يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحديد الوظيفة الهدبية وعدم نفاذية الغشاء في ظهارة مجرى الهواء الرئوي الكاذب

1.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67094

⸱

فبراير 21, 2025

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Medicine and Health Sciences, University of North Dakota

في هذه المقالة

ملخص

تستخدم ثقافة واجهة الهواء والسائل بشكل شائع لتطوير ظهارة مجرى الهواء الكاذب عن طريق التفريق بين الخلايا الظهارية القصبية البشرية الطبيعية الأولية التي تحاكي الجانب القمي من مجرى الهواء الرئوي. هنا ، نصف بروتوكولا سهلا لتحديد جودته من خلال مراقبة خصائصه الفيزيائية الحيوية ، مثل الوظيفة الهدبية وسلامة الغشاء.

الملخص

يعد التفريق بين الخلايا الظهارية لمجرى الهواء الرئوي الأولي في واجهة الهواء والسائل (ALI) تقنية شائعة لتطوير ظهارة مجرى الهواء الكاذبة متعددة الخلايا التي تحاكي الجانب القمي من مجرى الهواء الرئوي. في حين أنه من المتوقع تمايز خلايا مجرى الهواء الرئوي الأولي ، فإن تقييم الخصائص الفيزيائية الحيوية مثل الوظيفة الهدبية وعدم نفاذية الغشاء يوفر تقييما لجودة ظهارة مجرى الهواء ويضمن موثوقية التجربة. هنا ، نصف بروتوكولا مباشرا لتطوير ظهارة مجرى الهواء الكاذب متعددة الخلايا في ثقافة ALI ونقيم خصائصين فيزيائية حيوية مهمتين: الوظيفة الهدبية ونفاذية الغشاء. لتحديد الوظيفة الهدبية ، التقطنا الحركة الهدبية لظهارة مجرى الهواء المتمايز لمدة 4 أسابيع باستخدام كاميرا عالية السرعة متصلة بمجهر مقلوب ، متبوعة بقياس تردد النبض الهدبي (CBF) باستخدام نظام تحليل الفيديو Simon Amon (SAVA). قمنا أيضا بقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) باستخدام مقياس فولت أوم لتحديد سلامة الحاجز الظهاري لظهارة مجرى الهواء.

المقدمة

تعد أمراض الجهاز التنفسي المزمنة مثل الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن والتليف الكيسي من المخاوف الصحية الرئيسية في جميع أنحاءالعالم 1. كما أن انتشار أمراض الجهاز التنفسي التي تسببها فيروسات مثل فيروس الأنفلونزا البشرية A والفيروس المخلوي التنفسي (RSV) وفيروس كورونا 2 المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2) يسبب أيضا عبئا اقتصاديا وصحياعاما 2. لذلك ، هناك حاجة ماسة لتطوير أنظمة علاجية لأمراض الجهاز التنفسي التي تؤدي إلى تلف أنسجة الجهاز التنفسي بشكل لا رجعة فيه. لا يشارك النسيج الظهاري التنفسي نفسه في امتصاص الأكسجين فحسب ، بل يوفر أيضا حاجزا لحماية الجسم من غزو مسببات الأمراض والمواد الكيميائيةالخطرة 3. تحتوي ظهارة الجهاز التنفسي على تنظيم خلوي معقد يتكون من ثلاثة أنواع رئيسية من الخلايا: الخلايا المهدبة ، وخلايا الكأس ، والخلايا القاعدية. في الآونة الأخيرة ، كان هناك تقرير عن وجود خلايا أيونوسية جديدة ولكنها نادرة في ظهارة مجرى الهواء4. تعمل الأنسجة المعقدة بطريقة منسقة لتوفير استجابات مناعية فطرية مثل إفراز الببتيدات المضادة للميكروبات ، وإطلاق السيتوكينات لتنشيط الاستجابة المناعية التكيفية ، وإزالة الغشاء المخاطيالهدبي 5. يعد عدم وجود نموذج مناسب لمجرى الهواء أحد العقبات التي تحول دون دراسة التهابات الجهاز التنفسي وتطوير العلاجات.

أصبح نموذج واجهة الهواء والسائل (ALI) أداة رئيسية للبحث في أمراض الجهازالتنفسي 6. إنه نموذج مجرى هوائي رئوي فعال في المختبر حيث تتمايز خلايا مجرى الهواء الرئوي الأولية إلى ظهارة مجرى الهواء الكاذبة المكونة من ثلاثة أنواع على الأقل من الخلايا التي توجد بشكل عام في الجانب القمي من مجرى الهواء. أولا ، تغطي الخلايا المهدبة غالبية الجانب القمي من مجرى الهواء وتساهم في إزالة الغشاء المخاطي الهدبي. ثانيا ، تنتج خلايا الكأس مخاطا وهي أكبر الخلايا التي تقيم مع الخلايا الهدبية في الجانب القمي من مجرى الهواء. ثالثا ، توجد الخلايا القاعدية في الطبقة القاعدية للمجرى الهوائي وهي الخلايا السلفية التي تتمايز إلى خلايا ظهاريةمختلفة 5،7. على الرغم من أن الخلايا الأيونوسية وخلايا الخصل نادرة في ظهارة مجرى الهواء ، إلا أنها قد تلعب أيضا دورا في الوظيفة الهدبية ونفاذية الغشاء4. تختلف هذه التقنية عن ثقافة الخلايا المغمورة التقليدية ، والتي لا تحاكي بيئة الرئة في الجسم الحي . نظرا لأن ALI يتم إنتاجه من الخلايا الظهارية الأولية المشتقة من الأشخاص الأصحاء ومرضى الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن ، فإنه يوفر منصة أكثر تنوعا لدراسة الاستجابات للعدوى والفيزيولوجيا المرضية.

يعد التقييم الصحي للثقافات المطورة من ALI جانبا أساسيا للمراقبة ، مما يضمن صلاحية الخلايا المستنبتة ووظائفها وأهميتها الفسيولوجية. يعزز الثقة في نزاهة وموثوقية وقابلية استنساخ ثقافات ALI. كما تم نشره سابقا ، تقوم مجموعتنا بتقييم سلامة ثقافة ALI من خلال تقييم معلمتين فيزيائيتين حيويتين: الوظيفة الهدبية عن طريق تحديد تردد النبض الهدبي (CBF) وسلامة الحاجز الظهاري عن طريق تحديد المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) 6،7،8. يعد تصفية الغشاء المخاطي الهدبي (MCC) إحدى السمات المهمة لظهارة مجرى الهواء التي تحملها الخلايا المهدبة. تنبض العضيات المتخصصة التي تسمى الأهداب على سطح الخلايا المهدبة في موجات العقد لتطهير الشعب الهوائية من الالتهابات والجزيئات المستنشقة العالقة في الطبقة المخاطية لظهارة مجرى الهواء. تعتمد MCC الفعالة كليا على النشاط الهدبي المناسب9. مؤشر CBF الجيد على ظهارة مجرى الهواء صحية وسليمة. ومن ثم ، فإن مراقبة CBF لثقافات ALI توفر نظرة ثاقبة حول سلامة الظهارة10. على الرغم من وجود طرق متعددة لتحديد CBF ، على سبيل المثال ، الفحص المجهري بالفيديو عاليالسرعة 11 والتصوير المقطعي للتماسك البصري دوبلر12 ، فإن كل طريقة تحتاج إلى خبرة تقنية ومعدات متخصصة. في هذا البروتوكول ، نقدم طريقة أسهل وأقل تقنية لقياس CBF لظهارة مجرى الهواء المتمايزة. وصفنا أيضا طريقة لقياس TEER لنفس الظهارة ، والتي تشير إلى سلامة الأنسجة الظهارية ووظيفة الحاجز13.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يجب تنفيذ البروتوكول في حالة معقمة تحت غطاء تدفق رقائقي من المستوى 2 للسلامة البيولوجية (خزانة السلامة البيولوجية). يجب إذابة جميع الوسائط والمحاليل عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. يجب إجراء الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية. يجب أن تكون جميع المواد المستخدمة في التجربة معقمة. تم الحصول على الخلايا الأولية (متبرع مجهول الهوية) بالتعاون مع الدكتورة كريستينا بيلي في المركز الطبي بجامعة نبراسكا (UNMC) ، أوماها ، شمال شرق. الخلايا الأولية من متبرعين مجهولي الهوية ، ولا تندرج الخلايا تحت موضوع المعاهد الوطنية للصحة. تم الحصول على الخلايا بموجب اتفاقية نقل المواد المعتمدة (MTA) بين جامعة نورث داكوتا ، غراند فوركس ، إن دي ، و UNMC ، أوماها ، شمال شرق. هنا ، استخدمنا 4 خلايا NHBE مرتة. على الرغم من أن خلايا NHBE ذات المرور الأعلى (حتى المقطع 8) قد تبين أيضا أنها تتمايز إلى ظهارة مجرى الهواء ، إلا أننا نستخدم بشكل روتيني أربع خلايا NHBE لأنه لا يوجد فرق واضح في ملفات تعريف نسخ الجينوم الكامل بين المقاطع من 1 إلى 46،14.

1. زراعة الخلايا الأولية

ملاحظة: التعامل الدقيق مع الخلايا الأولية أمر بالغ الأهمية. يجب أن يتجنب البروتوكول بأكمله المعاملة القاسية وسحب العينات المفرطة للخلايا الأولية.

  1. باستخدام ماصة مصلية معقمة، أضف 5 مل من الكولاجين إلى طبق زراعة الأنسجة (TC) مقاس 100 مم لطلاء الطبق مسبقا. احتضن طبق TC بالكولاجين في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة.
  2. باستخدام ماصة مصلية معقمة ، قم بشفط الكولاجين من طبق TC واستبدله ب 8 مل من وسط الخلية الظهارية الكاملة لمجرى الهواء (AEC) المذابة مسبقا مع 2٪ (حجم / حجم) بنسلين ستربتومايسين و 1٪ (حجم / حجم) أمفوتريسين ب (الجدول 1).
  3. قم بإذابة قارورة واحدة (تحتوي على 5 × 105 خلايا) من الخلايا الظهارية القصبية البشرية الطبيعية الأولية (NHBE) في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
  4. باستخدام ماصة مصلية معقمة سعة 5 مل ، أضف 1 مل من وسط AEC الكامل المذاب مسبقا إلى الخلايا بالتنقيط لتأقلم خلايا NHBE ، وجمع جميع الخلايا في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل.
  5. قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 212 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من الوسط برفق من الأنبوب وأعد تعليق الخلايا في القطرات المتوسطة المتبقية في الأنبوب عن طريق النقر اللطيف.
    ملاحظة: يجب تجنب التنصت المفرط والقاسي.
  6. باستخدام ماصة مصلية معقمة سعة 5 مل ، أضف ببطء 2 مل من وسط AEC الكامل إلى الخلايا المعلقة واجمع كل الخلايا.
  7. أضف الخلايا إلى اللوحة المضافة مسبقا مع 8 مل من وسط إلغاء الصدى الصوتي الكامل. حرك طبق TC جانبا لتوزيع الخلايا في الطبق بشكل موحد.
  8. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة خلايا ثاني أكسيد الكربونالرطبة بنسبة 85٪ -95٪. بعد 24 ساعة ، راقب خلايا NHBE تحت المجهر عند 10x أو 20x لارتباطها بطبق TC والنمو. إذا كانت الخلايا معلقة في الوسط ، فهذا يظهر الخلايا الميتة.
  9. بعد 48 ساعة ، استنشق الوسط القديم من طبق TC باستخدام ماصة مصلية معقمة.
  10. باستخدام ماصة مصلية معقمة، أضف 10 مل من وسط AEC الكامل المسخن مسبقا إلى الخلايا. أضف الوسائط ببطء إلى زاوية واحدة ؛ تجنب السكب المباشر على الجزء العلوي من الخلايا.
  11. قم بتغيير وسائط إلغاء الصدى الصدى الكاملة كل 48 ساعة حتى تصل الخلايا إلى التقاء 95٪ -100٪.

2. ثقافة واجهة الهواء والسائل

  1. باستخدام ماصة P200، أضف 100 ميكرولتر من الكولاجين إلى ملحق بئر مغطى مسبقا مقاس 6.5 مم مع غشاء بوليستر مسام 0.4 ميكرومتر (يشار إليه من الآن فصاعدا باسم الإدخالات) واحتضنه في RT لمدة 20 دقيقة.
  2. باستخدام ماصة مصلية معقمة ، استنشق الوسط من خلايا NHBE المتقاربة.
  3. أضف 5 مل من 1x محلول ملحي عازل للفوسفات (DPBS) من Dulbecco مع ماصة مصلية معقمة إلى أحد أركان طبق TC.
  4. قم بتدوير اللوحة برفق لغسل الخلايا وشفط 1x DPBS باستخدام ماصة مصلية معقمة. تأكد من عدم جفاف الخلايا في أي خطوة أثناء البروتوكول.
  5. باستخدام ماصة مصلية ، أضف 5 مل من TrypsinLE إلى الخلايا واحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة خلايا CO2 الرطبة حتى يتم فصل جميع الخلايا عن السطح السفلي للوحة.
  6. باستخدام ماصة مصلية معقمة ، اجمع جميع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. باستخدام ماصة مصلية معقمة، أضف 3 مل من التربسين إلى طبق TC واجمع أي خلايا متبقية.
  7. قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 212 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من الوسيط واضغط برفق على الأنبوب لإعادة تعليق الخلايا الموجودة في قطرات التربسين المتبقية في الأنبوب.
  8. باستخدام ماصة مصلية ، أضف 2 مل من وسط AEC الكامل إلى الخلايا المعلقة.
  9. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي.
  10. قم بتخفيف الخلايا بوسائط إلغاء الصدى الصدى الكاملة ، حيث يستقبل كل إدخال 5 × 104 خلايا بحجم 200 ميكرولتر.
  11. باستخدام ملقط معقم ، انقل الإدخالات إلى بئر فارغ في طبق ثقافة مكون من 24 بئرا.
  12. باستخدام ماصة P1000، أضف 500 ميكرولتر من وسائط إلغاء الصدى الصبغية الكاملة إلى البئر القاعدي للوحة.
  13. باستخدام ملقط معقم ، انقل الحشوات مرة أخرى إلى البئر القاعدي مع إضافة وسائط AEC كاملة.
  14. باستخدام ماصة P200، أضف 5 × 104 خلايا NHBE معلقة في 200 ميكرولتر من وسط AEC الكامل إلى الجانب القمي من الملحق. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنةزراعة خلايا ثاني أكسيد الكربون الرطبة بنسبة 85٪ - 95٪.
  15. بعد 24 ساعة ، راقب الخلايا تحت المجهر لمعرفة ما إذا كانت قد شكلت طبقة ملتصقة في البئر.
    ملاحظة: إذا لم تشكل الخلايا طبقة متقاربة ، فقم بتغيير وسط AEC القاعدي كل 48 ساعة باستخدام وسط AEC جديد وكامل حتى تشكل الخلايا طبقة أحادية متقاربة. أثناء تغيير الوسائط القاعدية ، انقل الإدخالات إلى البئر الفارغ باستخدام ملقط معقم. قم بشفط الوسط القديم باستخدام ماصة P1000، وأضف وسيطا جديدا، ثم ضع الحشوات مرة أخرى في وسط AEC جديد وكامل.
  16. بمجرد أن تتلاقى الخلايا ، انقل الإدخالات إلى بئر فارغ باستخدام ملقط معقم. باستخدام ماصة P1000، قم بشفط كل وسط AEC الأساسي.
  17. باستخدام ماصة P1000، أضف 500 ميكرولتر من وسط تمايز السطح البيني الكامل للهواء والسائل (ALI) المكملة ب 2٪ (حجم/حجم) بنسلين-ستربتومايسين و1٪ (حجم/حجم) أمفوتريسين B إلى البئر القاعدية.
  18. انقل الحشوات إلى البئر القاعدي مع إضافة وسط ALI كامل باستخدام ملقط معقم. باستخدام ماصة P200، قم بشفط وسط AEC القمي برفق من البئر.
    ملاحظة: لا ينبغي إضافة الجانب القمي مع وسط ALI الكامل. استنشق وسط AEC بعناية من الجانب القمي لتجنب أي انفصال للخلايا.
  19. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة خلايا ثاني أكسيد الكربون2 الرطبة. بعد 48 ساعة ، انقل الإدخالات إلى بئر فارغ باستخدام ملقط معقم.
  20. باستخدام ماصة P1000، استنشق الوسط القديم وأضف 500 ميكرولتر من وسط ALI الكامل.
  21. باستخدام ملقط معقم ، ضع الإدخالات مرة أخرى في البئر بوسط جديد. استمر في تغيير وسط ALI الكامل كل 48 ساعة حتى اليوم 28 (أربعة أسابيع).
  22. في اليوم 28 ، باستخدام ماصة P200 ، أضف 100 ميكرولتر من 1x DPBS إلى الجانب القمي من الإدخالات واحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة خلاياCO2 الرطبة لمدة 30 دقيقة. قم بشفط 1x DPBS باستخدام ماصة P200.
    ملاحظة: يجب إضافة DPBS عن طريق سكبه على الحائط بدلا من الصب مباشرة في الخلايا. أثناء شفط DPBS، تجنب لمس الظهارة وسحب العينات القوية لأن أي ضرر يلحق بالظهارة يمكن أن يضر بسلامة الظهارة (الشبيهة بالأنسجة).
  23. منالأسبوع الثاني من التمايز ، قم بتقييم إنتاج المخاط من خلال ملاحظة طبقة داكنة محتملة بسبب المخاط على الظهارة تحت المجهر. يمكن إزالة المخاط الزائد عن طريق غسل DPBS. باختصار ، أضف 200 ميكرولتر من 1x DPBS على الجانب القمي من الإدخالات على صفيحة 24 بئرا واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة خلايا CO2 الرطبة لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة DPBS واحتفظ باللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة خلايا CO2 الرطبة.

3. تحديد تردد النبض الهدبي

ملاحظة: لتحديد CBF عند 37 درجة مئوية (إذا لزم الأمر) ، يحتاج المجهر إلى حاضنة غرفة بيئة توفر 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 عند 37 درجة مئوية والرطوبة.

  1. قم بتشغيل المجهر بجهاز الكمبيوتر المرفق به وغرفة البيئة. افتح باب الغرفة لوضع اللوحة التي تحتوي على الإدخالات على مرحلة المجهر.
  2. بمجرد وضع اللوحة على المسرح ، أغلق الغرفة. باستخدام مقبض تشغيل مرحلة المجهر ، حرك اللوحة لعرض الإدخالات.
  3. حدد عدسة التكبير 20x في وضع تباين الطور. راقب اللوحة من خلال عدسة المجهر وركز الخلية باستخدام مقبض الرنان.
  4. على شاشة الكمبيوتر ، انقر فوق أيقونة نظام SAVA . يجب تثبيت برنامج SAVA على الكمبيوتر المتصل بالمجهر.
  5. على واجهة البرنامج، انقر فوق تكوين التجربة. في علامة التبويب التالية ، انقر فوق إنشاء تجربة.
  6. ستظهر علامة تبويب جديدة، تقدم تفاصيل الدليل حيث سيتم تخزين البيانات في إدخال اسم دليل التجربة وتفاصيل التجربة في إدخال وصف التجربة، ثم انقر على موافق.
  7. انقر على التجربة التي تم إنشاؤها وتظهر في الدليل ضمن التجارب.
  8. انقر فوق تعديل وقدم عينة من التفاصيل في نموذج الوصف. انقر فوق إضافة ثم على خروج للخروج من علامة التبويب هذه.
  9. في واجهة البرنامج الرئيسية في فتحة التجربة، حدد التجربة التي تم إنشاؤها من القائمة المنسدلة على الواجهة الرئيسية.
  10. انقر فوق تسجيل الفيديو وراقب تردد النبض الهدبي (CBF) على شاشة الكمبيوتر. ستعرض الشاشة حركة هدبية مركزة.
  11. لكل إدراج ، سجل 6 حقول عشوائية مختلفة لمدة 2.1 ثانية بمعدل 120 إطارا في الثانية. انقر فوق حفظ الفيديو لمراقبة بيانات CBF.
  12. لتحليل البيانات ، انقر فوق تحليل الفيديو على واجهة البرنامج. في علامة التبويب التالية ، انقر فوق موافق.
  13. في علامة التبويب التالية ، انقر فوق تحليل الكل. قم بتنزيل جدول البيانات الذي تم إنشاؤه لكل تجربة في مجلد الحصول على بيانات SAVA للكمبيوتر في الكمبيوتر.
  14. خذ متوسط التردد الغوسي لعرض البيانات.

4. القياس الكمي للمقاومة الكهربائية عبر الظهارة

ملاحظة: يحتاج القياس الكمي TEER إلى سائل في الجانب القمي لظهارة مجرى الهواء. لإنشاء هذا البروتوكول ، أضف 100 ميكرولتر من 1x DPBS في الجانب القمي لظهارة مجرى الهواء في الإدخالات التي تحتوي بالفعل على الوسط القاعدي (التجريبي) أو 500 ميكرولتر من 1x DPBS.

  1. قم بتشغيل مقياس الأومتر EVOM2 فولت باستخدام مفتاح الطاقة. قم بتوصيل مقاوم الاختبار ب EVOM2 في فتحة INPUT.
  2. راقب القراءة على شاشة EVOM2. إذا كان أعلى أو أقل من 1000 ، فإنه يحتاج إلى معايرة. باستخدام الملقط ، أدر مفتاح ADJ عند مقياس أومتر EVOM2 فولت حتى يظهر قراءة 1000 موحدة.
  3. خذ إدخالا فارغا لقراءة التحكم التجريبي. باستخدام ماصة P200، أضف 100 ميكرولتر من 1x DPBS في الجانب القمي من الملحق الفارغ، بينما تتم إضافة 500 ميكرولتر من 1x DPBS على الجانب القاعدي باستخدام ماصة P1000.
  4. افصل مقاوم الاختبار وقم بتوصيل قطب STX2 عند فتحة INPUT في EVOM2. نظف قطب STX2 برفق باستخدام 70٪ إيثانول.
  5. أدخل القطب الكهربائي STX2 في الملحق الفارغ مع 1x DPBS ، مع الحفاظ على ساق القطب الأقصر على الجزء القمي من كل ملحق وساق القطب الأطول على الجزء القاعدي.
  6. سجل القراءة المستقرة على شاشة EVOM2 ، حيث يمكن أن تتقلب القراءة بسبب الحركة أو لأسباب أخرى غير محددة.
  7. أدخل قطب STX2 في الملحق مع ظهارة متباينة لمدة 28 يوما ، مع الحفاظ على ساق القطب الأقصر على الجزء القمي من كل ملحق وساق القطب الأطول على الجزء القاعدي في الوسط.
  8. سجل القراءة المستقرة على شاشة EVOM2. خذ عدة قراءات مستقلة لحساب متوسط موثوق. اطرح الخلفية (قراءة الإدراج الفارغة) من قراءة الإدراج التجريبي للحساب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قمنا بتقييم كل من الوظيفة الهدبية ونفاذية الغشاء لظهارة مجرى الهواء التي تم الحصول عليها من التفريق بين خلايا NHBE الأولية من اثنين من المتبرعين المستقلين غير المحددين (اثنان من غير المدخنين أو بالغين أصحاء أو بالغين مصابين بمرض الانسداد الرئوي المزمن ، فوق سن 50 عاما). لتحديد الوظيفة الهدبية ، حددنا CBF لظهارة مجرى الهواء المتمايزة لمدة 28 يوما. لاحظنا أن CBF وصل إلى 3 هرتز على الأقل لكل من ظهارة مجرى الهواء ، والتي كانت قابلة للمقارنة مع النتائج المنشورة سابقا (الشكل 1) 6...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تستخدم ظهارة مجرى الهواء الأولي البشري (ثقافة ALI) بشكل متزايد كنموذج رئة في المختبر للتقييمات البيولوجية للتحقيق في الوظيفة والآليات وتقليل استخدام14. تتمتع ALI بالعديد من المزايا مقارنة بأي ثقافة مغمورة أحادية الطبقة. على سبيل المثال ، يوفر ظهارة مجرى الهواء الكاذبة الشبيهة بالأنسجة والتي تحاكي الجانب القمي من مجرى الهواء الرئوي6،7،14. ومع ذلك ، يجب تقييم جودة وسلامة ظه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من خلال منحة تجريبية من المعاهد الوطنية للصحة P20GM113123 و UND SMHS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1x DPBSThermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية14190-144
مجرى الهواء لنمو الخلايا الظهارية المتوسطةPromoCell ، ألمانياC-21060
أمفوتريسين بثيرمو فيشر العلمي ، الولايات المتحدة الأمريكية15290-026
EVOM2 فولت أومترالدقة العالمية ، الولايات المتحدة الأمريكيةغير قابلة للتطبيق
حلول الهيبارينتقنيات STEMCELL، الولايات المتحدة الأمريكية07980
مخزون هيدروكورتيزونتقنيات STEMCELL ، الولايات المتحدة الأمريكية07926
المجهر: Leica DMI8 (مجهر لايكا) مع كاميرا عالية السرعة 120f / sec (Basler) مرتبطة بالمجهر. تم تثبيت Microsope أيضا مع حاضنة غرفة المسرح i8.لايكا ، الولايات المتحدة الأمريكيةغير قابل للتطبيق
البنسلين الستربتومايسينكورنينج ، الولايات المتحدة الأمريكية30-002-CI
PneumaCult-ALI Basal Medium   ؛تقنيات STEMCELL ، الولايات المتحدة الأمريكية05002
PureColAdvanced BioMatrix ، الولايات المتحدة الأمريكية5005
نظام تحليل الفيديو Sisson-Ammons (SAVA). البرمجيات V.2.1.15 Amson Engineering ، الولايات المتحدة الأمريكيةغير قابل للتطبيق
أدوات

المراجع

  1. GBDCRD Collaborators. Global burden of chronic respiratory diseases and risk factors, 1990-2019: an update from the Global Burden of Disease Study 2019. E Clin Med. 59, 101936(2023).
  2. Fendrick, A. M., Monto, A. S., Nightengale, B., Sarnes, M. The economic burden of non-influenza-related viral respiratory tract infection in the United States. Arch Intern Med. 163 (4), 487-494 (2003).
  3. LeMessurier, K. S., Tiwary, M., Morin, N. P., Samarasinghe, A. E. Respiratory barrier as a safeguard and regulator of defense against Influenza A virus and Streptococcus pneumoniae. Front Immunol. 11, 3(2020).
  4. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  5. Calven, J., Ax, E., Radinger, M. The airway epithelium-A central player in Asthma pathogenesis. Int J Mol Sci. 21 (23), 8907(2020).
  6. Talukdar, S. N., et al. RSV-induced expanded ciliated cells contribute to bronchial wall thickening. Virus Res. 327, 199060(2023).
  7. Osan, J., et al. Goblet cell hyperplasia increases SARS-CoV-2 infection in chronic obstructive pulmonary disease. Microbiol Spectr. 10 (4), e0045922(2022).
  8. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  9. Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. Cilia and mucociliary clearance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (4), a028241(2017).
  10. Rhee, C. S., et al. Ciliary beat frequency in cultured human nasal epithelial cells. Ann Otol Rhinol Laryngol. 110 (11), 1011-1016 (2001).
  11. Scopulovic, L., Francis, D., Pandzic, E., Francis, R. Quantifying cilia beat frequency using high-speed video microscopy: Assessing frame rate requirements when imaging different ciliated tissues. Physiol Rep. 10 (11), e15349(2022).
  12. Jing, J. C., Chen, J. J., Chou, L., Wong, B. J. F., Chen, Z. Visualization and detection of ciliary beating pattern and frequency in the upper airway using phase resolved Doppler optical coherence tomography. Sci Rep. 7 (1), 8522(2017).
  13. Yuksel, H., Turkeli, A. Airway epithelial barrier dysfunction in the pathogenesis and prognosis of respiratory tract diseases in childhood and adulthood. Tissue Barriers. 5 (4), e1367458(2017).
  14. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) Cell 3D Cultures for in vitro Lung Model Studies. Sci Rep. 9 (1), 500(2019).
  15. Osan, J. K., DeMontigny, B. A., Mehedi, M. Immunohistochemistry for protein detection in PFA-fixed paraffin-embedded SARS-CoV-2-infected COPD airway epithelium. STAR Protoc. 2 (3), 100663(2021).
  16. Talukdar, S. N., McGregor, B., Osan, J. K., Hur, J., Mehedi, M. Respiratory Syncytial Virus Infection Does Not Induce Epithelial-Mesenchymal Transition. J Virol. 97 (7), e0039423(2023).
  17. Christopher, A. B., et al. The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia. Front Pediatr. 2, 111(2014).
  18. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1, 14(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الواجهة بين الهواء والسائلتردد ضربات الأهدابالمقاومة الكهربائية عبر الظهارةالظهارة المطبقة كاذباًالخلايا الظهارية القصيبيةالمجهر عالي السرعةنظام SAVA
تحديد الوظيفة الهدبية وعدم نفاذية الغشاء في ظهارة مجرى الهواء الرئوي الكاذب
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.