مقالة منهجية

إجراءات التشغيل والاحتواء الحيوي لمنشأة لفئران المختبر ذات الميكروبيوم الطبيعي: إجراء التنميط المناعي

DOI:

10.3791/67100

⸱

ديسمبر 13, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BIH QUEST Center for Responsible Research, Berlin Institute of Health (BIH) at Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R), 3Institute of Microbiology, Infectious Diseases and Immunology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 4Experimental and Clinical Research Center (ECRC) & Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft (MDC), 5Department of Experimental Neurology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, Klinik und Hochschulambulanz für Neurologie, 6Center for Stroke Research Berlin, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 7Einstein Center for Neuroscience, 8German Center for Cardiovascular Research (DZHK), partner site Berlin, 9Department of Neuropathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 10Cluster of Excellence, NeuroCure, 11German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Berlin, 12Department of Hepatology and Gastroenterology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 13Institute of Animal Welfare, Animal Behavior and Laboratory Animal Science, Freie Universität Berlin, 14Forschungseinrichtungen für Experimentelle Medizin/FEM, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 15Department of Pediatric Respiratory Medicine, Immunology and Critical Care Medicine, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 16German Center for Lung Research (DZL), associated partner site, Berlin, 17Department of Infectious Diseases, Respiratory Medicine and Critical Care, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 18Division of Toxicology, Institute of Clinical Pharmacology and Toxicology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 19Institute of Immunology, Charité-Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 20German Cancer Research Center, 21German Cancer Consortium, partner site Berlin, 22Department of Radiology (including Pediatric Radiology), Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 23Department of Microbiome Research, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), 24Department of Medicine II, Faculty of Medicine, Medical Center - University of Freiburg

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف الهيكل وإجراءات التشغيل ، بما في ذلك تدابير الاحتواء الميكروبي لمنشأة "الفئران البرية" باستخدام أخذ عينات الدم للتنميط المناعي كمثال.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر استخدام فئران المختبر ذات الميكروبيوم الطبيعي ، مثل "الفئران البرية" ، أداة بحثية واعدة لكل من العلوم الأساسية والتطبيقية نظرا لتشابهها الوثيق مع الكائن الحي البشري الخارق. ومع ذلك ، فإن تربية وصيانة هذه الفئران ، التي تؤوي ميكروبيوم متنوع بما في ذلك البكتيريا والفيروسات والطفيليات ، تشكل تحديات كبيرة لمرافق تربية في المؤسسات البحثية. لمواجهة هذه التحديات ، تم تطوير مفهوم منشأة متخصصة لإسكان "الفئران البرية" في Charité - Universitätsmedizin Berlin. تضمن هذا النهج تصميم منشأة ذات ميزات هيكلية محددة وبروتوكولات تشغيلية لاحتواء الميكروبيوم الطبيعي بشكل فعال ، وبالتالي حماية المناطق ذات معايير النظافة الأعلى.

تم عرض منهجية لأخذ عينات الدم من كل من الحماية من الأمراض المحددة الخالية من مسببات الأمراض (SPF) و "الفئران البرية" للتنميط المناعي ، مما يسلط الضوء على سير العمل وتدابير الاحتواء الحيوي المنفذة في المنشأة. تكشف النتائج الرائعة أن "الفئران البرية" المعرضة لميكروبيوم طبيعي تطور مجموعات خلايا مناعية مميزة ، والتي يتم تقليصها بشكل كبير في الفئران التي يتم تربيتها وصيانتها في ظل ظروف نظافة صارمة.

تكمن أهمية هذه الدراسة في قدرتها على تزويد الباحثين بإمكانية الوصول إلى الفئران التي تمتلك ميكروبيوم طبيعي وجهاز مناعة ناضج مشابه لتلك الموجودة لدى البالغين. يمكن أن يعزز هذا النهج قابلية ترجمة النتائج قبل السريرية إلى ممارسة سريرية ، وبالتالي تطوير مجال البحوث الطبية الحيوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا تزال التجارب على الفئران لا غنى عنها في العلوم الأساسية والتطبيقية ، مثل البحوث قبل السريرية والسمية. ومع ذلك ، فإن توحيد النظافة في بيئات المختبرات ، الذي يهدف إلى تقليل الضوضاء البيولوجية وتقليل التباين في النتائج التجريبية ، أدى إلى استبعاد الجراثيم الطبيعية إلى حد كبير. وبالتالي ، فإن الظروف التي تولد فيها فئران المختبر القياسية صحيا والخالية من مسببات الأمراض (SPF) وتحتفظ بها تختلف عن ظروف العالم الحقيقي التي يتعرض لها البشر عادة. يؤدي عدم التطابق هذا بين ظروف المختبر والبيئات الطبيعية التي تحدث فيها الأمراض البشرية إلى "مغالطة التوحيد القياسي": بافتراض أن تقليل التباين في الظروف التجريبية يحسن النتائج الانتقالية. ومع ذلك ، في الواقع ، فإنه يحد من الأهمية البيولوجية للنتائج1،2. على سبيل المثال ، أظهرت الأبحاث أن غياب التنوع الميكروبي والبيئي في الفئران SPF يمكن أن يؤدي إلى تخلف جهاز المناعة ، مما يقوض صحة الدراسات المناعية وما قبلالسريرية 3.

تم اقتراح العديد من الأساليب لمعالجة التباين البيولوجي في نماذج الفئران ، ولكل منها مزاياها وقيودها الخاصة ، بما في ذلك السكن المشترك مع الفئران الوحشية الأليفة3،4،5،6،7،8 ، والتعرض المتسلسل للحيوانات9 ، وإبقاء في حاويات خارجية10 أو على فراش من الكبيرة11 ، وزرع البراز من الفئران البرية12. نموذج الفأر الجديد الواعد للأبحاث قبل السريرية والسمية هو نموذج "الفئران البرية" ، والذي يتكون من سلالات فئران المختبر القياسية التي تؤوي ميكروبيومطبيعي 13. يتم إنشاء هذه "الفئران البرية" عن طريق زرع أجنة من سلالات فئران المختبر إلى الفئران التي يتم اصطيادها في البرية. أثناء الولادة ، تكتسب سلالات فأر المختبر الميكروبيوم الطبيعي لأمهاتها البديلات ، وتحاكي التلقيح الطبيعي الذي يحدث أثناء الولادةالبشرية 13. يمكن تربية "الفئران البرية" مثل أي سلالة أخرى من فئران المختبر ، مع الحفاظ على ميكروبيومها الطبيعي عبر الأجيال.

تستضيف "الفئران البرية" ميكروبات متنوعة - بما في ذلك البكتيريا والفيروسات والطفيليات - والتي يتم استبعادها عادة من مرافق الفئران SPF. وبالتالي ، فإن الحفاظ على ميكروبيوم طبيعي في مرافق البحث يمثل تحديات ، حيث يجب احتواء هذه الميكروبات دون المساس بمعايير النظافة العامة لعامل الحماية من الشمس.

في Charité - Universitätsmedizin Berlin ، تم إنشاء منشأة مخصصة ل "الفئران البرية" ، مفصولة عن مناطق SPF من خلال تدابير احتواء حيوي صارمة. تشتمل المنشأة على غرف تربية وتجريب ، مما يضمن الحفاظ على الميكروبيوم الطبيعي ل "الفئران البرية" أثناء حماية مناطق SPF (الشكل 1).

تم استيراد الأزواج المؤسسين لمستعمرة Charité من مستعمرة "الفئران البرية" التي تم إنشاؤها في قسم أبحاث الميكروبيوم ، مستشفى جامعة إرلانغن ، جامعة فريدريش ألكسندر إرلانغن نورنبرغ (FAU) ، ألمانيا. يتم تزويدهم بشهادة صحية ومراقبتهم بلوحة موسعة لمسببات الأمراض الحيوانية المنشأ قبل استيراد مؤسسي المستعمرة. سيتم استخدام الحراس لمراقبة الميكروبيوم بمرور الوقت. يتم إيواء كل من عامل الحماية من الشمس و "الفئران البرية" في نفس الظروف. يتم تربية الفئران والاحتفاظ بها بشكل تفضيلي في أقفاص ذات تهوية فردية (IVC) من النوع الثاني في مجموعات من خمسة فئران. درجة الحرارة داخل المنشأة 22 درجة مئوية ، ودورة الضوء / الظلام 12 ساعة. تتلقى الفئران طعاما قياسيا قائما على الحبوب وماء الصنبور. تعقيم الفراش وعناصر التخصيب غير ضروري ل "الفئران البرية". ومع ذلك ، فإن تعقيم هذه العناصر يمنع خلط المواد في المناطق التي توجد بها الفئران SPF.

في هذا البروتوكول ، يتم توضيح إجراءات التنميط المناعي لكل من عامل الحماية من الشمس و "الفئران البرية" ، مما يسلط الضوء على بروتوكولات الاحتواء الميكروبي الصارمة في منشأة "الفأر البري". تضمن هذه التدابير سلامة بيئات SPF مع توفير فوائد العمل مع الفئران التي تحمل ميكروبيوم طبيعي.

figure-introduction-1
الشكل 1: تخطيط منشأة الفئران البرية. E1 = الوصول إلى المنشأة. تشير الأسهم إلى طريق الدخول إلى المنشأة. E2 = الوصول إلى كابينة تدفق الهواء الصفحي من خارج المنشأة. PA = غرفة معادلة الضغط للأفراد مع دش الهواء. AS = دش الهواء. R1 ، R2 = غرف لتربية الفئران البرية. R3 = مساحة لحفظ الفئران البرية. R4 = مساحة لحفظ الفئران SPF. PR1 = غرفة إجراء للفئران SPF. PR2 = غرفة إجراء للفئران البرية. SB = مقعد عمل معقم. EE = مخارج الطوارئ. CR = غرفة تغيير الملابس أمام مقصورة LAF. LAF = كابينة تدفق الهواء الصفحي للتدخلات تحت تدفق الهواء الواقي. أ = الأوتوكلاف. ER = غرفة المعدات. تمثل الأسهم الخضراء الطرق التي يمكن الوصول إليها عند العمل مع SPF ، وتشير الأسهم الصفراء إلى المسارات المتاحة للعمل مع الفئران البرية بعد الاستحمام بالهواء. تشير الأسهم الزرقاء إلى الوصول لموظفي التربية فقط. يشير الخط الأحمر إلى الجدار الزجاجي داخل مقصورة LAF ، والذي يقسم المساحة إلى قسمين يمكن الوصول إليهما إما من E1 عبر PR2 أو من E2 عبر CR. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على مرفق "الفئران البرية" والإجراءات التي تنطوي على الحية من قبل مكتب الدولة المسؤول عن التجارب على ، "Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin" (LAGeSo). يتم تلخيص أهم خطوات البروتوكول في الشكل 2.

1. الوصول إلى منشأة Wilding

  1. احصل على مقدمة شخصية لإجراءات التشغيل والاحتواء الحيوي للمنشأة من مسؤول رعاية المسؤول.
  2. احصل على مفتاح جهاز الإرسال والاستقبال لدخول المنشأة ل "الفئران البرية" وحجز غرف الإجراءات عبر نظام الحجز عبر الإنترنت.

2. دخول منشأة "الفئران البرية"

  1. قم بإيداع الملابس في غرفة تغيير الملابس.
  2. قم بالتغيير إلى ملابس المنطقة: السراويل والكساك وأغطية الأحذية التي تستخدم لمرة واحدة (الشكل 3).

3. أخذ عينات من الدم من الفئران SPF في منطقة SPF

  1. انقل الفئران SPF (ذكور وإناث ، من 8 إلى 20 أسبوعا) من الغرفة التي يتم الاحتفاظ بها (R4) إلى غرفة الإجراءات لحيوانات SPF (PR1) في قفص IVC مغلق.
  2. قم بتشغيل مقعد التدفق الرقائقي وقم بتطهير سطح مساحة العمل بنسبة 70٪ Vol. العمل داخل المقعد.
  3. افحص الأنابيب الشعرية بحثا عن الأقسام المكسورة أو المتكسرة لتجنب زيادة خطر الكسر أو الضرر.
  4. تحت التخدير العام القصير مع الأيزوفلوران (الحث عند 5٪ من الأيزوفلوران في الهواء الطبي المخصب بالأكسجين ، متبوعا بنسبة 1.5٪ -2.0٪ للصيانة) ، بعد فقدان منعكس انسحاب الدواسة (كما هو موضح عن طريق قرصة إصبع القدم) ، قم بضغط أوردة عنق الفئران عن طريق الإمساك بقشرة الرقبة.
  5. باستخدام يد واحدة ، قم بتأمين رأس باستخدام الإبهام والسبابة. أدخل الشعيرات الدموية الجديدة في الكانثوس الإنسي للعين تحت الغشاء المزج بزاوية 45 درجة. تأكد من وضع الشعيرات الدموية بين مقلة العين والمدار العظمي للعين.
    ملاحظة: لتجنب الصدمة ، لا تدع طرف الأنبوب الشعري يلمس سطح العين.
  6. أدخل الشعيرات الدموية من خلال غشاء الجيوب الأنفية بحركة دوران محورية لطيفة. استمر في تدوير الأنبوب في الجزء الخلفي من المدار حتى يتدفق الدم. اجمع ما لا يقل عن 15 ميكرولتر من الدم في أنبوب جمع الدم الذي يحتوي على حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) (حوالي 1 قطرة).
  7. قبل إزالة الشعيرات الدموية ، قم بفك قبضة الرقبة للحفاظ على النزيف في الأنسجة إلى الحد الأدنى. لضمان الإرقاء الجيد ، استخدم وسادة شاش نظيفة أو مسحة لوقف النزيف.
  8. قم بتدوير الأنبوب قليلا لخلط الدم و EDTA. لا تهز الأنبوب. قم بتخزين عينة الدم على الثلج.
  9. تطهير سطح العمل وإيقاف تشغيل مقعد التدفق الصفحي. أعد الفئران SPF في IVC مغلق إلى غرفة الإسكان SPF (R4).

4. دخول المنطقة ل "الفئران البرية"

  1. قم بإزالة الأحذية والجوارب في غرفة انتظار الدش الهوائي (PA). ارتد جوارب المنطقة ومعدات الحماية الشخصية لكامل الجسم (PPE) التي تتكون من Tyvek بشكل عام ، وشبكة الشعر ، إذا لزم الأمر ، والقفازات القطنية ، وقفازات النتريل ، وأقنعة الوجه (الشكل 3).
  2. أدخل الدش الهوائي في الجوارب عبر غطاء الأرضية اللاصق. أثناء الاستحمام بالهواء ، ارفع الذراعين وقم بتدوير 360 درجة.
  3. اخرج من الدش الهوائي وارتد أحذية المنطقة على الجانب الآخر.

5. أخذ عينات من الدم من "الفئران البرية"

  1. نقل "الفئران البرية" (ذكر وإناث ، من 8 إلى 20 أسبوعا) من الغرفة التي يتم الاحتفاظ بها (R3) في قفص IVC مغلق إلى غرفة العمليات (PR2).
  2. قم بتشغيل مقعد التدفق الصفحي وتطهير سطح مساحة العمل.
  3. اتبع الإجراءات الموضحة لأخذ عينات من الفئران SPF في القسم 3 ، الخطوات 2-8.
  4. بعد الانتهاء من أخذ عينات الدم ، قم بتغيير القفازات. تطهير جميع المواد والأسطح. قم بإيقاف تشغيل مقعد التدفق الرقائقي.

6. تصدير عينات الدم من منطقة "الفئران البرية" عبر خزانة تدفق الهواء الصفحي (LAF)

ملاحظة: تحتوي غرفة الإجراءات (PR2) على خزانة LAF ، والتي تعمل كقفل للمواد وغرفة تدخل معقمة. يتم نقل العينات عبر مقصورة القوات المسلحة اللبنانية. يمكن الوصول إلى الداخل من الداخل (عبر E1 و PR2) والخارج (عبر E2 و CR) منطقة Wildling وينقسم في المنتصف بجدار زجاجي بباب منزلق (الشكل 1). مطلوب شخصين لتصدير المواد: الشخص 1 (داخل منطقة Wildling [عبر PR2]) سيقوم بتنفيذ الخطوتين 6.1 و 6.2. سيقوم الشخص 2 (خارج منطقة Wildling [عبر E2]) بتنفيذ الخطوات 6.3-6.5.

  1. تطهير حاويات العينات. قم بإزالة حاويات العينات عبر الباب المنزلق في الجدار الزجاجي لكابينة LAF.
  2. بعد اكتمال نقل حاويات العينة إلى الشخص 2 ، احصل على ملابس واقية من الشخص 2 (يرتدي ملابس واقية في قفل المقصورة) على الجانب الآخر من مقصورة LAF وتخلص منها. تطهير جميع الأسطح.
  3. ارتد ملابس واقية في LAF أمام مقصورة LAF (CR ، الشكل 1).
  4. استلم حاويات عينات مطهرة من منطقة Wildling دون ملامسة من خلال الباب المنزلق في الجدار الزجاجي لكابينة LAF.
  5. قم بإزالة الملابس الواقية وتمريرها عبر الباب المنزلق إلى المنطقة الداخلية من مقصورة LAF للتخلص منها.

7. الخروج من منشأة "الفئران البرية"

  1. اترك وزرة وأحذية منطقة يمكن التخلص منها داخل المنطقة. تخلص من شبكة الشعر والقفازات المطاطية وقناع الوجه.
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدام الأحذية وزرة.
  2. أدخل الدش الهوائي على الفور في جوارب المنطقة. ارفع الذراعين وقم بتدوير 360 درجة أثناء الاستحمام بالهواء.
  3. اترك الدش الهوائي وضع جوارب المنطقة في مجمع الغسيل. ارتد الجوارب والأحذية وأغطية الأحذية التي تستخدم لمرة واحدة. إيداع ملابس المنطقة في غرفة تغيير الملابس في مجمع الغسيل. تغيير الملابس في غرفة تغيير الملابس

8. معالجة وتحليل عينات الدم

  1. إحضار عينات الدم إلى المختبر.
    1. تحضير كوكتيل تلطيخ الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور: لكل عينة ، أضف 0.25 ميكرولتر من Alexa Fluor 700 CD45 المضاد للفأر ، 0.25 ميكرولتر من سلسلة TCR-β المضادة للفأر Brilliant Violet 605 ، 0.25 ميكرولتر من APC المضاد للفأر CD4 ، 0.25 ميكرولتر من Brilliant Violet 785 CD8 المضاد للفأر ، 0.25 ميكرولتر من FITC المضاد للفأر CD44 و 0.25 ميكرولتر من الجسم المضاد للفأر PerCP / Cyanine5.5 CD62L إلى 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي (محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، 2 ملي EDTA ، 0.1٪ ألبومين مصل بقري ، 4 درجات مئوية). يحفظ في الظلام على الجليد حتى الخطوة 8.8.
      ملاحظة: يمكن تكييف الفلوروفورات المستخدمة مع تكوين مقياس التدفق الخلوي الذي سيتم استخدامه للحصول على العينة.
  2. تطهير أنابيب جمع الدم. أضف 2 مل من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي المثلج إلى أنبوب بوليسترين دائري القاع سعة 5 مل. ضع الأنبوب على الثلج.
  3. افتح أنبوب جمع الدم. أضف 10 ميكرولتر من الدم إلى الأنبوب الذي يحتوي على المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي ودوامة النبض.
  4. قم بالدوران عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. شفط المادة الطافية. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) ، ودوامة النبض ، واحتضنه لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  6. أضف 100 ميكرولتر من 10x PBS. قم بالدوران عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. كرر الخطوات 8.5-8.6.
  8. شفط المادة الطافية. أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل تلطيخ الأجسام المضادة ، والدوامة ، واحتضن لمدة 20 دقيقة على الجليد في الظلام.
  9. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي. قم بالدوران عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  10. شفط المادة الطافية. أضف 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي.
  11. أضف 20 ميكرولتر من صبغة الخلايا الميتة الزرقاء SYTOX (التركيز النهائي 1: 1000) للتمييز الحي / الميت.
  12. احصل على عينات على مقياس التدفق الخلوي وحلل البيانات باستخدام برنامج الحصول على مقياس التدفق الخلوي أو برنامج تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من المحتمل أن تؤوي "الفئران البرية" كائنات دقيقة مستبعدة عادة من مرافق SPF ، مما يشكل تحديا لممارسات تربية داخل المؤسسات البحثية التي تلتزم بمعايير النظافة الصارمة. على مدى السنوات الأربع الماضية ، طور العلماء والأطباء البيطريون في Charité - Universitätsmedizin Berlin والمركز الألماني لحماية المختبر (Bf3R) منشأة مخصصة للفئران ذات الميكروبيوم الطبيعي ، تتضمن تدابير احتواء حيوي صارمة من خلال مسعى تعاوني (الشكل 1). لتحقيق هذا التصميم ، خضعت منشأة الماوس الحالية لعملية إعادة بناء واسعة النطاق ، بما في ذلك تركيب دش هوائي وكابينة تدفق هواء رقائقية. يتم فصل المناطق التي يتم فيها تربية الفئران "البرية" والفئران SPF والاحتفاظ بها بواسطة دش الهواء وكلتا المنطقتين لهما غرف إجراءات مخصصة. تترك المواد المستقرة للحرارة المنطقة ل "الفئران البرية" فقط من خلال الأوتوكلاف ، بينما يمكن تصدير المواد الحرارية ، مثل العينات ، عبر خزانة LAF لمزيد من المعالجة في مناطق المختبر (الشكل 2). يعد الالتزام الصارم بجميع تدابير الاحتواء الحيوي أمرا ضروريا لمنع تلوث المناطق التي يتم فيها الحفاظ على ظروف النظافة الخاصة بعامل الحماية من الشمس (الشكل 3). بشكل جماعي ، يوفر التصميم وتدابير الاحتواء الحيوي لمنشأة "الفئران البرية" في شاريتيه - جامعة برلين للعلماء الفرصة لإجراء البحوث مع الفئران التي تحتوي على ميكروبيوم طبيعي مع منع انتشار الكائنات الحية الدقيقة بشكل فعال إلى مناطق المنشأة الحيوانية ذات مستويات النظافة الأعلى.

قياس التدفق الخلوي هو الطريقة القياسية الذهبية في علم المناعة الخلوية ويستخدم لاستجواب مجموعات الخلايا المناعية في الدم والأنسجة استجابة للظروف البيئية المتغيرة. على سبيل المثال ، لدى البشر البالغين عدد كبير من خلايا الذاكرة التائية المنتشرة في الدم ، والتي تتطور عند التعرض للكائنات الحية الدقيقة من البيئة3. هنا ، تم استخدام قياس التدفق الخلوي لاستكشاف الخلايا التائية للذاكرة في دم الفئران التي تم تربيتها والاحتفاظ بها في ظروف SPF وفي دم "الفئران البرية" (الشكل 4). "الفئران البرية" المستعمرة بالميكروبيوم الطبيعي ، تقدم مجموعة مميزة من الخلايا التائية للذاكرة. في المقابل ، أدت الفئران التي تم تربيتها والاحتفاظ بها في ظروف SPF إلى تقليل خلايا الذاكرة التائية في الدورة الدموية بشكل كبير. وبالتالي ، يمكن أن يميز قياس التدفق الخلوي تأثير البيئات الميكروبية المختلفة على حجرة المناعة. يمكن زيادة تحبيب البيانات من خلال تضمين علامات إضافية للخلايا المناعية. تسمح الأساليب التي تم تطويرها مؤخرا في قياس التدفق الخلوي ، مثل القياس الخلوي عن طريق وقت الرحلة (CyTOF) وقياس التدفق الخلوي الطيفي ، بالحصول على معلومات حول العديد من المعلمات ، وبالتالي توسيع عدد مجموعات الخلايا المناعية (الفرعية) التي يمكن قياسها كميا في نفس عينة الدم والأنسجة. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تقييم إنتاج السيتوكين الخلوي عن طريق قياس التدفق الخلوي ، مما يوفر نظرة ثاقبة لوظيفة الخلايا استجابة للميكروبيوم الطبيعي.

figure-results-1
الشكل 2: سير العمل في منشأة Wildling. تعتبر عينات الدم ومعالجة العينات أمثلة ولكن يمكن استبدالها بإجراءات أخرى ، مثل التدخلات الجراحية مع أخذ عينات الأنسجة وعلم الأنسجة. للاختصارات ، انظر الشكل 1 وسيلة الإيضاح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 3: مقارنة متطلبات معدات الحماية الشخصية (PPE) لمناطق SPF و Wildling. في منطقة عامل الحماية من الشمس (على اليسار) ، تتكون معدات الوقاية الشخصية القياسية من طبقة واحدة من الملابس الواقية. في المقابل ، تتطلب منطقة Wildling (يمين) عملية معدات الوقاية الشخصية من ثلاث خطوات قبل الدخول إلى الدش الهوائي: يتم ارتداء kasac (ملابس داخلية واقية = الخطوة 1) أسفل الإجمالي (الخطوة 2). تساعد هذه الطبقة الإضافية في الحفاظ على النظافة ومنع التلوث المتبادل بين المناطق. بعد الاستحمام الهوائي ، يجب ارتداء الأحذية المخصصة لمنطقة Wildling (الخطوة 3). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 4: النمط المناعي ل "الفئران البرية". تم تلطيخ عينات الدم من ذكور الفئران SPF (ن = 5 فئران و "فئران وايلدينج" (ن = 5 فئران) ، بعمر 14 أسبوعا ، بمزيج من الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور ضد CD45 ، سلسلة TCR-β ، CD4 ، CD8 ، CD44 ، و CD62L. الأرقام هي نسبة بوابة الوالدين ± الانحراف المعياري. يتم عرض استراتيجية البوابات للفئران SPF ، باستثناء آخر لطختين من SPF و "الفئران البرية". في "الفئران البرية" ، تزداد الخلايا التائية المركزية والمستجيبة مقارنة بالفئران التي يتم تربيتها وصيانتها في ظل ظروف SPF. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد الفئران ذات الميكروبيوم الطبيعي أداة بحثية واعدة للعلوم الأساسية والتطبيقية بسبب تشابهها الوثيق مع الكائن الحي البشري الخارق3،9،10،11،12. أدت محاولات دمج التعقيد البيولوجي في نماذج الفئران إلى تطوير مناهج مختلفة ، لكل منها مزاياها وحدودهاالخاصة 3،7،8،9،10،11،12. تجمع "الفئران البرية" بين فوائد بيئة المختبر الخاضعة للرقابة والميكروبيوم الطبيعي. يحافظ هذا النهج على الاستقرار في الظروف التجريبية مع الحفاظ على التنوع الميكروبي الطبيعي الضروري لدراسة التفاعلات البيولوجية المعقدة. وبالتالي ، فإن العلاجات الطبية الحيوية التي تم تطويرها واختبارها على "الفئران البرية" تنطوي على إمكانات كبيرة للترجمة الناجحة إلى تطبيقات سريرية.

ومع ذلك ، لا يزال يتعين تحديد نماذج الأمراض قبل السريرية "الفئران البرية" ، التي تتفوق على الفئران SPF. علاوة على ذلك ، فإن الفئران التي تحتوي على ميكروبيوم طبيعي تؤوي كائنات دقيقة مثل الديدان شديدة العدوى والتي يتم استبعادها عادة من المرافق المؤسسية. لذلك ، فإن تربية هذه الفئران والعمل معها تمثل تحديات لممارسات تربية داخل المؤسسات البحثية.

تضمن إنشاء منشأة ل "الفئران البرية" جهدا تعاونيا من العلماء والأطباء البيطريين والمسؤولين المؤسسيين في Charité - Universitätsmedizin ، والمركز الألماني لحماية المختبر (Bf3R) ، وجامعة فريدريش ألكسندر إرلانغن نورنبرغ (FAU). بعد تطوير مفهوم المنشأة ، خضعت منشأة الفئران الحالية لعملية إعادة بناء واسعة النطاق لدمج تدابير الاحتواء البيولوجي الصارمة. تم اعتماد المنشأة لعمليات السلامة البيولوجية من المستوى 2 (BSL-2) فيما يتعلق بالبحث مع مسببات الأمراض البشرية.

هنا ، يتم وصف إجراءات التشغيل والاحتواء الحيوي في منشأة "الفئران البرية" باستخدام أخذ عينات الدم للتنميط المناعي عن طريق قياس التدفق الخلوي كمثال. يعد الالتزام الصارم بتدابير الاحتواء البيولوجي أثناء العمل في منشأة "الفئران البرية" إلزاميا لمنع انتشار الكائنات الحية الدقيقة إلى مناطق أخرى من المنشأة الحيوانية. ويشمل ذلك تقييد الوصول إلى المنشأة لأقل عدد ممكن من الأشخاص وفقا لمجموعة البحث. بالإضافة إلى ذلك ، يلزم إجراء جلسة تمهيدية إلزامية يجريها مسؤول رعاية المؤسسي قبل الوصول الأولي إلى المنشأة. تتوفر أيضا معلومات عامة وإجراءات التشغيل القياسية (SOP) للعمل داخل منشأة Wildling على موقع ويب داخلي ("Wildling wiki")14،15.

أثناء العمل داخل المنشأة ، يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية بشكل صحيح. على سبيل المثال ، من الضروري التأكد من عدم تعرض أي شعر خارج شبكة الشعر ، حيث من المحتمل أن يلتصق بيض الطفيليات به. إذا كانت التجربة تتضمن كلا من "الفئران البرية" والفئران SPF ، فيجب التعامل مع الفئران SPF أولا. يتم فصل مناطق "الفئران البرية" والفئران SPF داخل المنشأة بواسطة دش هوائي ، وكل منطقة مجهزة بغرف إجراءات مخصصة. يمكن حجز هذه الغرف من خلال نظام الحجز عبر الإنترنت ، مما يضمن عمليات عمل سلسة وعدد محدود من الأشخاص داخل المنشأة. يسمح لشخصين كحد أقصى لكل منطقة لكل غرفة إجراءات (PR1 ، PR2 ، LAF) بالعمل في كل حاجز في نفس الوقت. تنطبق الاستثناءات على التجارب التي تتطلب موظفين إضافيين لضمان التنفيذ الأخلاقي والفعال للإجراءات. يتم نقل الفئران بين الغرف داخل مناطقها في أقفاص IVC مغلقة ، والتي لا يمكن فتحها إلا تحت مقعد التدفق الرقائقي لضمان احتواء الميكروبات وسلامة العمل. تحتوي غرفة الإجراءات في منطقة "الفئران البرية" أيضا على كابينة تدفق الهواء الصفحي (LAF). يجب استخدام مقصورة LAF هذه لتشريح وجراحة "الفئران البرية" ، بما في ذلك نقل الأجنة. يعد نقل الأجنة إجراء حاسما في سياق "الفئران البرية" ، حيث يتم استخدامه لإنشاء نماذج جديدة من "الفأر البري". على سبيل المثال ، يتم استخدام نقل الأجنة من سلالات الفئران المعدلة وراثيا (GMO) إلى "الفئران البرية" من النوع البري لإنشاء سلالات الكائنات المعدلة وراثيا البرية. تستخدم مقصورة LAF أيضا لتصدير العينات ، الأمر الذي يتطلب التنسيق مع شخص خارج منطقة "الفئران البرية". يمكن إجراء مزيد من معالجة العينات في مساحة المختبر المجاورة ، مما يسمح للباحثين بالتعامل مع المواد الحساسة للوقت في الموقع مع الحد من المواقع التي تتم فيها معالجة عينات من "الفئران البرية".

يجب أن تظل جميع المواد الأخرى داخل منشأة Wildling أو يجب تعقيمها قبل مغادرة المنشأة. بعد العمل ، يتم تطهير جميع المواد والأسطح بالمطهرات المناسبة لظروف BSL2. يحظر على الأشخاص الذين دخلوا المنشأة من أجل "الفئران البرية" دخول أي منشأة حيوانية أخرى في نفس اليوم.

يتم إجراء البحث في المنشأة في إطار الاتحاد العلمي "نموذج الفأر البري في الصحة والمرض (Wildling HeaD)" لتسهيل التواصل بين العلماء الذين يعملون مع "الفئران البرية" ، فضلا عن تبادل الأساليب والخبرات. يتم دعم الكونسورتيوم من قبل Responsible PrecliniX في مركز QUEST للأبحاث المسؤولة التابع لمعهد برلين للصحة (BIH) ، والذي يساعد في إجراءات التسجيل المسبق للدراسات على ، والتصميم التجريبي القوي ، وإدارة الجودة (www.bihealth.org/en/quest/service/service/responsible-preclinix).

باختصار ، تم إنشاء منشأة حديثة ، مجهزة بتدابير احتواء حيوي صارمة ، لدعم البحوث قبل السريرية الآمنة والأخلاقية. يسهل هذا المرفق دراسة "الفئران البرية" ، التي تؤوي ميكروبيوم طبيعي ، مما يسد الفجوة بشكل فعال بين ظروف المختبر الخاضعة للرقابة والبيئات الميكروبية الشبيهة بالعالم الحقيقي. لبناء منشأة مثل تلك الموصوفة ، من الضروري إعطاء الأولوية لعلوم الفريق والتعاون متعدد التخصصات ، مع دمج خبرات العلماء والأطباء البيطريين والمسؤولين المؤسسيين لضمان التصميم والتشغيل الفعالين لبيئات الاحتواء الحيوي العالية. بالإضافة إلى ذلك ، يعد تنفيذ تدابير الاحتواء البيولوجي الصارمة ، وتوفير التدريب الشامل ، وتطوير إجراءات التشغيل الموحدة الواضحة (SOPs) أمرا بالغ الأهمية. سيؤدي إنشاء هيكل اتصال فعال ، مثل موقع wiki داخلي ، والمراقبة المستمرة للظروف التجريبية والتحقق من صحتها إلى تعزيز فعالية المنشأة وسلامتها في إدارة النماذج المعقدة مثل "الفئران البرية".

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل Charité 3R | استبدال - تقليل - صقل. تم دعم S.P.R. من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ، مؤسسة الأبحاث الألمانية) Emmy Noether-Programm RO 6247 / 1-1 (معرف المشروع 446316360) ، DFG SFB1160 IMPATH (معرف المشروع 256073931) ، و TRR 359 PILOT (معرف المشروع 491676693). S.J. تم دعمه من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ، مؤسسة الأبحاث الألمانية) JO 1216 / 2-1 والجمعية الألمانية للتصلب المتعدد (DMSG e.V.).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Alexa Fluor 700 الأجسام المضادة CD45 المضادة للفأرBioLegend103127Clone 30F-11
Animal ChowAltromin1324
APC المضادة للفأر CD4 الأجسام المضادةBioLegend100515استنساخ RM4-5
أنبوب جمع الدمGreiner450475MiniCollect K3E ، K3EDTA
ألبومين مصل الأبقارSigma-AldrichA9647-100G
Brilliant Violet 605 الأجسام المضادة لسلسلة TCR-beta المضادة للفأرBioLegend109241Clone H57-597
Brilliant Violet 785 الجسم المضاد CD8 المضاد للفأرBioLegend100749Clone 53-6.7
CapillaryHirschmann9000210Hirschmann minicaps ، Na-hep
EDTACorning46-034-CI
FITC الأجسام المضادة CD44 المضادة للفأرBioLegend103021Clone IM7
PerCP / Cyanine5.5 الأجسام المضادة CD62L المضادة للفأرBioLegend104431استنساخ MEL-14
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (10x)Gibco12579099
ملحي مخزن بالفوسفات (1x)Gibco14190094
RBC المحلول المؤقتBioLegend420302
أنبوب البوليسترين المستدير القاعSarstedt55.476.005
SYTOX Blue Dead Cell StainInvitrogenS34852
Tyvek بشكل عام (دوبونت)فيشر 11371633
محلول العلمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Voelkl, B., Wurbel, H., Krzywinski, M., Altman, N. The standardization fallacy. Nat Methods. 18 (1), 5-7 (2021).
  2. Voelkl, B., et al. Reproducibility of animal research in light of biological variation. Nat Rev Neurosci. 21 (7), 384-393 (2020).
  3. Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
  4. Caruso, R., Ono, M., Bunker, M. E., Nunez, G., Inohara, N. Dynamic and asymmetric changes of the microbial communities after cohousing in laboratory mice. Cell Rep. 27 (11), 3401-3412.e3 (2019).
  5. Labuda, J. C., Fong, K. D., Mcsorley, S. J. Cohousing with dirty mice increases the frequency of memory T cells and has variable effects on intracellular bacterial infection. Immunohorizons. 6 (2), 184-190 (2022).
  6. Martin, M. D., et al. Cd115(+) monocytes protect microbially experienced mice against e. Coli-induced sepsis. Cell Rep. 42 (11), 113345(2023).
  7. Burger, S., et al. Natural microbial exposure from the earliest natural time point enhances immune development by expanding immune cell progenitors and mature immune cells. J Immunol. 210 (11), 1740-1751 (2023).
  8. Tabilas, C., et al. Early microbial exposure shapes adult immunity by altering cd8+ t cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (49), e2212548119(2022).
  9. Reese, T. A., et al. Sequential infection with common pathogens promotes human-like immune gene expression and altered vaccine response. Cell Host Microbe. 19 (5), 713-719 (2016).
  10. Leung, J. M., et al. Rapid environmental effects on gut nematode susceptibility in rewilded mice. PLoS Biol. 16 (3), e2004108(2018).
  11. Sbierski-Kind, J., et al. Distinct housing conditions reveal a major impact of adaptive immunity on the course of obesity-induced type 2 diabetes. Front Immunol. 9, 1069(2018).
  12. Rosshart, S. P., et al. Wild mouse gut microbiota promotes host fitness and improves disease resistance. Cell. 171 (5), 1015-1028.e13 (2017).
  13. Rosshart, S. P., et al. Laboratory mice born to wild mice have natural microbiota and model human immune responses. Science. 365 (6452), eaaw4361(2019).
  14. Dirnagl, U., Kurreck, C., Castanos-Velez, E., Bernard, R. Quality management for academic laboratories: Burden or boon? Professional quality management could be very beneficial for academic research but needs to overcome specific caveats. EMBO Rep. 19 (11), e47143(2018).
  15. Dirnagl, U., Kurreck, C., Bernard, R., Przesdzing, I. Premier. , https://premier-qms.org/ (2024).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة