مقالة منهجية

تحليل خاص بالخيوط للبروتينات عند تكرار سلاسل الحمض النووي من خلال إثراء وتسلسل طريقة الحمض النووي الناشئ المرتبط بالبروتين

DOI:

10.3791/67120

⸱

مايو 2, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Hormel Institute, University of Minnesota, 2West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, State Key Laboratory of Biotherapy, Sichuan University, 3Institute for Cancer Genetics, Department of Pediatrics and Department of Genetics and Development, Columbia University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير إثراء وتسلسل الحمض النووي الناشئ المرتبط بالبروتين (eSPAN) للكشف عن الوفرة النسبية لبروتين مرتبط بالكروماتين على سلسلتين من الحمض النووي المتكاثرين، مما يكشف عن رؤية جزيئية لتكرار الكروماتين وعملياته المترابطة. يصف هذا البروتوكول إجراءات eSPAN في خلايا الجذع الجنينية للخميرة والفئران.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تنظيم تكرار الجينوم بواسطة بروتينات الرد الزائد، بما في ذلك الهيليكاز، التي تفك الحمض النووي ثنائي السلسلة إلى خيوط فردية مضادة للتوازي منفردة، وكل منها يتطلب أوضاعا مميزة للتكرار: مستمر (قاد) وغير متصل (متأخر). فهم تفاعلات البروتينات المرتبطة بالكروماتين مع خيوط الحمض النووي المتكررة في الجسم الحي أمر بالغ الأهمية لتوضيح آليات تجميع الكروماتين وإصلاح الحمض النووي المرتبطة بتكرار الحمض النووي. يقدم هذا البروتوكول طريقة إثراء وتسلسل الحمض النووي الناشئ المرتبط بالبروتين (eSPAN)، المصممة لقياس مستويات البروتين النسبية على سلاسل الحمض النووي الناشئة الرائدة والمتأخرة عند نقاط التكرار. يبدأ إجراء eSPAN بتكرار الكروماتين المناعي (ChIP، في الخميرة) أو الانقسام تحت الأهداف والوسم (CUT&Tag؛ في الخلايا الثديية) لبروتين محل اهتمام، يليه إثراء الحمض النووي الناشئ المرتبط بالبروتين بواسطة برومودوكسيوريدين (BrdU) بالتقرب المناعي. يتم تطبيق تسلسل الجيل التالي الخاص بالخيوط على ssDNA معزول. يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد ما إذا كان البروتين قد تم إثراؤه عند شوكات التكاثر الرائدة أو المتأخرة. يوفر eSPAN تفضيلا على مستوى الجينوم للبروتينات المرتبطة بالكروماتين، بما في ذلك الهيستونات عند نقاط التكاثر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الكائنات حقيقية النواة، يبدأ تكرار الجينوم من عدة مواقع تسمى أصول النسخ، حيث يرتبط مركب التعرف على الأصل (ORC) ويشعل آلية بروتين التجنيد، بما في ذلك هيليكاز CMG، لبدء تكرار الحمض النووي1. تشكل آلية الرد عند كل أصل تكرار شوكتين للتكرار تتحركان بشكل ثنائي الاتجاه 2,3. تقوم شوكات النسخ التوأم بتكرار الخيطين الأم للحمض النووي من خلال التخليق المستمر للخيط الأمامي والتخليق غير المستمر للخيط المتخلف. نظرا لهذه الطبيعة غير المتماثلة لكل شوكة تكرار، فإن مكونات التكرار، بما في ذلك بوليميرات الحمض النووي على الخيوط الأمامية والمتخلفة، مختلفة. أظهرت التحليلات الجينية السابقة المستندة إلى بوليميرات الحمض النووي الطفرة أن DNA Pol ε وDNA Pol δ هما البوليميراز الرئيسيان المسؤولان عن تكرار الخيوط الرائدة والمتأخرة، على التوالي 4,5. تم تطوير عدة طرق للكشف عن تفضيل خيوط بوليميراز الحمض النووي، بما في ذلك Pu-seq 6,7، HydEn-seq8، وemRiboSeq أو RiboSeq 9,10. تقتصر هذه الطرق الجينية لتحليل خصوصية السلسلة على بوليميراز الحمض النووي وتتطلب إدخال طفرات على كل بروتين 4,5,11,12. تتبع ارتباط أي بروتين مستهدف مع خيوط التكاثر المبكرة والمتأخرة لشوك تكرار الحمض النووي سيوفر رؤى قيمة حول تكرار الحمض النووي. في هذا الجهد، طورنا أولا تقنية eSPAN (إثراء وتسلسل الحمض النووي الناشئ المرتبط بالبروتين، الشكل 1) في خلايا الخمراء. كدراسة إثبات المبدأ، أظهرنا أولا أن Pol δ وPol δ يثريان على الخيوط الرئيسية والمتأخرة على التوالي. كما كشفنا عن تفضيل الخيوط لمكونات تكرار الحمض النووي الرئيسية، بما في ذلك الهيليكاز المكرر، وبروتين ارتباط الحمض النووي أحادي السلسلة (بروتين التكرار A)، ومصباح المستضد النووي الخلوي المتكاثر (PCNA) وعامل تكرار المحمل C (RFC)13. ومن المهم أننا وآخرون استخدمنا هذه الطريقة لاكتشاف آليات نقل الهستونات من الوالدين، وهي عملية كانت مستعصية لأكثر من أربعة عقود14، 15، 16، 17.

تتضمن طريقة eSPAN خطوتين متسلسلتين: إثراء البروتين المستهدف بواسطة ChIP18 أو CUT&Tag19 وتخصيب الحمض النووي الناشئ المرتبط بالبروتين بواسطة التقرب المناعي BrdU. في سلالة الخميرة القياسية (W303 أو S288C)، لا يمكن للكائنات خارج الخلية BrdU أو EdU دخول الخلايا والاندماج في الكروموسومات. تفتقر هذه السلالات إلى ناقل نوكليوزيد مناسب لامتصاص الثيميدين وكذلك إلى كيناز الثيميدين اللازم لفسفرة الثيميدين إلى TMP، الذي يحول BrdU (أو EdU) إلى BrdUMP (EdUMP). يعزز التعبير عن ناقل النيوكليوزيدات المتوازن البشري 1 (hENT1) وفيروس الهربس البسيط ثيميدين كيناز (HSV-TK) امتصاص الثايميدين وتحويل BrdU (أو EdU) إلى BrdUMP (EdUMP)20. لذلك، لإجراء تجربة eSPAN في الخميرة، كان يجب إدخال السلالات ببنية مدمجة BrdU (BrdU-Inc) (HSV-TK و hENT1)13,21.

سابقا، قدمنا بروتوكول eSPAN لبروتينات تكرار الحمض النووي في الخميرة22. مؤخرا، قمنا بدمج طريقة CUT&Tag في بروتوكول eSPAN في الخلايا الثديية لمعالجة الخطوات التقنية الصعبة التي تتطلب تحسين، مثل الربط المتبادل، وقص الكروماتين، وتقليل عدد الخلايا الابتدائيةالتي تبلغ 17,23. هنا، قدمنا eSPAN هيستون للتصور باستخدام خلايا الخميرة (الشكل 2). تستخدم هذه الطريقة بشكل أساسي لتحليل توزيع الأشكال المعدلة من الهيستونات على سلاسل الحمض النووي المتكررة. بينما اختبرنا عدة علامات هيستون، استخدمنا H3K4me3، وهي علامة على هيستون H3 الأب، كمثال. لتحليل المكونات والعوامل التي تتعامل مع إصلاح الحمض النووي عند تشعبات التكرار، نوصي بقص الكروماتين إلى شظايا صغيرة باستخدام الصوتية كما هو موضح في منشورنا الأول22. بالنسبة للخلايا الثديية، اعتمدنا إجراءات القطع والوسم المعدلة لتحل محل خطوة ChIP الموصوفة في الخميرة23. يقلل هذا التعديل من كمية المواد الابتدائية (الخلايا)، والأهم من ذلك، تمكين إنشاء مكتبات eSPAN للتسلسل دون الحاجة لاستخدام مجموعات تحضير الحمض النووي أحادية السلسلة. بالنسبة لبروتوكول الخميرة، اخترنا عدم استخدام طريقة Cut&Tag لأن كمية المادة الأولية كانت كافية. والأهم من ذلك، وجدنا أن إجراءات Cut & Tag لم تكن فعالة باستمرار لخلايا الخميرة في أيدينا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: للحصول على إرشادات تحضير المخزن والمواد الكيميائية، راجع إرشادات تحضير المخزن والكواشف (الملف التكميلي 1).

1. هيستون eSPAN في الخميرة المتبرعمة

ملاحظة: معظم سلالات الخميرة تفتقر إلى ناقل نوكليوزيدات وظيفي لامتصاص الثيميدين. لوضع علامة فعالة على الحمض النووي مع BrdU أو EdU ل eSPAN، يلزم استخدام سلالة إيجابية للكيناز الثيميدين (TK+)رقم 21 . بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام سلالات الخميرة من النوع 'A' فقط لتوقف دورة الخلايا باستخدام عامل ألفا.

  1. تزامن خلايا الخميرة وتصنيف BrdU (8 ساعات)
    1. قم بتلقيح مستعمرة واحدة من سلالة الخميرة المناسبة (TK+) في 10 مل من وسط YPD وانمو عند 30 درجة مئوية على حاضنة تهز طوال الليل عند 220 دورة في الدقيقة.
    2. قس الكثافة البصرية، OD600 نانومتر، باستخدام مقياس طيف وتخفيف الثقافة إلى 200 مل من وسط YPD طازج باستخدام OD600 ~0.2-0.3.
    3. انمو الزراعة حتى OD600 ~0.4-0.5 (عادة يستغرق 3-4 ساعات) عند 30 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة.
    4. أضف 300 ميكرولتر من عامل α (5 ملغ/مل) وزرع لمدة 1.5 ساعة عند 25 درجة مئوية و220 دورة في الدقيقة.
    5. أضف جرعة أخرى من 300 ميكرولتر من عامل α (5 ملغ/مل) ونم لمدة 1.5 ساعة أخرى عند 25 درجة مئوية و220 دورة في الدقيقة.
    6. جهز محلول تثبيت بارافورمالديهايد بنسبة 37.5٪ وسخن الوسط مسبقا (200 مل YPD + HU (هيدروكسي يوريا)+ BrdU) إلى 30°C أثناء تزامن الخلية.
      تحذير: تعامل مع BrdU بحذر لأنه قد يكون مادة للطفرات والمثبط. حضر محلول بارافورمالديهايد بنسبة 37.5٪ في غطاء أبخرة كيميائي لتجنب التعرض للأبخرة الضارة، حيث أن بارافورمالديهايد قد يكون مسرطنا.
    7. تحقق من شكل الخلايا (على شكل شريط) باستخدام مجهر ضوئي للتأكد من أن 90٪ على الأقل من خلايا الخميرة في مرحلة G1 قبل 15 دقيقة من توقف G1 الذي يستغرق 3 ساعات. بدلا من ذلك، قم بتحليل فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) لتأكيد توقف G124.
      ملاحظة: تحقق من شكل الخلية وتأكد من توقف G1 (90٪ على شكل شريط) في هذه الخطوة.
    8. اجمع الخلايا (الحبيبات) عن طريق الطرد المركزي على حرارة 1600 جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية واغسل حبيبة الخلية مرتين ب 20 مل من الماء المقطر المثلج المزدوج.
    9. أعد تعليق الخلايا في 200 مل من YPD + HU+ BrdU المسخن مسبقا (30 درجة مئوية).
      ملاحظة: الغرض من إطلاق HU هو ضمان أن معظم خلايا الخميرة في مرحلة S المبكرة للتكاثر، مما سيحسن الاتساق ويضمن قابلية تكرار النتائج. حذف HU مقبول إذا كان العمل مع خلايا طور لوغاريتمية مطلوبا.
    10. زرع الخلايا على حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية و220 دورة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن إجراء تحليل FACS لتأكيد المرحلة S المبكرة. لتحليل FACS، من المهم تضمين عينة لوغاريتمية كضابط لتحديد مجموعة خلايا G1 بدقة. لدمج BrdU بكفاءة، من المفيد البدء بخلايا سريعة النمو. بعض الطفرات التي تعاني من عيوب نمو بطيئة تميل إلى إظهار كفاءة ضعيفة في تصنيف BrdU. يتم تقييم كفاءة دمج وأداء BrdU-IP بواسطة PCR الكمي من خلالمقارنة المناطق المكررة وغير المكررة باستخدام الحمض النووي المعزول من الخطوة 1.6.7.
  2. تثبيت وجمع العينات (ساعة واحدة)
    1. أضف 6 مل طازجة من بارافورمالديهايد 37٪ إلى تركيز نهائي 1٪، اخلط جيدا، وحضن على حرارة 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع هز لطيف بمعدل 90 دورة في الدقيقة.
    2. اروى التثبيت بإضافة 12 مل من 2.5 ميل جليسين، اخلط جيدا، وحضن على حرارة 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع هز لطيف و90 دورة في الدقيقة.
    3. قم بتسخين الخلايا بحرارة 1600 جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). ثم اغسل الخلايا مرتين ب 20 مل من الماء البارد عن طريق الدوران على حرارة 1600 جرام لمدة 5 دقائق.
    4. اجمع الخلايا في أنابيب غطاء لولبي بحجم 2 مل (50 مل من الخلايا/الأنبوب) وخزنها عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا لمدة تصل إلى سنة (نقطة توقف).
  3. تحلل خلايا الخميرة وتجزئة الكروماتين (5 ساعات)
    1. قم بإذابة حبيبات الخلايا، وأعد تعليقها عن طريق الدوامة الخفيفة، واغسل بمحلول تحلل ChIP بسعة 0.4 مل باستخدام مثبطات بروتياز وخليط مضاد حيوي (لمنع نمو البكتيريا الملوثة) وادور عند 5000 جرام لمدة دقيقة واحدة.
    2. أضف 0.1 مل من محلول تحلل ChIP الذي يحتوي على مثبطات بروتياز ومزيج مضاد حيوي، يليه حوالي 100 ميكرولتر من خرز الزجاج (0.5 مم).
    3. أعمل على التنظيف بالخرز لمدة 3 دورات (30 ثانية تشغيل/إيقاف، دقيقة واحدة توقف) في غرفة باردة بدرجة 4 درجات مئوية.
    4. قم بثقب في أسفل الأنبوب باستخدام إبرة ساخنة بسعة 16 جالون.
      ملاحظة: للحفاظ على الإبرة الساخنة، حاول إبقاء الأنبوب قريبا من النار.
    5. اجمع الليزات عن طريق وضع الأنبوب في أنبوب وطرد مركزي فارغ بسعة 1.5 مل من الحمض النووي منخفض الارتباط وجهاز طرد مركزي بوزن 1600 جرام لمدة دقيقتين أثناء التركيز.
    6. استنشق الفائق بحذر دون الإزعاج بالحبيبات (سيكون الكروماتين في جزء الحطام الخلوي).
      تحذير: كن حذرا من استنشاق حبيبات الخلية عن طريق الخطأ عند استخدام المكنسة الكهربائية.
    7. أعد تعليق حبيبات الخلايا عن طريق التوصيل بأنبوب 0.35 مل من محلول هضم MNase مع إضافة 0.5 ملليمول سبيرميدين و0.1 ملليمول 2-ميركابتوإيثانول.
    8. أضف 10 وحدات من MNase إلى التفاعلات، وامزجها بلطف عن طريق العكس 4-6 مرات فورا، وحضن الماء في حمام ماء بدرجة حرارة 37 °م لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: يجب تحسين ظروف الهضم لكل دفعة من إنزيم MNase لإثراء كسور النيوكليوسوم الأحادية أو ثنائية أو الثلاثية.
    9. قم بتشويش هضم MNase بإضافة 5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA لتركيز نهائي 10 ملليمولار EDTA. اخلطها بلطف عن طريق الانقلاب وابق الأنابيب في الثلج فورا لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل في هذه الخطوة. يجب تحسين ظروف هضم MNase للحصول على غالبية كسور الأحادية أو ثنائية أو ثلاثية النوكليوسوم (140-450 قطعة أساس لكل حركة)
    10. قم بسونيك خليط التفاعل باستخدام أنابيب دقيقة من Bioruptor (1.5 مل) لمدة 3 دقائق (طاقة عالية، 30 ثانية تشغيل/إيقاف). قم بتدوير 10,000 جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: تساعد هذه السونيكية القصيرة في إطلاق الكروماتين في المخزن المؤقت.
    11. انقل المادة الفائقة إلى أنابيب جديدة وادور 10 دقائق أخرى عند 10,000 جرام عند 4 درجات مئوية.
    12. اجمع المادة الفائقة (حوالي 400 ميكرولتر)، واحتفظ ب 30 ميكرولتر من العينة كحمض نووي مدخل، وتجميد عند -20 درجة مئوية. استخدم ما تبقى من تحلل الخلية (~370 ميكرولتر) في التقرب المناعي الكروماتين التالي (الخطوة 1.4.1).
  4. التكرار المناعي لكروماتين هيستون (خلال الليل)
    1. أضف 0.5 ميكروغرام من الأجسام المضادة H3K4me3 إلى الليسات والنوتاتات على الدوار، 10 دورات في الدقيقة عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
      ملاحظة: هنا يستخدم H3K4me3 كمثال. يجب اختبار كمية الأجسام المضادة تجريبيا.
    2. قم بتدوير 15,800 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وانقل المادة الفائقة إلى أنبوب جديد بسعة 1.5 مل.
    3. أضف 20 ميكرولتر من حبات البروتين المغسول مسبقا (3 مرات مغسولة باستخدام محلول تحلل ChIP، وقم بالتقطيع على الدوار لمدة 3 دقائق لكل منها، وجمع الخرزات بالطرد المركزي عند 350 × جم، 4 درجات مئوية) وحضن عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين.
    4. قم بتدوير 350 × جرام عند RT، واغسل الخرزات حسب الترتيب التالي.
      1. اغسله مرتين باستخدام 1 مل من محلول التحليل البارد لمدة 3 دقائق في كل مرة عن طريق الدوران بسرعة 10 دورة في الدقيقة على المدور عند RT.
      2. اغسل مرة واحدة بمحلول تحلل بارد بسعة 1 مل مع مخزن NaCl بسعة 0.5 متر لمدة 3 دقائق بالدوران بسرعة 10 دورات في الدقيقة على مدور عند RT.
      3. اغسل مرة واحدة بمحلول غسيل بارد بسعة 1 مل من محلول Tris/LiCl البارد لمدة 3 دقائق بالدوران بسرعة 10 دورات في الدقيقة على مدور في RT.
      4. اغسل واحدة بمحلول غسيل بسعة 1 مل من RT Tris/EDTA (ليس مخزن TE، الملف الإضافي 1 للوصفة). اسحب كل السائل الممكن من الحبيبات بإبرة 16 جرام ونصف.
  5. استخراج الحمض النووي (ساعتان)
    1. أضف 0.1 مل من راتنج مخلب 10٪ مخلوط جيدا لاستخراج الحمض النووي إلى الخرزات المغسولة (من الخطوة 1.4.4.4)، وعينة الإدخال (من الخطوة 1.3.12)، والدوامة.
    2. اغلي لمدة 10 دقائق على كتلة حرارة بدرجة حرارة 100 درجة مئوية، ثم برد إلى RT لعكس الربط المتقاطع.
      ملاحظة: ينصح بشدة باستخدام مشابك قفل الإيقاف لأنابيب الطرد المركزي للحفاظ على ختم الإغلاق.
    3. أضف 5 ميكرولتر من بروتياز K بجرعة 20 ملغ/مل إلى الخرزات وحضن على حرارة 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الرج عند 400 دورة في الدقيقة.
    4. اغلي الخرزات على كتلة حرارية بدرجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أخرى لتعطيل نشاط بروتيز ك.
      ملاحظة: ينصح بشدة باستخدام مشابك قفل الإيقاف لأنابيب الطرد المركزي للحفاظ على ختم الإغلاق.
    5. قم بتدوير الخرزات عند 6000 جرام لمدة دقيقتين عند RT، وأنقذ السوبرناتانت.
    6. أضف 100 ميكرولتر من 2XTE إلى الحبيبة. دوامة ودورانها عند 6000 جرام لمدة دقيقتين عند RT.
    7. اخلط واحفظ الفائقين (من الخطوات 1.5.5 و1.5.6) التي أخذت أعلاه (حوالي 180 ميكرولتر).
    8. قم بتنقية عينات 30 ميكرولتر إلى 18 ميكرولتر من مخزن التفريغ (EB، مزود مع مجموعة تنقية PCR) باستخدام أعمدة تنقية الحمض النووي لتحضير مكتبة ssDNA (من الخطوة 1.3.12 كمدخل والخطوة 1.5.7 كعينات H3K4me3 ChIP-seq).
      ملاحظة: يمكن تخزين عينات الحمض النووي عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر (نقطة توقف).
  6. التكرار المناعي في BrdU (5 ساعات)
    1. اغلي عينات (حوالي 150 ميكرولتر مدخل وH3K4me3 ChIP من الخطوة 1.5.7) لمدة 5 دقائق على كتلة حرارية بدرجة حرارة 100 °م، ثم برد فورا في الثلج لمدة 5 دقائق. أضف 15 ميكرولتر من 10x PBS و+ 1.35 مل من مخزن IP BrdU + 0.5 ميكرولتر من مضاد BrdU Ab + 1 ميكرولتر من tRNA الإشريكية القولونية (10 ملغ/مل).
      ملاحظة: هذه خطوة حاسمة. استخدم أنابيب الطرد المركزي منخفضة الارتباط بالحمض النووي لتجنب الارتباط غير النوعي بالحمض النووي.
    2. أعمل على النوتيت لمدة ساعتين على الدوار عند 4 درجات مئوية و10 دورات في الدقيقة.
    3. انقل الخليط إلى أنبوب بسعة 1.5 مل يحتوي على 20 ميكرولتر من حبات البروتين G سيفاروز (يغسلها ثلاث مرات ب 1 مل من مخزن BrdU IP ويدور لمدة 3 دقائق لكل منها عند 10 دورات في الدقيقة لكل غسلة عند RT) وانقل الخليط لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية على الدوار عند 10 دورات في الدقيقة.
    4. قم بتدوير 800 × جرام لمدة دقيقة واحدة عند RT واغسل وفقا للتعليمات التالية: ثلاث مرات باستخدام 1 مل من مخزن BrdU البارد IP، 3 دقائق على الدوار، ومرة واحدة مع 1 مل من مخزن TE لمدة 3 دقائق.
    5. قم بتدوير 800 × جرام لمدة دقيقة واحدة عند RT واستنشق السوبرناتان.
    6. أضف 100 × ميكرولتر من مخزن TE + 1٪ SDS إلى الخرزات المتبقية. حضن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أدور عند 800 × جرام لمدة دقيقة واحدة عند RT.
    7. قم بتنقية المادة الفائقة إلى 18 ميكرولتر من EB باستخدام أعمدة تنقية الحمض النووي (عينة BrdU IP و H3K4me3 eSPAN).
      ملاحظة: استخدم أنابيب الطرد المركزي منخفضة الارتباط لتجنب الارتباط غير النوعي بالحمض النووي. يمكن تخزين عينات الحمض النووي عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر (نقطة توقف).
  7. تحضير وتسلسل مكتبة ssDNA (3 ساعات)
    1. تحضير مكتبات الحمض النووي أحادية السلسلة مع 15 ميكرولتر من المدخلات المنقاة، وعينات BrdU IP، وH3K4me3 ChIP وeSPAN (الخطوات 1.5.8 و1.6.7) (بما في ذلك خطوات التكييف، التمديد، والربط) وفقا للأدلة المقدمة من ssDNA ومجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي منخفضة المدخلات، وتنقية منتج الربط المحصل إلى 20 ميكرولتر من مخزن التخلص منخفض EDTA (مقدمة من مجموعة التحضير لمكتبة الحمض النووي).
      ملاحظة: هناك خطوتان لتنقية الربط في المجموعة. يتبع هذا البروتوكول إجراء 200 نقطة أساس و<1 نانوغرام.
    2. تضخيم مكتبة الحمض النووي باستخدام مزيج تفاعل إجمالي بسعة 50 ميكرولتر (المواد المتوفرة من مجموعة تحضير مكتبة ssDNA): 20 ميكرولتر من مكتبة الحمض النووي المنقى، 4 ميكرولتر من المادة W2، 10 ميكرولتر من الكاشف W3، 1 ميكرولتر من إنزيم W4، 1.5 ميكرولتر من بادئات مؤشرات I7 (10 ميكرومول، انظر تسلسل الأوليغو الإضافي) و1.5 ميكرولتر من مؤشرات الأساس I5 (10 ميكرومول، انظر تسلسل أوليغو الإضافي)، 16 ميكرولتر من DDH 2 O. تسخين خليط PCR على 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، تليها 18 دورة من 10 ثوان عند 98 درجة مئوية، و30 ثانية عند 60 درجة مئوية، ودقيقة واحدة عند 68 درجة مئوية، ودورة واحدة من 10 دقائق عند 68 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب أن تستخدم كل مكتبة تركيبة فريدة من بادئات i7 و i5. يجب تعديل عدد دورات التضخيم بناء على كمية المكتبة لتجنب الإفراط في التضخيم، مما قد يؤدي إلى تشوهات PCR. نظرا لانخفاض كمية الحمض النووي عادة في عينات eSPAN، استخدم حتى 18 دورة.
    3. تنقية منتجات PCR عن طريق خلط 60 ميكرولتر (حجم 1.0x) من الخرزات (مسخنة مسبقا إلى 30 درجة مئوية) (انظر جدول المواد).
    4. اخلط منتجات PCR والخرز جيدا.
      1. دعه يقف على RT لمدة 5 دقائق. ربط الخرز على الحامل المغناطيسي لمدة 3 دقائق واغسل الخرزات مرتين بإيثانول طازج جاهز بنسبة 80٪ في كل مرة 200 ميكرولتر.
      2. جفف الخرزات في الهواء لمدة دقيقتين ثم أدخل في مخزن منخفض EDTA بسعة 20 ميكرولتر (متوفر في مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي).
    5. قم بقياس تركيز المكتبة وتوزيع حجم الشظايا باستخدام أنظمة الرحلان الكهربائي عالية الدقة (انظر جدول المواد).
    6. تجميع عدد متساو من المكتبات الفردية، بما في ذلك المدخلات، H3K4me3 ChIP، BrdU IP، وعينات eSPAN، وتنفيذ تسلسل متوازي مع منصة التسلسل Illumina. لعملية تحليل البيانات، راجع القسم 3.
      ملاحظة: معايير التقييم لنتائج مراقبة الجودة هي: (1) لم يتم اكتشاف أي قمم للمحول أو المؤشر (أقل من 180 نقطة أساس للحركة). (2) جميع المكتبات التي سيتم تجميعها لها توزيع حجم مماثل وضيق (~300 بيت). قد يؤدي تجفيف الخرزات بشكل مفرط إلى انخفاض الإنتاجية؛ استخدم محطة عمل DNA لتجنب التلوث. يمكن تخزين المكتبات إلى أجل غير مسمى عند -20°C (نقطة التوقف).

2. هيستون eSPAN مع خلية ES للفأر

ملاحظة: جهاز eSPAN الهيستون مع خلية ES الفأرية مطابق أساسا لبروتوكول23 المنشور سابقا.

  1. تصنيف BrdU وجمع عينات لخلايا ES للفأر (3 ساعات)
    1. نمي خلايا ES الفأرية في وسط زراعة خلايا ES عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع غلاف جوي رطب يحتوي على 5٪CO2 للوصول إلى التقاء 70٪-80٪. بشكل عام، كان هناك حاجة لحوالي مليون خلية ل eSPAN الهيستوني. الخلايا البذرية قبل يوم واحد من التجارب لضمان نمو الخلايا بمرحلة أسية.
    2. غير الوسط وحضن الخلايا مع BrdU بتركيز نهائي 50 ميكرومولار لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئويةمع غلاف جوي رطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
      ملاحظة: يمكن مراقبة كفاءة تصنيف BrdU من خلال تحليل PCR الكمي. بدلا من ذلك، يمكن استخدام تحليل التألق المناعي أو FACS لمراقبة كفاءة دمج BrdU. يمكن استخدام الخلايا غير الموسومة كوسيلة تحكم سلبية. هذه هي شروط الوسم القياسية لخلايا ES الفأرية. يوصى بتعديل شروط الوسم وفقا لذلك للخلايا ذات معدلات التكاثر ومدة طور S المتغيرة.
    3. اشطف الخلايا مرتين بلطف باستخدام PBS البارد جدا.
    4. قم بتربسين واجمع الخلايا عن طريق الحبيبات على حرارة 200 × جرام لمدة 5 دقائق.
    5. قم بعمل ماصة برفق على الوسط لإعادة تعليقها، ثم عدها. قم بعمل الطرد المركزي لعدد الخلايا اللازم عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق عند RT.
    6. أعد تعليق حبيبة الخلية في 4 مل من مخزن الغسيل عن طريق التوصيل بالماصات وتخلص من السوبرناتانت. الطرد المركزي عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق في RT.
    7. أعد تعليق الحبيبات مرة أخرى باستخدام 4 مل من محلول الغسيل والطرد المركزي عند 500 × جرام لمدة 5 دقائق عند الأشعة الطبيعية.
    8. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا في مخزن الغسيل.
    9. ضع الخرزات المغناطيسية المطلية ب ConA (استخدم 10 ميكرولتر من الخرزات ل 250000 خلية؛ قم بتكبير الأحجام عند استخدام المزيد من الخلايا) وأعد تعليقها في 1 مل من مخزن الربط. بعد عدة انقلابات، ضع الأنابيب على الحامل المغناطيسي للسماح للخرزات بالاستقرار.
    10. باستخدام الماصة أو المكنسة منخفضة السرعة، تخلص من الفائقات الفائقة. كرر خطوات الغسل مرتين وأعد تعليق الخرزات في مخزن الربط.
    11. أضف خرز مغناطيس مغسولة مسبقا مطلية ب ConA إلى العينات. اخلط جيدا وقم بتدوير الدوران لمدة 10-20 دقيقة.
    12. ضع الأنابيب على حامل مغناطيس للتخلص من جميع المواد الفائقة.
  2. الوسم19 لخلايا ES الفأرية (يومان)
    1. أعد تعليق الخرزات (خرزات مغناطيسة مغطاة ب ConA مرتبطة بالخلايا من الخطوة 2.1.10) في 200 ميكرولتر من مخزن الأجسام المضادة الباردة جدا. أضف IgG كمادة تحكم سلبية أو التركيزات المناسبة للأجسام المضادة الأولية ضد البروتينات المعنية.
    2. اخلط جيدا وقم بتحضير المغذيات عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    3. اخلط 2 ميكروغرام من الجسم المضاد الثانوي وكمية مناسبة من pA-Tn5 بنسبة مولية 1:2. ارفع الحجم الكلي إلى 8 ميكرولتر لكل عينة مع 50٪ (v/v) من الجلسرول. استخدم البيبيتي عدة مرات لخلط جيد واحتضانه في RT لمدة ساعة.
    4. ضع عينات CUT&Tag على حامل مغناطيس لمدة 30 ثانية وتخلص من جميع الفائق. أضف 1 مل من محلول Dig-wash إلى حبيبات الخرزات واقلب عدة مرات.
      ملاحظة: من هذه الخطوات إلى خطوات الغسل التالية (الخطوات 2.2.5-2.2.6)، ينصح بحضان الخرزات في المخازن لمدة 3-5 دقائق بعد خطوة العكس لتجنب الارتباط غير المحدد.
    5. ضع الأنابيب على حامل مغناطيس وأزل جميع المواد الفائقة. أضف 200 ميكرولتر من محلول Dig-300 لإعادة تعليق الخرزات وأضف 8 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الثانوية وpA-Tn5 إلى كل عينة. بعد الخلط جيدا مع استخدام الماصات عدة مرات، قم بالحضانة عند RT لمدة ساعة واحدة.
    6. ضع الأنابيب على حامل مغناطيس وأزل جميع المواد الفائقة. أضف 1 مل من مخزن Dig-300 لإعادة تعليق الخرزات وقلبها عدة مرات.
    7. ضع الأنابيب على حامل مغناطيس وأزل جميع المواد الفائقة. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات أخرى.
    8. أزل الفائقات تماما وأضف 250 ميكرولتر من حاجز الوسمنت لإعادة تعليق الخرزات واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
      ملاحظة: ينصح بهز خفيف في خطوة التفاعل على خلاط الحرارة لأن الخرزات قد تتراسب إلى أسفل الأنابيب.
    9. ضع الأنابيب على حامل مغناطيس وأزل جميع المواد الفائقة. استخدم 1 مل من مخزن الغسيل TAPS لإعادة تعليق الخرزات وقلبها عدة مرات.
    10. ضع الأنابيب على حامل مغناطيس وتخلص من جميع المواد الفائقة.
    11. أضف 250 ميكرولتر من محلول Dig-300 يحتوي على 15 مللي مولار EDTA، و0.1٪ (مع وزنه/ضبط) SDS، و0.1 ملغ/مل بروتيناز K إلى الخرزات المتبقية. دوامة لتخلط جيدا وتحتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل مع هز لطيف.
  3. تنقية الحمض النووي الجيني والوسم في المختبر في خلايا ES للفئران (بين ليلة وضحاها)
    ملاحظة: يتم استخراج الحمض النووي الجيني من نفس الخلايا الخاصة ب eSPAN وإعداده للوسم الصناعي ، والذي يستخدم في BrdU-IP-ssSeq. وسم الحمض النووي الجيني وتبعه BrdU-IP-ssSeq مخصصان لأغراض تطبيع eSPAN.
    1. أعد تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من مخزن تحلل الحمض النووي الجينومي والدوامة بأقصى سرعة حتى لا تظهر أي حبيبات.
    2. لكل عينة، أضف RNase A عند 100 ميكروغرام/مل. بعد الجمع، حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. أضف 100 ميكرولتر من محلول ترسيب البروتين إلى كل عينة. اخلط جيدا عن طريق الدوامة والطرد المركزي عند 15,000 جرام عند RT لمدة 3 دقائق.
    4. وفر الفائق عن طريق نقله إلى أنابيب جديدة بسعة 1.5 مل. أضف حجم 1x للأيزوبروبانول إلى العينات وامزج جيدا.
    5. قم بتدوير أقصى سرعة في RT لمدة 3 دقائق لإطلاق الحمض النووي الجينومي. اصب السوبرناتسيتس بحذر.
    6. أضف 1 مل من الإيثانول الطازج الجاهز بنسبة 70٪ (v/v) إلى كل عينة واقلب عدة مرات. الطرد المركزي بأقصى سرعة عند RT لمدة 3 دقائق.
    7. قم بالطرد المركزي بوزن 15,000 جرام لمدة دقيقة واحدة عند RT وإزالة الإيثانول المتبقي باستخدام ماصة P20. اتركه ليجف في الهواء لمدة 5-10 دقائق.
    8. أضف 50 ميكرولتر من ddH2O ودوامة لفترة وجيزة لإعادة تعليق الحمض النووي الجيني. اذيب على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    9. قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة ونقل الفائقات إلى أنابيب جديدة بسعة 1.5 مل. قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    10. حدد رد فعل الوسم في المختبر كما هو مذكور في الجدول 1.
    11. اخلط جيدا واحتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع هز لطيف.
    12. أضف 10 ملليمولار EDTA، و0.1٪ (مع الوزن) SDS، و0.1 ملغ/ملليتر بروتيناز K إلى كل عينة. اخلط جيدا عن طريق الدوامة وحضن البيت طوال الليل عند حرارة 37 درجة مئوية مع الرج.
  4. استخراج الحمض النووي واستبدال الأوليغو (3 ساعات)
    ملاحظة: يمكن تطبيق كل من كحول الفينول-كلوروفورم-إيزوأميل (PCI) وتنقية الأعمدة لاستخراج الحمض النووي. هنا، تقدم إجراءات مفصلة باستخدام تنقية الأعمدة.
    1. أضف 1.25 مل (5 أضعاف الحجم) من مخزن الربط (مزود بمجموعة تنقية PCR) إلى العينات (الخطوات 2.2.11 و2.3.12) وامزج جيدا عن طريق العكس عدة مرات.
    2. حمل الخليط إلى أعمدة تنقية الحمض النووي (في أنابيب جمع بقطر 2 مل) والطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 10,000 × جرام عند RT. تخلص من التدفق عبر الجهاز.
    3. أضف 600 ميكرولتر مخزن إخراج (مشمول في المجموعة) إلى الأعمدة وجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 10,000 × جرام عند RT. تخلص من تدفق الجريان.
    4. استخدم الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة دقيقتين لإزالة المخزن المتبقي تماما. ضع الأعمدة في أنابيب جديدة بسعة 1.5 مل مع أغطية مفتوحة وجففها في الهواء لمدة دقيقة واحدة.
    5. أضف 32 ميكرولتر من DDH2O الخالي من DNase (أو 10 ملليموتر تريس·HCl، pH = 8.0) إلى منتصف الغشاء ودعه يستريح لمدة دقيقة واحدة. الطرد المركزي عند أقصى سرعة لمدة دقيقتين وحمض نووي CUT&Tag الآن في المحلول.
    6. أضف 32 ميكرولتر من عينة CUT&Tag DNA إلى أنبوب PCR جديد ثم أضف 2 ميكرولتر من خليط dNTP (2.5 مللي مولار لكل منهما)، و4 ميكرولتر من 10x من مخزن Ampligase، و2 ميكرولتر من rep-B (10 ميكرومول). انقر برفق وامزج عن طريق التنبيه.
    7. قم بتشغيل البرنامج التالي لفترة وجيزة لاستبدال أوليغو23.
      50 درجة مئوية، دقيقة واحدة
      45 درجة مئوية، 10 دقائق
      المنحدر إلى 37 درجة مئوية، 0.1 درجة مئوية/ثانية
      37 درجة مئوية، حافظ على
    8. في جهاز التدوير الحراري، أضف 1 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي T4 و1 ميكرولتر من الأمبليغاز إلى كل أنبوب (الحجم النهائي، 40 ميكرولتر/عينة). امزج عن طريق العزف اللطيف على النبرة.
    9. استمر في التفاعل عند 37 درجة مئوية في جهاز التسخين لمدة 30-60 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن تخزين الحمض النووي عند -20 درجة مئوية إذا لم يكن الانتقال إلى بروتوكول BrdU مباشرة بعد هذه الخطوة (نقطة توقف آمنة).
  5. تقلل المناعي من نوع BrdU (وهو في الأساس نفس بروتوكول الخميرة) (ساعتان)
    1. انقل العينات إلى أنابيب DNA منخفضة الارتباط بحجم 1.5 مل. اغلي عينات الغل لمدة 5 دقائق على كتلة حرارية بدرجة حرارة 100 درجة مئوية، ثم برد فورا في الثلج لمدة 5 دقائق. أضف 15 ميكرولتر من 10x PBS و+ 1.35 مل من مخزن IP BrdU + 0.5 ميكرولتر من مضاد BrdU Ab + 1 ميكرولتر من tRNA الإشريكية القولونية (10 ملغ/مل).
    2. النوتيت لمدة ساعتين على الدوار عند 4 درجات مئوية.
    3. انقل الخليط إلى أنبوب يحتوي على 20 ميكرولتر من خرز البروتين G سيفاروز (يغسل ثلاث مرات ب 1 مل من مخزن BrdU IP، كل 3 دقائق).
    4. حضانه عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.
    5. قم بتدوير 800 × جرام لمدة دقيقة واحدة واغسله وفقا للطرق التالية: ثلاث مرات باستخدام 1 مل من مخزن BrdU IP البارد، 3 دقائق على الدوار؛ مرة واحدة مع 1 مل من مخزن TE لمدة 3 دقائق.
    6. قم بتدوير 800 × جرام لمدة دقيقة واحدة واستنشق السوبرناتان.
    7. أضف 100 ميكرولتر من مخزن TE + 1٪ من SDS إلى الخرزات المتبقية. حضن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. قم بتدوير 800 × جرام لمدة دقيقة واحدة.
    8. قم بتنقية المادة الفائقة إلى 18 ميكرولتر من مخزن التطهير (المرفق مع المجموعة) باستخدام أعمدة تنقية الحمض النووي (عينة BrdU IP وH3K4me3 eSPAN).
  6. تضخيم وتسلسل PCR (1.5 ساعة)
    1. تضخيم ووضع علامات على عينات مكتبة الحمض النووي أحادية السلسلة باستخدام تركيبات فهرسة مختلفة. جهز تفاعل PCR بإضافة المكونات التالية ((DNA منقى [ChIP أو ESPAN]، برايمر I5-Indexing [1 ميكرولتر]، برايمر I7-Indexing [1 ميكرولتر]، NEBNext عالي الدقة 2X PCR Master Mix (2x) [10 ميكرولتر]، ddH2O حتى 20 ميكرولتر)، وخلط العينات عن طريق التوصيل بالماصات، والغزل لفترة وجيزة.
    2. سخن خليط PCR على 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، تليها 12-14 دورة من 10 ثوان عند 98 درجة مئوية و20 ثانية عند 63 درجة مئوية، ودورة واحدة لمدة دقيقتين عند 72 درجة مئوية.
    3. قم بتنقية منتجات PCR بسعة 18 ميكرولتر من خرزات بارامغناطيسية (0.8x الحجم) إلى 20 ميكرولتر من مخزن منخفض EDTA.
    4. قياس تركيز المكتبة وتوزيع حجم الشظايا باستخدام أنظمة الرحلان الكهربائي عالية الدقة.
    5. تجميع عدد متساو من المكتبات الفردية، بما في ذلك المدخلات، H3K4me3 ChIP، BrdU IP، وعينات eSPAN، وتنفيذ تسلسل متوازي مع منصة التسلسل Illumina.

3. تحليل بيانات eSPAN لخلايا الخميرة (يوم واحد)

ملاحظة: تنطبق عملية تحليل البيانات هذه فقط على بيانات الخميرة؛ يمكن متابعة تحليل بيانات eSPAN لخلايا ES كما هو موضح في منشور حديث23.

  1. استخراج ملفات التسلسل الخام، وقص تسلسلات محولات التقليم باستخدام أدوات Trim Galore، وإزالة القراءات التي تقل عن 10 بت لتقليل حجم ملف الإخراج ولتجنب تعطل برامج المحاذاة. تأكد من أن الملفات بصيغة file1_1.fq file1_2.fq للقراءات الزوجية:
    /TrimGalore-0.6.10/trim_galore ملف ملف fq-o --طول 10 - مقاس
  2. إنشاء ملفات فهرس ربطة عنق للجينوم المرجعي:
    Bowtie2-build genome.FA
  3. قم بتعيين القراءات إلى الجينوم المرجعي المقابل (جينوم Saccharomyces (sacCer3) للخميرة) باستخدام Bowtie 2:
    بووتاي2 -X جينوم -1 trim_1.FQ -2 trim_2.FQ --محلي --بدون ذيل حمامة --بدون متنافر --ماكسينات 1000 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0.50
  4. إزالة القراءات متعددة الخرائط باستخدام أدوات SAMtools وتكرار القراءات باستخدام أدوات Sambamba:
    عرض SamTools -bhs - Q 40 input.bam -o output.bam
    sambamba-1.0.1.1-linux-amd64-static markdup output.bam filtered.bam -r
  5. استخدم deeptools لإنشاء ملفات تغطية القراءة الرئيسية على خيوط واتسون وكريك بشكل منفصل لكل عينة من ملفات bam النظيفة:
    bamCoverage -b filtered.bam -o watson.bw --filterRNAstrand عكس -bs 1 - extendReads
    bamCoverage -b filter.bam -o crick.bw --filterRNAstrand forward -bs 1 - extendReads
  6. احسب متوسط الانحياز عند كل موضع نيوكليوسوم25 لكل عينة بناء على الصيغة: log2 قراءات الأمام (سلسلة واتسون) / العكسية (خيط كريك) بعد تحديد موقع النيوكليوسوم المرجعي تم فصلها25. نصوص R لهذه الحسابات متوفرة على https://github.com/clouds-drift/eSPAN-bias. لحساب قياسي، استخدم الأوامر التالية.
    ملاحظة: تنطبق هذه الخطوة فقط على بيانات الخميرة؛ يمكن اتباع حساب التحيز لخلايا ES كما هو موضح في منشور حديث23.
    النص cal_bias. R -w watson.bw -c crick.bw -r replication_origins.bed
  7. إذا لزم الأمر، قم بضبط انحياز الخيط بواسطة انحياز BrdU:
    النص normalize_bias. R -i matrix_files -c classes_list -C condition_list --هدف target_list --control_list التحكم
    ملاحظة: "matrix_files" هي قائمة بالملفات التي يولدها cal_bias. خط R مفصوله بفواصل. مثلا: 'file1'، 'file2'، 'file3'. "classes_list" هي قائمة بفئات العينات التي تتوافق مع كل ملف مفصولة بفواصل (مثل 'brdu'، 'H3K4me3_eSPAN'، 'H3K56ac_eSPAN'). "condition_list" هي قائمة بحالات العينة التي تتوافق مع كل ملف ومفصولة بفواصل. سيتم إقران كل ملف حسب الفئة والشرط لتعديل التحيز. "target_list" هي قائمة بالمقررات المأخوذة من classes_list. سيحدد الفئات التي ستعمل كبيانات سيتم تعديلها بواسطة الضوابط (مثل 'H3K4me3_eSPAN'، 'H3K56ac_eSPAN'). "control_list" هي قائمة بالفصول المأخوذة من قائمة الصفوف. سيحدد الفئات التي ستعمل كبيانات يجب تعديلها بواسطة التحكمات. تأكد من أن طول القائمة هو نفسه target_list (مثل 'brdu')
  8. بعد الحساب والتعديل، قم بتجميع العينات وإنشاء تصورات للبيانات.
    الكتابة draw_bias. R -s' bias_matrix/file1.txt، bias_matrix/file2.txt' -o 'bias.pdf' -g المجموعة 1,المجموعة 2 --فاصل=T
    يتطلب -s قائمة بملفات التحيز التي تولدها السكريبتات أعلاه
    -o هو ملف الإخراج
    -g يحدد المجموعات التجريبية التي يجب حسابها، أي النسخ البيولوجية لرسم الانحياز المتوسط.
    --الفترة T أو F، لعرض الأخطاء القياسية على المخططات داخل مجموعات التجريب.
    ملاحظة: تم تعريف المعلومات حول أصول التكرار بواسطة بيانات IP الخاصة ب BrdU. تم الحصول على معلومات عن موقع النيوكليوسوم الواحد من مقال نشرسابقا رقم 25. لتحليل بيانات خلايا ES للفأر، تم الحصول على معلومات الأصل من مجموعة بياناتOK-seq رقم 26، ويجب أن يتبع حساب الانحياز المتوسط البروتوكول الموضح في العملالسابق 23.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن استخدام eSPAN للحصول على معلومات محددة بالخيوط حول البروتين المستهدف، مثل الهيستونات وتعديلات الهستون. في هذه النتيجة التمثيلية، أجريت عمليات جمع العينات وعمليات eSPAN وفقا للمخطط الموضح في الشكل 2 باستخدام نظام الخميرة التبرعمية. تتبع معالجة وجمع العينة حالة المرحلة S المبكرة المعالجة بالهيدروكسيوريا كما هو البروتوكول. تم استخدام سلالين من الخميرة، WT (النوع البري) وmcm2-3A المتحول. تعمل وحدة الهيليكاز في الحمض النووي MCM2 كمرافقة هيستونية H3-H4 من الوالدين، بينما يفتقر الطفرة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد اكتشاف البروتينات المرتبطة بسلاسل التكاثر الرئيسية والمتأخرة أمرا مهما لفهم آليات تكرار الكروماتين والعملية المرتبطة بها، والتي ترتبط مباشرة بأبحاث السرطان البشرية وآليات مقاومة الأدوية. تم استخدام عدة طرق، مثل الهلام ثنائي الأبعاد، والتقرب المناعي الأصلي للكروماتين (nChIP)، وiPOND، والتقاط الكروماتين الناشئ 29,30,31، لدراسة تكرار الحمض النووي والعمليات ذات الصلة مثل إصلاح الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير طرق رسم الخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة R35GM118015 (Z.Z.)، R01GM130588 (C.Y.)، وصندوق هورميل للشركات الناشئة (C.Y.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 مليون EDTA، الرقم الهيدروجيني 8.0ثيرمو فيشر العلمي15575020
أنابيب منخفضة الارتباط بحجم 1.5 مل من الحمض النووي  إبندورف22431021
مخزن Ampligase 10xلوسيجنA1905B
10x PBS كورنينغ21-040-CV
10x TBSبيوراد1706435
16 G × 1-1/2 بوصة. إبرة BD PrecisionGlidبكالوريوس العلوم الحيوية305198
مجموعة مكتبة ACCEL-NGS 1S بالإضافة إلى مجموعة مكتبة الحمض النوويتقنيات الحمض النووي المتكاملة10009817مجموعة تحضير مكتبة ssDNA ومنخفض الإدخال  
محلل بيولوجي Agilent 2100  أجيلينتتحليل بيولوجي 2100
مجموعة Agilent DNA 1000  أجيلينت5607-1504
Ampligase لوسيجنA0110Kتعامل مع البارافورمالديهايد بحذر، فهو قابل للاشتعال والصلب وخطير.
تجربة AMPureبيكمانA63881
واكل SPRI من AMPure XPبيكمان كولترA63882
الأجسام المضادة المضادة لبريديول بكالوريوس العلوم الحيوية555627
الأجسام المضادة المضادة ل-H3K4me3 أبكامab8580
عداد الخلايا الآلي  ، موديل TC10بيوراد145-0001
باسيتراسين  سيغما11702
بيبتون باكتو ثيرمو فيشر العلمي211830
هيدروكلوريد البنزاميدين سيغماB2417المواد الصلبة القابلة للاشتعال
BrdU سيغماB5002تعامل مع BrdU بحذر لأنه قد يكون متحولا ومثيرا.
BSAمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةB9000S
CaCl2سيغماC4901
حاضنة زراعة الخلايا  ثيرمو فيشر ساينتفيك  حاضنة ثاني أكسيد الكربون المغطاة بالماء من طراز فورما السلسلة الثانية3140
وسيط زراعة الخلايا  
خط الخلية ES-E14 
تشيلكس-100 بيوراد1422842200– حجم شبكة جافة 400
الكلوروفورم  سيغما366919
خرز مغناطيسي مغطاة بكونكانافالين A (ConA)&nb;العلوم متعددة86057-10
ديجيتونينميليبور300410-5MG
DMSOسيغماD8418
E. coli  tRNA سيغما10109541001
الإيثانول  ثيرمو فيشر العلميBP2818100تعامل مع الإيثانول بحذر، فهو قابل للاشتعال
الجلوكوزسيغماG7021
الجلسرول  سيغماG5516
HCl سيغماH1758
HEPES سيغماH3375
إيزوبروبانول ثيرمو فيشر العلميBP26324تعامل مع الأيزوبروبونول بحذر، فهو قابل للاشتعال
كابا هاي فاي هوت ستارت ريد ميكسروش7958889001
KClسيغماP9541
KOHسيغما221473تعامل مع KOH بحذر، فهو يسبب التآكل
الفراغ منخفض السرعة
حامل مغناطيسي  ميليبورLSKMAGS08
ماسترسايكلر تدرج PCR Thermal Cyclerإبندورف5331
MgCl2سيغماM8266
نوكلياز ميكروكوكي   (منيسي)وورثينغتونLS004798
مجموعة تنقية PCR MinElute  تشياغن28006
مضرب الخرز الصغيرميني بيد بيتر 24 ديسبستر607
جهاز الطرد المركزي المصغر إبندورف5424R
MnCl2سيغما244589
هزاز متعدد المنصاتفيشربراند02-217-765
حاضنة هزات متعددة المنصاتالمعيارإنكو-شاكر 10 لتر
كتلة حرارية متعددة الحرارة إبندورفخلط الحرارة C
N-[تريس(هيدروكسي ميثيل)ميثيل]-3-أمينوبروبانسولفونيك حمض (طرق)سيغماT5130200– حجم شبكة جافة 400
NaCl سيغماS9888
NaOH سيغماS8045تعامل مع NaOH بحذر، فهو يسبب التآكل
NEBNext هاي فاي 2× مزيج PCR الرئيسيمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةM0541
NP-40 إيغيبال CA-630ثيرمو ساينتفيكJ61055. أسوشيتد برس
بارافورمالدهايدسيغما158127تعامل مع البارافورمالديهايد بحذر، فهو قابل للاشتعال والصلب وخطير.
إنزيم pA-Tn5  أدجين121137
بيفابلوكسيغما11429868001
كحول الفينول-كلوروفورم-إيزوأميل  إنفيتروجين15593049
بيبيت P1000، P200، P20 وP2إبندورف2231300004
PMSFسيغما10837091001
قرص كوكتيل مثبط للبروتيزسيغماS8830
قرص كوكتيل مثبط للبروتياز  سيغماS8830
خرزات بروتين G-سيفاروز  جنرال إلكتريك للرعاية الصحية17-0618-02
محلول ترسيبيات البروتينتشياغن848023
محلول ترسيبيات البروتينتشياغن848023تعامل مع KOH بحذر، فهو يسبب التآكل
محلول ترسيب البروتين  تشياغن848023
بروتيناز K سيغما311584401
مجموعة تنقية QIAquick PCR  تشياغن28106
RNase Aسيغما10109169001
SDS سيغماL3771
مقياس الطيف  ثيرمو ساينتيفيك.2000/2000c
سبيرميدين  سيغماS2626
T4 DNA Polنيو إنجلاند بايولابز،  M0203
جهاز الطرد المركزي على الطاولة بيكمان كولترأليغرا X-5
تريس سيغما11814273001
ترايتون X-100 سيغماT8787
مستخلص الخميرة  ثيرمو فيشر العلمي212730

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bell, S. P., Stillman, B. ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex. Nature. 357 (6374), 128-134 (1992).
  2. Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (6), 360-374 (2015).
  3. Burgers, P. M. J., Kunkel, T. A. Eukaryotic DNA replication fork. Annu Rev Biochem. 86, 417-438 (2017).
  4. Pursell, Z. F., Isoz, I., Lundstrom, E. B., Johansson, E., Kunkel, T. A. Yeast DNA polymerase epsilon participates in leading-strand DNA replication. Science. 317 (5834), 127-130 (2007).
  5. Nick Mcelhinny, S. A., Gordenin, D. A., Stith, C. M., Burgers, P. M., Kunkel, T. A. Division of labor at the eukaryotic replication fork. Mol Cell. 30 (2), 137-144 (2008).
  6. Daigaku, Y., et al. A global profile of replicative polymerase usage. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 192-198 (2015).
  7. Koyanagi, E., et al. Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome. Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).
  8. Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 185-191 (2015).
  9. Reijns, M. aM., et al. Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome. Nature. 518 (7540), 502-506 (2015).
  10. Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. Ribose-seq: Global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA. Nat Methods. 12 (3), 253 p following 257 251-257 (2015).
  11. Stillman, B. DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes. Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).
  12. Zhou, Z. X., Lujan, S. A., Burkholder, A. B., Garbacz, M. A., Kunkel, T. A. Roles for DNA polymerase delta in initiating and terminating leading strand DNA replication. Nat Commun. 10 (1), 3992(2019).
  13. Yu, C., et al. Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall. Mol Cell. 56 (4), 551-563 (2014).
  14. Gan, H., et al. The mcm2-ctf4-polalpha axis facilitates parental histone h3-h4 transfer to lagging strands. Mol Cell. 72 (1), 140-151.e3 (2018).
  15. Yu, C., et al. A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands. Science. 361 (6409), 1386-1389 (2018).
  16. Petryk, N., et al. Mcm2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication. Science. 361 (6409), 1389-1392 (2018).
  17. Li, Z., et al. DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands. Sci Adv. 6 (35), eabb5820(2020).
  18. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone h4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  19. Kaya-Okur, H. S., et al. Cut&tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930(1930).
  20. Lengronne, A., Pasero, P., Bensimon, A., Schwob, E. Monitoring S phase progression globally and locally using brdu incorporation in tk(+) yeast strains. Nucleic Acids Res. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  21. Viggiani, C. J., Aparicio, O. M. New vectors for simplified construction of brdu-incorporating strains of saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (14-15), 1045-1051 (2006).
  22. Yu, C., Gan, H., Zhang, Z. Strand-specific analysis of DNA synthesis and proteins association with DNA replication forks in budding yeast. Methods Mol Biol. 1672, 227-238 (2018).
  23. Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Zhang, Z. Efficient and strand-specific profiling of replicating chromatin with enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA in mammalian cells. Nat Protoc. 16 (5), 2698-2721 (2021).
  24. Rosebrock, A. P. Analysis of the budding yeast cell cycle by flow cytometry. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).
  25. Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. P., Widom, J. A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution. Nature. 486 (7404), 496-501 (2012).
  26. Petryk, N., et al. Replication landscape of the human genome. Nat Commun. 7, 10208(2016).
  27. Foltman, M., et al. Eukaryotic replisome components cooperate to process histones during chromosome replication. Cell Rep. 3 (3), 892-904 (2013).
  28. Jia, J., Yu, C. The role of the MCM2-7 helicase subunit MCM2 in epigenetic inheritance. Biology (Basel). 13 (8), 572(2024).
  29. Alabert, C., et al. Nascent chromatin capture proteomics determines chromatin dynamics during DNA replication and identifies unknown fork components. Nat Cell Biol. 16 (3), 281-293 (2014).
  30. Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).
  31. Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2d gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. Methods Mol Biol. 2119, 43-59 (2020).
  32. Ramachandran, S., Henikoff, S. Mince-seq: Mapping in vivo nascent chromatin with edu and sequencing. Methods Mol Biol. 1832, 159-168 (2018).
  33. Petryk, N., et al. Genome-wide and sister chromatid-resolved profiling of protein occupancy in replicated chromatin with CHOR-seq and SCAR-seq. Nat Protoc. 16 (9), 4446-4493 (2021).
  34. Zhong, J., et al. Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in chip-seq application. BMC Genomics. 18 (1), 985(2017).
  35. Li, Z., et al. Asymmetric distribution of parental h3k9me3 in s phase silences l1 elements. Nature. 623 (7987), 643-651 (2023).
  36. Kanev, P. B., Atemin, A., Stoynov, S., Aleksandrov, R. Parp1 roles in DNA repair and DNA replication: The basi(c)s of parp inhibitor efficacy and resistance. Semin Oncol. 51 (1-2), 2-18 (2023).
  37. Hanzlikova, H., et al. The importance of poly(adp-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication. Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BrdU MNase

مقالات ذات صلة