يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

خط أنابيب شامل لتقييم كفاءة تكون الكريات الحمراء البشرية في المختبر وخارج الجسم الحي

1.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67123

⸱

يناير 10, 2025

 ,  , 
1Centre de Lutte contre le cancer Eugène Marquis, INSERM U1242, University of Rennes, 2Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

في هذه المقالة

ملخص

توفر نمذجة تكون الكريات الحمراء فرصة ثمينة لفهم الأهمية البيولوجية للجهات الفاعلة في هذه العملية وتقييم الأساليب العلاجية الجديدة التي قد تخفف من عيوب التمايز. هنا ، نصف طريقة بسيطة وموثوقة للتمييز بكفاءة بين الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية من الجسم الحي.

الملخص

تكون الكريات الحمر ، وهي عملية ديناميكية وفعالة بشكل ملحوظ مسؤولة عن توليد الحصة اليومية لخلايا الدم الحمراء (حوالي 280 ± 20 مليار خلية يوميا) ، أمر بالغ الأهمية للحفاظ على صحة الفرد. يمكن أن يكون لأي اضطراب في هذا المسار عواقب وخيمة ، مما يؤدي إلى مشاكل صحية. وفقا لمنظمة الصحة العالمية ، يعاني ما يقدر بنحو 25٪ من سكان العالم من أعراض فقر الدم. يصف هذا البروتوكول كيفية توليد خلايا الكريثرويد البشرية في المختبر باستخدام الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية (HSPCs) من مصادر مثل دم الحبل السري (UCB) أو الدم المأخوذ من متبرعين أصحاء وخارج الجسم الحي مع HSPCs المعزولة من نخاع عظم المرضى. باستخدام النهج الجيني ، يمكن تعديل الجينات ذات الأهمية في HSPCs ، ويمكن مراقبة تأثيرها على تكون الكريات الحمراء في مراحل مختلفة من عملية التمايز. تسمح هذه الطريقة بفحص المركبات التي تزعج أو تعزز أو تنقذ قدرة HSPCs على التمايز إلى خلايا كريثرويد الكريات الحمراء الناضجة والتحقيق في دور الجينات ذات الأهمية أثناء عملية تمايز الكريات الحمراء.

المقدمة

يتم إنتاج حوالي 280 مليار خلية دم حمراء يوميا في نخاع العظام لضمان نقل الأكسجين في جميع أنحاء الجسم1. تكون الكريات الحمراء هي عملية تمايز مضبوطة بدقة تنتج خلايا دم حمراء ناضجة ووظيفية من الخلايا الجذعية المكونة للدم. يمكن أن تؤثر العديد من الأمراض ، المكتسبة والخلقية ، على هذه العملية ، بما في ذلك متلازمة خلل التنسج النقوي وفقر الدم اللاتنسجي والثلاسيميا وفقر الدم الخلقي2.

المظهر السريري لتكون الكريات الحمراء المتقطعة هو فقر الدم ، وهو سبب رئيسي للمراضة في جميع أنحاء العالم. تتراوح أعراض فقر الدم من التعب وضيق التنفس والدوخة إلى الحالات التي تهدد الحياة ، مثل قصور القلب والسكتةالقلبية 3. مع تأثير فقر الدم على 1.8 مليار شخص في جميع أنحاءالعالم 4 ، تظل نمذجة تكون الكريات الحمراء خارج الجسم الحي من أجل التحقيق في هذه الحالات وآلياتها الكامنة وراء أولوية عالمية. تهدف الطريقة الموضحة هنا إلى توفير نموذج بسيط وقوي لدراسة كل من تمايز الكريات الحمراء السليمة والمريضة. يسمح هذا النموذج بتشريح أدوار جينات معينة في هذه العملية ويتيح اختبار المركبات التي يمكن أن تفيد مرضى فقر الدم. تاريخيا ، واجهت نمذجة تكون الكريات الحمراء غير الفعالة العديد من التحديات ، بما في ذلك ندرة الخلايا الجذعية في بعض نخاع العظام المريضة وصعوبات في تقليد مكانة نخاع العظم.

استخدمت الدراسات السابقة بروتوكولات مماثلة أو أكثر تعقيدا. على سبيل المثال ، Bondu et al. استخدم مزيجا من السيتوكينات بما في ذلك الإريثروبويتين (EPO) ، وعامل الخلايا الجذعية (SCF) ، والإنترلوكين -6 (IL6) لمدة 4 أيام قبل إزالة IL6 من كوكتيل تمايز الكريات الحمراء ، على النقيض من ذلك ، Yip et al. أضاف EPO فقط إلى كوكتيل السيتوكينات بعد 7 أيام من الثقافة السائلة. طور Elvarsdóttir et al. نموذج ثقافة ثلاثي الأبعاد (3D) لخلايا CD34 + لتسهيل أعلى توسع ونضج لخلايا الكريات الحمراء ، بما في ذلك توليد جزر الأرومات الحمراء وكريات الدم الحمراء المنزوعة النواة ، والتي تعتبر مهمة لدراسة ظواهر مثل الأرومات الحديدية الحلقية5،6،7،8. يستخدم هذا البروتوكول ثلاثة سيتوكينات فقط عند توسيع الخلايا (على سبيل المثال ، SCF ، الثرومبوبويتين [TPO] ، والتيروزين كيناز الشبيه ب FMS 3 [FLT3]) وثلاثة سيتوكينات يتم الحفاظ عليها طوال عملية التمايز بأكملها (على سبيل المثال ، EPO و IGF1 و SCF). أحد المعايير الرئيسية المشتركة عبر هذه الدراسات المختلفة هو استخدام خلايا CD34 + . على الرغم من اختلاف أصل هذه الخلايا ، إلا أنها تستخدم باستمرار عبر هذه البروتوكولات المختلفة. قد تتراوح المصادر من الجمع غير الجراحي ل UCB إلى إجراءات أكثر توغلا للحصول على عينات نخاع العظم البالغة التي يمكن حصادها إما من المرضى المحفزين لعامل تحفيز مستعمرة الخلايا الحبيبية (G-CSF) أو ثقوب نخاع العظام. بشكل عام ، يتم نقل نماذج الاستزراع السائل على مدار 14 يوما ، بينما يمكن للنماذج ثلاثية الأبعاد الحفاظ على الخلايا لفترات أطول. هذه البروتوكولات ضرورية لنمذجة الأمراض الوراثية والاضطرابات في تكون الكريات الحمر. يمكن استخدام الأساليب الجينية ، مثل ضربة قاضية قصيرة من الحمض النووي الريبي (shRNA) ، لإسكات الجينات ذات الأهمية ودراسة أدوارها في تكون الكريات الحمر. يمكن بعد ذلك مراقبة تأثير إسكات الجينات في مراحل مختلفة من التمايز ، مما يوفر نموذجا بشريا خارج الجسم الحي لإنتاج خلايا الدم الحمراء لدراسة فقر الدم في كل من الصحة والمرض. يتضمن هذا البروتوكول نقل خلايا دم الحبل السري CD34 + باستخدام shRNA التي تعبر بشكل أساسي عن جين مراسل ، مثل بروتين التألق الأخضر المعزز (EGFP) ، مما يسمح بفرز العينات عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS). ثم يتم احتضان الخلايا في وسائط التمايز لمدة أسبوعين ومراقبتها عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي وتلوين الكيمياء المناعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت البحوث على العينات الأولية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية (مرجع REC: 21/EE/0133; معرف مشروع IRAS: 283103).

1. إنتاج فيروس العدسي

ملاحظة: يجب إنتاج فيروسات العدسات في مختبر بمستوى السلامة البيولوجية L2 في ظل ظروف معقمة. يجب ارتداء جميع معدات الوقاية الشخصية المطلوبة لهذا المختبر ، بما في ذلك القفازات المزدوجة. يتم تطهير المواد الملوثة بمطهر مبيد للفيروسات قبل التخلص منها في صندوق معقم. هنا ، يتم استخدام تدافع shRNA (التحكم) الذي يؤوي جين مراسل EGFP لتوضيح العملية.

اليوم 1

  1. يسخن الجيلاتين عند 37 درجة مئوية في حمام مائي حتى يذوب تماما. يخفف الجيلاتين بنسبة 0.1٪ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  2. قم بتغطية طبق 150 مم ب 2 مل من الجيلاتين 0.1٪. استخدم 2 أطباق لكل فيروس. احتضن الأطباق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. قم بزرع 5 ملايين خلية HEK293T لكل طبق مغطى بالجيلاتين في 20 مل من 10٪ من Dulbecko ′ Modified Eagle Medium (DMEM) وضع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية.

اليوم 2

  1. تأكد من أن الخلايا قد وصلت إلى حوالي 50٪ من التقاء. قم بتغيير الوسط ب 22 مل من 10٪ DMEM دون إزعاج طبقة الخلية قبل ساعتين من التعدين.
  2. تحضير مزيج التعداد.
    ملاحظة: يتم تحضير مزيج تعداء واحد لكل طبق ، حيث قد يؤثر الحجم الأكبر على تكوين راسب الكالسيوم والفوسفات.
    1. قم بإعداد مزيج التفاعل في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل على النحو التالي: 32 ميكروغرام من البلازميد ، 20 ميكروغرام من بلازميد PAX (pCMVdR8.74) ، 9 ميكروغرام من بلازميد VSVG (pMD.G2) ، ورفع الحجم إلى 1125 ميكرولتر باستخدام H2O.
    2. أضف 125 ميكرولتر من CaCl2 إلى التفاعل واحتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) على الأسطوانة.
    3. قم بإعداد 1.25 مل من 2x HEPES في أنبوب طرد مركزي منفصل سعة 15 مل.
    4. أضف 2x HEPES قطرة قطرة إلى خليط التفاعل أثناء الدوامة برفق ، ثم ضع الخليط على أسطوانة لمدة 10 دقائق في RT.
  3. قم بتوزيع التفاعل قطرة قطرة على الخلايا في نمط حلزوني وضع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية بعد تحريك اللوحة برفق بطريقة متقاطعة لتجانس الوسط.

اليوم 3

  1. قم بتغيير الوسط ب 16 مل من 10٪ DMEM دون إزعاج طبقة الخلية.

يوم 4

  1. اجمع المادة الطافية وخزنها في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل. أضف 16 مل من DMEM الطازج إلى كل طبق دون إزعاج طبقة الخلية.

اليوم 5

  1. اجمع المادة الطافية وتجمع مع المادة الطافية من اليوم 4. قم بالفلتر للتخلص من الحطام باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر.
  2. انقل كل 30 مل (اليوم 4 + اليوم 5) طافي في أنبوب مخروطي الشكل للطرد المركزي الفائق. أضف الأنابيب في دلو متأرجح ، مع محولات للقاع المخروطي إذا لزم الأمر.
  3. قم بموازنة الأنابيب وجها لوجه بدقة 0.02 جم وأجهزة الطرد المركزي الفائقة عند 90,000 × جم لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية.
  4. تخلص من المادة الطافية وأضف 200 ميكرولتر من وسط الخلايا الجذعية لكل أنبوب. أغلق الأنابيب باستخدام البارافيلم واحتضان الأنبوب في غرفة باردة لمدة 2-4 ساعات تحت التحريض.
  5. اصنع 20 ميكرولتر من كل فيروس وقم بتخزين القوارير عند -80 درجة مئوية. احتفظ ب 2 ميكرولتر من كل فيروس وأضف 400 ميكرولتر من DMEM.
    ملاحظة: سيتم استخدام هذا التخفيف للمعايرة بالتحليل الحجمي.

2. معايرة الفيروسات

ملاحظة: يجب التعامل مع فيروسات العدسات في مختبر بمستوى السلامة البيولوجية L2 في ظل ظروف معقمة. يجب ارتداء جميع معدات الوقاية الشخصية المطلوبة لهذا المختبر ، بما في ذلك القفازات المزدوجة. يتم تطهير المواد الملوثة بمطهر مبيد للفيروسات قبل التخلص منها في صندوق معقم.

  1. HEK293T البذور في طبق 24 بئر. أضف 50,000 خلية / بئر في 500 ميكرولتر من 10٪ DMEM.
    ملاحظة: استخدم 6 آبار لكل فيروس واحتفظ ببئر واحد للخلايا غير المنقولة.
  2. قم بإجراء التنبيغ. أضف الآبار المختلفة: 2 ميكرولتر ، 4 ميكرولتر ، 8 ميكرولتر ، 16 ميكرولتر ، 32 ميكرولتر ، 64 ميكرولتر من الفيروس المخفف من الخطوة 1.13. تجانس بلطف.
  3. قم بتغيير الوسط بعد 24 ساعة بإضافة 500 ميكرولتر من 10٪ DMEM.
  4. في اليوم 4 بعد التنبيغ ، قم بإعداد الخلايا لقياس التدفق الخلوي.
    1. تحضير عازلة FACS مع PBS ، مصل بقري الجنين 2٪ (FBS) ، 1٪ بنسلين ستربتومايسين (P / S) ، 2 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) و 1 / 2,000 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
    2. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS مباشرة باستخدام EDTA إلى كل بئر.
    3. افصل الخلايا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
  5. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر ونقلها في أنابيب FACS.
  6. تحديد النسبة المئوية لخلايا EGFP عن طريق قياس التدفق الخلوي.
  7. قم بإعداد البوابات التالية:
    1. قم بإعداد DAPI مقابل التشتت الجانبي (SSC-A) لاستبعاد الخلايا الميتة.
    2. قم بإعداد ارتفاع SSC (SSC-H) مقابل منطقة SSC (SSC-A) لاستبعاد مجاميع الخلايا وتحديد الخلايا الفردية.
    3. قم بإعداد منطقة التشتت الأمامي (FSC-A) مقابل SSC-A لبوابة الخلايا وإزالة الحطام بناء على الحجم.
    4. قم بإعداد بروتين التألق الأخضر (GFP) مقابل SSC-A لتحديد خلايا GFP + .
  8. معايرة الفيروس.
    1. احسب تركيز الجسيمات (عدد الجسيمات / مل) لكل حالة:
    2. خلايا EGFP × فيروس عامل التخفيف (200) × عدد الخلايا المصنفة x1000) / حجم الفيروس.
      ملاحظة: على سبيل المثال ، عولجت الخلايا ب 64 ميكرولتر من الفيروس المخفف عند 1/200. بعد تحليل قياس التدفق الخلوي ، كانت 54٪ من الخلايا EGFP +. في هذه الظروف ، سيكون العيار (54٪ × 200 × 50 000 × 1000) / 64 = 8.44 × 107 جسيمات / مل.

3. تحويل خلايا CD34 + المعزولة من دم الحبل السري

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الجزء في ظل ظروف معقمة. هنا ، يتم تحويل خلايا CD34 + UCB (النقاء >85٪) مع shRNA واحد (تحكم) يؤوي محضر eGFP. يتم إجراء التجربة بثلاث نسخ مكررة تقنية. يجب تعديل النسبة حسب عدد العينات.

اليوم 1

  1. قم بإعداد الوسائط والمخزن المؤقت التاليين:
    1. تحضير وسط إزالة الجليد: FBS مكمل بنسبة 1٪ P / S و 10 ميكروغرام / مل DNAse
    2. تحضير المخزن المؤقت FACS: PBS مكمل بنسبة 1٪ P / S و 2٪ FBS (± 10 ميكروغرام / مل DNAse)
    3. تحضير وسائط التحفيز (في وسط الخلايا الجذعية) بإضافة 150 نانوغرام / مل SCF ، 150 نانوغرام / مل FLT-3 ، 10 نانوغرام / مل IL-6 ، 25 نانوغرام / مل G-CSF ، 20 نانوغرام / مل TPO ، و 1٪ HEPES.
  2. قم بإذابة 100,000 خلية CD34 + UCB عن طريق الغمس لمدة 30 ثانية في الحمام المائي عند 37 درجة مئوية. أضف 1 مل من وسط إزالة الجليد بالتنقيط إلى كل قارورة ثم أعد تعليقها برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
  3. انقل تعليق الخلية قطرة قطرة في ما مجموعه 5 مل وسط إزالة الجليد برفق.
    ملاحظة: لتجنب فقدان الخلايا ، احتفظ بكمية 2 مل من وسط إزالة الجليد جانبا والتي سيتم استخدامها في النهاية لغسل الطرف والقارورة.
  4. جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 320 × جم عند RT. اغسل الخلايا في 10 مل من المخزن المؤقت FACS + DNAse.
  5. جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 320 × جم في RT. أعد تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من وسائط التحفيز (طرف الغسيل والأنبوب مع وسط التحفيز).
  6. عد الخلايا باستخدام 5 ميكرولتر من تعليق الخلية و 5 ميكرولتر من التريبان الأزرق.
    ملاحظة: استهدف 75,000 خلية كحد أدنى (25,000 خلية / حالة).
  7. انقل 2 مل من تعليق الخلية إلى صفيحة 24 بئرا واحتضانها لمدة ≥4-6 ساعات عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم زرع جميع الخلايا (75,000-100,000) في بئر واحد في هذه الخطوة.
  8. اجمع الخلايا في أنابيب FACS وقم بتعبئتها ب 1 مل من وسط الخلايا الجذعية. جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 320 × جم عند RT.
  9. قم بإذابة الفيروس وأضف الحجم المطلوب إلى وسائط التحفيز بتعدد العدوى (MOI) 30.
  10. أعد تعليق الخلايا المحببة في وسائط تحتوي على فيروسات عند 100,000 خلية لكل 100 ميكرولتر من الفيروس في بئر واحد من صفيحة 96 بئرا. أضف PBS إلى الآبار الفارغة واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

اليوم 2

  1. تحضير وسط التمدد (في وسط الخلايا الجذعية) بإضافة 150 نانوغرام / مل SCF و 150 نانوغرام / مل FLT3-L و 20 نانوغرام / مل TPO.
  2. أضف الحجم الكامل لتعليق الخلية من بئر اللوحة المكونة من 96 بئرا إلى أنابيب FACS مع 1 مل من وسط الخلايا الجذعية. اغسل البئر والطرف بوسط الخلايا الجذعية ، مما يؤدي إلى إضافة 2 مل من وسط الخلايا الجذعية إلى تعليق الخلية في أنبوب FACS.
  3. جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 320 × جم عند RT.
  4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من وسائط التمدد. أضف معلق الخلية إلى بئر 24 بئر (اغسل البئر وقم بطرفه في العملية للحصول على إجمالي 2 مل). احتضان الخلايا لمدة 4 أيام عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: ثم يتم إجراء فرز الخلايا في اليوم 7.

4. CD34 + EGFP + فرز الخلايا وتمايز الكريات الحمراء

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الجزء في ظل ظروف معقمة.

  1. قم بإعداد الوسائط والمخزن المؤقت التاليين.
    ملاحظة: يجب تحضير الوسائط التي تحتوي على السيتوكينات طازجة:
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت FACS عن طريق استكمال PBS بنسبة 1٪ P / S و 2٪ FBS.
    2. تحضير وسائط التمدد (في وسط الخلايا الجذعية) بإضافة 150 نانوغرام / مل SCF و 150 نانوغرام / مل FLT3-L و 20 نانوغرام / مل TPO.
    3. تحضير وسائط تمايز كريات الدم الحمراء (في وسط الخلايا الجذعية) بإضافة 25 نانوغرام / مل SCF و 3 U / مل EPO و 50 نانوغرام / مل IGF1.
    4. قم بإعداد 2x وسائط تمايز كريات الدم الحمراء (في وسط الخلايا الجذعية) عن طريق إضافة 50 نانوغرام / مل SCF و 6 U / مل EPO و 100 نانوغرام / مل IGF1.
  2. أضف الحجم الكامل للخلايا إلى أنبوب FACS منفصل (اغسل البئر وقم بطرفه في العملية بوسط الخلايا الجذعية). جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 320 × جم عند RT. قم بإعادة تعليق الخلايا المحببة في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
  3. أضف 5 ميكرولتر من CD34 Ab / أنبوب واحتضنه في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
  4. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت FACS باستخدام DAPI (تخفيف 1/2000 في المخزن المؤقت FACS) وجهاز الطرد المركزي لمدة 8 دقائق عند 320 × جم عند RT.
  5. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS باستخدام DAPI (تخفيف 1/2000 في المخزن المؤقت FACS) وقم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر قبل الفرز.
  6. تحضير الخرزات للتحكم:
    1. أضف 0.5 ميكرولتر من الجسم المضاد CD34 (Ab) إلى قطرة واحدة من الخرز في 100 ميكرولتر من PBS واحتضانها في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
    2. أضف 1 مل من PBS. جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 320 × جم في RT. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS.
  7. تحضير خطوط خلايا اللوكيميا للتحكم في GFP.
    ملاحظة: استخدم أي خط خلوي GFP + متاح كعنصر تحكم. يمكن استخدام الخرز بدلا من ذلك.
    1. أضف خلايا GFP (2 أنابيب FACS مع 100,000 خلية) و GFP + (1 أنبوب FACS مع 100,000 خلية) في أنبوب FACS.
      ملاحظة: ما مجموعه 3 أنابيب.
    2. اغسل الخلايا في 1 مل من محلول FACS. جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 320 × جم عند RT.
    3. أعد تعليق 100,000 خلية GFP في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS (غير ملوث) ، و 100,000 خلية GFP في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS مع DAPI (تخفيف 1/2000 في المخزن المؤقت FACS) (صبغ DAPI) ، و 100,000 من خلايا GFP + في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS (خلايا GFP + ).
      ملاحظة: سيتم استخدام أنابيب التحكم لإعدادات البوابات والتعويض في مقياس التدفق الخلوي. إذا كانت الخلايا المستخدمة هي 100٪ GFP ، فيمكن إضافة خلايا GFP إلى الأنبوب (50,000 خلية GFP و 50,000 خلية GFP +).
    4. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر قبل الفرز.
  8. قم بإعداد البوابات التالية:
    1. قم بإعداد DAPI مقابل التشتت الجانبي (SSC-A) لاستبعاد الخلايا الميتة.
    2. قم بإعداد ارتفاع SSC مقابل منطقة SSC (SSC-A) لاستبعاد مجمعات الخلايا وتحديد الخلايا الفردية.
    3. قم بإعداد منطقة التشتت الأمامي (FSC-A) مقابل SSC-A لإزالة الحطام بناء على الحجم.
    4. قم بإعداد GFP مقابل SSC-A لتحديد خلايا GFP+ .
    5. قم بإعداد CD34 (PerCP-Cy5.5) مقابل SSC-A لتحديد خلايا CD34+ .
  9. اقلب أنبوب FACS للتجميع قبل تجميع الخلايا لتغطية جدران الأنبوب باستخدام FBS.
  10. اجمع الخلايا في وسط الخلايا الجذعية.
    ملاحظة: استهدف 75,000-80,000 خلية (25,000 خلية × 3)
  11. جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 320 × جم في RT وإعادة تعليق الخلايا في 3 مل من وسائط تمايز الكريات الحمراء.
  12. قم بتعليق ثم توزيع 1 مل لكل بئر في 3 آبار من صفيحة 24 بئر. املأ جميع الآبار الخارجية ببرنامج تلفزيوني.
  13. قم بإجراء نصف استنفاد للوسائط كل يومين واستبدلها بوسيط تمايز كريات الدم الحمراء 2x.
    1. لتحديث الوسائط ، تأكد من استقرار الخلايا في الجزء السفلي من اللوحة. قم بإمالة الطبق برفق وأخرج 500 ميكرولتر من الوسائط.
    2. قم بالتحديث عن طريق إضافة 500 ميكرولتر باستخدام وسيط تمايز كريات الكريات الحمراء 2x.
    3. انقل الخلايا في اليوم 6 إلى طبق 12 بئر وأضف 1 مل من الوسائط لعمل حجم نهائي يبلغ 2 مل.

5. تحليل تمايز الكريات الحمراء عن طريق قياس التدفق الخلوي مرتين في الأسبوع من اليوم 6 حتى اليوم 14

  1. قم بإعداد الوسائط والمخزن المؤقت التاليين.
    1. إعداد المخزن المؤقت FACS عن طريق استكمال PBS بنسبة 1٪ P / S و 2٪ FBS
    2. تحضير وسائط تمايز كريات الدم الحمراء (في وسط الخلايا الجذعية) بإضافة 25 نانوغرام / مل SCF و 3 U / مل EPO و 50 نانوغرام / مل IGF1.
  2. اجمع 200 ميكرولتر خلية من كل بئر من صفيحة 12 بئر واستبدلها ب 250 ميكرولتر من وسائط تمايز الكريات الحمراء 2x. أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب.
  3. جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 320 × جم عند RT. قم بإعادة تعليق الخلايا المحببة في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
  4. أضف 1 ميكرولتر من CD71 Ab (1/100) ، و 1 ميكرولتر من CD34 Ab (1/100) ، و 1 ميكرولتر من CD235a Ab (1/100) واحتضنه في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
  5. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت FACS باستخدام DAPI (تخفيف 1/2000 في المخزن المؤقت FACS). جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 320 × جم عند RT.
  6. قم بإعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS باستخدام DAPI (تخفيف 1/2000 في المخزن المؤقت FACS).
  7. تحضير الخرزات للتحكم:
    1. أضف 1 حبة تعويض قطرة إلى أنبوبين في 100 ميكرولتر من PBS ثم أضف 0.55 ميكرولتر من جسم مضاد واحد إلى كل أنبوب لعمل عناصر تحكم في البقع الفردية (واحد ل CD34 ، وواحد ل CD71 ، وواحد ل CD235a).
      ملاحظة: 1 قطرة كافية لكلا التحكمين.
    2. احتضن في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. أضف 1 مل من PBS.
    3. جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 320 × جم في RT. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS.
  8. قم بإعداد خط خلايا سرطان الدم للتحكم.
    ملاحظة: تعبر خلايا K562 عن علامة CD71 ويمكن استخدامها كعنصر تحكم إيجابي لإعداد FACS.
    1. أضف خلايا GFP (2 أنابيب FACS مع 100,000 خلية) و GFP + (1 أنبوب FACS مع 100,000 خلية) في أنبوب FACS.
    2. اغسل الخلايا في 1 مل من محلول FACS. جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 320 × جم عند RT.
    3. قم بإعادة تعليق 100,000 خلية GFP في المخزن المؤقت FACS (غير ملطخ) ، و 100,000 GFP - خلية في المخزن المؤقت FACS مع DAPI (تخفيف 1/2000 في المخزن المؤقت FACS) (ملطخ ب DAPI) ، و 100,000 خلية GFP + في المخزن المؤقت FACS (خلايا GFP + ).
  9. قم بإعداد البوابات التالية:
    1. قم بإعداد DAPI مقابل التشتت الجانبي (SSC-A) لاستبعاد الخلايا الميتة.
    2. قم بإعداد ارتفاع SSC مقابل منطقة SSC (SSC-A) لاستبعاد مجمعات الخلايا وتحديد الخلايا الفردية.
    3. قم بإعداد منطقة التشتت الأمامي (FSC-A) مقابل SSC-A لإزالة الحطام بناء على الحجم.
    4. قم بإعداد CD235a (APC-Cy7) مقابل CD71 (PE).
    5. قم بإعداد CD34 (PerCP-Cy5.5) مقابل SSC-A.
  10. قم بتشغيل عينة من خلايا GFP غير الملوثة والخلايا الملطخة بالكامل من أجل ضبط الفولتية بحيث تجلس الخلايا في المكان الصحيح.
  11. قم بتشغيل الخرز وخلايا GFP + والخلايا الملطخة ب DAPI. تعويض وتطبيق التعويض على إعدادات مقياس الخلويات.
  12. قم بتشغيل العينات وتسجيل الأحداث.

6. تحليل تمايز الكريثرويد بواسطة تلطيخ Giemsa

  1. تحضير 5 برطمانات تلطيخ شرائح:
    1. قم بإعداد برطمان تلطيخ منزلق باستخدام محلول الأيزين الميثيلين الأزرق 1: 1 من May-Grünwald و PBS.
    2. قم بإعداد برطمان تلطيخ منزلق مع 2.5 مل من مخزون Giemsa + 50 مل من PBS.
    3. تحضير جرة تلطيخ منزلق بالماء المقطر.
    4. تحضير جرة تلطيخ منزلق مع PBS.
    5. قم بإعداد جرة تلطيخ منزلقة بالميثانول البارد المثلج.
  2. اجمع 100,000 خلية للحصول على تلطيخ مثالي ، وأضف 1 مل من PBS ، وجهاز طرد مركزي 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  3. تخلص من الوسط وأعد تعليقه في 150 ميكرولتر من PBS.
  4. قم بإعداد الشرائح وورق الترشيح والمحول المخروطي في جهاز طرد خلوي وإسقاط تحضير الخلية ببطء في المحول المخروطي.
  5. تدور في 800 × جم لمدة 3 دقائق. قم بإزالة الشرائح وضعها في وعاء شريحة الميثانول في الثلج لمدة 15 دقيقة.
  6. اغمر الشرائح في محلول May-Grünwald لمدة 5 دقائق وحرك من حين لآخر لضمان التلوين المناسب.
  7. بعد ذلك ، اغمر الشرائح في جرة PBS حتى تختفي البقعة.
  8. اغمر الشرائح في محلول Giemsa لمدة 20 دقيقة وحرك من حين لآخر لضمان التلوين المناسب.
  9. اغمر الشرائح بعناية مع PBS حتى تختفي البقعة.
  10. اسمح للشرائح بالبقاء في PBS لمدة 3 دقائق إضافية.
  11. اغمر الشرائح بسرعة في الماء المقطر وجففها بالهواء في RT.
  12. أضف قطرة من الراتنج الصناعي على كل بقعة من الخلايا وأضف غطاء برفق في الأعلى.
  13. اترك الشرائح تجف لمدة 1 ساعة في RT وأغلق الغطاء بطلاء الأظافر لمنع انزلاق التجفيف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم أولا إذابة خلايا CD34 + من دم الحبل السري أو نخاع العظم وتحفيزها ونقلها باستخدام shRNA الذي يعبر عن GFP (الشكل 1 أ). يتم فرز خلايا CD34 + GFP + بعد 4 أيام من التنبيغ ، وفقا لاستراتيجية البوابة الموضحة في الشكل 1 ب. أظهرت النتائج التمثيلية نضوج خلايا CD34 + بعد التنبيغ وفرز FACS. يتم تحليل الخلايا (1) عن طريق قياس التدفق الخلوي في مراحل مختلفة من النضج ، باستخدام تلطيخ CD71 / CD235a9،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا ، وصفنا طريقة فعالة وموثوقة للحث على تمايز الكريات الحمراء للخلايا الجذعية المكونة للدم CD34 + (HSPCs) المعزولة إما من نخاع العظم البالغ (BM) أو من دم الحبل السري (UCB). يتضمن خط الأنابيب هذا تحرير / تعديل الخلايا الأولية للتحقيق في وظيفة أي جين ذي أهمية أثناء عملية تمايز الكريات الحمراء. تم استخدام هذه الطريقة بنجاح للتحقيق في الأهمية الوظيفية للجينات التي لم تكن مرتبطة سابقا بتمايز الكريات الحمراء12،13،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

CP و SB و K.RP. تم دعمها من قبل برنامج HARP ، و Barts Charity (G-002167) ، وصندوق Kay Kendall Leukaemia (KKL1149) وأكاديمية العلوم الطبية (SBF004 \ 1099). نشكر الدكتور بانتيليتسا بروتوبابا على تلطيخ MGG والاستحواذ على الفحص المجهري. نعترف أيضا بقياس التدفق الخلوي ومرافق الفحص المجهري لمعهد بارتس للسرطان ، جامعة كوين ماري في لندن. نشكر مؤسسة أنتوني نولان الخيرية في المملكة المتحدة لتزويدنا بوحدات دم الحبل السري المستخدمة في هذه المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2x HEPESMerck51558
الخرزالحراري العلمي01-2222-42
CD235a APC Cy7Biolegend349115
CD34 PerCP Cy5.5 الجسم المضادBD Biosciences347222
CD71 PE الجسم المضادBiolegend334106
DAPIMerckD9542
DMEMThermo Scientific41966-029
DNAseMerckD4527-200KU
DPX تصاعد متوسط VWR1.00579.0500
FACSAria Fusion BD BiosciencesNA
FBSMerckF9665
الجيلاتينMerckG1393
Giemsa solutionAbcamab150670
HEPESMerckH0887-100mL
Human EPOPeproTech100-64
Human Flt-3 ligandPeproTech300-19
الإنسان G-CSFPeproTech300-23
البشري IGF1PeproTech100-11
البشري IL-6PeproTech200-06
الإنسان SCFPeproTech300-07
الإنسان TPOPeproTechAF-300-18
LSRFortessa محلل الخلاياBD BiosciencesNA
May-Grunwald الحل Generon26250-01
Pannoramic 250 ماسح ضوئي عالي الإنتاجية 3DHISTECHNA
البنسلين / الستربتومايسينالحرارية العلمية15140-122
شاندون سيتوسبين 3   ؛للخلايا الجذعية الحرارية العلمية
NA 9655
تقنيات الخلايا الجذعية المتوسطة المتوسطة

المراجع

  1. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nat Med. 27 (1), 45-48 (2021).
  2. Cazzola, M. Ineffective erythropoiesis and its treatment. Blood. 139 (16), 2460-2470 (2022).
  3. Silverberg, D. S., Iaina, A., Wexler, D., Blum, M. The pathological consequences of anaemia. Clin Lab Haematol. 23 (1), 1-6 (2001).
  4. Safiri, S., et al. Burden of anemia and its underlying causes in 204 countries and territories, 1990-2019: results from the Global Burden of Disease Study 2019. J Hematol Oncol. 14 (1), 185(2021).
  5. Bondu, S., et al. A variant erythroferrone disrupts iron homeostasis in SF3B1-mutated myelodysplastic syndrome. Sci Transl Med. 11 (500), eaav5467(2019).
  6. Elvarsdottir, E. M., et al. A three-dimensional in vitro model of erythropoiesis recapitulates erythroid failure in myelodysplastic syndromes. Leukemia. 34 (1), 271-282 (2020).
  7. Yip, B. H., et al. Effects of L-leucine in 5q- syndrome and other RPS14-deficient erythroblasts. Leukemia. 26 (9), 2154-2158 (2012).
  8. Clough, C. A., et al. Coordinated missplicing of TMEM14C and ABCB7 causes ring sideroblast formation in SF3B1-mutant myelodysplastic syndrome. Blood. 139 (13), 2038-2049 (2022).
  9. Chao, R., Gong, X., Wang, L., Wang, P., Wang, Y. CD71(high) population represents primitive erythroblasts derived from mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 30-38 (2015).
  10. Loken, M. R., Shah, V. O., Dattilio, K. L., Civin, C. I. Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development. Blood. 69 (1), 255-263 (1987).
  11. Marsee, D. K., Pinkus, G. S., Yu, H. CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens. Am J Clin Pathol. 134 (3), 429-435 (2010).
  12. Berastegui, N., et al. The transcription factor DDIT3 is a potential driver of dyserythropoiesis in myelodysplastic syndromes. Nat Commun. 13 (1), 7619(2022).
  13. Mian, S. A., et al. Vitamin B5 and succinyl-CoA improve ineffective erythropoiesis in SF3B1-mutated myelodysplasia. Sci Transl Med. 15 (685), eabn5135(2023).
  14. Armes, H., et al. Germline ERCC excision repair 6 like 2 (ERCC6L2) mutations lead to impaired erythropoiesis and reshaping of the bone marrow microenvironment. Br J Haematol. 199 (5), 754-764 (2022).
  15. Hug, N., et al. A dual role for the RNA helicase DHX34 in NMD and pre-mRNA splicing and its function in hematopoietic differentiation. RNA. 28 (9), 1224-1238 (2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CD34 V
خط أنابيب شامل لتقييم كفاءة تكون الكريات الحمراء البشرية في المختبر وخارج الجسم الحي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.