يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل قوي للميتوكوندريا عن أنسجة قلب القوارض

1.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67093

⸱

أغسطس 23, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Michigan State University, 2Department of Kinesiology, Michigan State University

في هذه المقالة

ملخص

كشفت دراسات الطاقة الحيوية والتمثيل الغذائي على الميتوكوندريا عن دورها متعدد الأوجه في العديد من الأمراض ، لكن طرق عزل هذه العضيات تختلف. الطريقة المفصلة هنا قادرة على تنقية الميتوكوندريا عالية الجودة من مصادر أنسجة متعددة. يتم تحديد الجودة من خلال نسب التحكم في الجهاز التنفسي والمقاييس الأخرى التي يتم تقييمها باستخدام قياس إعادة الالتنفس عالي الدقة.

الملخص

يمارس عزل الميتوكوندريا منذ عقود ، باتباع الإجراءات التي وضعها الرواد في مجالات البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية لدراسة ضعف التمثيل الغذائي والأمراض. جودة الميتوكوندريا المتسقة ضرورية للتحقيق بشكل صحيح في فسيولوجيا الميتوكوندريا والطاقة الحيوية. ومع ذلك ، تتوفر العديد من طرق العزل المنشورة المختلفة للباحثين. على الرغم من أن الاستراتيجيات التجريبية المختلفة تتطلب طرق عزل مختلفة ، إلا أن المبادئ والإجراءات الأساسية متشابهة. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة قادرة على استخراج الميتوكوندريا المقترنة جيدا من مجموعة متنوعة من مصادر الأنسجة ، بما في ذلك والخلايا الصغيرة. تشمل الخطوات الموضحة تشريح الأعضاء ، وتنقية الميتوكوندريا ، والقياس الكمي للبروتين ، وفحوصات مراقبة الجودة المختلفة. مقياس مراقبة الجودة الأساسي المستخدم لتحديد الميتوكوندريا عالية الجودة هو نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR). RCR هو نسبة معدل التنفس أثناء الفسفرة المؤكسدة إلى المعدل في حالة عدم وجود ADP. تتم مناقشة المقاييس البديلة. بينما يتم الحصول على قيم RCR عالية بالنسبة لمصدر الأنسجة باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تحسين عدة خطوات لتناسب الاحتياجات الفردية للباحثين. هذا الإجراء قوي وقد أدى باستمرار إلى عزل الميتوكوندريا مع قيم RCR أعلى من المتوسط عبر النماذج الحيوانية ومصادر الأنسجة.

المقدمة

الميتوكوندريا هي عضيات تحت الخلوية تنشئ ظروفا نشطة سيتوبلازمية محسنة لوظائف خلوية معينة. في حين أن الدراسات الخلوية والأنسجة والكائن الحي يمكن أن توفر رؤى حول وظيفة الميتوكوندريا ، فإن عزل العضيات يوفر مستوى من التحكم التجريبي غير ممكن بخلاف ذلك. تم إجراء عزلات الميتوكوندريا منذ الأربعينيات ، مما يسمح بإجراء دراسات ميكانيكية لعملية التمثيل الغذائي والتنفس عبر مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة1،2. الأهمية التاريخية للميتوكوندريا موثقة جيدا3. بصفتها المنتجين الرئيسيين ل ATP ، تلعب الميتوكوندريا العديد من الأدوار الرئيسية الحيوية للوظيفة الخلوية والأعضاء المثلى4. داخل مصفوفة الميتوكوندريا ، تتأكسد الركائز بواسطة دورة TCA ، مما ينتج عنه مكافئات مختزلة وناقلات إلكترونية متنقلة مثل NADH و UQH25،6. السيتوكروم C هو ثالث ناقل إلكتروني متحرك رئيسي في شبكة التفاعل الكيميائي الحيوي للميتوكوندريا7. ثم تتأكسد هذه الجزيئات بواسطة مجمعات الغشاء لنظام نقل الإلكترون (ETS) المضمنة في غشاء الميتوكوندرياالداخلي 8. تقترن تفاعلات الأكسدة والاختزال ل ETS بانتقال البروتون من المصفوفة إلى الفضاء بين الغشاء. تنشئ هذه العمليات تدرجا كهروكيميائيا للبروتون يستخدم لفسفرة ADP مع Pi بواسطة F1F0 ATP synthase لإنتاج ATP9،10. يمكن استكشاف العمليات الفردية التي تحدث في كل مجمع من خلال قياس إعادة الوضوح عالي الدقة باستخدام أقطاب كهربائية من نوع كلارك أو فحوصات استهلاك الأكسجين الدقيقة11،12. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لنماذج المرض والعلاجات التي تستخدم الميتوكوندريا المعزولة تحديد تأثير أو أهمية وظيفة الميتوكوندريا في تطور بعض الأمراض. وقد ثبت أن هذا مثمر في مجال أمراض القلب ، حيث تم استخدام التعديلات في توصيل الوقود والركيزة لتوضيح كيفية تأثير الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا على قصور القلب13،14،15،16. من المعروف أيضا أن الميتوكوندريا تؤثر على تطور حالات مرضية أخرى مثل مرض السكري والسرطان والسمنة والاضطرابات العصبية والاعتلالات العضلية17،18. لذلك ، فإن استخدام الميتوكوندريا المعزولة أو المنقاة يتيح إجراء تحقيقات ميكانيكية لعملية التمثيل الغذائي التأكسدي وإنتاج ATP في أنسجة المصدر.

لا يوجد نقص في بروتوكولات عزل الميتوكوندريا نظرا لأهميتها في أبحاث الطاقة الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن العثور على طرق محددة للغاية مصممة خصيصا لمجموعات سكانية فرعية من الميتوكوندريا داخلالأنسجة والخلايا 19،20. تتشابه الخطوات الإجرائية الأساسية بين طرق العزل ، ولكن يمكن إجراء اختلافات في التركيب المؤقت ، وخطوات التجانس ، ودورات الطرد المركزي لتحسين كمية وجودة الميتوكوندريا. تستند التغييرات في هذه الجوانب إلى الطلب الأيضي للأنسجة ، ووظيفة الجهاز الكلية ، وكثافة الميتوكوندريا ، وعوامل أخرى. في أنسجة مثل الكبد والعضلات الهيكلية ، تستخدم المجانسات المحمولة للحفاظ على سلامة الميتوكوندريا والحد من تلف أغشية الميتوكوندريا21. ومع ذلك ، عند العزل عن الكلى ، تقترح بعض البروتوكولات استخدام التجانس المدفوع يدويا أو مجموعات تجارية لتحقيق نتائج أفضل22. على الرغم من أن كلتا الطريقتين تسفر عن ميتوكوندريا وظيفية ، إلا أن جودة العضيات يمكن أن تتأثر بسبب الوقت الإضافي الذي يستغرقه إكمال عمليات العزل باستخدام هذه البروتوكولات. يعد الطرد المركزي أمرا حيويا أيضا لاستخراج بروتين الميتوكوندريا ، لأنه يفصل المكونات الخلوية مثل النوى والعضيات الأخرى عن الميتوكوندريا23. أثناء عملية العزل ، يناقش ما إذا كان ينبغي تنفيذ الطرد المركزي التفاضلي أو القائم على الكثافة للحصول على عزلات أنقى24. في حين أن الطرد المركزي الكثافة يمكن أن يفصل الميتوكوندريا عن العضيات ذات الثقل النوعي المماثل ، مثل البيروكسيسومات ، فليس من الثابت ما إذا كانت الميتوكوندريا من هذه الطرق تمثل وظيفة العضية في الموقع بشكل أفضل مقارنة بالميتوكوندريا المعزولة باستخدام الطرد المركزي التفاضلي. في مجال فسيولوجيا الميتوكوندريا ، يفضل الطرد المركزي القائم على الكثافة ويمكن تغييره بسهولة لزيادة نقاء المعزول. يجب النظر في ما إذا كانت التغييرات في قوى g ومدة الطرد المركزي وعدد دورات الطرد المركزي مدمجة قبل التجربة نظرا لتأثيرها على تنقية الميتوكوندريا. علاوة على ذلك ، فإن إعادة تعليق الميتوكوندريا ، التي يمكن القول إنها الخطوة الأكثر أهمية أثناء العزلة ، تختلف اختلافا كبيرا بين الدراسات ، مع استخدام الكشط أو الخلط القائم على الدوامة أو التجانس23،25،26. يمكن أن يكون التعليق الميكانيكي لهذه الأنواع كاشطة للغاية ويضعف سلامة غشاء الميتوكوندريا. لهذا السبب ، يجب إجراء الغسيل اللطيف لتصحيح ذلك. على الرغم من عدد كبير من التعديلات والمنهجيات المقترحة ، هناك عدد أقل من البروتوكولات الشاملة ذات قابلية عالية للاستنساخ والقدرة على التكيف مع نماذج القوارض.

تحدد الطرق الموضحة هنا بروتوكولا مفصلا وقويا وقابلا للتكرار بدرجة كبيرة ينتج ميتوكوندريا نقية ومقترنة جيدا من أنسجة القلب الحيوانية الصغيرة. كما هو موضح ، يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة لاستيعاب الاحتياجات المحددة لكل تجربة و / أو بيئة معملية لعزل الميتوكوندريا عن الكلى والكبد والخلايا المستنبتة. يمكن إجراء مزيد من التعديلات لعزل الميتوكوندريا عن الأنسجة الأخرى غير المدرجة هنا. يتم توفير وصفات العازلة المستخدمة لجميع العزل ويمكن تعديلها إذا لزم الأمر. على غرار البروتوكولات المنشورة الأخرى ، يتم تنفيذ التجانس الآلي والطرد المركزي التفاضلي. ومع ذلك ، يتم إجراء تعديلات على كل من وقت القص والقوة التي يتم بها الطرد المركزي للعينات لتقديم عزلات الميتوكوندريا عالية الجودة باستمرار ، اعتمادا على مصدر العزل. والجدير بالذكر أن هذا البروتوكول يختلف عن غيره باستخدام الغسيل اللطيف عن طريق سحب العينة لإعادة تعليق الميتوكوندريا المحببة، مما يساعد في الحفاظ على سلامة غشاء الميتوكوندريا والحفاظ على الوظيفة العامة للعضيات. يتم قياس بروتين الميتوكوندريا إما عن طريق تحديد البروتين الكلي أو عن طريق قياس نشاط سينسيز السترات. يتم دعم فائدة طريقة العزل هذه وقابليتها للتطبيق الواسع من خلال قيم نسب التحكم في الجهاز التنفسي (RCR) التي تم تحقيقها عبر الكائنات الحية ومصادر الأنسجة المختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء استخدام وعلاج جميع الفقارية وفقا للبروتوكولات المعتمدة التي تمت مراجعتها وقبولها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في جامعة ولاية ميشيغان. تم تصميم هذا البروتوكول باستخدام كل من ذكور وإناث خنازير غينيا هارتلي ألبينو وفئران سبراج داولي (SD). لعزل الميتوكوندريا القلبية عن خنازير غينيا ، تم التضحية بالحيوانات في أعمار تتراوح بين 4-6 أسابيع (300-450 جم). تم الحصول على الميتوكوندريا القلبية من الفئران SD من كلا الجنسين بين سن 10-13 أسبوعا (250-400 جم). وصفات للمخازن المؤقتة موصوفة في الجدول 1 ويجب تحضيرها مسبقا. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. التحضير التجريبي

  1. قبل البدء في العزل ، قم بتسمية أنبوبين للطرد المركزي سعة 50 مل على أنهما "Spins 1 و 2" و "Spin 3".
  2. ضع الأنابيب ، وعازلة العزل المذابة حديثا (IB) ، ومقص فرم حاد ، ومسبار تجانس مجمع ، ودورق 5 مل أو حاوية مكافئة الحجم على الثلج.
  3. ضع عازلة التنفس المذابة حديثا (RB) في حاضنة للتدفئة لإجراء فحوصات الجهاز التنفسي اللاحقة.
  4. قم بتبريد جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
  5. تأكد من ترتيب جميع المعدات وإضافة 20 ميكرولتر من 7-15 وحدة / ملغ بروتياز من Bacillus licheniformis إلى الأنبوب المسمى "الدوران 1 و 2".
  6. قم بإعداد نظام ضغط يعتمد على الجاذبية للتروية عن طريق القنية باستخدام عازلة شلل القلب (CB ، الجدول 1) ، والقنية الزجاجية ، والأنابيب البلاستيكية مع توصيل صمام محبس.
  7. رتب الأدوات الجراحية وقم بتضمين المقص والملقط المناسب لتشريح القلب وقنطه.
    ملاحظة: يجب أن تكون جميع المياه ذات جودة نقية (18.2 MΩ · سم)

2. تشريح الأنسجة

  1. حقن بكبريتات الهيبارين المعقمة داخل الصفاق بجرعة 500 وحدة / كجم.
  2. اسمح للحيوان بالجلوس في غرفة الحث لمدة 15 دقيقة بعد إعطاء الهيبارين. خلال هذا الوقت ، قم بتوفير 2 لتر / دقيقة من غاز O2 النقي لتزويد بالأكسجين الكامل ، وتهدئتها ، وتقليل أي إجهاد قد يكون له عواقب سلبية على الأنسجة ذات الأهمية.
  3. ابدأ تحريض التخدير عن طريق التدفق المستمر للأيزوفلوران بنسبة 0.5٪. بعد 1 دقيقة ، قم بالزيادة إلى 1٪. استمر في زيادة بنسبة 1٪ كل دقيقة حتى يتم الوصول إلى 5٪. مرة واحدة في 5٪ ، انتظر لمدة 1 دقيقة وراقب نمط تنفس.
  4. بمجرد أن يتباطأ التنفس ويصبح شاقا (تقريبا عند علامة 6.5 دقيقة) ، قم بإيقاف تشغيل تدفق الأيزوفلوران والأكسجين.
  5. قم بإزالة بسرعة من غرفة الحث وتحقق من عمق التخدير المناسب عن طريق الضغط على مخلب والتحقق من منعكس القرنية. إذا استجاب لأي من المنبهين ، فضعه مرة أخرى في غرفة الحث ، وأعد إدارة التخدير ، وكرر فحص عمق التخدير.
  6. بمجرد الوصول إلى العمق المناسب للتخدير ، قم بقطع رأسه بسرعة بالمقصلة لتشديد العمود الفقري العنقي ووضع الجسم المعرض على الجليد.
  7. قم بعمل شقين رأسيين متوازيين من الترقوة على طول القفص الصدري الجانبي أسفل طول الصدر. تأكد من أن الشقوق عميقة بما يكفي لقطع الأضلاع الموجودة في الصدر الجانبي ، ولكن تجنب إتلاف الهياكل داخل الصدر مثل القلب أو الأوعية الكبيرة.
    ملاحظة: تعتمد أحجام الشق الرأسي على المستخدم. في حالة استخدام خنازير غينيا والجرذان ، قم بقصها إلى الحجاب الحاجز (حوالي 6.35 سم للفئران و 11 سم لخنازير غينيا). في حالة استخدام الفئران ، قم بإجراء بضع الصدرالقياسي 27.
  8. كشف القلب باستخدام الإرقاء لإزاحة الصدر الأمامي وتعبئة التجويف الصدري المكشوف بالثلج. تقلل هذه الخطوة من وقت نقص التروية الدافئ وتعزز صلاحية العضيات المعزولة.
  9. استخدم الملقط لتشريح الغدة الصعترية والتامور بصراحة وتعريض القلب بالكامل.
  10. باستخدام الملقط ، ضع قوة جر سفلية لطيفة على القلب لكشف الشريان الأورطي والتعرف عليه. الشريان الأورطي هو أثخن وعاء كبير يتفرع من قاعدة القلب. الأوعية الكبيرة الأخرى ، مثل الوريد الرئوي ، أكثر شفافية بشكل ملحوظ من الشريان الأورطي.
  11. قطع الشريان الأورطي حوالي 4-6 مم فوق جذر الشريان الأورطي ولكن أسفل نقاط التفرع السباتية.
  12. قم بقنية الشريان الأورطي وزرع القلب28،29 بمحلول شلل القلب المثلج (CB) باستخدام رأس ضغط يعتمد على الجاذبية حتى يتم تطهير الشرايين التاجية من الدم ويظهر العضو مبيضا.
    ملاحظة: بالنسبة للقوارض الكبيرة ، يعمل قطر القنية من 1.8 إلى 2.2 مم بشكل جيد ، بينما بالنسبة للقوارض الصغيرة ، يوصى بنطاق قطر يتراوح بين 1.4 و 1.8 مم. يجب ألا يستغرق التروية الرجعية أكثر من 15-30 ثانية حتى تتخلص الأوعية التاجية من الدم.
  13. اعزل عضلة القلب البطينية عن طريق تشريح الأذينين والأنسجة الصمامية الغضروفية والأنسجة الدهنية.
  14. ضع البطينين في دورق مبرد مسبقا سعة 10 مل يحتوي على 0.1-0.2 مل من IB المثلج.
  15. افرم الأنسجة بمقص جراحي حاد حتى تصبح القطع حوالي 1 مم3.

3. تنقية الميتوكوندريا وقياس البروتين

  1. انقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب الطرد المركزي المبرد مسبقا المسمى "Spins 1 و 2" الذي يحتوي على محلول البروتياز.
  2. أضف IB المثلج إلى الحجم النهائي البالغ 25 مل.
  3. باستخدام الخالط الدوار الثابت المحمول باليد ، قم بتفريق الأنسجة عند 18,000 دورة في الدقيقة على الجليد لمدة 20-25 ثانية.
  4. أنسجة متجانسة بأجهزة الطرد المركزي في أنبوب يسمى "يدور 1 و 2" عند 8,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. تخلص من المادة الطافية (التي تحتوي على البروتياز) عن طريق سكبها في نفايات الكربوي واشطف الحبيبات برفق مع 5 مل من IB لإزالة البروتياز المتبقي.
  6. بعد التخلص من الشطف ، أعد تعليق الحبيبات باستخدام IB المثلج الطازج إلى حجم نهائي يبلغ 25 مل بواسطة دوامة لطيفة.
  7. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  8. قم بإزالة المادة الطافية (التي تحتوي على الميتوكوندريا) عن طريق سكبها برفق في أنبوب مبرد مسبقا سعة 50 مل يسمى "Spin 3". أثناء الصب, احرص على تجنب إزاحة الجزء العلوي السائب من الحبيبات. كبديل ، يمكن استخدام ماصة النقل أو الشريط لجمع المادة الطافية.
  9. جهاز الطرد المركزي للطافي عند 8000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  10. تخلص من المادة الطافية الناتجة واحتفظ بالحبيبات المحتوية على الميتوكوندريا.
  11. استخدم منديلا خاليا من النسالة لامتصاص المادة الطافية الزائدة من الجدار الداخلي للأنبوب ، مع الحرص على تجنب إزعاج الحبيبات. احتفظ بالحبيبات عند 4 درجات مئوية على الجليد قدر الإمكان.
  12. لإعادة تعليق الميتوكوندريا ، أضف 80 ميكرولتر من IB المثلج إلى قاع الأنبوب. أعد تعليق الحبيبات برفق عن طريق غسل IB بشكل متكرر على الحبيبات.
  13. لتجنب تكوين فقاعات، اضبط ماصة دقيقة على الشفط وتوفر ما بين 40-60 ميكرولتر من الحجم.
  14. عندما تشتت حبيبات الميتوكوندريا ، قم بزيادة حجم الماصة الدقيقة لإعادة تعليق الميتوكوندريا المحببة بكفاءة. تجنب لمس الحبيبات بطرف الماصة ، وتجنب تكوين الفقاعات.
  15. بمجرد إعادة تعليقها ، انقل الميتوكوندريا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مبرد مسبقا وقم بتسميتها على أنها ميتوكوندريا مخزون. قم بتدوين الحجم الإجمالي لإعادة التعليق.
  16. لتحديد تركيز بروتين الميتوكوندريا في العينة ، قم بإجراء فحص بروتين كلي باستخدام فحوصات بروتين BCA أو برادفورد المعروفة كما هو محدد في تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: تتمثل الإستراتيجية البديلة أو التكميلية لتقييم العائد في تحديد نشاط سينسيز السترات. كمرجع ، يمكن قياس محتوى الميتوكوندريا باتباع البروتوكول الموضح في Vinnakota et al.30.

4. فحوصات مراقبة الجودة

  1. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق المبرد مسبقا ، قم بتخفيف مخزون الميتوكوندريا إلى تركيز العمل المطلوب باستخدام IB.
    ملاحظة: يتم تخفيف مخزون الميتوكوندريا إلى 40 مجم / مل للعمل بتركيز نهائي 0.1 مجم / مل لمقايسات قياس التنفس عند استخدام العزلات من أنسجة القلب.
  2. اشطف غرف الأوكسجراف، والسدادات، وماقن الميكرولتر عشر مرات بالماء المقطر لتنظيفها قبل استخدامها في فحوصات قياس إعادة التصنيع.
  3. لاختبار جدوى وجودة عزلات الميتوكوندريا ، قم بتحميل 2.3 مل من عازلة التنفس (RB) في غرف الأوكسجين والسماح لإشارة استهلاك الأكسجين بالتوازن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا أو عندما يكون المعدل قريبا من 0.
  4. بمجرد أن يتم توازن الإشارة ، ادفع السدادات لأسفل واستنشق المخزن المؤقت الزائد الذي يخرج من الشعيرات الدموية للسدادة.
  5. أضف 1 ملي مولار EGTA باستخدام حقنة ميكرولتر لاستخلاص أي كالسيوم متبقي في المخازن المؤقتة أو عينة الميتوكوندريا.
  6. لتغذية التنفس ، أضف 5 ملي مولار من بيروفات الصوديوم و 1 ملي مولار من المالات.
  7. بعد إضافة الركائز ، أضف بلعة من الميتوكوندريا المخففة لتحقيق تركيز العمل والسماح بحدوث التنفس لمدة 5 دقائق. تسمى هذه الفترة LEAK أو تنفس الحالة 2.
  8. عند علامة 5 دقائق ، أضف بلعة 500 ميكرومتر ADP لبدء التنفس في الحالة 3 ، والتي تسمى أيضا OXHPOS ، واسمح للميتوكوندريا بالتنفس حتى نقص الأكسجين.
  9. احسب نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR) بقسمة الحد الأقصى لمعدل استهلاك الأكسجين خلال الحالة 3 على معدل استهلاك الأكسجين قبل إضافة ADP في الحالة 2 (انظر الشكل 1).
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام تعبير RCR بديل للعدد 1 - 1 / RCR كمقياس للجودة ، والذي يحد بين 0 و 1 ؛ ومع ذلك ، فإنه يجعل من الصعب التمييز بين الجودة باستخدام هذا المقياس عندما > RCR 10 (انظر الشكل 2).
  10. اشطف الغرف والسدادات 10 مرات بالماء النقي لتنظيف الأوكسجرافية للفحوصات اللاحقة. إذا اكتمل قياس إعادة التسخين ، املأ الغرف بنسبة 70٪ من الإيثانول وضع السدادات في الغرف حتى الاستخدام التالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عند الانتهاء من عزل الميتوكوندريا ، يجب اختبار جودة ووظائف العزلات عن طريق تحديد معدلات استهلاك الأكسجين (JO2) باستخدام قياس إعادة التسخين عالي الدقة. للقيام بذلك ، تم تخفيف مخزونات الميتوكوندريا إلى 40 مجم / مل للسماح بتركيزات العمل البالغة 0.1 مجم / مل في 2 مل من RB لجميع فحوصات قياس إعادة التقسيس باستخدام الميتوكوندريا القلبية المعزولة. تم تغذية التنفس بواسطة 5 ملي مولار بيروفات الصوديوم و 1 ملي مولار لتر مالات في وجود 1 ملي مولار EGTA ، وهو مخلب الكالسيوم ، وسمح له بالتوازن لمدة 5 دقائق لإنشاء تنف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

سيضمن الالتزام بالطرق الموضحة بإيجاز في هذا البروتوكول عزل الميتوكوندريا المقترنة جيدا عن أنسجة القلب للقوارض الصغيرة ، بالإضافة إلى أنواع ومصادر الأنسجة الأخرى. بشكل عام ، يجب أن تستغرق العملية ما مجموعه 3-3.5 ساعة ، حيث يجب أن تبقى جميع الأنسجة الحيوانية والعينات والعزلات على الجليد عند 4 درجات مئوية قدر الإمكان للحد من التدهور. هذا الإجراء قوي ويمكن تغييره بعدة طرق لتناسب الأهداف والنماذج التجريبية المستخدمة بشكل أفضل. أحد التعديلات التي يمكن إجراؤها أثناء عملية تشريح الأنسجة هو استبع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفان أنه لا يوجد ما يمكن الكشف عنه.

شكر وتقدير

نود أن نتوجه بخالص الشكر إلى دانيال أ. بيرد وكاليان سي فيناكوتا لمساهماتهم التأسيسية في هذا البروتوكول. تم تمويل هذا العمل من قبل منحة NSF CAREER MCB-2237117.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب الطرد
10 مل دورقلتشريح الأعضاء وفرمها
50 مل أنابيبالمركزي
الأدينوزين 5'-ثنائي الفوسفات أحادي البوتاسيوم الملح ثنائي الهيدراتسيجما  A5285فحوصات قياس ريتبيرومتر
BSAفحص البروتين Thermo ScentificPI23225تكميم بروتين الميتوكوندريا
DextroseSigma DX0145للمخزن المؤقت (CB)
الإيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينو-إيثيل إيثر) -N ، N ، N '، N'-حمض رباعي الأسيتيك   ؛سيجما E4378للمخازن المؤقتة (CB و IB) ومقايسات قياس إعادة التنفس
قنية زجاجيةRadnotiخنزير غينيا والفئران نضح قلب
الهيبارين الصوديوم المخاطي للخنزيرSigma   ؛SRE0027-250KUحقن IP للحيوان
مقياس التنفس عالي الدقةمن نوع كلارك. أوكسجراف مع غرف 2 مل
غرفة الحث
IsofluraneSigma & nbsp ؛792632التخدير 
حمض الماليكSigma 02288-50Gمقايسات قياس ريسبيروميتري
كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدراتسيجما   ؛M9272للمخزن المؤقت (RB)
MannitolSigma MX0214للمخزن المؤقت (IB) محاقن
ميكرولترأحجام تتراوح من 5 &ndash ؛ 50 وميكرو ؛ L
قارئيجب أن يكون قادرا على الاحتضان عند 37 درجة ؛ ج 
MOPSSigma 475898لجميع المخازن المؤقتة
O2< / sub> خزان
OMNI THQ HomogenizerOMNI International   ؛12-500مجانسات الجزء الثابت الدوار مماثلة ستعمل
الماصاتالمجدادات من  2– 20 وميكرو ؛ L; 20 & - ندش; 200 وميكرو ؛ L; 200 & - - نداش. 1000 & ميكرو; L
كلوريد البوتاسيومسيجما P3911للمخازن المؤقتة (RB و CB)
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةSigma   ؛795496للمخازن المؤقتة (IB و RB)
البروتياز من Bacillus licheniformisSigma P5459
كلوريد الصوديومسيجما S9888للمخزن المؤقت (CB)
الكواشف الحيويةلبيروفات الصوديومBP356-100فحوصات قياس إعادة التقسيس
السكروزسيجما & nbsp ؛8510-OPللمخزن المؤقت (IB)
التشريح الجراحييعتمد على مصدر والأنسجة
يجب أن يبرد جهازإلى 4 درجات ؛ ج 
المركزي الدقيقة 1.7 مل زجاجي الطرد مجموعة قطب Microplate فيشر طقم الطرد المركزي المنضدي

المراجع

  1. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  2. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: Ii. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  3. Ernster, L., Schatz, G. Mitochondria: A historical review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  4. Martinez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial tca cycle metabolites control physiology and disease. Nat Commun. 11 (1), 102(2020).
  5. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation, and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  6. Fernie, A. R., Carrari, F., Sweetlove, L. J. Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 254-261 (2004).
  7. Kalpage, H. A., et al. Cytochrome C phosphorylation: Control of mitochondrial electron transport chain flux and apoptosis. Int J Biochem Cell Biol. 121, 105704(2020).
  8. Sousa, J. S., D'imprima, E., Vonck, J. Mitochondrial respiratory chain complexes. Subcell Biochem. 87, 167-227 (2018).
  9. Mitchell, P., Moyle, J. Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation. Nature. 213 (5072), 137-139 (1967).
  10. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).
  11. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods Mol Biol. 837, 63-72 (2012).
  12. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  13. Bisaccia, G., Ricci, F., Gallina, S., Di Baldassarre, A., Ghinassi, B. Mitochondrial dysfunction and heart disease: Critical appraisal of an overlooked association. Int J Mol Sci. 22 (2), 614(2021).
  14. Zhou, B., Tian, R. Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure. J Clin Invest. 128 (9), 3716-3726 (2018).
  15. Holzem, K. M., et al. Mitochondrial structure and function are not different between nonfailing donor and end-stage failing human hearts. FASEB J. 30 (8), 2698-2707 (2016).
  16. Cordero-Reyes, A. M., et al. Freshly isolated mitochondria from failing human hearts exhibit preserved respiratory function. J Mol Cell Cardiol. 68, 98-105 (2014).
  17. Norat, P., et al. Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation. NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).
  18. Diaz-Vegas, A., et al. Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases. Endocr Rev. 41 (3), bnaa005(2020).
  19. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).
  20. Holmuhamedov, E. L., Oberlin, A., Short, K., Terzic, A., Jahangir, A. Cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria display distinct responsiveness to protection by diazoxide. PLoS One. 7 (9), e44667(2012).
  21. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: Functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  22. Micakovic, T., et al. Isolation of pure mitochondria from rat kidneys and western blot of mitochondrial respiratory chain complexes. Bio Protoc. 9 (19), e3379(2019).
  23. Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods Cell Biol. 155, 3-31 (2020).
  24. Hubbard, W. B., et al. Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue. Sci Rep. 9 (1), 9656(2019).
  25. Zhou, D., et al. Protocol for mitochondrial isolation and sub-cellular localization assay for mitochondrial proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102088(2023).
  26. Hernandez-Camacho, J. D., et al. Isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays. J Vis Exp. (180), e63336(2022).
  27. Farrugia, G. E., et al. A protocol for rapid and parallel isolation of myocytes and non-myocytes from multiple mouse hearts. STAR Protoc. 2 (4), 100866(2021).
  28. Wollenman, L. C., Vander Ploeg, M. R., Miller, M. L., Zhang, Y., Bazil, J. N. The effect of respiration buffer composition on mitochondrial metabolism and function. PLoS One. 12 (11), e0187523(2017).
  29. Vinnakota, K. C., et al. Open-loop control of oxidative phosphorylation in skeletal and cardiac muscle mitochondria by ca(2). Biophys J. 110 (4), 954-961 (2016).
  30. Vinnakota, K. C., Bazil, J. N., Van Den Bergh, F., Wiseman, R. W., Beard, D. A. Feedback regulation and time hierarchy of oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria. Biophys J. 110 (4), 972-980 (2016).
  31. Warnock, L. B., Huang, D. Heparin. Statpearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).
  32. Sercel, A. J., et al. Generating stable isolated mitochondrial recipient clones in mammalian cells using mitopunch mitochondrial transfer. STAR Protoc. 2 (4), 100850(2021).
  33. Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. J Vis Exp. (97), e52076(2015).
  34. Sobolewski, P., Kandel, J., Eckmann, D. M. Air bubble contact with endothelial cells causes a calcium-independent loss in mitochondrial membrane potential. PLoS One. 7 (10), e47254(2012).
  35. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  36. Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. A colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster. J Vis Exp. (155), e59454(2020).
  37. Tomar, N., et al. Substrate-dependent differential regulation of mitochondrial bioenergetics in the heart and kidney cortex and outer medulla. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1863 (2), 148518(2022).
  38. Ter Veld, F., Jeneson, J. A., Nicolay, K. Mitochondrial affinity for ADP is twofold lower in creatine kinase knock-out muscles. Possible role in rescuing cellular energy homeostasis. FEBS J. 272 (4), 956-965 (2005).
  39. Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709(2011).
  40. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-em reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Sci Rep. 11 (1), 1037(2021).
  41. Zhou, Z., et al. Diverse functions of cytochrome C in cell death and disease. Cell Death Differ. 31 (4), 387-404 (2024).
  42. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic bcl-2 family members. Cancer Cell. 9 (5), 351-365 (2006).
  43. Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: Multiple roles of inorganic phosphate. J Biol Chem. 278 (40), 39155-39165 (2003).
  44. Motawe, Z. Y., Abdelmaboud, S. S., Breslin, J. W. Evaluation of glycolysis and mitochondrial function in endothelial cells using the seahorse analyzer. Methods Mol Biol. 2711, 241-256 (2024).
  45. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat Protoc. 1 (6), 2563-2572 (2006).
  46. Huerta, B., et al. Sea lamprey cardiac mitochondrial bioenergetics after exposure to TFM and its metabolites. Aquat Toxicol. 219, 105380(2020).
  47. Malyala, S., Zhang, Y., Strubbe, J. O., Bazil, J. N. Calcium phosphate precipitation inhibits mitochondrial energy metabolism. PLoS Comput Biol. 15 (1), e1006719(2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تنقية الميتوكوندريانسبة التحكم التنفسيتقدير كمية البروتينتشريح الأعضاءالخلل في الطاقة الحيويةحبيبات فوسفات الكالسيومفشل القلبفسيولوجيا الميتوكوندريا
عزل قوي للميتوكوندريا عن أنسجة قلب القوارض
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.