجية. تسهل شفافيتها المراقبة في الوقت الفعلي للهلاميات المائية وظروف التدفق أثناء التجارب. تم تصميم الغرفة بثلاث طبقات متميزة ، وتقلل من مخاطر تلف الهيدروجيل أثناء التحميل أو التفريغ: توفر اللوحة السفلية قاعدة قوية ، وتوفر الطبقة الوسطى دعما جانبيا للهلاميات المائية ، وتخلق اللوحة العلوية ، على طول الحشية ، الخلوص اللازم لتدفق السوائل (الشكل 3 أ). تم إجراء عمليات محاكاة حسابية باستخدام CFD لتقييم ظروف التدفق وإجهاد القص داخل الغرفة. المعادلة التالية - إجهاد القص = 0.0558 × معدل التدفق - حسبت إجهاد القص المطبق على الخلايا بناء على معدل التدفق كمدخل (الشكل 3 ب). والجدير بالذكر أن التغيرات في خصائص المواد ، مثل الصلابة ، لم تغير إجهاد القص في عمليات المحاكاة. لحساب الاختلافات في حجم الهيدروجيل في الإعداد التجريبي النهائي ، تم قياس الهلاميات المائية عن قصد أصغر قليلا في النموذج الحسابي. تم إنشاء فجوة 0.5 مم بين جانب واحد من الهلاميات المائية وجدران اللوحة الوسطى للغرفة ، عموديا على اتجاه التدفق. سمح هذا التكوين بتحليل تأثيرات إجهاد القص في هذه الفجوات. في حين لوحظت مخالفات في إجهاد القص في مواقع الفجوة (الشكل 3 ب) ، اقتصر تأثيرها على منطقة صغيرة مجاورة للفجوات ، مع تعرض سطح الهيدروجيل المتبقي لإجهاد قص موحد (الشكل 3 ج). تشير هذه الأفكار إلى التخلص من الخلايا من حواف الهلاميات المائية لتقليل التأثير المحتمل للمناطق المضطربة. ومن الجدير بالذكر أن إجهاد القص العالي ، حتى 15 داين / سم² ، تم تطبيقه تجريبيا على ECs المصنفة على الهلاميات المائية 5 كيلو باسكال و 10 كيلو باسكال مع عدم وجود تسرب في الجهاز (البيانات غير مدرجة). ومع ذلك ، فإن زيادة إجهاد القص بشكل أكبر يمكن أن يؤدي إلى انفصال الخلايا وفشل الهيدروجيل ، مما يؤكد الحاجة إلى تحسين دقيق للظروف التجريبية.

لكي تشكل خلايا البذر طبقة أحادية ، من الضروري استخدام كثافة خلايا أعلى من الثقافات التقليدية. وقد تبين أن كثافة البذر المنخفضة تعيق تكوين الطبقة الأحادية على الهلاميات المائية الأكثر ليونة8. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الهلاميات المائية المطلية مسبقا بالجيلاتين قبل بذر الخلايا تعزز الارتباط الأولي للخلية وتنتشر على الهلاميات المائية الأكثر ليونة. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن التأثير المفيد لهذا الطلاء مؤقت ، لأنه يسهل في المقام الأول التفاعل الأولي بين الخلايا والركيزة.

يوضح الشكل 4 كيف تؤثر الصلابة وإجهاد القص على تكوين ألياف الأكتين. تحت ضغط القص ، تشكلت ألياف إجهاد أكثر سمكا ، مما يشير إلى ارتباط أقوى بالسطح. في العينات الأكثر ليونة ، كان هناك المزيد من ألياف الأكتين المحيطية ، وهي مؤشرات على الظروف الفسيولوجية. ومع ذلك ، في ECs على ركائز أكثر صلابة ، يمكن أن يؤدي وجود ألياف إجهاد أقوى وعدد أقل من الألياف الطرفية إلى خلل وظيفي في EC17. تؤكد هذه البيانات فعالية النظام المقدم في تعديل سلوك EC.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على الدراسة الحالية. (أ) توليف GelMA. تم تعديل الجيلاتين كيميائيا إلى ميثاكريلات الجيلاتين (GelMA) من خلال تفاعل بين الجيلاتين وأنهيدريد الميثاكريليك (MAH) عند 55 درجة مئوية. ثم تم ترسيب المنتج في الأسيتون وتجفيفه تحت فراغ. (ب) تصنيع الهيدروجيل. تم إعداد زجاج الغطاء عن طريق إرفاق الفواصل. ثم ، تم إرفاق الزجاج المعدل بزجاج الغطاء. تم وضع زجاج الغطاء على القالب ، مع توفير الفواصل الخلوص المطلوب بين الزجاج المعدل وأسفل القالب. تمت إضافة محلول GelMA الذي يحتوي على مبادرين إلى الفتحة بين الزجاج المعدل والقالب ، والبلمرة لتشكيل هيدروجيل مرتبط تساهميا بالزجاج المعدل. ج: تجربة التدفق. تم استخدام هيدروجيل الناتج لبذور ECs. بعد تشكيل طبقة أحادية ، خضعت الخلايا لتجربة تدفق لمدة 6 ساعات عند إجهاد قص يبلغ 12 داين / سم². تم إنشاء هذا الرقم مع BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: 1أطياف H-NMR للجيلاتين والبلمرة المسبقة ل GelMA. (أ) الرجوع إلى الصناديق المبطنة المتقطعة لمعرفة القمم ذات الصلة. ظهرت قمم الميثاكريلويل (أي مجموعات الفينيل والميثيل) بعد التعديل الكيميائي للجيلاتين ، بينما تم استخدام مجموعة اللايسين لتحديد درجة الاستبدال بعد التفاعل الكيميائي18. (ب) تم قياس معامل يونغ للهلاميات المائية عن طريق اختبار الانضغاط ، واعتبرت الهلاميات المائية GelMA 4٪ (w / v) ركائز فسيولوجية ، و 10٪ (w / v) اعتبرت ركيزة مرضية (n = 4 ، متوسط ± SEM). تم تعديل هذا الرقم من8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تصميم غرفة تدفق الألواح المتوازية والمحاكاة الحسابية. (أ) استخدمت ثلاث لوحات منفصلة للحد من إمكانية إتلاف الهلاميات المائية أثناء التحميل أو التفريغ؛ حيث توفر اللوحة السفلية سطحا خلفيا ، قدم السطح الأوسط دعما جانبيا للهلاميات المائية ، وشكلت اللوحة العلوية والحشية الخلوص لتدفق السائل. (ب) خضعت غرفة التدفق لعمليات محاكاة حسابية11. عندما يكون معدل التدفق 215 مل / دقيقة ، يكون إجهاد القص على طول الخط المرسوم حوالي 12 داين / سم2 ، وهو ما يمثل إجهاد القص الفسيولوجي. (ج) يقتصر تأثير الفجوة التي مقدارها 0.5 مم على منطقة صغيرة مجاورة للفجوة. يتعرض السطح المتبقي من الهيدروجيل لإجهاد قص موحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: يزيد إجهاد القص والهيدروجيل القاسي من تكوين ألياف الإجهاد. يتم تشكيل المزيد من ألياف الأكتين المحيطية في ECs على عينات 5 كيلو باسكال تحت التدفق. تشكلت ألياف إجهاد أقوى عندما تعرضت الخلايا لإجهاد القص على الهلاميات المائية 10 كيلو باسكال ، مما يدل على فعالية النموذج في سلوك EC. تشير الأسهم إلى الأكتين المحيطي ، وتشير العلامات النجمية إلى الألياف المجهدة. شريط المقياس = 10 ميكرومتر (الأزرق: DAPI ، الأحمر: ألياف الأكتين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظام الأوعية الدموية هو بيئة ديناميكية حيث تؤثر القوى المختلفة بشكل كبير على السلوك الخلوي. دراسة الأحداث البيولوجية في أمراض القلب والأوعية الدموية دون النظر في هذه القوى ستكون غير دقيقة. وبالتالي ، فإن النماذج الخلوية القادرة على محاكاة البيئة الميكانيكية الوعائية أمر بالغ الأهمية. لقد أحرز الباحثون بالفعل تقدما كبيرا في تسليط الضوء على تأثير هذه القوى على السلوك الخلوي11. ومع ذلك ، لفهم سلوك الخلية في ظل كل من الظروف المرضية والفسيولوجية في جسم الإنسان ، من الضروري تطوير نماذج أكثر دقة تشبه إلى حد كبير بيئة الأوعية الدموية. لذلك ، كنا نهدف إلى تطوير نظام يكرر بيئة الأوعية الدموية بشكل أكثر دقة مع الحفاظ على سهولة الوصول وسهولة الاستخدام.

يمكن للنموذج تطبيق إجهاد القص المشتق من التدفق المتحكم فيه على الخلايا البشرية على ركائز ذات مستويات صلابة متفاوتة ، مما ينتج عنه ظروف أقرب إلى الحقائق الفسيولوجية مقارنة بالنماذج الحالية. تم تصنيع GelMA واستخدامه في هذا النموذج لتلبية المعايير التالية: 1) الخواص الميكانيكية القابلة للضبط ، 2) سلوك عدم التورم ، 3) توافق الخلايا والالتصاق ، و 4) القدرة على تضمين خلايا الأوعية الدموية لنمذجة الأوعية الدموية بشكل أكثر دقة. تم تحقيق قابلية ضبط الخواص الميكانيكية عن طريق تغيير تركيز البوليمر الحيوي8 لتقليد الظروف الفسيولوجية والمرضية. المعيار الثاني هو السلوك غير المنتفخ. من الأهمية بمكان أن يكون لديك ركيزة غير منتفخة للحفاظ على أبعاد غرفة التدفق المتسقة ، وظروف التدفق ذات الصلة ، وإجهاد القص على الخلايا. أظهر GelMA بدرجة عالية من الميثاكريل خصائص غير منتفخة ، مما يحافظ على شكل الهيدروجيل ونعومة سطحه طوال التجربة8. الأهم من ذلك ، أن التركيز والتصلب لم يؤثرا على سلوك التورم ، مما أدى إلى تبسيط النموذج من خلال القضاء على الحاجة إلى تعديلات منفصلة لكل مجموعة تجريبية. كان المعيار الثالث هو التصاق الخلية ، حيث أن التعلق المناسب ضروري لمنع انفصال الخلية والحفاظ على سلامة الطبقة الأحادية. قدمت GelMA التصاق الخلايا ، وبالتالي تقليل الحاجة إلى خطوات إضافية لاقتران جزيئات لاصقة الخلية بالركيزة ، وهو أمر ضروري للعديد من البوليمرات الحيوية. علاوة على ذلك ، تم النظر في قدرة GelMA على تغليف الخلايا ، على الرغم من أنه لم يتم اختبارها مباشرة في هذه الدراسة. تحتوي إمكانات تغليف الخلايا على مؤشرات لدعم زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد ودمج طبقات الخلايا ، مثل خلايا العضلات الملساء الوعائية أو الخلايا المحيطة ، لتعزيز دقة النموذج19. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تخليق GelMA فعال من حيث التكلفة ويتطلب الحد الأدنى من المعدات ، مما يجعله مرشحا ممتازا كمادة حيوية لتصنيع الركيزة20،21،22.

تستخدم غرفة تدفق الألواح المتوازية بشكل شائع لتطبيق إجهاد القص على الخلايا ، ولكن تم استخدامها تقليديا فقط مع أغطية زجاجية أو مواد صلبة. ومع ذلك ، فإن هذه المواد تفتقر إلى الأهمية الفسيولوجية23. في المقابل ، أدخلت أجهزة الموائع الدقيقة مزيدا من التعقيد الهندسي وركائز أكثر ليونة من خلال استخدام المواد القائمة على البوليمر. ومع ذلك ، لا تستطيع هذه الأجهزة في كثير من الأحيان التحكم في نظام التدفق بدقة ، وتحد أبعادها الصغيرة من قدرتها على دراسة عدد صغير فقط من الخلايا ، مما يحد من النتائج التجريبية11. يجمع الجهاز المقترح بين فوائد كلا النظامين من خلال دمج الهلاميات المائية أحادية الطبقة للخلايا البطانية مع غرفة تدفق تطبق إجهاد القص الذي يتم التحكم فيه بدقة.

أظهر الجهاز القدرة على دمج كل من القوى الميكانيكية المشتقة من التدفق والقوى المشتقة من المواد الصلبة. عندما تم تطبيق إجهاد القص من 12 داين / سم2 لمدة 6 ساعات ، لوحظ تشكيل ألياف الإجهاد الخلوي ، على النقيض من غلبة الأكتين المحيطي في مجموعة الركيزة ليونة. يتماشى هذا مع العديد من التقارير التي تظهر عددا أقل من ألياف الإجهاد التي تشكلت عندما يتم استزراع ECs على أسطح أكثر نعومة24،25،26،27. من ناحية أخرى ، يمكن أن يؤدي التدفق الصفحي إلى تكوين ألياف إجهاد بارزة. لقد ثبت أن الاستجابة الهيكلية الخلوية لظروف التدفق تبدأ في غضون 1 ساعة من التعرض للتدفق ولكنها تتطلب وقتا أطول بشكل ملحوظ لإكمال إعادة التنظيم28،29،30. تعد شبكة الأكتين المحيطية ضرورية لمختلف وظائف EC ، بما في ذلك التصاق الخلايا الخلوية ووظيفة الحاجز17. إن تنظيم هذه الشبكة في مجموعة تجريبية صحية مقارنة بالمجموعة المرضية ذات ألياف الإجهاد الواسعة النطاق يوافق على النمذجة الناجحة للجهاز للظروف الصحية والمريضة.

عيب واحد من هذا الجهاز هو احتمال تلف الهلاميات المائية ، والتي يمكن أن تعطل التدفق وتقلل من معدل نجاح التجارب. تنشأ هذه المشكلة في المقام الأول من العيوب الأولية في الهلاميات المائية ، والتي ، تحت ضغط القص ، قد تتفاقم ، مما يؤدي إلى انفصال العينة وعرقلة التدفق الجزئي. لذلك ، يجب إجراء خطوات تحضير العينة ، بما في ذلك البلمرة والتوازن والقطع ، بعناية لمنع أي ضرر إضافي للعينات. التحدي الآخر في هذا النظام هو تحقيق والحفاظ على سلامة الطبقة الأحادية. في حين أن طلاء الهلاميات المائية بالجيلاتين يمكن أن يحسن الارتباط الأولي للخلية ، أظهر عملنا السابق أن هذا الطلاء لا يؤثر على تكاثر الخلايا8. لذلك ، لتعزيز تكوين الطبقة الأحادية ، خاصة بالنظر إلى أن تكاثر الخلايا يكون أبطأ في الهلاميات المائية الأكثر ليونة31 ، فإن زيادة كثافة البذر مفيدة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تنفصل الخلايا بسبب إجهاد القص الناجم عن تدفق السوائل. وبالتالي ، من الأهمية بمكان زيادة معدل التدفق تدريجيا ، مما يتيح للخلايا وقتا كافيا للتكيف مع الظروف البيئية الجديدة.

في الختام ، يمثل الجهاز تقدما كبيرا في محاكاة بيئة الأوعية الدموية بشكل أكثر دقة نظرا لقدرته على محاكاة كل من القوى الميكانيكية المشتقة من السوائل والمواد الصلبة في وقت واحد. يوفر منصة شاملة لدراسة سلوك EC في ظل ظروف فسيولوجية ومرضية مختلفة. هذا التنوع يجعله أداة قيمة لتعزيز فهمنا لبيولوجيا الأوعية الدموية وتطور المرض. يمكن أن يساهم هذا النموذج في مجموعة متنوعة من الدراسات البحثية ، بما في ذلك علم الأحياء الميكانيكي ، وتصلب الشرايين ، وتطور ورم خبيث للسرطان ، وهندسة أنسجة الأوعية الدموية وتكوين الأوعية الدموية ، وتوصيل الأدوية وفحصها.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أن طلب براءة اختراع مؤقت (رقم 63/634,853) قد تم تقديمه بعنوان غرفة التدفق مع ركيزة قابلة للضبط ميكانيكيا ، وأنه لا توجد مصالح منافسة أخرى.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعرب المؤلفون عن امتنانهم لروبرت إيغان لمساعدته في تصنيع غرفة التدفق. يشكر المؤلفون لوكاس ماكولي على مساعدته أثناء التجارب. بالإضافة إلى ذلك ، يرغبون في الاعتراف بالمرافق الأساسية لمعهد التصوير الكيميائي للأنظمة الحية (CILS) بجامعة نورث إيسترن لمنح الوصول إلى المجاهر متحدة البؤر. يقر المؤلفون بدعم التمويل المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (NIH 1R01EB027705 الممنوحة ل SB) والمؤسسة الوطنية للعلوم (جوائز NSF CAREER: DMR 1847843 إلى SB و CMMI 1846962 إلى EE).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(تريميثوكسي سيليل) بروبيل ميثاكريلات ، رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED)إنفيتروجين15524-010تصنيع هيدروجيل
3- (تريميثوكسي سيليل) بروبيل ميثاكريليتسيجما ألدريتش440159تملح الزجاج
4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) - تحتوي على وسائطالتركيب مختبرات ناقلاتH-1200Immunostaining
الأسيتونثيرمو فيشر العلميA18-4GelMA التوليف
Alexa Fluor 555 Phalloidin تقنية إشارات الخلية8953SImmunostaining
Ammonium Persulfate (APS)Bio-Rad1610700Hydrogel Fabrication
Clear Proof- ومقاومة للأشعة فوق البنفسجية ورقة أكريليك مصبوبة (45/64 بوصة)McMaster-CARR8560K165مجهر متحد البؤر لتصنيع غرفة التدفق
Carl Zeiss Meditex AGZeiss LSM 800Immunostaining
Covidien Monoject Rigid Pack 60 مل محاقن بدون إبرفيشر    22-031-375مجموعة نمو تجربة التدفق
EC  مجموعة الثقافة من النوع الأمريكي (ATCC)PCS-100-041ثقافة الخلايا
الإيثانول 200 مختبراتDecon Proof2701تملح الزجاج
الجيلاتين من النوع A (300 بلوم) من جلد الخنازيرSigma-AldrichG1890GelMA Synthesis
Glacial Acetic AcidThermo Fisher Scientifics9526-33تملح الزجاج
عالي النقاء سيليكون عالي الحرارة ورقة مطاطيةMcMaster-Carr87315K74تصنيع غرفة التدفق
للوريد السري البشري (HUVEC) مجموعةثقافة النوع الأمريكي (ATCC)PSC-100-010ثقافة الخلية
M3x30mm مسامير آلة مقبس عرافة برغي رأس دائري 304 مسامير مثبتات من الفولاذ المقاوم للصدأ 20 قطعةغرفةالتدفق
B07Q5RM2TP Uxcellمحرك رقمي Masterflex L / S مع Easy-Load & Reg ؛ 3 رأس مضخة للأنابيب الدقيقة ؛ 115/230 فولت تيار مترددVWR#MFLX77921-65تجربة التدفق 
مضخة الدقة Masterflex L / S ، Puri-Flex ، L / S 25 ؛ 25 قدمVWR#MFLX96419-25تجربة التدفق   ؛
ميثاكريليك أنهيدريد (MAH)سيجما ألدريتش276685GelMA توليف
بارافورمالديهايدثيرمو فيشر العلميين043368.9Mثقافة الخلايا
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Gibco14080-055
بيكربونات الصوديومفيشر الكيميائيةS233-3GelMA تخليق
كربونات الصوديومفيشر الكيميائيةS263-500GelMA Synthesis
SOLIDWORKS الإصدار
SOLIDWORKS Student Edition Desktop ، 2023SolidWorksN / Aتصميم غرفة
التدفق الوعائية مجموعةثقافة النوع الأمريكي المتوسط (ATCC)PCS-100-030ثقافة الخلايا
الخلايا البطانية تصنيع أنابيب العامة التعليمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  2. Suowen, X., et al. Endothelial dysfunction in atherosclerotic cardiovascular diseases and beyond: From mechanism to oharmacotherapies. Pharmacol Rev. 73 (3), 924(2021).
  3. Jansen, K. A., Atherton, P., Ballestrem, C. Mechanotransduction at the cell-matrix interface. Sem Cel Dev Biol. 71, 75-83 (2017).
  4. Tarbell, J. M., Pahakis, M. Y. Mechanotransduction and the glycocalyx. J Int Med. 259 (4), 339-350 (2006).
  5. Topper, J. N., Cai, J., Falb, D., Gimbrone, M. A. Identification of vascular endothelial genes differentially responsive to fluid mechanical stimuli: cyclooxygenase-2, manganese superoxide dismutase, and endothelial cell nitric oxide synthase are selectively up-regulated by steady laminar shear stress. Proc Natl Acad Sci. 93 (19), 10417-10422 (1996).
  6. Mitchell, G. F., et al. Arterial stiffness and cardiovascular events. Circulation. 121 (4), 505-511 (2010).
  7. Bonetti, P. O., Lerman, L. O., Lerman, A. Endothelial dysfunction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (2), 168-175 (2003).
  8. Hamrangsekachaee, M., et al. Endothelial glycocalyx sensitivity to chemical and mechanical sub-endothelial substrate properties. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1250348(2023).
  9. Mensah, S. A., et al. Flow-regulated endothelial glycocalyx determines metastatic cancer cell activity. FASEB J. 34 (5), 6166-6184 (2020).
  10. Russell-Puleri, S., et al. Fluid shear stress induces upregulation of COX-2 and PGI2 release in endothelial cells via a pathway involving PECAM-1, PI3K, FAK, and p38. Am J Physiol-Heart Cir Physiol. 312 (3), H485-H500 (2016).
  11. Hamrangsekachaee, M., Wen, K., Bencherif, S. A., Ebong, E. E. Atherosclerosis and endothelial mechanotransduction: current knowledge and models for future research. Am J Physiol-Cell Physiol. 324 (2), C488-C504 (2022).
  12. Zhu, M., et al. Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency. Sci Rep. 9 (1), 6863(2019).
  13. Kim, J., Bencherif, S. A., Li, W. A., Mooney, D. J. Cell-friendly inverse opal-like hydrogels for a spatially separated co-culture system. Macromol Rapid Comm. 35 (18), 1578-1586 (2014).
  14. Orr, A. W., et al. The subendothelial extracellular matrix modulates NF-kappaB activation by flow: a potential role in atherosclerosis. J Cell Biol. 169 (1), 191-202 (2005).
  15. Hamrangsekachaee, M., Baumann, H. J., Pukale, D. D., Shriver, L. P., Leipzig, N. D. Investigating mechanisms of subcutaneous preconditioning incubation for neural stem cell embedded hydrogels. ACS Appl Bio Mater. 5 (5), 2176-2184 (2022).
  16. Rezaeeyazdi, M., Colombani, T., Memic, A., Bencherif, S. A. Injectable hyaluronic acid-co-gelatin cryogels for tissue-engineering applications. Materials. 11 (8), 1374(2018).
  17. Belvitch, P., Htwe, Y. M., Brown, M. E., Dudek, S. Cortical actin dynamics in endothelial permeability. Curr Top Membr. 82, 141-195 (2018).
  18. Krishnamoorthy, S., Noorani, B., Xu, C. Effects of encapsulated cells on the physical-mechanical properties and microstructure of gelatin methacrylate hydrogels. Int J Mol Sci. 20 (20), 5061(2019).
  19. Jin, Q., et al. Bioprinting small-diameter vascular vessel with endothelium and smooth muscle by the approach of two-step crosslinking process. Biotechnol Bioeng. 119 (6), 1673-1684 (2022).
  20. Villard, P., et al. Autoclavable and injectable cryogels for biomedical applications. Adv Healthcare Mater. 8 (17), 1900679(2019).
  21. Bencherif, S. A., et al. Influence of cross-linker chemistry on release kinetics of PEG-co-PGA hydrogels. J Biomed Mater Res A. 90 (1), 142-153 (2009).
  22. Rogers, Z. J., Zeevi, M. P., Koppes, R., Bencherif, S. A. Electroconductive hydrogels for tissue engineering: Current status and future perspectives. Bioelectricity. 2 (3), 279-292 (2020).
  23. James, B. D., Allen, J. B. Vascular endothelial cell behavior in complex mechanical microenvironments. ACS Biomater Sci Eng. 4 (11), 3818-3842 (2018).
  24. Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), e4688(2012).
  25. Fioretta, E. S., Fledderus, J. O., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. Influence of substrate stiffness on circulating progenitor cell fate. J Biomech. 45 (5), 736-744 (2012).
  26. Geemen, D. v, et al. F-Actin-anchored focal adhesions distinguish endothelial phenotypes of human arteries and veins. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (9), 2059-2067 (2014).
  27. Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Comm Biol. 4 (1), 764(2021).
  28. Estrada, R., Giridharan, G. A., Nguyen, M. D., Prabhu, S. D., Sethu, P. Microfluidic endothelial cell culture model to replicate disturbed flow conditions seen in atherosclerosis susceptible regions. Biomicrofluidics. 5 (3), 32006(2011).
  29. Inglebert, M., et al. The effect of shear stress reduction on endothelial cells: A microfluidic study of the actin cytoskeleton. Biomicrofluidics. 14 (2), 024115(2020).
  30. Noria, S., et al. Assembly and reorientation of stress fibers drives morphological changes to endothelial cells exposed to shear stress. Am J Pathol. 164 (4), 1211-1223 (2004).
  31. Amer, M., Shi, L., Wolfenson, H. The 'Yin and Yang' of cancer cell growth and mechanosensing. Cancers (Basel). 13 (19), 4754(2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Endothelial CellsShear StressGelMA HydrogelsFlow ChamberLaminar FlowConfocal MicroscopyMechanotransductionVascular Diseases
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة