مقالة منهجية

إنشاء نموذج فأر لبطانة الرحم الرقيقة

2.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67084

⸱

نوفمبر 1, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Key Laboratory of Reproductive Immunology for Peri-implantation, Shenzhen Zhongshan Institute for Reproductive Medicine and Genetics, Shenzhen Zhongshan Obstetrics and Gynecology Hospital (formerly Shenzhen Zhongshan Urology Hospital), 2Guangdong Engineering Technology Research Center of Reproductive Immunology for Peri-Implantation, 3School of Biomedical Engineering, Shenzhen Campus of Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لإنتاج بطانة الرحم الرقيقة الموثوقة والقابلة للتكرار مع معدل وفيات منخفض للغاية والحد الأدنى من الالتصاقات داخل الرحم عن طريق حقن 95٪ من الإيثانول في رحم الفأر في غضون 1-3 دقائق.

الملخص

تم التعرف على بطانة الرحم الرقيقة (TE) على نطاق واسع كسبب خطير للعقم. ومع ذلك، لا يزال التسبب في TE غير واضح، ولا تزال هناك حاجة ماسة إلى خيارات علاجية مرضية. تم تطوير العديد من النماذج الحيوانية ل TE ، لكن نموذج الفأر الذي يتضمن جراحة في البطن وحقن 95٪ من الإيثانول يمثل تحديا هائلا بسبب ارتفاع معدل الوفيات وخطر الالتصاقات داخل الرحم إذا لم يتم إجراؤه بشكل صحيح. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا ينتج TE موثوقا وقابلا للتكرار مع معدل وفيات منخفض للغاية والحد الأدنى من الالتصاقات داخل الرحم عن طريق حقن 95٪ من الإيثانول في رحم الفأر بأوقات تسريب متفاوتة. أظهرت النتائج أن جميع الفئران نجحت في تطوير TE مع أوقات تسريب تتراوح من 1-3 دقائق ، تتميز بانخفاض نموذجي في سمك بطانة الرحم وعدد الغدد ، بالإضافة إلى تليف بطانة الرحم المفرط. تشير هذه النتائج إلى أن نموذج الفأر هذا مناسب لدراسة بطانة الرحم الرقيقة ويمكن أن يكون بمثابة منصة لتطوير علاجات TE المستقبلية.

المقدمة

بطانة الرحم الرقيقة (TE) هي حالة خطيرة في أمراض النساء والتوليد تصيب غالبا النساء في سن الإنجاب. يتم تشخيص TE عندما يبلغ سمك بطانة الرحم أقل من 7 مم في الفحص بالموجات فوق الصوتية ، مصحوبا بتجويف الرحم الطبيعي ، ويرتبط ارتباطا وثيقا بفشل الحمل1،2. تشير التقديرات إلى أن ما يقرب من 1.5٪ -9.1٪ من النساء اللواتي يخضعن لعلاج الإخصاب في المختبر (IVF) سيختبرون TE ، مما يجعله تحديا متزايدا في الطب التناسلي3،4،5. تشمل الأسباب الأكثر شيوعا للعودة إلى الماء الإصلاح غير السليم لبطانة الرحم بعد الفصل الجراحي للالتصاقات داخل الرحم والكشط ، والتي غالبا ما تكون مصحوبة باضطراب في توزيع الأوعية الدموية والغدد المتناثرة6،7،8. حتى الآن ، لا تزال الآليات الخلوية والجزيئية الخلفية ل TE غير واضحة. إن تعافي بطانة الرحم في مرضى TE يستغرق وقتا طويلا، على الرغم من استكشاف العلاج بالإستروجين والعلاج بجرعة منخفضة من الأسبرين كتدخلاتمحتملة 9. لذلك ، فإن الدراسة المتعمقة للتسبب في TE هي النهج الأكثر مباشرة لمواجهة تحديات هذه الحالة. ومع ذلك ، فإن الدراسات حول التسبب في TE تعتمد على النماذج الحيوانية ، مما يجعل اختيار النموذج المناسب أمرا بالغ الأهمية.

أظهرت معظم الدراسات النسيجية المرضية لبطانة الرحم الرقيقة (TE) أن ضعف تكاثر الخلايا الظهارية والضامة ، وانخفاض التعبير عن مستقبلات هرمون الستيرويد المبيضي ، والترسب المفرط للمصفوفة خارج الخلية ، والشيخوخة الخلوية هي أهم السمات المرضية ل TE6،9،10. حاليا ، تم تطوير نماذج مختلفة من الفئران لتقليد TE ، بما في ذلك النماذج الناجمة عن الخدش11،12،13 ، ونقص التروية14 ، والإصابة الحرارية15 ، والإصابة الكيميائية16،17،18،19. يتم تحفيز نموذج الفئران عن طريق خدش بطانة الرحم بإبرة أو قسطرة ، مما يؤدي غالبا إلى التصاقات داخل الرحم (IUA) بدلا من TE11،12،20،21،22. كما تم الإبلاغ عن نموذج TE الناجم عن نقص التروية في الفئران ، حيث يتم تحقيق نقص تروية بطانة الرحم عن طريق إجراء ربط شريان الرحم الثنائي ، مما يؤدي إلى تقليل سمك بطانة الرحم. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تستغرق وقتا طويلا ، وتتطلب ثلاثة أشهر ، ولا تستخدم على نطاق واسع للبحث14. في النموذج الناجم عن الإصابة الحرارية ، يتم استخدام أنبوب تلقيح اصطناعي لضخ 85 درجة مئوية من الماء المسخن مسبقا في جانب واحد من قرن الرحم من خلال التقاء الجانبين ، مما يجعله أكثر تعقيدا من الطرق الأخرى15. يتضمن النموذج المستحث عن المواد الكيميائية حقن 95٪ من الإيثانول في قرن الرحم المكشوف لإتلاف بطانة الرحم بأكملها. يقدم هذا النموذج مزايا التكلفة المنخفضة والفترة التجريبية القصيرة لدراسة الآليات والعلاجات المرضية في TE ، ولكنه يستخدم بشكل أساسي في الفئران بدلا من الفئران16،17،23. على الرغم من وجود نماذج حيوانية مختلفة ، وخاصة نماذج الفئران ، إلا أن لكل منها حدودها. يمكنهم فقط محاكاة جوانب معينة من TE ، وعدد قليل من نماذج الفئران تكرر عن كثب خصائص مرض TE بينما تكون أيضا مريحة ومتعددة الاستخدامات للبحث.

في هذا السياق ، قمنا بتطوير نموذج فأر بطانة الرحم الرقيق (TE) الجديد عن طريق ضخ 95٪ من الإيثانول في تجويف الرحم باستخدام نهج التدرج الزمني مع طريقة معدلة24 (الشكل 1). أظهرت النتائج أن جميع الفئران نجحت في تطوير TE عندما تراوح وقت التسريب من 1-3 دقائق ، مما يعرض خصائص نموذجية مثل انخفاض سمك بطانة الرحم ، وتقليل الغدة ، وزيادة تليف بطانة الرحم. تشير هذه النتائج إلى أن نموذج الفأر الخاص بنا هو أداة مناسبة لدراسة TE ويمكن أن يكون بمثابة منصة لتطوير علاجات TE المستقبلية.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في مستشفى Shenzhen Zhongshan لأمراض النساء والتوليد (مستشفى Shenzhen Zhongshan لجراحة المسالك البولية سابقا) ، حيث تم إجراء جميع التجارب على. تم استخدام إناث الفئران C57BL / 6 (العمر 6-8 أسابيع ، الوزن 18-20 جم) في هذه الدراسة. تم إيواء جميع في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) في نفس الغرفة وتأقلمت لمدة أسبوع واحد قبل التجارب في غرفة بدون مسببات أمراض محددة عند (22 ± 1) درجة مئوية تحت دورة ضوء / ظلام مدتها 12 ساعة. تم تزويدهم بحرية الحصول على الطعام والماء. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحديد الشبق

ملاحظة: مرحلة الشبق في الفئران قابلة للمقارنة مع المرحلة الأصفرية المتأخرة عند البشر ، مع بطانة بطانة الرحم السميكة نسبيا في هذا الوقت. يضمن اختيار الفئران في الشبق لتحريض النموذج أنها في حالة فسيولوجية متسقة نسبيا. بالإضافة إلى ذلك ، تكون نتائج ترقق بطانة الرحم أكثر وضوحا عندما يكون سمك بطانة الرحم سميكا نسبيا. للحصول على تفاصيل حول هذا الإجراء، يرجى الرجوع إلى التقارير المنشورةسابقا 25،26.

  1. تحضير 20 ميكرولتر من المحلول الملحي باستخدام ماصة. من خلال الإمساك بجانبي أذني الفأر وتثبيت ذيل الفأر ، أدخل طرف الماصة برفق في فتحة المهبل على عمق 2 مم تقريبا. ضعي 20 ميكرولتر من المحلول الملحي في المهبل واشطفيه برفق لمدة 5 دورات.
  2. اسحب المحلول الملحي وانقله بالتساوي إلى شريحة نظيفة. اتركه يتبخر ويجف بشكل طبيعي في درجة حرارة الغرفة.
  3. ضع 30 ميكرولتر من الإيثانول على كل شريحة لإصلاح الخلايا. اترك الإيثانول يتبخر لمدة 5 دقائق حتى تجف الشريحة.
  4. ضع 50 ميكرولتر من محلول تلطيخ البنفسج البلوري على كل شريحة وصمة عار الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  5. اشطف كل شريحة بالماء منزوع الأيونات لإزالة الصبغة الزائدة وتقليل البقع غير المحددة.
  6. راقب مورفولوجيا الخلية وحدد نسبة أنواع الخلايا تحت المجهر.
  7. راقب دورات الشبق للفئران مرتين متتاليتين لضمان الاستقرار. حدد الفئران في الشبق الثالث للتجربة.
    ملاحظة: تستمر دورة الشبق في الفئران عادة من 4 إلى 5 أيام وتنقسم إلى أربع مراحل: البروستروس ، الشبق ، الميتيستروس ، وديستروس. يستمر Proestrus حوالي 24 ساعة ويتميز بخلايا ظهارية ذات نواة مستديرة إلى بيضاوية (الشكل 2 أ). يستمر فتوري ما بين 12 ساعة و 48 ساعة ويتميز بخلايا ظهارية متقرنة في الغالب (الشكل 2 ب). يستمر Metestrus لمدة تصل إلى 24 ساعة ويتميز بمزيج من الخلايا الظهارية الكيراتينية المضغوطة والعدلات (الشكل 3C). يستمر Diestrus ما بين 48 ساعة و 72 ساعة ويتميز بمزيج من العدلات والخلايا الظهارية ذات النواة وعدد قليل من الخلايا الكيراتينية منوية النواة (الشكل 2 د).

2. تصميم المجموعة

ملاحظة: لتقييم تأثير الفترات المختلفة لضخ الإيثانول بنسبة 95٪ على استقرار نموذج TE ، تم إنشاء ست مجموعات علاجية. خضعت مجموعة واحدة لعملية جراحية زائفة دون إعطاء الإيثانول لتكون بمثابة عنصر تحكم في التأثيرات الإجرائية. تم تقسيم الفئران المصابة ب TE الناجم عن الإيثانول بشكل عشوائي إلى خمس مجموعات علاجية بناء على وقت التسريب (ن = 5 لكل مجموعة) على النحو التالي:

  1. مجموعة لمدة 1 دقيقة: حقن الإيثانول في تجويف الرحم لمدة 1 دقيقة.
  2. 2- دقيقة المجموعة: حقن الإيثانول في تجويف الرحم لمدة دقيقتين.
  3. مجموعة 3 دقائق: حقن الإيثانول في تجويف الرحم لمدة 3 دقائق.
  4. 4- دقيقة للمجموعة: حقن الإيثانول في تجويف الرحم لمدة 4 دقائق.
  5. 5- دقيقة للمجموعة: حقن الإيثانول في تجويف الرحم لمدة 5 دقائق.

3. تحريض نموذج TE في الفئران

  1. تخدير الفئران باستخدام آلة تخدير تحتوي على 5٪ إيزوفلوران و 100٪ أكسجين لمدة 3 دقائق (باتباع بروتوكول معتمد مؤسسيا). حافظ على التخدير عند 1٪ -3٪ إيزوفلوران باستخدام مخروط الأنف. ضع مرهما بيطريا على عيون الفئران لمنع الجفاف أثناء التخدير. راقب معدل التنفس بقرصة إصبع القدم طوال العملية.
  2. استخدم شريطا طبيا لتأمين أطراف الفئران وإبقائها في وضع ضعيف على طاولة العمليات المسخنة مسبقا ببطانية إلكترونية. اسحب لسان الفئران برفق قليلا لمنع انسداد مجرى الهواء.
    ملاحظة: يساعد الحفاظ على دفء الفئران أثناء الجراحة في الحفاظ على وظيفة المناعة والدورة الدموية ، ويمنع التخثر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن سحب ألسنة الفئران يضمن تنظيف المسالك التنفسية لتجنب الاختناق أثناء التخدير.
  3. ضعي كريم إزالة شعر على الجزء السفلي من البطن من الفئران لمدة 3 دقائق. أزيلي الشعر بمناديل نظيفة. تطهير المنطقة بنسبة 75٪ من الإيثانول واليودوفور.
  4. قم بعمل شق 1 سم في البطن ، على بعد 1 سم من فتحة مجرى البول. استخدم مقصا معقما وملقطا لتمديد الشق وصولا إلى التجويف البريتوني.
  5. حركي الأحشاء برفق جانبا باستخدام ملقط معقم لتحديد موقع الرحم وفضح قرن الرحم الأيمن. ضع المشابك المرقئة في الطرف القريب من عنق الرحم والطرف البعيد بالقرب من المبيض.
    ملاحظة: يضمن تثبيت طرفي قرن الرحم عدم حدوث تسرب أثناء حقن الإيثانول ، مما يمنع تلف عنق الرحم والمهبل والمبيض.
  6. غرس ما يقرب من 50 ميكرولتر من 95٪ إيثانول27 في تجويف الرحم باستخدام حقنة 25 جم ، مع إبرة موازية لاتجاه قرن الرحم. أدخل الإبرة في تجويف الرحم بزاوية 30 درجة. احتفظ بالحقنة لمدة 1 دقيقة أو 2 دقيقة أو 3 دقائق أو 4 دقائق أو 5 دقائق حسب الاقتضاء. اسحب الإيثانول واغسل تجويف الرحم بمحلول ملحي معقم 5 مرات لإزالة أي إيثانول متبقي. وبالمثل ، قم بغرس كمية متساوية من المحلول الملحي المعقم في قرن الرحم الأيسر كعنصر تحكم ، باتباع نفس الإجراءات.
    ملاحظة: تأكد من أن إبرة المحقنة موازية لاتجاه قرن الرحم. تجنب إدخال الإبرة بزاوية شديدة الانحدار لمنعها من اجتياز قرن الرحم بأكمله. اسحب الإيثانول بشكل كامل قدر الإمكان لتجنب التلف المستمر وعدم الاستقرار التجريبي.
  7. قم بإزالة المشابك وأعد الرحم والأحشاء إلى وضعها الأصلي.
  8. خياطة الصفاق بخيوط جراحية قابلة للامتصاص 5-0 بولي جليكوليد ، متبوعة بخياطة البشرة بخيوط جراحية من البولي جليكوليد 5-0 غير قابلة للامتصاص.
  9. تطهير الشق بنسبة 75٪ من الإيثانول واليودوفور ، ثم أعد إلى قفصها. بعد الجراحة ، لاحظ عن كثب ما إذا كان معدل ضربات قلب الفأر يزداد تدريجيا وثابتا حتى يتعافى الفأر تماما ويمكنه التحرك بشكل طبيعي (الشكل 3A-H).
    ملاحظة: تم توفير مسكن فموي (3.2 مجم / مل أسيتامينوفين في مياه الشرب) في اليوم السابق للجراحة واستمر طوال الفترة المتبقية من الدراسة.
  10. راقب الفئران في الساعة 9:00 و 15:00 كل يوم وقم بتطهير الشق باليودوفور للتأكد من أنها في حالة جيدة.

4. جمع العينات

  1. القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع العمود الفقري العنقي أثناء التخدير العميق بعد 7 أيام من العلاج بالإيثانول بنسبة 95٪ (باتباع بروتوكول معتمد مؤسسيا).
  2. قطع الغرز لكشف الرحم باستخدام مقص جراحي.
  3. استخرج الرحم بالكامل بعناية وببطء باستخدام ملقط جراحي. افصل الرحم عن الأحشاء المحيطة.
  4. قم بإزالة قرني الرحم على الفور وقسم كل قرن إلى 3-4 أجزاء صغيرة.
  5. أضف 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل باستخدام ماصة. الحفاظ على أنسجة الرحم في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة للتثبيت.

5. جفاف الأنسجة

ملاحظة: يتم تحقيق جفاف الأنسجة باستخدام معالج الأنسجة الأوتوماتيكي (انظر جدول المواد).

  1. ضع العينات المثبتة بالفورمالين في أشرطة الأنسجة.
  2. انقل أشرطة الأنسجة من خلال سلسلة من تركيزات الإيثانول المتزايدة لتجفيف الأنسجة على النحو التالي: 70٪ إيثانول لمدة ساعة واحدة ، 85٪ إيثانول لمدة ساعة واحدة ، 95٪ إيثانول مرتين (1 ساعة لكل منهما) ، و 100٪ إيثانول مرتين (1 ساعة لكل منهما).
  3. استبدل الإيثانول بالزيلين بنسبة 100٪ (135 دقيقة للغمر الأول ، و 20 دقيقة لكل غمر لاحق مرتين) للتأكد من أن البارافين يخترق الأنسجة.
  4. اغمر أشرطة المناديل في البارافين في حاضنة عند 60-65 درجة مئوية (3 مرات ، 140 دقيقة لكل منهما) ، واحتفظ بالكاسيت دافئا حتى يتم تضمينها.

6. تضمين البارافين

ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوات باستخدام مركز تضمين الأنسجة المعياري (انظر جدول المواد).

  1. املأ قالب الشمع بشمع البارافين المنصهر المسخن إلى 55 درجة مئوية.
  2. استخدم ملقطا ساخنا لنقل الأجزاء المخللة بسرعة من كاسيت التضمين إلى قالب الشمع ، مما يضمن أن المقطع العرضي لكل جزء يقع بالتوازي مع قاعدة القالب.
  3. بمجرد وضع الأجزاء بشكل صحيح ، ضع الجزء السفلي من كاسيت التضمين أعلى قالب الأنسجة.
  4. ضع القالب مباشرة على لوح تبريد مضبوطة على 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل للسماح للبارافين بالتصلب.
  5. بعد أن يصلب الشمع ، قم بإزالة العينة من القالب واستخدم أداة تشذيب البارافين لتقليم أي شمع زائد حولها.

7. تقسيم البارافين

  1. تحضير حمام مائي عند 42 درجة مئوية. ضع كتل البارافين على طبق بارد قبل التقطيع للسماح لها بالتبريد وتسهيل تقليمها.
  2. قم بتثبيت العينة المضمنة في البارافين على ميكروتوم دوار بحيث يكون سطح الأنسجة متجها لأعلى.
  3. قسم 20 ميكرومتر في المرة الواحدة لإزالة البارافين الزائد الذي يغطي الأنسجة حتى يتم الوصول إلى مستوى الأنسجة المطلوب.
  4. قطع أقسام 4 ميكرومتر في المرة الواحدة.
  5. انقل الشريط المقسم بالبارافين إلى حمام الماء الدافئ 42 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
  6. التقط الأقسام من سطح الماء وضعها على شريحة مجهرية بعد فتحها.
  7. جفف الشرائح في حاضنة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

8. تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوسين

ملاحظة: يتم إجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين باستخدام آلة تلطيخ الشرائح الآلية (انظر جدول المواد).

  1. قم بإعداد جميع الكواشف مسبقا قبل البدء في إجراء التلوين.
  2. انقع الشرائح في 100٪ زيلين لمدة 10 دقائق و 5 دقائق و 3 دقائق على التوالي.
  3. أعد ترطيب الشرائح في سلسلة الإيثانول المتناقصة في الماء منزوع الأيونات على النحو التالي: 100٪ إيثانول ، 95٪ إيثانول (مرتين) ، و 80٪ إيثانول ، لمدة دقيقتين لكل منهما.
  4. اشطف الشرائح بالماء منزوع الأيونات.
  5. تلطخ الشرائح في محلول الهيماتوكسيلين لمدة 10 دقائق. اشطف الشرائح بالماء منزوع الأيونات لمدة 1 دقيقة أو حتى يختفي الماء من اللون الأرجواني.
  6. اغمس الشرائح في محلول تمايز الإيثانول الحمضي بنسبة 0.5٪ مرتين لمدة 3-5 ثوان في كل مرة. اشطف الشرائح بالماء منزوع الأيونات لمدة 1 دقيقة.
  7. ضع الشرائح في مخزن مؤقت مزرق (محلول أمونيا 1٪) لمدة 1 دقيقة. اشطف الشرائح بالماء منزوع الأيونات لمدة 1 دقيقة.
  8. قم بتجفيف الشرائح بنسبة 80٪ من الإيثانول ثم اغمسها في محلول عمل eosin-Y لمدة 10 ثوان.
  9. انقل الشرائح إلى 95٪ من الإيثانول واشطفها مرتين لمدة 10 ثوان لكل منهما. بعد ذلك ، انقل الشرائح إلى الإيثانول المطلق وقم بتجفيفها مرتين لمدة 10 ثوان لكل منهما.
  10. اغمس الشرائح في 100٪ زيلين لتنظيف الأنسجة مرتين ، لمدة دقيقتين لكل منهما.
  11. ضع غطاء على المنديل وأغلقه بالراتنج الطبيعي.

9. تلطيخ ماسون

  1. قم بإزالة الأنسجة عن طريق نقع الشرائح في 100٪ زيلين لمدة 10 دقائق و 5 دقائق و 3 دقائق على التوالي.
  2. بعد إزالة الفلافينات ، انقع الشرائح في سلسلة متناقصة من الإيثانول في ماء منزوع الأيونات: 100٪ إيثانول ، 95٪ إيثانول (مرتين) ، و 80٪ إيثانول ، لمدة دقيقتين لكل منهما.
  3. اشطف الشرائح بالماء منزوع الأيونات.
  4. قم بتلطيخ الشرائح في محلول الهيماتوكسيلين الحديدي من Weigert لمدة 5 دقائق ، ثم اغسل الشرائح بالماء منزوع الأيونات لمدة 30 ثانية.
  5. قم بتمييز ألوان هياكل الأنسجة الملطخة عن طريق احتضان الشرائح في كحول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 1٪ لمدة 15 ثانية.
  6. اشطف الشرائح بالماء منزوع الأيونات لمدة 30 ثانية.
  7. احتضان الأنسجة في محلول أزرق لمدة 3-5 دقائق.
  8. اشطف الشرائح بالماء منزوع الأيونات لمدة 30 ثانية.
  9. ضع الشرائح في محلول Ponceau-Acid Fuchsin لمدة 5-10 دقائق.
    ملاحظة: امزج الماء منزوع الأيونات والمحلول الحمضي الضعيف بنسبة 2: 1 لتحضير محلول العمل الحمضي الضعيف.
  10. اشطف الشرائح بمحلول العمل الحمضي الضعيف لمدة 30 ثانية.
  11. قم بتمييز الأنسجة في محلول حمض الفوسفوموليبديك لمدة 1-2 دقيقة ، ثم اشطف الأقسام بمحلول عمل حمضي ضعيف لمدة 30 ثانية.
  12. تلطخ أقسام الأنسجة بمحلول أنيلين أزرق لمدة 1-2 دقيقة.
  13. قم بتجفيف أقسام الأنسجة بسرعة في 95٪ إيثانول لمدة 2-3 ثوان ، متبوعا ب 100٪ إيثانول مرتين لمدة 5-10 ثوان لكل منهما. امسح الشرائح في الزيلين مرتين ، لمدة 1-2 دقيقة لكل منهما.
  14. ضع غطاء على المنديل وأغلقه بالراتنج الطبيعي.
  15. صفي الراتنج الزائد واتركي الشرائح تجف.

10. التصوير والتحليل

  1. التقط صورا للأقسام باستخدام نظام الماسح الضوئي للشرائح.
    ملاحظة: استخدم هدف 4x أو 10x للحصول على نظرة عامة على الأقسام. للحصول على صور أكثر تفصيلا، استخدم أهدافا من 20 ضعفا إلى 100 ضعفا.
  2. قم بإجراء تحليل كمي لسمك بطانة الرحم وعدد الغدد ومدى تليف الأنسجة باستخدام منصة تحليل الصور HALO.
    ملاحظة: يتم الحصول على متوسط السماكة عن طريق قياس المسافة الرأسية من تجويف الرحم إلى عضل الرحم في 5 مجالات رؤية مختارة عشوائيا.

11. التحليلات الإحصائية

  1. إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام SPSS الإصدار 23.0 (SPSS Inc. ، شيكاغو ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية).
  2. تقييم الدلالة الإحصائية للفروق التجريبية بين المجموعات الضابطة والنموذجية عن طريق إجراء اختبار التوزيع العادي أولا.
  3. تقديم البيانات التي يتم توزيعها عادة كمتوسط ± SEM.
  4. تحليل البيانات من مجموعات العلاج المختلفة باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه. اضبط المقارنات المتعددة لعدد الأليلات المختبرة في كل موضع باستخدام طريقة Bonferroni. ضع في اعتبارك قيمة P <0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

السمات الرئيسية لبطانة الرحم الرقيقة (TE) هي انخفاض سمك بطانة الرحم والكثافة الغدية ، إلى جانب زيادة تليف بطانة الرحم. نجحت هذه الطريقة في تكرار هذه الخصائص في الفئران النموذجية. كشف تحليل البيانات عن انخفاض معتد به في سمك بطانة الرحم في المجموعة التي مدتها دقيقة واحدة (222.3 ميكرومتر ± 13.96 ميكرومتر مقابل 359.2 ميكرومتر ± 12.41 ميكرومتر ، ص < 0.05) ، ومجموعة مدتها دقيقتان (168.7 ميكرومتر ± 17.57 ميكرومتر مقابل 359.2 ميكرومتر ± 12.41 ميكرومتر ، ص < 0.05) ، ومجموعة 3 دقائق (131.8 ميكرومتر ± 3 ميكرومتر مقابل 359.2 ميكرومتر ± 12.41 ميكرومتر ، P < 0.05) عند مقارنتها بالمجموعة الضابطة. ومع ذلك ، لم يلاحظ أي فرق كبير في سمك بطانة الرحم بين المجموعات التي مدتها 2 دقيقة و 3 دقائق (168.7 ميكرومتر ± 17.57 ميكرومتر مقابل 131.8 ميكرومتر ± 3 ميكرومتر ، ص > 0.05) (الشكل 3 أ ، ب).

انخفض عدد الغدد البطاقية بشكل ملحوظ في المجموعة التي مدتها دقيقة واحدة (4.4 ± 2.38 مقابل 24.4 ± 1.6 ، ص < 0.05) ، والمجموعة التي استمرت دقيقتين (0.8 ± 0.49 مقابل 24.4 ± 1.6 ، ص < 0.05) ، ومجموعة 3 دقائق (4.4 ± 3.20 مقابل 24.4 ± 1.6 ، ص < 0.05) عند مقارنتها بالمجموعة الضابطة (الشكل 3 أ ، ج). ومع ذلك ، لم يلاحظ فرق كبير في عدد الغدد بطانة الرحم بين المجموعات التي تبلغ مدتها 1 دقيقة و 2 دقيقة و 3 دقائق.

نظرا لأن TE حدث بعد العلاج بالإيثانول بنسبة 95٪ لمدة 7 أيام ، فقد تم الافتراض بأن سمك بطانة الرحم قد يكون مرتبطا بمدة التسريب. للتحقيق في ذلك ، عولجت مجموعتان إضافيتان بنسبة 95٪ من الإيثانول لمدة 4 دقائق و 5 دقائق على التوالي. ومن المثير للاهتمام أن النتائج أظهرت التصاق شديد بالرحم عند زيادة وقت التسريب. (الشكل 4) ، حيث يصبح تجويف الرحم غير مرئي تقريبا. بالإضافة إلى ذلك ، لم يلاحظ أي غدد بطانة الرحم في رحم الفأر مع وقت التسريب المطول (الشكل 4).

علاوة على ذلك ، زاد مستوى تليف بطانة الرحم مع مدة تسريب الإيثانول بنسبة 95٪ ، كما أكد تلطيخ ماسون ، مما يشير إلى التليف المفرط في بطانة الرحم التالفة (الشكل 5 أ ، ب).

figure-results-1
الشكل 1: مخطط انسيابي لتأسيس نموذج الماوس TE. يتضمن الإجراء بأكمله الخطوات التالية: أولا ، سمح للفئران بالتأقلم لمدة أسبوع واحد قبل التجربة. بعد ذلك ، تمت مراقبة دورتين من الشبق. ثم تم اختيار الفئران في الشبق الثالث لإنشاء نموذج عن طريق حقن 95٪ من الإيثانول في تجويف الرحم. بعد سبعة أيام من حقن الإيثانول ، تم التضحية بالفئران ، وتم جمع قرون الرحم لمزيد من تلطيخ HE وتحليل تلطيخ Masson. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تحديد الشبق في الفئران. (أ) يتميز Proestrus بغلبة الخلايا الظهارية ذات النواة (السهم). (ب) يتميز الفتوري بغلبة الخلايا الظهارية الكيراتينية منزوعة النواة (العلامات النجمية). (ج) يتميز Metestrus بمزيج من الخلايا الظهارية الكيراتينية المنزعة النواة والعدلات (المثلث). (د) يتميز ديستروس بمزيج من العدلات والخلايا الظهارية ذات النواة وعدد قليل من الخلايا الكيراتينية المنزعة النواة. التكبير الموضوعي 20x. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: إجراء تحريض TE عن طريق تسريب الإيثانول بنسبة 95٪. (أ) يتم تخدير الفئران باستخدام آلة التخدير. (ب) تتم إزالة شعر البطن. (ج) يتم إجراء شق بطول 1 سم على بعد 1 سم من فتحة مجرى البول. (د) يقع الرحم ، وأحد جوانب القرن الرحمي مكشوف. (ه) يتم تطبيق المشابك المرقئة على جانبي قرن الرحم. (F) يتم غرس 95٪ من الإيثانول في قرن الرحم ثم يتم غسله بمحلول ملحي معقم. (ز) تتم إزالة المشابك وإعادة الرحم. (ح) يتم خياطة الشق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: ملاحظة مورفولوجيا بطانة الرحم في الفئران باستخدام تلطيخ بطانة الرحم تحت الفحص المجهري. (أ) تم فحص مورفولوجيا بطانة الرحم على الجانبين المصاب وعنصر التحكم. تم حقن الرحم الأيمن بنسبة 95٪ من الإيثانول ، بينما تم حقن الرحم الأيسر بمحلول ملحي معقم كعنصر تحكم. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. (ب) مقارنة سمك بطانة الرحم بين مجموعات Con ، 1 دقيقة ، 2 دقيقة ، و 3 دقائق. (ج) مقارنة عدد الغدد في بطانة الرحم بين مجموعة Con ، مجموعات 1 دقيقة ، 2 دقيقة ، 3 دقائق ، 4 دقائق ، و 5 دقائق. يخدع ، السيطرة. ** P < 0.01 ، ****P < 0.0001 مع ANOVA أحادي الاتجاه. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تليف بطانة الرحم في بطانة الرحم الفأر. (أ) تم استخدام تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان لتقييم تليف بطانة الرحم ، حيث يشير اللون الأزرق إلى توزيع ألياف الكولاجين ، في مجموعات العلاج المشار إليها. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. (ب) يوضح المخطط الشريطي الملخص مستوى تليف الكولاجين بين المجموعات المختلفة. ** P < 0.01 ، ***P < 0.001 ، ****P < 0.0001 مع ANOVA أحادي الاتجاه. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

يتميز TE بعدم كفاية تكاثر الخلايا والخلايا المختلة ، وترتبط ارتباطا وثيقا بالعقم والإجهاض المتكرر وتشوهات المشيمة2،3. لسوء الحظ ، لا يوجد حاليا علاج فعال ل TE. تلعب النماذج الحيوانية دورا مهما في دراسة هذه الحالة. بين عامي 2014 و 2024 ، تم استخدام الفئران ككائنات نموذجية في 16.4٪ من 208,000 دراسة (34,200 دراسة) والفئران في 22.7٪ (47,300 دراسة). يمكن أن يعزى الاستخدام المتزايد للفئران في التجارب إلى مزاياها على النماذج الأخرى ، لا سيما إمكاناتها في دراسات التجديد28،29،30. نظرا لأهمية اتساق النموذج ، هناك حاجة متزايدة لأدوات أكثر توافقا لإجراء دراسات باستخدام الفئران كنماذج31.

تشمل الطرق الشائعة لتحفيز نماذج TE ، كما ورد في الدراسات السابقة ، الخدش11،12 ، ونقص التروية14 ، والإصابة الحرارية15 ، والإصابة الناجمة عن المواد الكيميائية16،17،23. لتسهيل استخدام النماذج الحيوانية في دراسات TE وإرساء الأساس للعلاجات الفعالة ، أنشأ Gao et al.24 لأول مرة نموذج TE في فئران SD عن طريق حقن الإيثانول المطلق لمدة 5 دقائق لإصابة بطانة الرحم. على الرغم من أن هذه الطريقة تقيد نمو بطانة الرحم ، إلا أنها غالبا ما تؤدي إلى التصاقات شديدة في تجويف البطن ، بمعدل بقاء 70٪ فقط.

في السابق ، كان 95٪ من الإيثانول يستخدم في الغالب في الفئران نظرا لسهولة تطبيقه ، لكن هذه الطريقة ولدت عددا قليلا من نماذج الفئران لدراسات TE. بعد الملاحظات السريرية ، ومراجعة شاملة للأدبيات ، والتجارب المسبقة ، والمناقشات المتكررة ، والتحليل ، تم تطوير طريقة محسنة مع وقت أقصر لتسريب الرحم. تسمح التقنيات الماهرة بحقن 95٪ من الإيثانول في تجويف الرحم لإنشاء نموذج TE بأوقات تسريب متفاوتة.

يعتمد نموذج الفأر الذي تم تقديمه في هذه الدراسة على مبادئ نموذج جاو24. ومع ذلك ، تم إجراء العديد من التعديلات ، بما في ذلك تقصير وقت ضخ الإيثانول وزيادة وتيرة التنظيف الملحي. في هذا النموذج ، تعرض رحم الفأر عن طريق تشريح البطن ، وتم حقن 95٪ من الإيثانول في جانب واحد من قرون الرحم لفترات مختلفة: 1 دقيقة ، 2 دقيقة ، 3 دقائق ، 4 دقائق ، و 5 دقائق. بفضل التحكم الدقيق في وقت ضخ الإيثانول والإجراء الموحد ، تم تحقيق بيانات مستقرة في تجارب الفئران ، مما قلل من الانحرافات بسبب الاختلافات الفردية بين الفئران.

تظهر النتائج النسيجية تغيرات واضحة في سمك بطانة الرحم ، وعدد الغدد البطانية الرحمية ، وتليف بطانة الرحم بدرجات متفاوتة بين الفئران TE ، مما يؤكد موثوقية النموذج الذي تم إنشاؤه في هذه الدراسة3،6،9. والجدير بالذكر أنه عندما تجاوز وقت ضخ الإيثانول 4 دقائق أو 5 دقائق ، لوحظت التصاقات شديدة داخل الرحم (IUA). تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن إنشاء نموذج الفأر TE بشكل فعال من خلال 1-3 دقائق من ضخ الإيثانول بنسبة 95٪ ، في حين أن أوقات التسريب التي تتجاوز 3 دقائق قد تحفز IUA شديدا.

حتى الآن ، تم تطوير العديد من النماذج الحيوانية لدراسة TE ، بما في ذلك الخدش ، ونقص التروية ، والنماذج التي يسببها الحرارة ، والنماذج التي يسببها المواد الكيميائية. على الرغم من أن النموذج الناجم عن الخدش ، على الرغم من أنه أسهل في الأداء ، غالبا ما يؤدي إلى التصاقات داخل الرحم (IUA) بدلا من TE. يتطلب نموذج TE الناجم عن نقص التروية مدة أطول بكثير من النموذج المستحث عن المواد الكيميائية ، والطريقة المستحثة حراريا أكثر تعقيدا ويصعب تنفيذها مقارنة بالحث الكيميائي. على الرغم من أن النموذج المستحث عن المواد الكيميائية فعال من حيث الوقت ومستقر ، إلا أن له قيودا محتملة ، مثل الصدمة التي تلحق بالحيوانات ومخاطر العدوى أو الوفاة بسبب التقنية غير السليمة. يمكن التخفيف من هذه المشكلات من خلال التدريب الدقيق والخبرة.

في الختام ، توضح النتائج أنه يمكن إنشاء نموذج الماوس TE بشكل فعال عن طريق حقن 95٪ من الإيثانول في تجويف الرحم لمدة 1-3 دقائق. يقدم هذا النهج طريقة واعدة لدراسة الآليات المرضية وعمليات إصلاح TE ، ولتطوير علاجات فعالة للمرضى الذين يعانون من هذه الحالة.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر الحكام المجهولين على تعليقاتهم المهمة والمفيدة. تم دعم هذا العمل من قبل مشروع شنتشن للعلوم والتكنولوجيا (رقم 1). JCYJ20220818103207016) ومؤسسة قوانغدونغ للبحوث الأساسية والتطبيقية (رقم 2024A1515010478).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
آلة التخديرRWD Life ScienceR530آلة التخدير الاستنشاقية المتنقلة للحيوانات الصغيرة
0.9٪ محلولملحي Hubei Kelun Pharmaceutical   ؛C230817A210 مل ، حقن طبي
75٪ إيثانولLIRCON6303060031500 مل ، كاشف مطهر
95٪ مصنع كاشفكيميائي قوانغتشو64-17-5500 مل ، كاشف كيميائي
خيوط قابلة للامتصاصJinhuan MedicalCR537السماكة: 5-0 ؛ الطول: 90 سم
الأمونيا المائيةMilliporeSigma1336-21-61000 مل ، كاشف كيميائي
معالج الأنسجة الأوتوماتيكيLeicaTP1020يمكن معالجة صناديق التضمين 100 في وقت واحد
C57BL / 6 فئران & nbsp ؛مركز التجريبية بالجامعة الطبية الجنوبية  
Eosin-YBASOBA40241000 مل ، يستخدم لتلوين أقسام البارافين ، والأقسام المجمدة ، وما إلى ذلك
HaematoxylinBASOBA40411000 مل ، يستخدم لتلوين أقسام البارافين ، والأقسام المجمدة ، وما إلى ذلك
HALO Image Analysis PlatformIndicalabs تتميز الأداة بسهولة الاستخدام وقابلية التوسع ، وقدرات تحليلية قوية ، وأسرع معالجة سرعة
المشابك المرقئHUAYON18-50211.8 سم في الطول الإجمالي مع 0.7 سم الفك
ملقط مرقئHUAYON18-502010 سم في الطول الإجمالي
HistoCore Rotary MicrotomeLeica149BIO000C1يتراوح سمك الشريحة من 1 إلى 60 مو ؛ م
IndorphorADF1005500 مل ، كاشف مطهر
IsofluraneRWD Life ScienceR510-22-10100 مل ، المكون النشط 100٪ الأيزوفلوران
ثلاثي الألوان من ماسونSOLARBIOG13407 & مرات ؛ 100 مل ل 100 اختبار
شريحة مجهرGene TechGT100511الطول: 75 سم ؛ العرض: 25 سم
مركز تضمين الأنسجة المعياريLeicaEG1150 Cتحتوي الأداة على مرحلة باردة ووحدة توزيع بارافين ساخنة ، مما يوفر المرونة لعمل التضمين
الراتنج الطبيعيSAKURA4770فيلم مطلي بالراتنج ، مناسب لتلوين الأنسجة
أوليمبوس SLIDEVIEW VS200PANOVUEVS200تلتقط الأداة صور شرائح افتراضية عالية الجودة وتمكن من تحليل الصور الكمي المتقدم.
محلول إصلاح بارافورمالدهايدServicebioG1011500 مل ، مثبت أنسجة عالمي (محايد)
ملقط جراحيHUAYON18-13002.2 مم مستقيم ، عرض 12.5 سم
مقص جراحيHUAYON18-011010 سم ، مقص جراحي من الفولاذ المقاوم للصدأ
حقنةيرجى600170311 مل ، حقنة معقمة يمكن التخلص منها مع
منديل إبرة أشرطةCITOTEST80106-1100-16أبيض ؛ فتحات متدفقة من خلال ، غطاء متكامل من 0ne قطعة ؛ تقع مناطق الملصقات على ثلاثة جوانب
Tissue-Tek Prisma PlusSAKURADRS-Prisma-P-JCSقدرة المعالجة هي 60 شريحة في وقت واحد
XyleneGuangdong Guanghua Sci-Tech1330-20-71000 مل ، مذيب عضوي

المراجع

  1. Mahajan, N., Sharma, S. The endometrium in assisted reproductive technology: How thin is thin. J Hum Reprod Sci. 9 (1), 3-8 (2016).
  2. Liu, X., et al. Thin endometrium is associated with the risk of hypertensive disorders of pregnancy in fresh IVF/ICSI embryo transfer cycles: A retrospective cohort study of 9,266 singleton births. Reprod Biol Endocrinol. 19 (1), 55(2021).
  3. Liu, K. E., Hartman, M., Hartman, A. Management of thin endometrium in assisted reproduction: A clinical practice guideline from the Canadian Fertility and Andrology Society. Reprod Biomed Online. 39 (1), 49-62 (2019).
  4. Wang, Y., Tang, Z., Teng, X. New advances in the treatment of thin endometrium. Front Endocrinol (Lausanne). 15, 1269382(2024).
  5. Saad-Naguib, M. H., Kenfack, Y., Sherman, L. S., Chafitz, O. B., Morelli, S. S. Impaired receptivity of thin endometrium: Therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1268990(2023).
  6. Lv, H., et al. Deciphering the endometrial niche of human thin endometrium at single-cell resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (8), e2115912119(2022).
  7. Gharibeh, N., et al. Cell-based therapy in thin endometrium and Asherman syndrome. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 33(2022).
  8. Lei, L., et al. Angiogenic microspheres for the treatment of a thin endometrium. ACS Biomater Sci Eng. 7 (10), 4914-4920 (2021).
  9. Maekawa, R., et al. Thin endometrium transcriptome analysis reveals a potential mechanism of implantation failure. Reprod Med Biol. 16 (2), 206-227 (2017).
  10. Xu, L., Fan, Y., Wang, J., Shi, R. Dysfunctional intercellular communication and metabolic signaling pathways in thin endometrium. Front Physiol. 13, 1050690(2022).
  11. Hu, J., Song, K., Zhang, J., Zhang, Y., Tan, B. Z. Effects of menstrual blood-derived stem cells on endometrial injury repair. Mol Med Rep. 19 (2), 813-820 (2019).
  12. Kim, Y. Y., et al. Efficient production of murine uterine damage model. Tissue Eng Regen Med. 16 (2), 119-129 (2019).
  13. Chen, K., et al. A novel method to repair thin endometrium and restore fertility based on menstruation-derived stem cell. Reprod Sci. 31 (6), 1662-1673 (2024).
  14. Hu, J., Yuan, R. Decreased expression of C-kit and telomerase in a rat model of chronic endometrial ischemia. Med Sci Monit. 17 (4), Br103-Br109 (2011).
  15. Wang, G., Ren, C., Jiang, J. Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on repair and receptivity of damaged endometrium in rats. J Obstet Gynaecol Res. 47 (9), 3223-3231 (2021).
  16. Lin, J., et al. Microenvironment-protected exosome-hydrogel for facilitating endometrial regeneration, fertility restoration, and live birth of offspring. Small. 17 (11), e2007235(2021).
  17. López-Martínez, S., et al. Bioengineered endometrial hydrogels with growth factors promote tissue regeneration and restore fertility in murine models. Acta Biomater. 135, 113-125 (2021).
  18. Haghighi, L., et al. Angiogenic lipid-based drug delivery system (phytosolve) for treatment of a thin endometrium in animal model. Tissue Cell. 90, 102481(2024).
  19. Saleem Raheem, S., Falah Hasan, H., Hashim Abid Ali, A., Mansour Jasim, A. Effectiveness of histopathological changes of induced thin layer endometrium by pentoxifylline and pentoxifylline-loaded poly lactic-co-glycolic acid on female rats. Arch Razi Inst. 78 (6), 1762-1770 (2023).
  20. Feng, Q., et al. Establishment of an animal model of intrauterine adhesions after surgical abortion and curettage in pregnant rats. Ann Transl Med. 8 (4), 56(2020).
  21. Bazoobandi, S., et al. Induction of Asherman's syndrome in rabbit. J Reprod Infertil. 17 (1), 10-16 (2016).
  22. Bai, X., et al. Therapeutic effect of human amniotic epithelial cells in rat models of intrauterine adhesions. Cell Transplant. 29, 963689720908495(2020).
  23. Liu, J., et al. The effects and mechanisms of GM-CSF on endometrial regeneration. Cytokine. 125, 154850(2020).
  24. Yan-Ping, L. Establishment and identification of rat thin endometrium model. Life Sci Res. , https://api.semanticscholar.org/CorpusID:88150888 (2011).
  25. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicol Pathol. 43 (6), 776-793 (2015).
  26. Quignon, C. Collection and analysis of vaginal smears to assess reproductive stage in mice. Curr Protoc. 3 (9), e887(2023).
  27. Yi, K. W., et al. marrow-derived cells or C-X-C motif chemokine 12 (CXCL12) treatment improve thin endometrium in a mouse model. Biol Reprod. 100 (1), 61-70 (2019).
  28. Nakada, Y., et al. Hypoxia induces heart regeneration in adult mice. Nature. 541 (7636), 222-227 (2017).
  29. Mylonas, K. J., et al. Cellular senescence inhibits renal regeneration after injury in mice, with senolytic treatment promoting repair. Sci Transl Med. 13 (594), eabb0203(2021).
  30. Mckellar, D. W., et al. Large-scale integration of single-cell transcriptomic data captures transitional progenitor states in mouse skeletal muscle regeneration. Commun Biol. 4 (1), 1280(2021).
  31. Elzat, E. Y., et al. Establishing a mouse contusion spinal cord injury model based on a minimally invasive technique. J Vis Exp. 187, e64538(2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة