مقالة منهجية

عزل قوي للميتوكوندريا عن أنسجة قلب القوارض

DOI:

10.3791/67093

⸱

أغسطس 23, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Michigan State University, 2Department of Kinesiology, Michigan State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كشفت دراسات الطاقة الحيوية والتمثيل الغذائي على الميتوكوندريا عن دورها متعدد الأوجه في العديد من الأمراض ، لكن طرق عزل هذه العضيات تختلف. الطريقة المفصلة هنا قادرة على تنقية الميتوكوندريا عالية الجودة من مصادر أنسجة متعددة. يتم تحديد الجودة من خلال نسب التحكم في الجهاز التنفسي والمقاييس الأخرى التي يتم تقييمها باستخدام قياس إعادة الالتنفس عالي الدقة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمارس عزل الميتوكوندريا منذ عقود ، باتباع الإجراءات التي وضعها الرواد في مجالات البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية لدراسة ضعف التمثيل الغذائي والأمراض. جودة الميتوكوندريا المتسقة ضرورية للتحقيق بشكل صحيح في فسيولوجيا الميتوكوندريا والطاقة الحيوية. ومع ذلك ، تتوفر العديد من طرق العزل المنشورة المختلفة للباحثين. على الرغم من أن الاستراتيجيات التجريبية المختلفة تتطلب طرق عزل مختلفة ، إلا أن المبادئ والإجراءات الأساسية متشابهة. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة قادرة على استخراج الميتوكوندريا المقترنة جيدا من مجموعة متنوعة من مصادر الأنسجة ، بما في ذلك والخلايا الصغيرة. تشمل الخطوات الموضحة تشريح الأعضاء ، وتنقية الميتوكوندريا ، والقياس الكمي للبروتين ، وفحوصات مراقبة الجودة المختلفة. مقياس مراقبة الجودة الأساسي المستخدم لتحديد الميتوكوندريا عالية الجودة هو نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR). RCR هو نسبة معدل التنفس أثناء الفسفرة المؤكسدة إلى المعدل في حالة عدم وجود ADP. تتم مناقشة المقاييس البديلة. بينما يتم الحصول على قيم RCR عالية بالنسبة لمصدر الأنسجة باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تحسين عدة خطوات لتناسب الاحتياجات الفردية للباحثين. هذا الإجراء قوي وقد أدى باستمرار إلى عزل الميتوكوندريا مع قيم RCR أعلى من المتوسط عبر النماذج الحيوانية ومصادر الأنسجة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا هي عضيات تحت الخلوية تنشئ ظروفا نشطة سيتوبلازمية محسنة لوظائف خلوية معينة. في حين أن الدراسات الخلوية والأنسجة والكائن الحي يمكن أن توفر رؤى حول وظيفة الميتوكوندريا ، فإن عزل العضيات يوفر مستوى من التحكم التجريبي غير ممكن بخلاف ذلك. تم إجراء عزلات الميتوكوندريا منذ الأربعينيات ، مما يسمح بإجراء دراسات ميكانيكية لعملية التمثيل الغذائي والتنفس عبر مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة1،2. الأهمية التاريخية للميتوكوندريا موثقة جيدا3. بصفتها المنتجين الرئيسيين ل ATP ، تلعب الميتوكوندريا العديد من الأدوار الرئيسية الحيوية للوظيفة الخلوية والأعضاء المثلى4. داخل مصفوفة الميتوكوندريا ، تتأكسد الركائز بواسطة دورة TCA ، مما ينتج عنه مكافئات مختزلة وناقلات إلكترونية متنقلة مثل NADH و UQH25،6. السيتوكروم C هو ثالث ناقل إلكتروني متحرك رئيسي في شبكة التفاعل الكيميائي الحيوي للميتوكوندريا7. ثم تتأكسد هذه الجزيئات بواسطة مجمعات الغشاء لنظام نقل الإلكترون (ETS) المضمنة في غشاء الميتوكوندرياالداخلي 8. تقترن تفاعلات الأكسدة والاختزال ل ETS بانتقال البروتون من المصفوفة إلى الفضاء بين الغشاء. تنشئ هذه العمليات تدرجا كهروكيميائيا للبروتون يستخدم لفسفرة ADP مع Pi بواسطة F1F0 ATP synthase لإنتاج ATP9،10. يمكن استكشاف العمليات الفردية التي تحدث في كل مجمع من خلال قياس إعادة الوضوح عالي الدقة باستخدام أقطاب كهربائية من نوع كلارك أو فحوصات استهلاك الأكسجين الدقيقة11،12. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لنماذج المرض والعلاجات التي تستخدم الميتوكوندريا المعزولة تحديد تأثير أو أهمية وظيفة الميتوكوندريا في تطور بعض الأمراض. وقد ثبت أن هذا مثمر في مجال أمراض القلب ، حيث تم استخدام التعديلات في توصيل الوقود والركيزة لتوضيح كيفية تأثير الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا على قصور القلب13،14،15،16. من المعروف أيضا أن الميتوكوندريا تؤثر على تطور حالات مرضية أخرى مثل مرض السكري والسرطان والسمنة والاضطرابات العصبية والاعتلالات العضلية17،18. لذلك ، فإن استخدام الميتوكوندريا المعزولة أو المنقاة يتيح إجراء تحقيقات ميكانيكية لعملية التمثيل الغذائي التأكسدي وإنتاج ATP في أنسجة المصدر.

لا يوجد نقص في بروتوكولات عزل الميتوكوندريا نظرا لأهميتها في أبحاث الطاقة الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن العثور على طرق محددة للغاية مصممة خصيصا لمجموعات سكانية فرعية من الميتوكوندريا داخلالأنسجة والخلايا 19،20. تتشابه الخطوات الإجرائية الأساسية بين طرق العزل ، ولكن يمكن إجراء اختلافات في التركيب المؤقت ، وخطوات التجانس ، ودورات الطرد المركزي لتحسين كمية وجودة الميتوكوندريا. تستند التغييرات في هذه الجوانب إلى الطلب الأيضي للأنسجة ، ووظيفة الجهاز الكلية ، وكثافة الميتوكوندريا ، وعوامل أخرى. في أنسجة مثل الكبد والعضلات الهيكلية ، تستخدم المجانسات المحمولة للحفاظ على سلامة الميتوكوندريا والحد من تلف أغشية الميتوكوندريا21. ومع ذلك ، عند العزل عن الكلى ، تقترح بعض البروتوكولات استخدام التجانس المدفوع يدويا أو مجموعات تجارية لتحقيق نتائج أفضل22. على الرغم من أن كلتا الطريقتين تسفر عن ميتوكوندريا وظيفية ، إلا أن جودة العضيات يمكن أن تتأثر بسبب الوقت الإضافي الذي يستغرقه إكمال عمليات العزل باستخدام هذه البروتوكولات. يعد الطرد المركزي أمرا حيويا أيضا لاستخراج بروتين الميتوكوندريا ، لأنه يفصل المكونات الخلوية مثل النوى والعضيات الأخرى عن الميتوكوندريا23. أثناء عملية العزل ، يناقش ما إذا كان ينبغي تنفيذ الطرد المركزي التفاضلي أو القائم على الكثافة للحصول على عزلات أنقى24. في حين أن الطرد المركزي الكثافة يمكن أن يفصل الميتوكوندريا عن العضيات ذات الثقل النوعي المماثل ، مثل البيروكسيسومات ، فليس من الثابت ما إذا كانت الميتوكوندريا من هذه الطرق تمثل وظيفة العضية في الموقع بشكل أفضل مقارنة بالميتوكوندريا المعزولة باستخدام الطرد المركزي التفاضلي. في مجال فسيولوجيا الميتوكوندريا ، يفضل الطرد المركزي القائم على الكثافة ويمكن تغييره بسهولة لزيادة نقاء المعزول. يجب النظر في ما إذا كانت التغييرات في قوى g ومدة الطرد المركزي وعدد دورات الطرد المركزي مدمجة قبل التجربة نظرا لتأثيرها على تنقية الميتوكوندريا. علاوة على ذلك ، فإن إعادة تعليق الميتوكوندريا ، التي يمكن القول إنها الخطوة الأكثر أهمية أثناء العزلة ، تختلف اختلافا كبيرا بين الدراسات ، مع استخدام الكشط أو الخلط القائم على الدوامة أو التجانس23،25،26. يمكن أن يكون التعليق الميكانيكي لهذه الأنواع كاشطة للغاية ويضعف سلامة غشاء الميتوكوندريا. لهذا السبب ، يجب إجراء الغسيل اللطيف لتصحيح ذلك. على الرغم من عدد كبير من التعديلات والمنهجيات المقترحة ، هناك عدد أقل من البروتوكولات الشاملة ذات قابلية عالية للاستنساخ والقدرة على التكيف مع نماذج القوارض.

تحدد الطرق الموضحة هنا بروتوكولا مفصلا وقويا وقابلا للتكرار بدرجة كبيرة ينتج ميتوكوندريا نقية ومقترنة جيدا من أنسجة القلب الحيوانية الصغيرة. كما هو موضح ، يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة لاستيعاب الاحتياجات المحددة لكل تجربة و / أو بيئة معملية لعزل الميتوكوندريا عن الكلى والكبد والخلايا المستنبتة. يمكن إجراء مزيد من التعديلات لعزل الميتوكوندريا عن الأنسجة الأخرى غير المدرجة هنا. يتم توفير وصفات العازلة المستخدمة لجميع العزل ويمكن تعديلها إذا لزم الأمر. على غرار البروتوكولات المنشورة الأخرى ، يتم تنفيذ التجانس الآلي والطرد المركزي التفاضلي. ومع ذلك ، يتم إجراء تعديلات على كل من وقت القص والقوة التي يتم بها الطرد المركزي للعينات لتقديم عزلات الميتوكوندريا عالية الجودة باستمرار ، اعتمادا على مصدر العزل. والجدير بالذكر أن هذا البروتوكول يختلف عن غيره باستخدام الغسيل اللطيف عن طريق سحب العينة لإعادة تعليق الميتوكوندريا المحببة، مما يساعد في الحفاظ على سلامة غشاء الميتوكوندريا والحفاظ على الوظيفة العامة للعضيات. يتم قياس بروتين الميتوكوندريا إما عن طريق تحديد البروتين الكلي أو عن طريق قياس نشاط سينسيز السترات. يتم دعم فائدة طريقة العزل هذه وقابليتها للتطبيق الواسع من خلال قيم نسب التحكم في الجهاز التنفسي (RCR) التي تم تحقيقها عبر الكائنات الحية ومصادر الأنسجة المختلفة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء استخدام وعلاج جميع الفقارية وفقا للبروتوكولات المعتمدة التي تمت مراجعتها وقبولها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في جامعة ولاية ميشيغان. تم تصميم هذا البروتوكول باستخدام كل من ذكور وإناث خنازير غينيا هارتلي ألبينو وفئران سبراج داولي (SD). لعزل الميتوكوندريا القلبية عن خنازير غينيا ، تم التضحية بالحيوانات في أعمار تتراوح بين 4-6 أسابيع (300-450 جم). تم الحصول على الميتوكوندريا القلبية من الفئران SD من كلا الجنسين بين سن 10-13 أسبوعا (250-400 جم). وصفات للمخازن المؤقتة موصوفة في الجدول 1 ويجب تحضيرها مسبقا. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. التحضير التجريبي

  1. قبل البدء في العزل ، قم بتسمية أنبوبين للطرد المركزي سعة 50 مل على أنهما "Spins 1 و 2" و "Spin 3".
  2. ضع الأنابيب ، وعازلة العزل المذابة حديثا (IB) ، ومقص فرم حاد ، ومسبار تجانس مجمع ، ودورق 5 مل أو حاوية مكافئة الحجم على الثلج.
  3. ضع عازلة التنفس المذابة حديثا (RB) في حاضنة للتدفئة لإجراء فحوصات الجهاز التنفسي اللاحقة.
  4. قم بتبريد جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
  5. تأكد من ترتيب جميع المعدات وإضافة 20 ميكرولتر من 7-15 وحدة / ملغ بروتياز من Bacillus licheniformis إلى الأنبوب المسمى "الدوران 1 و 2".
  6. قم بإعداد نظام ضغط يعتمد على الجاذبية للتروية عن طريق القنية باستخدام عازلة شلل القلب (CB ، الجدول 1) ، والقنية الزجاجية ، والأنابيب البلاستيكية مع توصيل صمام محبس.
  7. رتب الأدوات الجراحية وقم بتضمين المقص والملقط المناسب لتشريح القلب وقنطه.
    ملاحظة: يجب أن تكون جميع المياه ذات جودة نقية (18.2 MΩ · سم)

2. تشريح الأنسجة

  1. حقن بكبريتات الهيبارين المعقمة داخل الصفاق بجرعة 500 وحدة / كجم.
  2. اسمح للحيوان بالجلوس في غرفة الحث لمدة 15 دقيقة بعد إعطاء الهيبارين. خلال هذا الوقت ، قم بتوفير 2 لتر / دقيقة من غاز O2 النقي لتزويد بالأكسجين الكامل ، وتهدئتها ، وتقليل أي إجهاد قد يكون له عواقب سلبية على الأنسجة ذات الأهمية.
  3. ابدأ تحريض التخدير عن طريق التدفق المستمر للأيزوفلوران بنسبة 0.5٪. بعد 1 دقيقة ، قم بالزيادة إلى 1٪. استمر في زيادة بنسبة 1٪ كل دقيقة حتى يتم الوصول إلى 5٪. مرة واحدة في 5٪ ، انتظر لمدة 1 دقيقة وراقب نمط تنفس.
  4. بمجرد أن يتباطأ التنفس ويصبح شاقا (تقريبا عند علامة 6.5 دقيقة) ، قم بإيقاف تشغيل تدفق الأيزوفلوران والأكسجين.
  5. قم بإزالة بسرعة من غرفة الحث وتحقق من عمق التخدير المناسب عن طريق الضغط على مخلب والتحقق من منعكس القرنية. إذا استجاب لأي من المنبهين ، فضعه مرة أخرى في غرفة الحث ، وأعد إدارة التخدير ، وكرر فحص عمق التخدير.
  6. بمجرد الوصول إلى العمق المناسب للتخدير ، قم بقطع رأسه بسرعة بالمقصلة لتشديد العمود الفقري العنقي ووضع الجسم المعرض على الجليد.
  7. قم بعمل شقين رأسيين متوازيين من الترقوة على طول القفص الصدري الجانبي أسفل طول الصدر. تأكد من أن الشقوق عميقة بما يكفي لقطع الأضلاع الموجودة في الصدر الجانبي ، ولكن تجنب إتلاف الهياكل داخل الصدر مثل القلب أو الأوعية الكبيرة.
    ملاحظة: تعتمد أحجام الشق الرأسي على المستخدم. في حالة استخدام خنازير غينيا والجرذان ، قم بقصها إلى الحجاب الحاجز (حوالي 6.35 سم للفئران و 11 سم لخنازير غينيا). في حالة استخدام الفئران ، قم بإجراء بضع الصدرالقياسي 27.
  8. كشف القلب باستخدام الإرقاء لإزاحة الصدر الأمامي وتعبئة التجويف الصدري المكشوف بالثلج. تقلل هذه الخطوة من وقت نقص التروية الدافئ وتعزز صلاحية العضيات المعزولة.
  9. استخدم الملقط لتشريح الغدة الصعترية والتامور بصراحة وتعريض القلب بالكامل.
  10. باستخدام الملقط ، ضع قوة جر سفلية لطيفة على القلب لكشف الشريان الأورطي والتعرف عليه. الشريان الأورطي هو أثخن وعاء كبير يتفرع من قاعدة القلب. الأوعية الكبيرة الأخرى ، مثل الوريد الرئوي ، أكثر شفافية بشكل ملحوظ من الشريان الأورطي.
  11. قطع الشريان الأورطي حوالي 4-6 مم فوق جذر الشريان الأورطي ولكن أسفل نقاط التفرع السباتية.
  12. قم بقنية الشريان الأورطي وزرع القلب28،29 بمحلول شلل القلب المثلج (CB) باستخدام رأس ضغط يعتمد على الجاذبية حتى يتم تطهير الشرايين التاجية من الدم ويظهر العضو مبيضا.
    ملاحظة: بالنسبة للقوارض الكبيرة ، يعمل قطر القنية من 1.8 إلى 2.2 مم بشكل جيد ، بينما بالنسبة للقوارض الصغيرة ، يوصى بنطاق قطر يتراوح بين 1.4 و 1.8 مم. يجب ألا يستغرق التروية الرجعية أكثر من 15-30 ثانية حتى تتخلص الأوعية التاجية من الدم.
  13. اعزل عضلة القلب البطينية عن طريق تشريح الأذينين والأنسجة الصمامية الغضروفية والأنسجة الدهنية.
  14. ضع البطينين في دورق مبرد مسبقا سعة 10 مل يحتوي على 0.1-0.2 مل من IB المثلج.
  15. افرم الأنسجة بمقص جراحي حاد حتى تصبح القطع حوالي 1 مم3.

3. تنقية الميتوكوندريا وقياس البروتين

  1. انقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب الطرد المركزي المبرد مسبقا المسمى "Spins 1 و 2" الذي يحتوي على محلول البروتياز.
  2. أضف IB المثلج إلى الحجم النهائي البالغ 25 مل.
  3. باستخدام الخالط الدوار الثابت المحمول باليد ، قم بتفريق الأنسجة عند 18,000 دورة في الدقيقة على الجليد لمدة 20-25 ثانية.
  4. أنسجة متجانسة بأجهزة الطرد المركزي في أنبوب يسمى "يدور 1 و 2" عند 8,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. تخلص من المادة الطافية (التي تحتوي على البروتياز) عن طريق سكبها في نفايات الكربوي واشطف الحبيبات برفق مع 5 مل من IB لإزالة البروتياز المتبقي.
  6. بعد التخلص من الشطف ، أعد تعليق الحبيبات باستخدام IB المثلج الطازج إلى حجم نهائي يبلغ 25 مل بواسطة دوامة لطيفة.
  7. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  8. قم بإزالة المادة الطافية (التي تحتوي على الميتوكوندريا) عن طريق سكبها برفق في أنبوب مبرد مسبقا سعة 50 مل يسمى "Spin 3". أثناء الصب, احرص على تجنب إزاحة الجزء العلوي السائب من الحبيبات. كبديل ، يمكن استخدام ماصة النقل أو الشريط لجمع المادة الطافية.
  9. جهاز الطرد المركزي للطافي عند 8000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  10. تخلص من المادة الطافية الناتجة واحتفظ بالحبيبات المحتوية على الميتوكوندريا.
  11. استخدم منديلا خاليا من النسالة لامتصاص المادة الطافية الزائدة من الجدار الداخلي للأنبوب ، مع الحرص على تجنب إزعاج الحبيبات. احتفظ بالحبيبات عند 4 درجات مئوية على الجليد قدر الإمكان.
  12. لإعادة تعليق الميتوكوندريا ، أضف 80 ميكرولتر من IB المثلج إلى قاع الأنبوب. أعد تعليق الحبيبات برفق عن طريق غسل IB بشكل متكرر على الحبيبات.
  13. لتجنب تكوين فقاعات، اضبط ماصة دقيقة على الشفط وتوفر ما بين 40-60 ميكرولتر من الحجم.
  14. عندما تشتت حبيبات الميتوكوندريا ، قم بزيادة حجم الماصة الدقيقة لإعادة تعليق الميتوكوندريا المحببة بكفاءة. تجنب لمس الحبيبات بطرف الماصة ، وتجنب تكوين الفقاعات.
  15. بمجرد إعادة تعليقها ، انقل الميتوكوندريا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مبرد مسبقا وقم بتسميتها على أنها ميتوكوندريا مخزون. قم بتدوين الحجم الإجمالي لإعادة التعليق.
  16. لتحديد تركيز بروتين الميتوكوندريا في العينة ، قم بإجراء فحص بروتين كلي باستخدام فحوصات بروتين BCA أو برادفورد المعروفة كما هو محدد في تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: تتمثل الإستراتيجية البديلة أو التكميلية لتقييم العائد في تحديد نشاط سينسيز السترات. كمرجع ، يمكن قياس محتوى الميتوكوندريا باتباع البروتوكول الموضح في Vinnakota et al.30.

4. فحوصات مراقبة الجودة

  1. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق المبرد مسبقا ، قم بتخفيف مخزون الميتوكوندريا إلى تركيز العمل المطلوب باستخدام IB.
    ملاحظة: يتم تخفيف مخزون الميتوكوندريا إلى 40 مجم / مل للعمل بتركيز نهائي 0.1 مجم / مل لمقايسات قياس التنفس عند استخدام العزلات من أنسجة القلب.
  2. اشطف غرف الأوكسجراف، والسدادات، وماقن الميكرولتر عشر مرات بالماء المقطر لتنظيفها قبل استخدامها في فحوصات قياس إعادة التصنيع.
  3. لاختبار جدوى وجودة عزلات الميتوكوندريا ، قم بتحميل 2.3 مل من عازلة التنفس (RB) في غرف الأوكسجين والسماح لإشارة استهلاك الأكسجين بالتوازن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا أو عندما يكون المعدل قريبا من 0.
  4. بمجرد أن يتم توازن الإشارة ، ادفع السدادات لأسفل واستنشق المخزن المؤقت الزائد الذي يخرج من الشعيرات الدموية للسدادة.
  5. أضف 1 ملي مولار EGTA باستخدام حقنة ميكرولتر لاستخلاص أي كالسيوم متبقي في المخازن المؤقتة أو عينة الميتوكوندريا.
  6. لتغذية التنفس ، أضف 5 ملي مولار من بيروفات الصوديوم و 1 ملي مولار من المالات.
  7. بعد إضافة الركائز ، أضف بلعة من الميتوكوندريا المخففة لتحقيق تركيز العمل والسماح بحدوث التنفس لمدة 5 دقائق. تسمى هذه الفترة LEAK أو تنفس الحالة 2.
  8. عند علامة 5 دقائق ، أضف بلعة 500 ميكرومتر ADP لبدء التنفس في الحالة 3 ، والتي تسمى أيضا OXHPOS ، واسمح للميتوكوندريا بالتنفس حتى نقص الأكسجين.
  9. احسب نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR) بقسمة الحد الأقصى لمعدل استهلاك الأكسجين خلال الحالة 3 على معدل استهلاك الأكسجين قبل إضافة ADP في الحالة 2 (انظر الشكل 1).
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام تعبير RCR بديل للعدد 1 - 1 / RCR كمقياس للجودة ، والذي يحد بين 0 و 1 ؛ ومع ذلك ، فإنه يجعل من الصعب التمييز بين الجودة باستخدام هذا المقياس عندما > RCR 10 (انظر الشكل 2).
  10. اشطف الغرف والسدادات 10 مرات بالماء النقي لتنظيف الأوكسجرافية للفحوصات اللاحقة. إذا اكتمل قياس إعادة التسخين ، املأ الغرف بنسبة 70٪ من الإيثانول وضع السدادات في الغرف حتى الاستخدام التالي.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند الانتهاء من عزل الميتوكوندريا ، يجب اختبار جودة ووظائف العزلات عن طريق تحديد معدلات استهلاك الأكسجين (JO2) باستخدام قياس إعادة التسخين عالي الدقة. للقيام بذلك ، تم تخفيف مخزونات الميتوكوندريا إلى 40 مجم / مل للسماح بتركيزات العمل البالغة 0.1 مجم / مل في 2 مل من RB لجميع فحوصات قياس إعادة التقسيس باستخدام الميتوكوندريا القلبية المعزولة. تم تغذية التنفس بواسطة 5 ملي مولار بيروفات الصوديوم و 1 ملي مولار لتر مالات في وجود 1 ملي مولار EGTA ، وهو مخلب الكالسيوم ، وسمح له بالتوازن لمدة 5 دقائق لإنشاء تنفس الحالة 2. خلال هذه الحالة ، يجب أن يبلغ متوسط معدلات استهلاك الأكسجين 45-55 pmol / mL / s أو 27-33 nmol / mg / min. كن على دراية بمعدل استهلاك الأكسجين المعتمد على القطب الكهربائي وقم بإجراء تصحيحات الخلفية المناسبة عند الضرورة. تبدأ الفسفرة المؤكسدة (الحالة 3) عند علامة 5 دقائق بواسطة بلعة 500 ميكرومتر ADP. تم تفصيل إضافات الركيزة والتتبع التمثيلي في الشكل 1. سيكون للميتوكوندريا الوظيفية زيادة فورية في JO2 بعد إضافة ADP ، والذي يتراوح وفقا لمصدر الأنسجة ، كما هو موضح في الشكل 2. بدون استخدام EGTA ، يكون للكالسيوم المتبقي تأثيرات متغيرة على المعدلات القصوى ل JO2 أثناء OXPHOS ، اعتمادا على تركيز الميتوكوندريا وتوافر الركيزة والعوامل البيئية الأخرى. تكوين العازلة مهم للحفاظ على سلامة غشاء الميتوكوندريا ووظائفه. تم تفصيل جميع وصفات المخزن المؤقت المذكورة في جميع أنحاء البروتوكول بشكل أكبر في الجدول 1 ويمكن استخدامها لجميع مستحضرات الميتوكوندريا الموضحة هنا.

يشار إلى العزل الناجح للميتوكوندريا من خلال الحصول على قيم RCR التي تقع ضمن النطاق المحدد لكل نوع ومصدر للأنسجة ، كما هو موضح في الجدول 2. بناء على البيانات التي تم جمعها باستخدام هذا البروتوكول ، في حالة عزل الميتوكوندريا القلبية عن خنازير غينيا أو الفئران أو الفئران ، يجب أن تكون RCRs ≥16 و ≥8 و ≥5 على التوالي. في حالة العزل عن كبد الفئران أو الكلى ، يجب أن تكون RCRs ≥6 ، بينما تعتبر RCRs من الخلايا مقبولة إذا كانت أعلى من 3.8. إذا انخفضت قيم RCR إلى ما دون هذه النطاقات أو إذا كانت هناك اختلافات نوعية في تتبع قياس إعادة التدوير ، فمن المستحسن إجراء فحص إضافي مع RB وركائز جديدة لاستبعاد المشكلات من التلوث. على الرغم من أن التحويل 1-1 / RCR يحد القيم بين 0 و 1 ، إلا أن هذا المقياس لا ينصح به عند مقارنة جودة الميتوكوندريا عبر الجنسين أو الأنواع عندما تكون قيمة RCR أكبر من 10. لهذا السبب ، تم قياس قيم RCR القياسية (الحالة 3 / الحالة 2 أو OXPHOS / LEAK) أثناء جميع التجارب. المعلومات المتعلقة بالتعديلات التي يمكن إجراؤها على هذا البروتوكول لعزل الميتوكوندريا بشكل أفضل من قلوب الفئران والكبد والكلى والخلايا مفصلة في الجدول 3.

figure-results-1
الشكل 1: مناطق الأهمية لفحوصات مراقبة الجودة باستخدام قياس إعادة التذمر عالي الدقة. تم تحميل غرف الجهاز التنفسي ب 2 مل من RB وسمح لها بالتوازن عند 37 درجة مئوية حتى يقترب معدل استهلاك الأكسجين من 0. بمجرد التوازن ، تمت إضافة 1 ملي مولار EGTA ، وهو مخلب الكالسيوم ، جنبا إلى جنب مع 5 ملي مولار من بيروفات الصوديوم و 1 ملي مولار من المالات. بعد إضافة هذه الركائز ، تمت إضافة الميتوكوندريا بتركيز العمل المطلوب (0.1 مجم / مل) وسمح لها بالتنفس لمدة 5 دقائق لتحقيق تنفس الحالة 2 (أصفر). عند علامة 5 دقائق ، تمت إضافة 500 ميكرومتر ADP لبدء تنفس الحالة 3 (أحمر). تم تحديد RCRs حسب الوقت بمتوسط معدلات استهلاك الأكسجين المشار إليها بالصندوقين الأحمر والأصفر لمقارنة الحالة 3 بالحالة 2. يشار إلى الحالة 4 بالصندوق الأخضر وتمثل فترة التحلل المائي ATPase خارج الميتوكوندريا ل ATP ويمكن استخدامها لتقييم سلامة الغشاء الخارجي في فحوصات السيتوكروم C. تم جمع البيانات المعروضة باستخدام الميتوكوندريا القلبية للفئران SD. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تتبع JO2 الممثل ونسب التحكم في الجهاز التنفسي عبر المصادر الحيوانية والأنسجة. تم اختبار جودة الميتوكوندريا المعزولة عن طريق تحديد معدلات استهلاك الأكسجين باستخدام قياس إعادة التنفس عالي الدقة. تم تغذية التنفس بواسطة 5 ملي مولار من بيروفات الصوديوم و 1 ملي مولار من المالات في وجود 1 ملي مولار EGTA. سمح للميتوكوندريا والركائز بالتنفس لمدة 5 دقائق حتى يستقر التنفس في الحالة 2. تمت مقارنة المعدلات القصوى لاستهلاك الأكسجين بعد إضافة ADP بمعدلات استهلاك الأكسجين في الحالة 2 قبل ADP لحساب نسب التحكم في الجهاز التنفسي (RCRs) لكل نسيج. تم تقييم جودة الميتوكوندريا بشكل أكبر من خلال حساب قيم 1-1 / RCR كما تتميز بمعايير كفاءة التحكم في الربح المنخفض. تشير الرسوم البيانية الشريطية الموجودة على يمين كل تتبع إلى متوسط RCR للذكور (الأزرق) والإناث (الأخضر) وقيم 1-1 / RCR ± SD لنسيج معين. (أ) و (ب) و (ج) تشير إلى البيانات التي تم جمعها باستخدام خنازير غينيا وفئران سبراج داولي (SD) وقلوب الفئران بفيروس اللوكيميا B (FVB) ، على التوالي. (D) و (E) النتائج التفصيلية من كبد وكلى الفئران SD ، بينما يشير (F) إلى خلايا HEK293. تم جمع فصوص الكبد الثلاثة الكبيرة ، بينما تم استخدام كلتا الكليتين للعزل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: وصفات العازلة. يجب تحضير عازلة شلل القلب (CB) ، وعازلة العزل (IB) ، وعازلة التنفس (RB) المستخدمة طوال عملية العزل مسبقا وفقا للتعليمات المدرجة. يمكن تخزين CB لمدة تصل إلى شهر عند 4 درجات مئوية ، بينما يمكن الاحتفاظ بالIB و RB لمدة 4 أشهر عند -80 درجة مئوية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: تحليل نسبة التحكم في الجهاز التنفسي. تم إجراء عزل الميتوكوندريا للتحليلات الوظيفية عبر مجموعة واسعة من الأنواع ومصادر الأنسجة في كل من القوارض من الذكور والإناث بالإضافة إلى خلايا HEK293. يتم تفصيل حجم العينة لكل جنس ومصدر للأنسجة والأنواع جنبا إلى جنب مع متوسط قيم RCR و 1-1 / RCR ± SD. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: التعديلات الموصى بها لبروتوكول عزل الميتوكوندريا لمختلف الأنسجة لزيادة إنتاجية البروتين. يتم عرض التغييرات في كميات البروتياز والطرد المركزي وفقا لمصدر الأنسجة. تم حساب متوسط كميات البروتين الكلي (ملغ) من نتائج اختبار بروتين BSA وحجم إعادة تعليق حبيبات الميتوكوندريا النهائية. يتم الإبلاغ عن القيم كمتوسط ± SD. تنصح التعليمات الجريئة المضمنة في عمود الطرد المركزي حول ما إذا كان يجب التخلص من المادة الطافية أو الاحتفاظ بها أو تجميعها. يشير التخلص من المادة الطافية في حاوية نفايات بيولوجية ، بينما يشير الاحتفاظ والتجميع إلى نقل المادة الطافية إلى أنبوب الطرد المركزي التالي أو جمعه للدوران النهائي ، على التوالي. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل المتعلقة بالتعديلات على البروتوكول في قسم المناقشة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سيضمن الالتزام بالطرق الموضحة بإيجاز في هذا البروتوكول عزل الميتوكوندريا المقترنة جيدا عن أنسجة القلب للقوارض الصغيرة ، بالإضافة إلى أنواع ومصادر الأنسجة الأخرى. بشكل عام ، يجب أن تستغرق العملية ما مجموعه 3-3.5 ساعة ، حيث يجب أن تبقى جميع الأنسجة الحيوانية والعينات والعزلات على الجليد عند 4 درجات مئوية قدر الإمكان للحد من التدهور. هذا الإجراء قوي ويمكن تغييره بعدة طرق لتناسب الأهداف والنماذج التجريبية المستخدمة بشكل أفضل. أحد التعديلات التي يمكن إجراؤها أثناء عملية تشريح الأنسجة هو استبعاد الهيبارين. يتم إعطاء الهيبارين لمنع تكوين جلطات الدم31 ولكنه ليس ضروريا إذا تم تقشير القلب ونقعه بسرعة كافية (في غضون 1.5 دقيقة من قطع الرأس). علاوة على ذلك ، يوصى باستخدام نضح القلب باستخدام CB للقوارض الكبيرة ، لذلك عند العمل مع قلوب الفئران أو الأعضاء الأخرى ، ينصح بتضمين غسول البكالوريا الدولية قبل الفرم والتجانس الأولي. تسمح هذه الخطوة بالتخلص من الدم المنقول من عملية التشريح. تشمل التغييرات الأخرى تغييرات في سرعات التجانس والطرد المركزي لزيادة إنتاجية بروتين الميتوكوندريا. تلك الموضحة أعلاه مخصصة لعزل الميتوكوندريا القلبية عن خنازير غينيا والجرذان. الأهم من ذلك ، يمكن تكييف هذا البروتوكول لعزل الميتوكوندريا عن كبد القوارض والكلى وقلوب الفئران والخلايا. يتم تفصيل التعديلات الموصى بها على حجم البروتياز والتجانس والطرد المركزي بناء على أنواع الأنسجة المحددة في الجدول 3.

بعد تكوين حبيبات الميتوكوندريا المنقاة من خطوة الطرد المركزي النهائية ، يجب إعادة تعليق الميتوكوندريا في IB المبردة مسبقا. يعتمد حجم IB المضاف على حجم حبيبات الميتوكوندريا ولكنه يبلغ حوالي 80 ميكرولتر لخنازير غينيا والجرذان. في حالة العزل عن قلوب الفئران ، يتم إضافة 60 ميكرولتر من IB لإعادة التعليق. عند عزل الميتوكوندريا لأول مرة ، ينصح بإضافة كميات أصغر من IB حتى لا تمييع محلول المخزون. نظرا لتناسق كريات الميتوكوندريا التي تشكلت بعد تنقية العينات من الكبد والكلى ، يجب إضافة عدد أقل بكثير من IB (20 ميكرولتر) لإعادة التعليق. تقترح طرق أخرى استخدام إعادة التعليق الميكانيكية عن طريق الكشط الذي يمكن أن يكون كاشطا لأغشية الميتوكوندريا ويقلل من السلامة الكلية32،33. عند استخدام هذا البروتوكول ، ينصح بغسل الحبيبات برفق باستخدام IB لتحسين جودة الميتوكوندريا. أثناء هذه العملية ، احرص على تجنب إنتاج فقاعات أو إزعاج الحبيبات بطرف الماصة ، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى تمزق الغشاء وسوء طي البروتين34. يمكن أن يساعد الدفع فقط إلى المحطة الأولى للماصة في تقليل احتمالية تكوين الفقاعات. يجب غسل الماصة بلطف حتى يتم تعليق الحبيبات بالكامل. يجب أن يكون إجمالي عائد إعادة التعليق 150-200 ميكرولتر للميتوكوندريا القلبية من خنازير غينيا والجرذان ويظهر باللون البني الفاتح. ستكون العينات الأكثر تركيزا ذات لون بني أغمق ويمكن تخفيفها لتناسب نطاق تركيز العمل المطلوب بعد القياس الكمي لبروتين الميتوكوندريا.

تعتبر فحوصات البروتين القياسية باستخدام BSA مثالية لقياس بروتين الميتوكوندريا35. يجب تأخير فحوصات البروتين واحتضانها لفترات ودرجات حرارة موصى بها على النحو المحدد في بروتوكول الشركة المصنعة. بالنسبة للميتوكوندريا المعزولة ، يسمح الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بتطوير اللون بشكل جيد وقياس دقيق للبروتين. أثناء تحديد الكمية الإجمالية للبروتين ، يوصى في البداية بتخفيف الميتوكوندريا المعلقة و IB بنسب 1: 50 و 1: 100 و 1: 200 للتأكد من أن نتائج فحص البروتين ستكون ضمن نطاق المعايرة. يتم توفير مزيد من التفاصيل حول كيفية إجراء فحوصات البروتين باستخدام BSA كمعيار لكل مجموعة الشركة المصنعة ، لذلك قد لا تكون التوصيات المذكورة هنا قابلة للتطبيق. يجب أيضا إجراء اختبار CS لتحديد محتوى الميتوكوندريا في كل عينة. هذا الاختبار راسخ ويسمح بمزيد من التطبيع في حالة دراسة الاختلافات البيولوجية بين الأنواع الفرعية للميتوكوندريا36.

بعد تحديد البروتين ، يجب تخفيف مخزون الميتوكوندريا لتحقيق تركيز العمل النهائي المطلوب لمقايسات قياس إعادة الضغط. يتم تخفيف الميتوكوندريا المعزولة من خنازير غينيا وقلوب الفئران إلى 40 مجم / مل ، ويضاف 5 ميكرولتر من هذا المخزون إلى غرفة الجهاز التنفسي لينتج عنه تركيز عمل يبلغ 0.1 مجم / مل. في حالة العزل عن قلوب الفئران المفردة أو عن الكلى والكبد ، فقد لا يكون تخفيف مخزون الميتوكوندريا ضروريا. يمكن أيضا إضافة كميات أكبر من الميتوكوندريا للحصول على التركيزات المطلوبة. معدلات استهلاك الأكسجين خلال الحالة 2 التي تتراوح بين 35-55 pmol / mL / s مقبولة لمعظم تحليلات قياس إعادة التدفق28. يتم شرح التفاصيل المتعلقة بكيفية إجراء الاختبارات الموحدة الإقليمية وتحليلها في الشكل 1 وقسم النتائج التمثيلية. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن التنفس يغذيه البيروفات والمالات. ستؤدي ظروف الركيزة الأخرى ، مثل السكسينات والروتينون ، إلى قيم RCR مختلفة نظرا لأن نسبة P / O ومتغيرات الطاقة الحيوية الأخرى مختلفة37. واستخدام البيروفات والمالات كوقود للأجهزة التنفسية يحقق ما يقرب من الحد الأقصى لدوران دورة TCA وإنتاج مكافئات مختزلة؛ ومع ذلك ، يتم الحصول على الحد الأقصى لنشاط دورة TCA ووظيفة ETS المقترنة مع 5 ملي مولار بيروفات ، و 1 ملي مولار لتر مالات ، و 20 ملي مولار سكسينات. عند تحفيز الفسفرة المؤكسدة لتحديد معدلات استهلاك الأكسجين خلال الحالة 3 ، تتم إضافة ADP بتركيزات لا تقل عن 10 أضعافKD المقدرة ل ADP لمحول نوكليوتيدات الأدينين38. يمكن تحقيق ذلك عن طريق الجرعات التي تزيد عن 350 ميكرومتر ADP ، ولهذا السبب تم استخدام 500 ميكرومتر في جميع المقايسات التجريبية. إذا كانت مدة الحالة 3 قصيرة جدا ، فيمكن استخدام تركيزات أقل في الميتوكوندريا لإطالة أمدها. لمزيد من التحليل للتنفس ، يمكن إجراء تعديلات على تركيز ADP الذي يتم إدخاله إلى النظام لتناسب المعلمات التجريبيةبشكل أفضل 39. عند تطوير هذا البروتوكول لأول مرة ، تم استخدام اختبار السيتوكروم C لتقييم سلامة الغشاء الخارجي لعزلات الميتوكوندريا40. إذا كانت قيم RCR أقل من النطاقات المتوقعة ، فقم بإجراء اختبار السيتوكروم C لتقييم ما إذا كان تلف الغشاء الخارجي كبيرا. للقيام بذلك ، أضف 10 ميكرومتر من السيتوكروم C إلى غرفة الجهاز التنفسي وتأكد من أن الزيادة في التنفس أقل من 5 أو 10٪ من معدل الحالة 4. تم العثور على النطاقات المتوقعة من الدراسات المنشورة السابقة وهي خاصة بالأنواع والأنسجة والركيزة. إذا كانت إضافة السيتوكروم ج تحفز تنفس الحالة 4 فوق 10٪ ، فيمكن تكرار آخر 8,000 × جم لإزالة الميتوكوندريا التالفة. ومع ذلك ، قد يكون تلف الغشاء الخارجي جزءا من النمط الظاهري للمرض ، وبالتالي ، يجب تفسير اختبار السيتوكروم C مع وضع ذلك فيالاعتبار 41. بمجرد الحصول على قيم RCR عالية باستمرار مع تأثيرات محفزة منخفضة (<10٪) للسيتوكروم C ، يصبح هذا الاختبار ضروريا فقط وينصح به إذا كانت قيم RCR تقع خارج النطاقات المقبولة. إذا كان اختبار السيتوكروم C <10٪ وكانت قيم RCR خارج النطاق المتوقع ، كما هو مفصل في الجدول 2 ، كرر اختبار قياس التنفس باستخدام RB جديد بعد الغسيل بالماء المقطر 10 مرات. إذا استمرت المعدلات المنخفضة ، فيجب عمل كواشف جديدة (البيروفات ، مالات ، EGTA ، و ADP) لتشخيص المشكلة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء فحوصات السيتوكروم C عن طريق ELISAs واستخدام أصباغ الميتوكوندريا مثل TMRE33،42. اعتمادا على نوع الأنسجة ومصدرها ، قد تكون هذه الخيارات أكثر ملاءمة لتحديد سلامة الغشاء الخارجي.

على الرغم من عدم وجود قيود رئيسية على استخدام هذا البروتوكول لعزل الميتوكوندريا القلبية ، فمن المهم ملاحظة أنه يجب مراعاة بعض الاعتبارات عند استخدام هذه الأساليب. تتأثر جودة عزلات الميتوكوندريا بشكل كبير بدرجة الحرارة والوقت المستغرق لاختراق القلب وإعادة تعليق الحبيبات المنقاة. وبالتالي ، قد تكون هناك حاجة إلى الإلمام بهذه العمليات للحصول على RCRs مماثلة لتلك المبلغ عنها هنا. بالإضافة إلى ذلك ، يعد تكوين المخازن المؤقتة والمحاليل المستخدمة أثناء عملية العزل أمرا مهما لأنه يؤثر بشكل مباشر على سلامة الميتوكوندريا ووظيفتها43. يتم توفير المخازن المؤقتة المدرجة في الجدول 1 كمراجع وسمحت بعزل الميتوكوندريا جيدة الاقتران عبر مجموعة متنوعة من مصادر الأنسجة ، ولكن يمكن إجراء تغييرات للحد من كمية الكلوريد في تحليلات التنفس لأن هذا يمكن أن يتداخل مع نقل نيوكليوتيدات الأدينين ووظيفة ETS28. يمكن أيضا تغيير تكوين العازلة لعزل الميتوكوندريا الكبدية بشكل أفضل. نظرا لأن الكبد يحتوي على نسبة عالية من تركيزات الأحماض الدهنية ، فمن المستحسن غسل العضو والأنسجة المفرومة بمخزن مؤقت يحتوي على تركيزات مرتفعة من BSA إذا لوحظت RCRs خارج النطاق المتوقع. على الرغم من أن جودة عزلات الميتوكوندريا التي تم الحصول عليها من أقسام الكبد متقاربة ومتسقة بشكل جيد ، إلا أن هذا التغيير يمكن أن يؤدي إلى تحسين وظيفة العضية. يجب أيضا الاعتراف بأن عزل الميتوكوندريا عن الخلايا التي تستخدم هذه الطرق يتطلب كمية كبيرة من الخلايا المستنبتة ، مما يشكل قيودا محتملة. علاوة على ذلك ، لم يتم تصميم هذا البروتوكول خصيصا للعزلات الخلوية ولكنه أثبت نجاحه عند تنفيذه. لذلك ، قد تكون طرق العزل المستهدفة للخلايا المستنبتة ذات فائدة أفضل. بدلا من ذلك ، لتقييم جودة الميتوكوندريا ، قد يختار الباحثون مجسات الفلورسنت لحساب RCRs. تعد طرق القياس الطيفي خيارا شائعا ، خاصة إذا تم استخراج كميات أقل من البروتين44،45.

بشكل عام ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لعزل الميتوكوندريا القلبية المقترنة جيدا باستمرار عن الصغيرة مثل خنازير غينيا والجرذان. يمكن تعديله بسهولة لزيادة غلة البروتين عن طريق تغيير سرعات التجانس وأوقات الطرد المركزي وعدد الدورات للسماح بعزل الميتوكوندريا عن قلوب الفئران والكبد والكلى والخلايا. علاوة على ذلك ، فإن هذا البروتوكول عام وقوي بما يكفي لدرجة أنه تم استخدامه للتحقيق في وظيفة الميتوكوندريا من الأنواع غير الثديية مثل لامبري البحر46 ، بالإضافة إلى إجراء التحليل الهيكلي باستخدام المجهر الكلاسيكي والإلكترون بالتبريد40،47. بينما تركز العديد من الدراسات الحديثة على استكشاف سلوك الميتوكوندريا في أنظمة الخلايا والأنسجة السليمة ، فإن اتساع وعمق المعلومات المستخرجة من الميتوكوندريا المعزولة باستخدام هذه الطرق تكشف عن التأثيرات على التمثيل الغذائي والإجهاد التأكسدي وإنتاج ATP التي لن تكون أبدا بدون مزايا. يسمح عزل الميتوكوندريا المقترنة جيدا للباحثين بالتحقيق في الجوانب الرئيسية لتطور المرض وتطوره والتي لا يمكن تحقيقها في نماذج الخلايا الكاملة. نظرا لتعدد استخدامات هذا البروتوكول ، يمكن استكشاف التغييرات في طاقة الميتوكوندريا التي لوحظت في أمراض مثل أمراض القلب والأوعية الدموية والسكري والاضطرابات العصبية باستخدام المنهجية الموضحة هنا.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفان أنه لا يوجد ما يمكن الكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نتوجه بخالص الشكر إلى دانيال أ. بيرد وكاليان سي فيناكوتا لمساهماتهم التأسيسية في هذا البروتوكول. تم تمويل هذا العمل من قبل منحة NSF CAREER MCB-2237117.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب الطرد
10 مل دورقلتشريح الأعضاء وفرمها
50 مل أنابيبالمركزي
الأدينوزين 5'-ثنائي الفوسفات أحادي البوتاسيوم الملح ثنائي الهيدراتسيجما  A5285فحوصات قياس ريتبيرومتر
BSAفحص البروتين Thermo ScentificPI23225تكميم بروتين الميتوكوندريا
DextroseSigma DX0145للمخزن المؤقت (CB)
الإيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينو-إيثيل إيثر) -N ، N ، N '، N'-حمض رباعي الأسيتيك   ؛سيجما E4378للمخازن المؤقتة (CB و IB) ومقايسات قياس إعادة التنفس
قنية زجاجيةRadnotiخنزير غينيا والفئران نضح قلب
الهيبارين الصوديوم المخاطي للخنزيرSigma   ؛SRE0027-250KUحقن IP للحيوان
مقياس التنفس عالي الدقةمن نوع كلارك. أوكسجراف مع غرف 2 مل
غرفة الحث
IsofluraneSigma & nbsp ؛792632التخدير 
حمض الماليكSigma 02288-50Gمقايسات قياس ريسبيروميتري
كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدراتسيجما   ؛M9272للمخزن المؤقت (RB)
MannitolSigma MX0214للمخزن المؤقت (IB) محاقن
ميكرولترأحجام تتراوح من 5 &ndash ؛ 50 وميكرو ؛ L
قارئيجب أن يكون قادرا على الاحتضان عند 37 درجة ؛ ج 
MOPSSigma 475898لجميع المخازن المؤقتة
O2< / sub> خزان
OMNI THQ HomogenizerOMNI International   ؛12-500مجانسات الجزء الثابت الدوار مماثلة ستعمل
الماصاتالمجدادات من  2– 20 وميكرو ؛ L; 20 & - ندش; 200 وميكرو ؛ L; 200 & - - نداش. 1000 & ميكرو; L
كلوريد البوتاسيومسيجما P3911للمخازن المؤقتة (RB و CB)
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةSigma   ؛795496للمخازن المؤقتة (IB و RB)
البروتياز من Bacillus licheniformisSigma P5459
كلوريد الصوديومسيجما S9888للمخزن المؤقت (CB)
الكواشف الحيويةلبيروفات الصوديومBP356-100فحوصات قياس إعادة التقسيس
السكروزسيجما & nbsp ؛8510-OPللمخزن المؤقت (IB)
التشريح الجراحييعتمد على مصدر والأنسجة
يجب أن يبرد جهازإلى 4 درجات ؛ ج 
المركزي الدقيقة 1.7 مل زجاجي الطرد مجموعة قطب Microplate فيشر طقم الطرد المركزي المنضدي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  2. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: Ii. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  3. Ernster, L., Schatz, G. Mitochondria: A historical review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  4. Martinez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial tca cycle metabolites control physiology and disease. Nat Commun. 11 (1), 102(2020).
  5. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation, and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  6. Fernie, A. R., Carrari, F., Sweetlove, L. J. Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 254-261 (2004).
  7. Kalpage, H. A., et al. Cytochrome C phosphorylation: Control of mitochondrial electron transport chain flux and apoptosis. Int J Biochem Cell Biol. 121, 105704(2020).
  8. Sousa, J. S., D'imprima, E., Vonck, J. Mitochondrial respiratory chain complexes. Subcell Biochem. 87, 167-227 (2018).
  9. Mitchell, P., Moyle, J. Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation. Nature. 213 (5072), 137-139 (1967).
  10. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).
  11. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods Mol Biol. 837, 63-72 (2012).
  12. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  13. Bisaccia, G., Ricci, F., Gallina, S., Di Baldassarre, A., Ghinassi, B. Mitochondrial dysfunction and heart disease: Critical appraisal of an overlooked association. Int J Mol Sci. 22 (2), 614(2021).
  14. Zhou, B., Tian, R. Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure. J Clin Invest. 128 (9), 3716-3726 (2018).
  15. Holzem, K. M., et al. Mitochondrial structure and function are not different between nonfailing donor and end-stage failing human hearts. FASEB J. 30 (8), 2698-2707 (2016).
  16. Cordero-Reyes, A. M., et al. Freshly isolated mitochondria from failing human hearts exhibit preserved respiratory function. J Mol Cell Cardiol. 68, 98-105 (2014).
  17. Norat, P., et al. Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation. NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).
  18. Diaz-Vegas, A., et al. Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases. Endocr Rev. 41 (3), bnaa005(2020).
  19. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).
  20. Holmuhamedov, E. L., Oberlin, A., Short, K., Terzic, A., Jahangir, A. Cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria display distinct responsiveness to protection by diazoxide. PLoS One. 7 (9), e44667(2012).
  21. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: Functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  22. Micakovic, T., et al. Isolation of pure mitochondria from rat kidneys and western blot of mitochondrial respiratory chain complexes. Bio Protoc. 9 (19), e3379(2019).
  23. Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods Cell Biol. 155, 3-31 (2020).
  24. Hubbard, W. B., et al. Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue. Sci Rep. 9 (1), 9656(2019).
  25. Zhou, D., et al. Protocol for mitochondrial isolation and sub-cellular localization assay for mitochondrial proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102088(2023).
  26. Hernandez-Camacho, J. D., et al. Isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays. J Vis Exp. (180), e63336(2022).
  27. Farrugia, G. E., et al. A protocol for rapid and parallel isolation of myocytes and non-myocytes from multiple mouse hearts. STAR Protoc. 2 (4), 100866(2021).
  28. Wollenman, L. C., Vander Ploeg, M. R., Miller, M. L., Zhang, Y., Bazil, J. N. The effect of respiration buffer composition on mitochondrial metabolism and function. PLoS One. 12 (11), e0187523(2017).
  29. Vinnakota, K. C., et al. Open-loop control of oxidative phosphorylation in skeletal and cardiac muscle mitochondria by ca(2). Biophys J. 110 (4), 954-961 (2016).
  30. Vinnakota, K. C., Bazil, J. N., Van Den Bergh, F., Wiseman, R. W., Beard, D. A. Feedback regulation and time hierarchy of oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria. Biophys J. 110 (4), 972-980 (2016).
  31. Warnock, L. B., Huang, D. Heparin. Statpearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).
  32. Sercel, A. J., et al. Generating stable isolated mitochondrial recipient clones in mammalian cells using mitopunch mitochondrial transfer. STAR Protoc. 2 (4), 100850(2021).
  33. Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. J Vis Exp. (97), e52076(2015).
  34. Sobolewski, P., Kandel, J., Eckmann, D. M. Air bubble contact with endothelial cells causes a calcium-independent loss in mitochondrial membrane potential. PLoS One. 7 (10), e47254(2012).
  35. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  36. Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. A colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster. J Vis Exp. (155), e59454(2020).
  37. Tomar, N., et al. Substrate-dependent differential regulation of mitochondrial bioenergetics in the heart and kidney cortex and outer medulla. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1863 (2), 148518(2022).
  38. Ter Veld, F., Jeneson, J. A., Nicolay, K. Mitochondrial affinity for ADP is twofold lower in creatine kinase knock-out muscles. Possible role in rescuing cellular energy homeostasis. FEBS J. 272 (4), 956-965 (2005).
  39. Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709(2011).
  40. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-em reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Sci Rep. 11 (1), 1037(2021).
  41. Zhou, Z., et al. Diverse functions of cytochrome C in cell death and disease. Cell Death Differ. 31 (4), 387-404 (2024).
  42. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic bcl-2 family members. Cancer Cell. 9 (5), 351-365 (2006).
  43. Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: Multiple roles of inorganic phosphate. J Biol Chem. 278 (40), 39155-39165 (2003).
  44. Motawe, Z. Y., Abdelmaboud, S. S., Breslin, J. W. Evaluation of glycolysis and mitochondrial function in endothelial cells using the seahorse analyzer. Methods Mol Biol. 2711, 241-256 (2024).
  45. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat Protoc. 1 (6), 2563-2572 (2006).
  46. Huerta, B., et al. Sea lamprey cardiac mitochondrial bioenergetics after exposure to TFM and its metabolites. Aquat Toxicol. 219, 105380(2020).
  47. Malyala, S., Zhang, Y., Strubbe, J. O., Bazil, J. N. Calcium phosphate precipitation inhibits mitochondrial energy metabolism. PLoS Comput Biol. 15 (1), e1006719(2019).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة