هنا ، نصف طرق وشم Xenopus laevis البالغ (ضفدع أفريقي مخلبي) باستخدام آلة وشم دوارة. ينتج عن الوشم المناسب أرقام داكنة يسهل قراءتها تدوم لعدة أشهر وتجعل قابلة للتمييز بسهولة لأغراض البحث وحفظ السجلات.
مقالة منهجية
طرق وشم Xenopus laevis باستخدام آلة الوشم الدوارة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعمل النماذج الحيوانية على توسيع نطاق البحوث الطبية الحيوية ، مما يعزز فهمنا للبيولوجيا التنموية والجزيئية والخلوية وتمكين الباحثين من نمذجة الأمراض البشرية. يسمح تسجيل وتتبع الفردية للباحثين بتقليل عدد المطلوبة للدراسة وتحسين الممارسات لتحسين رفاهية. توجد العديد من الطرق الموثقة جيدا لوضع علامات على الثدييات وتتبعها ، بما في ذلك تثقيب الأذن وعلامات الأذن. ومع ذلك ، فإن طرق تمييز أنواع البرمائيات المائية محدودة ، حيث أن الموارد الحالية قديمة أو غير فعالة أو باهظة التكلفة. في هذه المخطوطة ، نوضح الطرق وأفضل الممارسات لتمييز Xenopus laevis بآلة وشم دوارة. ينتج عن الوشم المناسب وشم عالي الجودة ، مما يجعل الأفراد قابلين للتمييز بسهولة للباحثين ويشكل الحد الأدنى من المخاطر على صحة. نسلط الضوء أيضا على أسباب الوشم ذي الجودة الرديئة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى ظهور وشم يتلاشى بسرعة ويسبب ضررا غير ضروري للحيوانات. يسمح هذا النهج للباحثين والأطباء البيطريين بوضع علامات على البرمائيات ، مما يمكنهم من تتبع النسخ البيولوجية والخطوط المعدلة وراثيا والاحتفاظ بسجلات دقيقة لصحة.
المقدمة
النماذج الحيوانية هي أدوات مفيدة للتحقيق في الأسئلة المتعلقة بصحة الإنسان. في الممارسة العملية ، تتطلب البحوث الطبية الحيوية باستخدام النماذج الحيوانية تنظيما دقيقا وصيانة مستعمرة حيوانية صحية. تهدف أفضل الممارسات للتعامل الأخلاقي مع وتربيتها إلى تقليل عدد اللازمة للتجارب وتحسين الممارسات لضمان رعاية1. جنس الضفدع المخالب ، بما في ذلك Xenopus laevis (X. laevis; الضفدع الأفريقي ذو المخالب) و Xenopus tropicalis (X. tropicalis; الضفدع الغربي المخالب) ، وقد استخدمت في البحوث الطبية الحيوية منذ ثلاثينيات القرن العشرين عندما تم استخدام X. laevis من قبل أطباء جنوب أفريقيا لإجراء اختبارات الحمل الأولى2. في حين أن اختبارات الحمل الحديثة لم تعد تتطلب الضفادع ، إلا أن دور أبحاث Xenopus لا يزال قائما. تشمل مزايا استخدام Xenopus للبحوث الطبية الحيوية الجينومات المشروحةجيدا 3 ، والإباضة المستحثة على مدار العام لبراثن كبيرة من البيض4 ، والبيض الموضوعة خارجيا القابلة للتخصيب في المختبر . هذه الميزات تجعلها رصيدا مفيدا لعلم أجنة الفقاريات وتطورها5،6،7 ، والبيولوجيا الجزيئية والخلوية الأساسية7،8،9،10 ، ونمذجة الأمراض البشرية7،11،12،13.
تعد الطرق الموثوقة لتتبع Xenopus الفردية ضرورية لتسجيل النسخ البيولوجية وتحسين الدقة والتكاثر في البحث. نظرا لأن Xenopus غالبا ما يتم إيواؤه في مجموعات ، فإن وضع العلامات على يسمح للباحثين بتتبع الفردية بسهولة4. يمكن أن يؤدي الاحتفاظ بسجل دقيق للحيوانات إلى توفير الوقت والموارد وتحسين القدرة على تتبع صحة. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي التعرف الفردي على إلى تحسين سير عمل المنظمة لتوليد خطوط Xenopus المعدلة وراثيا ، حيث يتطلب ذلك أجيالا متعددة من الضفادع ذات الأنماط الجينية المحددة التي تم التحقق منها عن طريق التسلسل14 ، الأمر الذي يتطلب التنظيم والتعرف الفردي على. هذا صحيح بشكل خاص عندما تفتقر هذه الطفرات إلى الأنماط الظاهرية للبالغين التي يمكن تمييزها بسهولة. وبالمثل ، فإن استخدام بويضات Xenopus والأجنة لدراسة البيولوجيا الخلوية والتنموية الأساسية يستفيد من تتبع الفردية. بعد تحفيز الإباضة ، تحتاج إلى الراحة لمدة لا تقل عن 3 أشهر لمنع المضاعفات الصحية مثل متلازمة فرط الإباضة15. تضمن طرق تحديد الهوية الفردية عدم حث على الإباضة بشكل متكرر.
كما يمكن وضع العلامات على وتتبعها موظفي المختبر من تتبع المخاوف الصحية للحيوانات. يمكن أن تشير من نفس النمط الوراثي التي تصاب بالمرض إلى زواج الأقارب المفرط أو المخاوف الصحية غير المتوقعة المرتبطة بجين التحوير. وبالمثل ، يمكن أن تشير إصابة بالمرض بعد الإباضة الأخيرة إلى مشاكل في الكواشف أو المواد أو التقنيات. يمكن تتبع وصحتها موظفي المختبرات والأطباء البيطريين من المتابعة عند ظهور المخاوف واتخاذ تدابير وقائية لمنع المرض في المستقبل. في الثدييات ، هناك العديد من طرق تحديد الهوية. تشمل الطرق الدائمة للفئران تثقيب الأذن ، وعلامات الأذن ، والوشم ، والرقائق الدقيقة تحت الجلد16. يمكن أن تميز هذه بشكل واضح وموثوق داخل مستعمرة أو قفص ويمكن إدارتها بسهولة من قبل موظفي المختبر. طرق مثل تثقيب الأذن طفيفة التوغل ، وتتطلب قطعة واحدة فقط من المعدات المتخصصة ، وتعمل مع من معظم الأعمار. في حين أن هذه الأنظمة واضحة ومفيدة للفئران ، فإن استخدامها في الضفادع يمثل مجموعة فريدة من التحديات. تفتقر الضفادع والبرمائيات الأخرى إلى صيوان الأذن (بنية الأذن الخارجية). قام بعض الباحثين بإرفاق علامات على فك أو إصبع قدمه أو أطرافه الخلفية17,18. أدى هذا النهج إلى مشاكل مختلفة: تسببت علامات الفك في تهيج ، وحاولت الضفادع المهتاجة سحب العلامات بأطرافها الأمامية17. اخترقت علامات أصابع القدم الحزام بين أصابع القدم ، مما أضعف الحركة وتحمل خطر الضياع. على هذا النحو ، تتطلب البرمائيات طرقها الخاصة لتحديد الهوية. تاريخيا ، تم استخدام قص أصابع القدم أيضا لتمييز البرمائيات17,19. يتم قص إصبع القدم بمقص حاد ، ويمكن التعرف على من خلال طول أصابع القدم على القدمين الأماميتين والقدمين الخلفيتين أو من خلال الزاوية التي نما بها إصبع القدم مرة أخرى (في السمندل). ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تشكل قلقا أخلاقيا من أن قص إصبع القدم قد يضعف حركة17. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يسبب هذا النزيف وإدخال خطر العدوى. نظام آخر راسخ لوضع العلامات هو الطعوم الذاتية للجلد ، حيث يتم أخذ الجلد من جزء من الضفدع وربطه جراحيا بجزء آخر. على سبيل المثال ، يتم وصف طريقة لتمييز ظهر الضفدع أو كتفه باستخدام طعم جلدي فاتح اللون من صدره20. تأتي ترقيع الجلد أيضا مع قيود ومخاطر: الإجراء غازي ويعرض خطر الإصابة بعدوى Aeromonas hydrophila ، أو الساق الحمراء ، وهي إصابة قاتلة. يستغرق الشفاء التام للطعم الذاتي ما يصل إلى 6 أسابيع ؛ ومع الطرق الموصوفة ، يمكن إيواء 6 ضفادع فقط معا بسبب الأماكن المحدودة لوضع الطعم الذاتي20.
تشمل طرق وضع العلامات الأقل توغلا الخرز الزجاجي ورقائق جهاز الإرسال والاستقبال17,19. في طريقة الخرزة الزجاجية ، يتم ربط الخرز الزجاجي على خياطة صغيرة وخياطتها في جلد الضفدع. يوفر هذا تنوعا أكبر من الطعوم الذاتية للجلد ، مع ما لا يقل عن 60 مجموعة ألوان مميزة. ومع ذلك ، هناك خطر من أن الخيط يمكن أن يخرج ويؤدي إلى فقدان الخرز. بدلا من ذلك ، يمكن زرع جهاز إرسال واستقبال رقاقة تحت الجلد في الكيس الليمفاوي الظهري للضفدع. تعتبر هذه الطريقة الأكثر ديمومة لوضع العلامات وتمكن من تحديد عدد لا حصر له من وفهرستها بشكل فردي. ومع ذلك ، فهذه أيضا أغلى طريقة ، حيث أن الرقائق الفردية باهظة الثمن ، وسيكون وضع علامة على مستعمرة كبيرة مكلفا. تتطلب الرقائق الدقيقة أيضا ماسحا ضوئيا خاصا لقراءة19. أحد الأساليب الشائعة لتحديد Xenopus هو الإشارة إلى التلوين والزخرفة الطبيعية للحيوانات. هذا يعمل بشكل جيد بشكل خاص مع الضفادع مثل X. laevis ، والتي لها أنماط مميزة تبقى طوال مرحلة البلوغ. ومع ذلك ، يمكن أن تتغير هذه الأنماط بمرور الوقت مع الإجهاد ، ويمكن أن يظهر التلوين مختلفا عند نقل الضفادع بين الحاويات الشفافة والملونة15. بالإضافة إلى ذلك ، فإن طريقة التعريف هذه أقل فائدة ل X. tropicalis ، التي لها أنماط تمييز أقل تميزا مقارنة ب X. laevis ، أو للحيوانات البيضاء ، التي ليس لها علامات ملونة21. حتى بالنسبة للأنواع ذات العلامات المميزة ، يمكن لموظفي المختبر تفسير موضع العلامات وحجمها بشكل مختلف ، مما قد يتسبب في حدوث أخطاء في تحديد الهوية. لهذا السبب ، يكون تصوير أكثر موثوقية بالاقتران مع طريقة تحديد إضافية. لذلك ، نسعى إلى تمييز وتحديد Xenopus باستخدام تقنية يسهل تمييزها ودائمة وطفيفة التوغل.
هناك موارد منشورة محدودة تصف طرق وشم البرمائيات. تم وصف الوشم جنبا إلى جنب مع تقنيات العلامات التجارية الأخرى ، بما في ذلك العلامات التجارية الحرارية وماركات نترات الفضة والعلامات التجاريةللتجميد 17. في نفس المورد ، تم إجراء الوشم عن طريق رسم الأرقام بإبرة تحت الجلد 27G ، ولوحظ أن العملية لا تسبب العدوى ، على عكس تقنيات العلامات التجارية الأخرى ، التي استخدمت سلكا على شكل رقم أو علامة أخرى. في مصدر آخر ، تم استخدام آلة الوشم الكهربائية (الموصوفة بأنها إبرة تهتز) لتمييز الضفادع ، ولكن تم تقديم القليل من التفاصيل حول التقنية 17,19. يحذر المؤلفون من أنه من خلال إزعاج طبقة الوحل الواقية للضفدع ، فإن هذا الإجراء يزيد من خطر احمرار الساق. على الرغم من عدم وجود طريقة لوضع العلامات أو تحديد الهوية تكون غير جراحية تماما (مثل الصور الفوتوغرافية) ودائمة (مثل الرقائق الدقيقة) ، فإن الوشم يوفر حلا وسطا فعالا. الوشم بسيط نسبيا مقارنة بالتقنيات الأخرى ، مثل الطعوم الذاتية للجلد. تشمل المزايا الإضافية منحنى تعليمي أصغر ومعدات غير مكلفة نسبيا. يأتي وشم البرمائيات المائية مع بعض التحديات التي يمكن أن تخيف الباحثين وتضعف العلامات الحيوانية الناجحة. تهدف هذه الورقة إلى تزويد الباحثين بطرق موثقة جيدا لوشم Xenopus البالغ باستخدام آلة الوشم الدوارة.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في كلية دارتموث.
1. إعداد المعدات
ملاحظة: يتم تضمين سير عمل للإجراء ومثال على إعداد مقاعد البدلاء (الشكل 1).
- قم بتوصيل مسدس الوشم ودواسة القدم بمصدر الطاقة. ضع دواسة القدم تحت سطح العمل.
- تجميع مسدس الوشم
- باستخدام مفتاح ألين أو مفك البراغي السداسي ، قم بفك البراغي الموجودة في المقبض (الشكل 2 أ ، محاط باللون الأحمر).
- أدخل الطرف البلاستيكي بالكامل في المقبض. أحكم ربط المسمار لتثبيته في مكانه.
- أدخل الأنبوب المعدني في الجزء الخلفي من القبضة (الشكل 2 أ). سيتم تعديل هذا ، لذا أدخله إلى نصف طوله. أحكم ربط المسمار لتثبيته في مكانه.
- أدخل إبرة وشم في الجزء الخلفي من القبضة بحيث تستقر بشكل مريح في الطرف البلاستيكي في مقدمة القبضة (الشكل 2 ب).
- حرك الجزء الخلفي من الإبرة والأنبوب المعدني من خلال مشبك الأنبوب. اضبط الأنبوب المعدني بحيث تتناسب الإبرة بشكل مريح مع الطرف البلاستيكي (الشكل 2 ب). شد مشبك الأنبوب يدويا حتى يصبح الأنبوب غير قادر على الحركة (الشكل 2C).
- قم بإزالة الحلقة السوداء O واربط الإبرة بذراع الدوار ؛ استبدل الحلقة O لتثبيت الإبرة في مكانها (الشكل 2C).
- اضبط الجهد على مصدر الطاقة بحيث يكون هناك طاقة كافية لاختراق الجلد ولكن ليست قوية بحيث يصعب التحكم فيها. بمجرد توصيل مصدر الطاقة وتوصيله ، اضغط على دواسة القدم للتأكد من عمل الجهاز. احرص على عدم توجيه الإبرة إلى نفسك أو إلى أفراد آخرين.
ملاحظة: تعمل آلة الوشم المستخدمة في هذا البروتوكول بشكل أفضل بين 6.0 و 9.0 فولت ، ولكن قد يختلف هذا بين آلات الوشم وإمدادات الجهد ويجب تحديده تجريبيا. - املأ غطاء أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 1.5 مل أو وعاء الحبر البلاستيكي المزود بحبر الوشم الأسود إلى حوالي ثلاثة أرباع ممتلئ.
2. التخدير
- تحضير التخدير في خزان كبير بما يكفي لغمر أنثى واحدة بالغة X. laevis الضفدع.
- باستخدام ماء آمن للضفادع (خال من الكلور) ، أضف التريكائين إلى التركيز النهائي البالغ 1.5 جم / لتر وبيكربونات الصوديوم إلى التركيز النهائي البالغ 3.5 جم / لتر. اخلطيها حتى تذوب. الرقم الهيدروجيني لهذا المحلول هو 7.15.
تنبيه: تريكايين مهيج.
- باستخدام ماء آمن للضفادع (خال من الكلور) ، أضف التريكائين إلى التركيز النهائي البالغ 1.5 جم / لتر وبيكربونات الصوديوم إلى التركيز النهائي البالغ 3.5 جم / لتر. اخلطيها حتى تذوب. الرقم الهيدروجيني لهذا المحلول هو 7.15.
- اغمر ضفدعا واحدا في خزان التخدير. تأكد من بقاء الضفدع مغمورا في محلول التريكائين حتى يتم تخديره (7-8 دقائق).
- للتحقق مما إذا كان الضفدع مخدرا بالكامل ، التقطه ، وأمسكه رأسا على عقب ، واضغط عليه بقوة على قدم واحدة. إذا لم يتوانى الضفدع أو يستجيب ، فيمكن وشمه.
- إذا استغرقت الضفادع باستمرار أكثر من 10 دقائق لتخديرها ، فقم بإعداد محلول تريكايين طازج مخزن ببيكربونات الصوديوم.
ملاحظة: يجب ألا تقضي الضفادع أكثر من 30 دقيقة في محلول التريكائين15.
3. الوشم
ملاحظة: قبل وشم حي ، قد يكون من المفيد التدرب على قطعة من الفاكهة ذات قشرة صلبة (مثل الليمون أو الموز).
- قم بإعداد خزان استرداد للضفادع قبل الوشم. املأ خزانا ب 10-15 لترا من المياه العذبة الآمنة للضفادع وأضف جزيرة الستايروفوم. سيوفر هذا سطحا للضفدع ليستيقظ دون الغرق.
ملاحظة: يمكن صنع جزيرة الستايروفوم باستخدام غطاء حاوية الشحن البارد المصنوعة من الستايروفوم الموضوعة داخل كيس بسحاب. - ضع الضفدع المخدر على ظهره على منشفة ورقية جافة أو ورق مقاعد البدلاء (الشكل 3 أ). استخدم مناشف ورقية غير مبيضة (بنية) لجميع الأعمال التي تنطوي على الضفادع.
- باستخدام منديل جاف خال من النسالة ، امسح الماء والمخاط من صدر الضفدع.
- العثور على القص في وسط صدر الضفدع بالأصابع ، وباستخدام اليد غير المهيمنة ، أمسك الجلد مشدودا.
- بمناسبة الضفدع
- أمسك مسدس الوشم المجمع عموديا بالنسبة لسطح العمل واغمس الإبرة في الحبر (الشكل 3 ب).
- حافظ على مسدس الوشم المجمع عموديا ، واضغط على طرف الإبرة على جلد الضفدع قبل الضغط على دواسة القدم. ارسم خطوطا على جلد الضفدع مع الضغط المتساوي.
ملاحظة: بعض النزيف الطفيف أو الاحمرار أمر طبيعي ، وكذلك تقشير الجلد الطفيف. - إذا علقت الإبرة على جلد الضفدع ، فقم بإزالة الحبر الزائد أو الجلد من الإبرة بمسح. الحبر الزائد أمر طبيعي أثناء الوشم.
- إذا كان صدر الضفدع مغطى بالكثير من الحبر بحيث لا يمكن رؤية المنطقة التي يتم تمييزها بوضوح (الشكل 3C) ، فقم بإزالة الحبر الزائد بماء آمن للضفادع ومسح (الشكل 3C). بعد ذلك ، تخلص من الرطوبة بمنديل جاف واستمر في التحبير.
ملاحظة: يمكن تحضير زجاجة ضغط من الماء الآمن للضفادع قبل الوشم. - استمر في الحبر في نفس المنطقة حتى تصبح الأرقام الداكنة مقروءة بعد مسح الحبر الزائد (الشكل 3D). بدلا من رسم العلامة أو الرقم بالكامل بضربة واحدة ، قم بعمل ضربات أصغر بشكل متكرر ، خاصة بالنسبة للمنحنيات.
4. الانتعاش
- بلل منشفة ورقية بماء آمن للضفادع وضعها بشكل مسطح فوق جزيرة الستايروفوم (الشكل 4 أ).
- إعادة الضفادع إلى الدبابات الدائمة
- ضع بطن الضفدع لأسفل على المنشفة المواجهة للماء (الشكل 4 ب). قم بطي نصف المنشفة الورقية فوق النصف الخلفي من الضفدع ، وباستخدام الأيدي المقعرة ، بلل الجزء العلوي من الضفدع. بمجرد خروج الضفدع من التخدير (حوالي 1 ساعة بعد الوشم) ، سوف يدخل الماء بشكل مستقل ويسبح بشكل طبيعي.
- أعد الضفادع إلى سكن طويل الأجل بعد 24 ساعة ، بمجرد أن يلتئم الوشم تماما.
5. التنظيف وصيانة المعدات
- إعادة استخدام وإبر الوشم والتعقيم
- اشطف الإبر في 100٪ الأيزوبروبانول والماء منزوع الأيونات لفك الحبر وفرك الحبر المتبقي الذي لم يذوب.
- بعد الفرك ، ضع الإبر في علبة تعقيم معدنية أو لفها بورق الألمنيوم والأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة في دورة جافة.
- إذا كان هناك حبر على قطع من آلة الوشم أو غيرها من المعدات ، فقم بمسحها باستخدام الإيثانول بنسبة 100٪ ومنشفة ورقية.
- يحتوي محلول التخدير على تركيز تريكايين نهائي يبلغ حوالي 0.5٪. تخلص من هذا وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لإدارة النفايات الخطرة.
- تخزين المعدات وصيانتها
- إذا أمكن ، قم بتخزين آلة الوشم في غرفة جافة. ستؤدي الرطوبة الزائدة إلى إتلاف المكونات الكهربائية وتقليل طول عمر الماكينة.
- للحفاظ على آلة الوشم في حالة عمل جيدة ، تحقق من المحمل الموجود على الدوار (الشكل 2 ج) للتأكد من أنه لم ينفصل عن الاهتزازات22. يمكن تشديد هذا باستخدام مفتاح ألين أو مفك البراغي السداسي.
- حوالي مرة واحدة في الشهر ، قم بتليين المحمل على ذراع الدوار باستخدام شحم تشحيم سميك22.
- في بعض آلات الوشم ، يمكن أن يتعطل ذراع الدوار ولن يهتز. لتصحيح ذلك ، قم بلف ذراع الدوار أو ضغط الزنبرك بحيث تكون الإبرة في الوضع المنخفض (الشكل 2C).
النتائج
سيكون للوشم عالي الجودة ضربات داكنة ومقروءة على صدر الضفدع ويمكن تمييزه بوضوح من على بعد عدة أقدام (الشكل 5 أ). بشكل عام ، تعد الأرقام والعلامات الأكبر أفضل لسهولة القراءة ، ولكن يمكن تصغير الأسماء والأرقام الأطول لتناسب بشكل مريح صدر الضفدع. يصعب الحكم على طول عمر الوشم ، ولكن يجب أن يظل وشم الضفدع عالي الجودة داكنا ومقروءا لمدة 3-6 أشهر على الأقل (الشكل 5D-D). بمجرد أن يتلاشى الوشم ، يمكن لمسه باستخدام نفس التقنية.
لن تسبب التقنية السيئة ضررا للحيوانات ولكنها قد تؤدي إلى ظهور وشم يتلاشى بسرعة (الشكل 5 ب) ، مما يؤدي إلى المزيد من عمليات اللمس المتكررة. يمكن أن يسبب الوشم المفرط النزيف والاحمرار ، ويمكن أن يؤدي وضع الضفدع في وضع تعافي غير صحيح إلى الغرق غير المقصود.
يمكن تقييم جودة الوشم وفعالية التقنية في الأشهر التالية للوشم (الشكل 5E). طالما يوجد حبر على الضفدع بعد فترة الشفاء ، يعتبر الوشم ناجحا.
الشكل 1: سير عمل البروتوكول وإعداد مقاعد البدلاء. (أ) سير العمل والتوقيت. (1) تقضي الضفادع 7-8 دقائق في التخدير في محلول 1.5 جم / لتر تريكايين و 3.5 جم / لتر بيكربونات الصوديوم ، درجة الحموضة 7.15 ، مذابة في ماء آمن للضفادع. أثناء وشم ضفدع واحد ، يمكن وضع ضفدع ثان على سطح السفينة في خزان التخدير. يمكن أن يكون ضفدع واحد فقط في محلول التريكائين في كل مرة. (2) تقضي الضفادع حوالي 10 دقائق من الماء في الوشم. سيختلف الوقت حسب حجم الوشم وخبرة موظفي المختبر. (3) توضع الضفادع اللاواعية على الستايروفوم لمدة 30-45 دقيقة لمنع الغرق ومغطاة بمنشفة ورقية مبللة لمنعها من الجفاف. (4) بعد الوشم ، تقضي الضفادع 24 ساعة في التعافي في المياه الراكدة العذبة الآمنة للضفادع. بمجرد تعافيها ، يمكن إعادة الضفادع إلى مستعمرتها. (ب) إعداد مقاعد البدلاء لمساحة عمل مثال. تتمركز مساحة عمل الوشم ، وهي منشفة ورقية غير مبيضة ، على المقعد. آلة الوشم وإمدادات الجهد على يسار المنشفة الورقية. يتم وضعها على الجانب المهيمن من الأفراد (الأفراد أعسر). يتم وضع محبرة وحبر وشم بالقرب من مصدر الجهد وبعيدا عن مساحة عمل الوشم. دواسة القدم على نفس جانب مصدر الجهد. يؤدي الضغط على دواسة القدم هذه إلى التحكم في الحركة الدورانية. توجد مناديل خالية من النسالة وزجاجة ضغط بمياه آمنة للضفادع على يمين المنشفة الورقية. تستخدم هذه لتنظيف الحبر الزائد من جلد الضفدع أثناء الوشم. يتم استخدام مفتاح ألين لتشديد وفك البراغي في آلة الوشم. يستخدم هذا لتجميع وتفكيك آلة الوشم. يتم أيضا الاحتفاظ بخزان التخدير والمناشف الورقية الإضافية على المقعد أثناء الوشم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تجميع آلة الوشم. (أ) صورة إبرة الوشم والقبضة والمكونات ذات الصلة مفككة. البراغي الموجودة على القبضة المعدنية محاطة بدائرة باللون الأحمر. ب: صورة لإبرة الوشم مجمعة بشكل مناسب في المقبض. (ج) صورة لإبرة الوشم والقبضة المجمعة في مسدس الوشم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحديد المواقع والصور المرجعية لوشم الضفدع. أ: صورة لضفدع يضع وجهه لأعلى على منشفة ورقية. يشير السهم إلى عظم الضفدع. (ب) صورة لموظفي المختبر وهم يحبرون الضفدع. ( C) صور الأرقام أثناء الكتابة بالحبر وقبل (C) وبعد غسل الحبر الزائد (C'). (د) صورة وشم الضفدع مباشرة بعد التحبير ، قبل الشفاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التعافي بعد الوشم. أ: جزيرة الستايروفوم. يتم وضع غطاء صندوق الثلج الستايروفوم داخل كيس بسحاب. (ب) الضفادع في وضع التعافي بعد الوشم. يمكن أن تتسع جزر الستايروفوم عادة ل 1 أو 2 ضفادع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: أمثلة على النتائج التمثيلية. (أ) وشم جديد بعد 24 ساعة من الوشم. (ب) تقنيات رديئة النوعية. في (ب) ، لم يتم تجميع آلة الوشم بشكل صحيح ولكنها كانت لا تزال قادرة على الحركة الدورانية. تم التقاط هذه الصورة بعد 4 أشهر من الوشم. في (B') ، لم يتم تجميع آلة الوشم بشكل صحيح ولم تكن قادرة على الحركة الدورانية. تم التقاط هذه الصورة بعد 6 أشهر من الوشم. (ج) آلة الوشم المجمعة بشكل غير صحيح. الأنبوب المعدني والطرف البلاستيكي غير موجودين ، ولم يتم تثبيت القبضة المعدنية بشكل صحيح على بقية آلة الوشم. الشريط المطاطي يضعف الحركة الدورانية (D) قبل (D) وبعد (D') للضفدع الموشوم بتقنية جيدة وإعداد مناسب للمعدات. تم أخذ (D) مباشرة بعد الوشم ، وتم أخذ (D') بعد 4 أشهر من الوشم. ه: البيانات الكمية لنتائج وشم الضفدع. من بين الضفادع الموشومة ، كان لدى 100٪ وشم مرئي بعد الوشم مباشرة ، و 100٪ لديهم 24 ساعة بعد الوشم ، و 91٪ لديهم 4 أشهر بعد الوشم. ن = 58 ضفدع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
المناقشة
وشم البشر هو شكل من أشكال الفن يعود تاريخه إلى آلاف السنين ، وطالما أن البشر قد وشموا أنفسهم ، فقد قاموا أيضا بوشم أو وصفهم23. إن معدات وتقنيات وسم ، وخاصة الثدييات ، راسخة وموثقة جيدا ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع. في حين أن تمييز كان في الأصل للتمييز بين الماشية وردع السرقة23 ، أصبح دورها في البحوث الطبية الحيوية بنفس القدر من الأهمية.
من فوائد وشم البرمائيات أن الوشم يشفى في غضون 24 ساعة وسيستمر الوشم الجيد لعدة أشهر (الشكل 5 د). يوفر الوشم مزايا متعددة لإسكان وتربية البرمائيات. يسمح الوشم للباحثين والموظفين البيطريين بتمييز الفردية بسهولة باستخدام أرقام يسهل رؤيتها وتفسيرها ، حتى في الخزانات ذات الصبغات الداكنة19. يمكن أيضا إجراء هذا الإجراء على أي ضفدع بالغ ، مقارنة بالطعوم الذاتية للجلد ، والتي لا ينصح بها للضفادع التي يزيد عمرهاعن عامين 15. الأهم من ذلك ، يسمح الوشم بتحديد عدد كبير من ، مع ثلاثة أرقام على الأقل تتناسب بشكل مريح على صدر X. laevis (الشكل 5 أ).
بالمقارنة مع إرفاق الخرز أو العلامات ، فإن الوشم لا يترك أي شيء يمكن أن يسقط ويسبب تهيجا محدودا17. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح الوشم بتعدد استخدامات أكثر من تقنيات العلامات التجارية الأخرى ، والتي تتطلب تشكيل سلك في العلامة التجارية. الإجراء نفسه أقل إزعاجا بكثير من الطعوم الذاتية للجلد لأنه لا تتم إزالة الأنسجة. ومع ذلك ، مثل الطعوم الذاتية ، فإن الوشم أيضا غازي جزئيا ويعرض خطرا صغيرا للإصابة أو العدوى. هذا جزء ضروري من وضع علامات على أي ، ولكن من المهم للباحثين توخي الحذر من النزيف المفرط أثناء الوشم ومراقبة بحثا عن عدوى A. hydrophilia . يمكن منع ذلك عن طريق الحفاظ على مساحة عمل نظيفة قبل وأثناء وبعد الوشم وعن طريق ضمان شفاء الوشم تماما قبل إعادة إلى مستعمرتها. في كتابة وتطوير هذه الورقة ، لم يصب أي من الضفادع بجروح دائمة أو مات بسبب الوشم. أحد قيود هذا الإجراء هو أنه تم اختباره فقط على الضفادع البالغة التي يزيد عمرها عن 1 سنة. حتى الآن ، لم يتم وشم أي ضفادع بهذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، لم يتم تحسين هذا الإجراء ل X. tropicalis ، التي لها لون داكن على صدرها وستجعل الوشم أقل وضوحا21. في المستقبل ، قد يتم تحديث بروتوكول الوشم هذا ليشمل اعتبارات X. tropicalis.
نظرا لأن موطن Xenopus مائي4 ، فمن الطبيعي أن تتلاشى هذه الأوشام بمرور الوقت. تم توثيق الحاجة إلى استبدال الوشم بشكل متكرر في وشم الشفاه البشرية داخل الفم ، والذي يتلاشى بشكل أسرع من وشم البشرة بسبب التلامس المستمر مع اللعاب والمشروبات24. ومع ذلك ، فإن طول عمر الوشم يعتمد إلى حد كبير على تقنية الوشم. يمكن أن تنبع التقنية السيئة من آلة الوشم التي تم تجميعها بشكل غير صحيح (الشكل 4C) أو إعدادات إمداد الجهد دون المستوى الأمثل. سيمنع ضبط الجهد المنخفض جدا الإبرة من اختراق الجلد ، مما يؤدي إلى ظهور علامات أو خطوط باهتة. ضبط الجهد مرتفع للغاية سيؤدي إلى ضرر غير ضروري للحيوان. مصدر شائع آخر للوشم السيئ يأتي من وضع الإبرة أو الضغط غير الصحيح حيث يحمل الأفراد مسدس الوشم. الوشم بضغط قليل جدا له نفس تأثير ضبط الجهد منخفضا جدا وسيؤدي إلى وشم باهت يتلاشى بسرعة (الشكل 5 ب). أثناء الوشم ، يمكن أن تشعر وكأن الإبرة تقشط جلد الضفدع بدلا من ثقبه. سيؤدي الوشم مع الكثير من الضغط إلى نزيف ملحوظ أو لا يمكن السيطرة عليه. يتم إجراء أفضل وشم بصبر ومنهجية عن طريق التحبير في أقسام قصيرة وتتبع الخطوط بضغط ثقيل وثابت.
بشكل عام ، تفوق فوائد تعليم عن طريق الوشم في البرمائيات العيوب. يتيح التتبع الفردي ل Xenopus في الأبحاث الطبية الحيوية الدقة العلمية في تتبع النسخ البيولوجية ، ويسمح للباحثين والموظفين البيطريين بتقييم رفاهية الفردية ، ويضمن التردد المناسب للإباضة للحفاظ على صحة على المدى الطويل. فيما يتعلق ب 3Rs للبحوث الحيوانية - الصقل والتخفيض والإزالة - هذا البروتوكول هو الأكثر صلة بالصقل والاختزال1. يسهل وضع علامات على الضفادع على الباحثين والأطباء البيطريين تتبع المخاوف الصحية ، وكذلك التأكد من منح الضفادع وقتا كافيا للراحة بين التجارب. وهذا يحسن عملية البحث من خلال ضمان جودة أعلى للبيانات والعينات التي تم جمعها من ، فضلا عن تحسين تربية وممارسات الرعاية. كما أنه يساعد على تحسين قابلية التكاثر في التجارب. بالإضافة إلى ذلك ، يتيح وضع علامات على إعادة استخدامها ، مما يقلل من العدد الإجمالي للحيوانات المطلوبة. يمكن تمييز الضفادع التي تضع بيضا عالي الجودة بشكل خاص أو تكون مفيدة للغاية في تجارب أخرى وتحديدها على أنها أكثر ملاءمة للبحث. إذا لم تكن الضفادع مفيدة باستمرار للتجارب ، فيمكن التعرف عليها وإزالتها من المستعمرة ، مما يوفر الموارد والمساحة. الغرض من هذه الورقة هو توثيق أفضل الممارسات في وشم البرمائيات وتزويد مختبرات Xenopus ببروتوكول وشم مفصل يسهل الوصول إليه. هذه الممارسة ليست شائعة بعد في مجال Xenopus ، ويرجع ذلك جزئيا إلى أن الموارد المنشورة الحالية محدودة. سيمكن هذا المورد الباحثين من تمييز بأمان وفعالية ، وتحسين حفظ السجلات للمستعمرات الكبيرة ، وتحسين استخدام البرمائيات في البحوث الطبية الحيوية.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
نشكر مركز الطب المقارن والبحوث التابع لكلية دارتموث على توفير التربية اليومية للحيوانات المستخدمة في هذا البروتوكول. كما نشكر ليا جاكوب وأدويتا بوس على مساعدتهما في اختبار البروتوكول وتصوير. أخيرا ، نشكر مختبر آن ميلر على التدريب على ممارسة الوشم. تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R00 GM147826 إلى J.L.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 3 بطانات إبرة مستديرة | في جميع أنحاء العالم توريد الوشم | 1203RLB | معبأة معقمة |
| 5 إبرة مستديرة يمكن التخلص منها ULTRA | في جميع أنحاء العالم توريد الوشم | HTIPRS5-U | معبأة معقمة |
| 5 إبرة بطانات مستديرة | في جميع أنحاء العالم توريد الوشم | 1205RLB | معبأة |
| معقمة 7 إبرة بطانات مستديرة | في جميع أنحاء العالم توريد الوشم | 1207RLB | معبأة معقمة |
| مشبك الحبل | في جميع أنحاء العالم توريد الوشم | N / A | |
| دواسة القدم | في جميع أنحاء العالم توريد الوشم | N / A | |
| Inkpots | توريد الوشم في جميع أنحاء | العالم Kimwipes | |
| ، مناديل مهمة دقيقة | فيشر Scientific | 06-666A | |
| RCA اتصال | توريد الوشم في جميع أنحاء العالم | N / A | |
| صرخة حبر الملعب أسود ، 1 أوقية | توريد الوشم في جميع أنحاء العالم | SI101 | |
| بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) | سيجما ألدريتش | S5761 | |
| قبضة الفولاذ المقاوم للصدأ | توريد الوشم في جميع أنحاء العالم | N / A | |
| الشبح 2.0 آلة الوشم | الدوارة في جميع أنحاء العالم توريد الوشم | N / A | |
| الشبح 2.0 الروتاري آلة الوشم مربع مجموعة | في جميع أنحاء العالم توريد الوشم | STEALTH2-SET | |
| جزيرة الستايروفوم | N / A | N / A | هذا هو غطاء حاوية الشحن البارد الستايروفوم |
| Tricaine (إيثيل 3-أمينوبنزونات ميثان سولفات) | Sigma-Aldrich | E10521 | تحذير: مناشف |
| ورقية مهيجة غير مبيضة | Grainger | 2U229 | يجب أن تكون المناشف الورقية غير مبيضة ، المبيض سام للبرمائيات |
| إمدادات الجهد | في جميع أنحاء العالم توريد الوشم | N / A | |
| زجاجة اغسل (بمياه آمنة للضفادع) | إزالة الكلور من Fisher Scientific FB0340923T Frog المياه الآمنة ، درجة الحموضة 7.0-8.5 ، الموصلية 1200-1800 uS | ||
| X. laevis< / em> أنثى بالغة | Xenopus1 | N / A | |
| كيس بلاستيكي بسحاب | N / A | N / A N / A | يجب أن تكون هذه الحقيبة كبيرة بما يكفي لحمل جزيرة الستايروفوم |
المراجع
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals (Basel). 9 (10), 754(2019).
- Elkan, E. R. The Xenopus pregnancy test. British Med J. 2, 1253-1256 (1938).
- Vize, P. D., Zorn, A. M. Xenopus genomic data and browser resources. Dev Biol. 426 (2), 194-199 (2017).
- Sive, H. Xenopus: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Press. (2023).
- Borodinsky, L. N. Xenopus laevis as a model organism for the study of spinal cord formation, development, function and regeneration. Front Neural Circuits. 11, 90(2017).
- Hoppler, S., Conlon, F. L. Xenopus: Experimental access to cardiovascular development, regeneration discovery, and cardiovascular heart-defect modeling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (6), a037200(2020).
- Fisher, M., et al. Xenbase: key features and resources of the Xenopus model organism knowledgebase. Genetics. 224 (1), 018(2023).
- Slater, P. G., Hayrapetian, L., Lowery, L. A. Xenopus laevis as a model system to study cytoskeletal dynamics during axon pathfinding. Genesis. 55 (1-2), 22994(2017).
- Bermudez, J. G., Chen, H., Einstein, L. C., Good, M. C. Probing the biology of cell boundary conditions through confinement of Xenopus cell-free cytoplasmic extracts. Genesis. 55 (1-2), 23013(2017).
- Stooke-Vaughan, G. A., Davidson, L. A., Woolner, S. Xenopus as a model for studies in mechanical stress and cell division. Genesis. 55 (1-2), 23004(2017).
- Blackburn, A. T. M., Miller, R. K. Modeling congenital kidney diseases in Xenopus laevis. Dis Model Mech. 12 (4), 038604(2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Dev Biol. 426 (2), 325-335 (2017).
- Wheeler, G. N., Brändli, A. W. Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: Lessons from zebrafish and Xenopus. Dev Dyn. 236 (6), 1287-1308 (2009).
- Carron, M., et al. Evolutionary origin of Hox13-dependent skin appendages in amphibians. Nat Commun. 15 (1), 2328(2024).
- Schultz, T. W., Dawson, D. A. Housing and husbandry of Xenopus for oocyte production. Lab Animal. 32 (2), 34-39 (2003).
- Cadillac, J. Animal identification systems used for mice. , The Jackson Laboratory. (2006).
- Donnelly, M. A., Guyer, C., Juterbock, J. E., Alford, R. A. Techniques for marking amphibians. Meas Monitor Biol Div: Std Meth Amphibians. , Smithsonian Institute Press. 277-284 (1994).
- Hutchens, S. J., Deperno, C. S., Matthews, C. E., Pollock, K. H., Woodward, D. K. Visible implant fluorescent marker: A reliable marking alternative for snakes. Herpetol Rev. 39 (3), 301-303 (2008).
- Hoogstraten-Miller, S., Dunham, D. Practical identification methods for African clawed frogs (Xenopus laevis). Lab Animal. 26 (7), 36-38 (1997).
- Loopstra, J. A., Zwart, P., Verhoeff-de Fremery, R., Vervoordeldonk, F. J. M. Marking of African clawed toads (Xenopus laevis). Improvement of a skin autograft technique. New Dev Biosci: Their Implicat Lab Animal Sci. , 311-316 (1988).
- Rodel, M. Xenopus tropicalis. AmphibiaWeb. , (2001).
- Worldwide Tattoo Supply. Stealth 2 Rotary Tattoo Machine Intro & Maintenance. Worldwide Tattoo Supply. , (2015).
- Khan, S. U., Mufti, O. The hot history and cold future of brands. J Manager Sci. 1 (1), 75-84 (2007).
- Catlett, T. All About Lip Tattoo: what to Expect, Cost, Risks, Touch-ups & More. Healthline. , (2019).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
