Method Article

تقدير الجلوكوز Bergmeyer للعينات الميكروبيولوجية

DOI:

10.3791/67126

⸱

January 17th, 2025

 ,  ,  , 
1Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Morelia, 2Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدير الجلوكوز Bergmeyer هو تقنية إنزيمية طيفية تستخدم بشكل أساسي في الاختبارات السريرية التي تقيس كمية الجلوكوز بدقة وحساسية. هنا ، نقدم بروتوكولا لاستخدام هذه الطريقة للعينات الميكروبيولوجية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تركيز الجلوكوز مؤشرا رئيسيا على التمثيل الغذائي الخلوي ويمكن أن يشير إلى معدل التمثيل الغذائي الكلي ، والانحراف في استقلاب الجلوكوز ، وفي بعض الحالات ، كيف تقوم الخلايا بإقران استقلاب الجلوكوز في التمثيل الغذائي النشط. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مستويات الجلوكوز داخل الخلايا وخارجها تدل على حالة التمثيل الغذائي الخلوي. تعتبر التقنيات الأنزيمية ، مثل قياس الجلوكوز في بيرجماير ، أكثر دقة وحساسية من التقنيات الأخرى ، مثل حمض ثنائي النيتروساليسيليك أو طرق التألق ، والتي تستخدم عادة في علم الأحياء الدقيقة. على الرغم من استخدامه بشكل أساسي في المجال السريري ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيق قياس الجلوكوز في بيرغماير على أي خلية ولكن لم يتم الإبلاغ عنه بالتفصيل للبكتيريا أو الفطريات أو الخمائر أو الكائنات الحية الدقيقة الأخرى.

هنا ، نقدم منهجية لقياس الجلوكوز من عينات البكتيريا والخميرة باستخدام طريقة قياس الجلوكوز الأنزيمي Bergmeyer. تضمن الإجراء إنزيمات الجلوكوز أوكسيديز والبيروكسيداز وثنائي هيدروكلوريد أو ديانيسيدين محضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، تليها إضافة حمض الكبريتيك. ثم يتم قياس الامتصاص عند 545 نانومتر. من المهم تسليط الضوء على أنه على الرغم من أن هذه التقنية تمثل صعوبات في قياس التركيزات العالية من الجلوكوز (فوق 60 جم / لتر) ، فمن الممكن قياس التركيزات التي تقل عن 50 جم / لتر باستخدام عوامل التخفيف. هذا النهج الأنزيمي ذو قيمة للبحث والتحليل في علم الأحياء الدقيقة والمجالات العلمية الأخرى. إن دقة وحساسية الطريقة تجعلها مفيدة في الكشف عن التركيزات المنخفضة من الجلوكوز في العينات الميكروبيولوجية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعمل الجلوكوز كمصدر أساسي للطاقة والكربون للعديد من الكائنات الحية الدقيقة ، بما في ذلك البكتيريا والخمائر والفطريات. تمتص هذه الكائنات الحية الدقيقة الجلوكوز من خلال الناقلات الموجودة على الغشاء خارج الخلية ، حيث تخضع لسلسلة من التفاعلات الكيميائية الحيوية داخل مسار التمثيل الغذائي لتحلل السكر ليتم تحويلها إلى بيروفات1. هناك تقنيات مختلفة لقياس كمية السكريات المختزلة مثل الجلوكوز. على سبيل المثال ، يمكن استخدام كاشف بنديكت2 ، أو استخدام 3،5-dinitrosalicylic acid (DNS) 3،4 ، أو طريقة الأنثرونا5 ، أو طرق حمض الفينول والكبريتيك6 . ومع ذلك ، فإن هذه الطرق تكتشف أي سكر مختزل موجود في العينة ، مثل الفركتوز والمالتوز ، والتي يمكن أن تساهم في الإشارة وتعقد القياس الكمي الدقيق لسكر معين.

بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تتطلب تحكما صارما في درجة الحرارة والتعامل مع المواد الخطرة ، مما قد يعقد العملية ويؤثر على الدقة. يمكن أن تعاني هذه الطرق أيضا من تداخل المركبات الأخرى الموجودة في العينة ، مما يجعل القياس الكمي الدقيق للجلوكوز أمرا صعبا. على العكس من ذلك ، يوفر الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) بديلا أكثر دقة ، مما يسمح بالتمييز بين الجلوكوز والسكريات المختزلة الأخرى ، وإن كان ذلك بتكاليف تشغيلية أعلى. تسلط هذه الأساليب المتناقضة الضوء على الحاجة المستمرة لتطوير تقنيات قياس كمية الجلوكوز دقيقة وفعالة من حيثالتكلفة 7.

تستخدم طريقة الجلوكوز أوكسيديز - بيروكسيداز - حمض الكبريتيك (GOX-H2SO4) إنزيمين ، الجلوكوز أوكسيديز (GOD) والبيروكسيداز (POD). الله هو إنزيم أوكسيديودوكتاز انتقائي للغاية لأكسدة β-D-glucose8. يعمل هذا المركب كمحفز أثناء التفاعل الذي يحدث عندما يكون الجلوكوز في وجود الأكسجين ، وينتج حمض الجلوكونيك وبيروكسيد الهيدروجين (H2O2). يتم الكشف عن H2O2 عن طريق متقبل الأكسجين الكروموجينيك ، o-dianisidine ، والذي ، عند التفاعل مع POD ، يتسبب في أكسدته وإطلاق H2O2 ، مما يمنع حمض الجلوكونيك من التحول مرة أخرى إلى جلوكوز (انظر الشكل 1). يتم تثبيت اللون الذي تم الحصول عليه عن طريق إضافة حمض الكبريتيك (H2SO4) ، والذي يوقف أيضا التفاعل الأنزيمي ، وبالتالي تجنب التداخل المحتمل الذي يمكن أن يحدث إذا استمر التفاعل9.

figure-introduction-1
الشكل 1: نظرة عامة على طريقة قياس الجلوكوز الكمي باستخدام إنزيم أوكسيديز الجلوكوز الذي يتفاعل مع الجلوكوز لإنتاج بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) وحمض الجلوكونيك. بعد ذلك ، يتفاعل إنزيم البيروكسيديز مع H2O2 في وجود O-dianisidine dihydrochloride. في الخطوة الأخيرة ، يضاف حمض الكبريتيك (H2SO4) لإيقاف التفاعل الأنزيمي ، مما ينتج عنه لون وردي يقاس عند 529 نانومتر. الاختصارات: POD = بيروكسيداز. الله = أوكسيديز الجلوكوز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الطريقة الأنزيمية GOX-H2SO4 هي تقنية تستخدم على نطاق واسع لقياس تركيز الجلوكوز في العينات البيولوجية ، ومعظمها ذو أهمية سريرية. ومع ذلك ، فقد بحثت دراسات قليلة في تقنية تسمح بتحديد كمية الجلوكوز في وسط النمو لتقييم استهلاكه. لذلك ، في هذا البروتوكول ، يتم تقديم منهجية تحديد كمية الجلوكوز عن طريق التفاعل الأنزيمي للجلوكوز أوكسيديز ، والبيروكسيداز ، و o-dianisidine dihydrochloride ، و H2SO4 في عينات السائل الميكروبيولوجية ، والتي تنشأ كتعديل للعمل الذي قام به Bergmeyer9 ، باستخدام 50٪ (v / v) H2SO4 وكميات أقل من الكواشف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الحل

  1. تحضير 100 مل من عازلة الفوسفات 0.1 M. تزن 1.28 جم من فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم (KH2PO4) و 0.1304 جم من فوسفات ثنائي البوتاسيوم (K2HPO4) وأضفهما إلى دورق زجاجي. الآن ، أضف 70 مل من الماء منزوع الأيونات (H2Odi) واضبط الرقم الهيدروجيني على 5.5 باستخدام 1 M حمض الهيدروكلوريك (HCl) أو هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH). انقل المحلول إلى قارورة حجمية واضبط الحجم النهائي على 100 مل. بعد ذلك ، انقل المحلول إلى حاوية كهرمانية وقم بتخزين المحلول في درجة حرارة 4-8 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
    تنبيه: ارتد قفازات النتريل طوال عملية التحضير لمنع ملامسة الجلد والتلوث المحتمل ، حيث يحتمل أن يكون o-dianisidine dihydrochloride مسببا للسرطان.
  2. تحضير محلول 1٪ وزن / حجم من o-dianisidine dihydrochloride. يزن 0.01 جم من o-dianisidine dihydrochloride ويوضع في أنبوب طرد مركزي سعة 2.0 مل. باستخدام ماصة دقيقة سعة 1,000 مل، أضف 1.0 مل من H2Odi لإذابة المركب، ثم اخلطه ببطء عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. احم المحلول من الضوء عن طريق لف الحاوية بورق الألمنيوم وتخزينها عند -20 درجة مئوية للحفاظ على الاستقرار.
    ملاحظة: لتسهيل دعم الأنبوب أثناء القياس على الميزان التحليلي، يمكن استخدام دورق سعة 10 مل كدعم إضافي. يساعد هذا على تثبيت الأنبوب، مما يضمن القياس الدقيق عن طريق تقليل مخاطر الإزاحة أو الإمالة التي يمكن أن تغير النتائج التي تم الحصول عليها على الميزان.
  3. في قارورة حجمية سعة 100 مل ، أضف 10 مل من محلول عازلة الفوسفات متبوعا ب 1 مل من محلول 1٪ v / v o-dianisidine dihydrochloride. بعد ذلك ، اضبط الحجم النهائي على 100 مل باستخدام مخزن الفوسفات للحصول على تركيز نهائي بنسبة 0.01٪ من خليط o-dianisidine-buffer. انقل المحلول إلى قارورة كهرمانية ولفه بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة 4-8 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3-4 أشهر.
    ملاحظة: التبريد ضروري لمنع التحلل ، مما قد يضر بسلامة القياسات التجريبية. لتجنب تدهور خليط o-dianisidine-buffer ، يمكن وضع جزء صغير من 13 مل (يكفي ل 12 عينة) في أنبوب بلاستيكي سعة 14 مل على الثلج حتى الاستخدام.
  4. تحضير محلول 50٪ H2SO4 . ضع قارورة حجمية سعة 100 مل مع 30 مل من H2Odi في حمام جليدي واتركها تبرد لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اسكب ببطء 51 مل من H2SO4 (98٪ حجم / حجم) أسفل جدران القارورة ، ورجها بعناية لتجانس المحلول. انتظر حتى يبرد الخليط ، لأن التفاعل طارد للحرارة (يولد الحرارة). اضبط الحجم النهائي على 100 مل باستخدام H2Odi وانقل المحلول إلى قارورة كهرمانية زجاجية.
    ملاحظة: استخدم غطاء الدخان واتبع جميع بروتوكولات السلامة ، تأكد من ارتداء معدات الحماية المناسبة. قم بإعداد 50 مل من محلول كربونات الكالسيوم بنسبة 40٪ لتحييد أي انسكابات محتملة قد تحدث.
  5. تحضير محلول أسيتات الصوديوم 50 ملي مولار عن طريق إذابة 0.04 جم من أسيتات الصوديوم في 5 مل من H2Odi في دورق اضبط الرقم الهيدروجيني على 5.1 باستخدام حمض الخليك الجليدي. أخيرا ، اضبط مستوى الصوت على 10 مل باستخدام H2Odi.

2. تحضير الإنزيمات

  1. في أنبوب دقيق معقم سعة 2.0 مل ، قم بوزن 0.01 جم من أوكسيديز الجلوكوز واخلطه مع 1 مل من أسيتات الصوديوم 50 ملي ، درجة الحموضة 5.0 ، للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 مجم / مل. قم بتغطية الأنبوب بورق الألمنيوم وتخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تخزين المحلول لمدة تصل إلى شهرين عند -20 درجة مئوية.
  2. احسب حجم محلول الإنزيم V2 المطلوب لتحقيق نشاط الإنزيم المطلوب في كل كوفيت بلاستيكي (بحجم إجمالي 1.5 مل) باستخدام المعادلة (1): V1C1 = V2C2 ، حيث V1 هو 1,500 ميكرولتر ، C1 هو 28.5 U من نشاط الإنزيم ، و C2 (تركيز محلول الإنزيم) هو 12,970 U / مل (10 مجم من الإنزيم [129,000 وحدة / جم] في 1 مل من H2Odi).
    V2 = (1,500 ميكرولتر × 28.5 U) / 12,970 U = 3.29 ميكرولتر (1)
    ملاحظة: للحصول على سحب أكثر دقة، يمكن تقريب القيمة إلى 3.3 ميكرولتر.
  3. في أنبوب صغير جديد سعة 2 مل ، قم بوزن 0.0031 جم من إنزيم البيروكسيديز وأضف 1 مل من محلول الفوسفات ، الرقم الهيدروجيني 5.5 ، لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 3.1 مجم / مل. قم بتغطية الأنبوب الدقيق بورق الألمنيوم وتخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  4. احسب حجم محلول البيروكسيديز المطلوب لتحقيق نشاط الإنزيم المطلوب لكل كوفيت باستخدام المعادل (1). ابدأ بحجم كوفيت إجمالي يبلغ 1,500 ميكرولتر ونشاط إنزيم مستهدف يبلغ 1.25 وحدة واحدة. بعد ذلك، حدد الحجم الضروري لمحلول الإنزيم، بالنظر إلى تركيزه البالغ 1,551 وحدة واحدة.
    V2 = (1,500 ميكرولتر × 1.25 U)/1,551 U = 1.208 ميكرولتر
    ملاحظة: للحصول على سحب ماصة أكثر دقة، تم تقريب القيمة إلى 1.20 ميكرولتر.

3. معيار الجلوكوز

  1. قم بإعداد معيار 1 جم / لتر D-glucose عن طريق إضافة 0.01 جم من D-glucose إلى 10 مل من H2Odi في قارورة حجمية. لتخفيف التركيز إلى 0.5 جم / لتر ، خذ 500 ميكرولتر من محلول المرق واخلطه مع 500 ميكرولتر من H2Odi لتحقيق حجم نهائي قدره 1 مل.
    ملاحظة: عملية التخفيف هذه ضرورية لإنشاء حلول قياسية دقيقة.

4. إعداد المنحنى القياسي

  1. باستخدام أنبوب دقيق جديد سعة 2 مل ، أضف المخزن المؤقت وأحجام الجلوكوز الموضحة في الجدول 1.
  2. اضبط الحمام الحراري الجاف على 37 درجة مئوية. بمجرد استقرار درجة الحرارة ، أضف 3.3 ميكرولتر من أوكسيديز الجلوكوز إلى جميع الأنابيب ثم أضف 1.2 ميكرولتر من البيروكسيديز إلى كل أنبوب. احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. بعد الحضانة ، أضف على الفور 750 ميكرولتر من 50٪ H2SO4 (v / v) إلى كل أنبوب دقيق واترك الخليط يبرد في حمام جليدي لمدة دقيقتين. ينتج عن هذا حجم نهائي يبلغ 1,500 ميكرولتر. أخيرا ، انقل المحلول إلى كوفيت بلاستيكي وقم بقياس الامتصاص عند 529 نانومتر.

الجدول 1: منحنى معايرة الجلوكوز لطريقة GOX-H2SO4 . الاختصارات: الله = أوكسيديز الجلوكوز. POD = بيروكسيداز. H2SO4 = حمض الكبريتيك. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

5. اختبار العينات الميكروبيولوجية

  1. احصل على العينة عن طريق زراعة البكتيريا أو الخميرة في وسط استزراع سائل في ظل ظروف محددة ، بما في ذلك درجة الحرارة وسرعة التحريك ووقت الحضانة. بمجرد أن تصل المزرعة إلى الكثافة الضوئية المطلوبة (OD) أو تركيز الخلية ، اجمع المزرعة لمزيد من المعالجة.
    ملاحظة: تم استزراع Pseudomonas reptilivora بسرعة تحريض ثابتة تبلغ 300 دورة في الدقيقة و 28 درجة مئوية ، بينما تم استزراع Debaryomyces hansenii بسرعة تحريك تبلغ 200 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية في شاكر مداري. في الحالة المحددة ل D. hansenii ، تم استخدام زيت الكانولا الصالح للأكل أيضا كمحفز لإنتاج الليباز.
  2. نظف منطقة العمل بمحلول كحول 70٪ أو عامل تنظيف مناسب وفقا لبروتوكولات السلامة البيولوجية. أشعل الموقد لضمان التعقيم.
  3. انقل 100 ميكرولتر من وسائط الاستزراع إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل أو 2 مل باستخدام أطراف معقمة.
  4. قم بالطرد المركزي للعينات عند 7,500 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية ، أو عند 10,000 × جم لمدة 7 دقائق دون التحكم في درجة الحرارة. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، والتي تحتوي على الجلوكوز في المحلول ، وتخلص من الحبيبات.
  5. استخدم 0.5 ميكرولتر من المادة الطافية لتركيزات الجلوكوز التي تتراوح من 1 إلى 20 جم / لتر ، ثم اخلطها مع 749.5 ميكرولتر من o-dianisidine-buffer ، و 3.3 ميكرولتر من GOD ، ثم 1.2 ميكرولتر من POD. احتضن الأنابيب الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، كما هو مفصل في الخطوة 4.2 وأضف على الفور 750 ميكرولتر من 50٪ H2SO4 واتركها تبرد في حمام جليدي لمدة دقيقتين.
    1. بالنسبة للتركيزات التي تزيد عن 20 جم / لتر ، قم بإجراء تخفيف 1: 1 باستخدام H2Odi المعقم قبل المتابعة.
    2. إذا تم تجميد عينات المواد الطافية مسبقا عند -80 درجة مئوية أو -20 درجة مئوية ، فقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة والدوامة لمدة 30 ثانية قبل الاستخدام. إذا كان التخفيف ضروريا ، فاستخدم H2Odi المعقم.
    3. بالنسبة للعينات التي تزيد تركيزات الجلوكوز عنها عن 30 جم / لتر ، قم بإجراء تخفيف 1: 1 باستخدام H2Odi المعقم ، مما ينتج عنه عامل تخفيف قدره 2.
  6. احسب إجمالي تركيز الجلوكوز في كل عينة باستخدام المعادلة (2) في برنامج جداول البيانات.
    figure-protocol-1(2)
    أين:
    x = تركيز الجلوكوز (جم / لتر) δ = حجم التفاعل النهائي (0.0015 لتر)
    y = الامتصاص MS = كمية العينة المستخدمة *
    ملاحظة: القيم b و m مأخوذة من المعادلة التي تصمم خط الاتجاه لمنحنى المعايرة للطريقة (y = mx + b). * يجب أن تستند قيمة MS إلى كمية العينة المستخدمة للحصول على النسبة عند التخفيف المقابل (على سبيل المثال ، إذا كنت تأخذ 0.5 ميكرولتر من المادة الطافية ، MS = 0.0000005 L = 0.5 × 10-6 L) ؛ إذا تم استخدام عامل التخفيف (DF) ، اضرب الامتصاص الذي تم الحصول عليه في محدد الأساس.
    على سبيل المثال ، إذا تم الحصول على امتصاص 0.5 واستعمل محدد تحديد الاتجاه 2 ، فستكون النتيجة 1.0. لذلك ، y = 1.0 ، ويجب إدخال هذه القيمة في المعادلة (2) ، كما هو موضح سابقا.

6. التحقق التحليلي

  1. احسب معلمات التحقق التحليلية لطريقة GOX-H2SO4 وفقا لما تم إنشاؤه من قبل المركز الوطني للمترولوجيا وكيان الاعتماد المكسيكي10 (CENAM-ema).
    1. احسب الدقة كنسبة مئوية من معامل التباين أو ٪ CV = (S / x) × 100 ، حيث x هو متوسط مجموعة العينة و S هو الانحراف المعياري بقيمة قبول ≤10٪.
    2. حدد الخطية عن طريق تركيب المنحنى القياسي للنموذج الخطي R2 أعلى من 0.995.
    3. احسب حد القياس الكمي (LOQ) باستخدام المعادلة: LOQ = yB + 10sB ، حيث يمثل yB تركيز التحليل الذي ينتج إشارة مكافئة للإشارة المستهدفة ، و 10sB يشير إلى 10x الانحراف المعياري للفراغ
    4. احسب الخطأ المنهجي باستخدام هذه المعادلة: الميل = x - m ، حيث x = متوسط التركيز التجريبي و m هو التركيز النظري.
    5. تحديد الدقة كدرجة الاتفاق بين القيمة الحقيقية والقيمة النظرية.
      الاسترداد ٪ = (CR / CV) × 100
      حيث CR هو متوسط التركيز التجريبي والسيرة الذاتية هي معامل تباين التركيز النظري.

7. التدخل من قبل السكريات المختزلة الأخرى

  1. قم بتقييم أربعة سكريات مختزلة بشكل منفصل: الجلوكوز والفركتوز والجالاكتوز والزيلوز من محلول مخزون 0.5 جم / لتر. بالإضافة إلى ذلك ، استخدم التريهالوز كعنصر تحكم سلبي. اتبع البروتوكول لجميع العينات وقم بقياس الامتصاص عند 545 و 529 نانومتر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كشف التحليل الطيفي الضوئي ل GOX-H2SO4 عن امتصاص أقصى واحد عند 529 نانومتر (λ كحد أقصى) (الشكل 2 أ) ، مع قيم امتصاص إضافية لوحظت عند 545 نانومتر. من خلال تحليل قيم الامتصاص بتركيزات الجلوكوز المختلفة ، حصلنا على خطية (R²) تبلغ 0.9977 ل λ529 نانومتر و R² من 0.9967 ل λ545 نانومتر (الشكل 2 ب). تشير الخطية ، ضمن نطاق معين ، إلى القدرة على تقديم نتائج تتناسب طرديا مع تركيز الجلوكوز في العينات. تم تقييم ذلك باستخدام معامل التحديد ، والذي يعكس ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد قياس الجلوكوز في وسط الاستزراع أمرا ضروريا لفهم النمو الميكروبي ونشاط التمثيل الغذائي ، حيث يعمل الجلوكوز كمصدر أساسي للطاقة للعديد من الكائنات الحية الدقيقة. في هذه الدراسة ، استخدمنا طريقة GOX-H2SO4 لقياس مستويات الجلوكوز بدقة في وسط الاستزراع ، بهدف تحسين العمليات الميكروبية في البكتيريا أو تخمير الخميرة. النتائج التي توصلنا إليها تتوافق مع تلك التي توصلنا إليها Yuen و McNeill11. ومع ذلك ، على عكسهم ، تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن ممتنون للتبرعات الجزئية من Tecnológico Nacional de México في دعوة 2023 و 2024 لتقديم مقترحات للبحث العلمي والتطوير التكنولوجي (16432.23-P y 19545.24-P). نود أن نشكر المجلس الوطني للعلوم الإنسانية والعلوم والتقنيات (CONAHCyT) على المنحة الدراسية التي حصلت عليها (رقم 832315) خلال دراسات الدكتوراه (IHRH) ، ونعرب عن امتناننا لمشاركة وتعاون Wendolyne Monroy-Martínez. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 مل أنبوب دقيقEppendorf-
2.0 مل أنبوب دقيقEppendorf-
CaCO3< / sub>Meyer471-34-1كربونات الكالسيوم
D-GlucoseMeyer50-99-7D-Glucose   ؛
DrybathFisherScientific11-718-4Serial 911NO251. كتلة العرض × العمق × الارتفاع مم / بوصة: 124 × 76 × 39 / 4.9 × 3.0 × 1.5
جلوكوز أوكسيديز إنزيمSigma AldrichG6125-50KU
H2< / sub>O-الماء منزوع الأيونات
H2< / sub>SO4< / sub>Meyer7664-93-9حمض الكبريتيك
HClماير7647-01-0حمض الهيدروكلوريدريك   ؛
K2< / sub>HPO4< / sub>Meyer7758-11-4فوسفات ثنائي البوتاسيوم
KH2< / sub>PO4< / sub>Meyer7778-77-0فوسفات أحادي البوتاسيوم
KOHMeyer1310-58-3هيدروكسيد البوتاسيوم
Lambda 35PerkinElmer-Spectrophotometer
Microtube أجهزة الطرد المركزي---
o-Dianisidine dihydrochlorideSigma AldrichD3252الكروموجينيك
بيروكسيدازSigma AldrichP8125-50KUمسحوق إنزيم
pH-meterHanna & nbsp ؛1131حنا 1170
أسيتات الصوديومماير127-09-3ماير
وزن الملاعق  ---
مسحوق

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, W. C., Tang, I. C. Bacterial and yeast cultures: process characteristics, products, and applications. Bioprocessing for value-added products from renewable resources. New Technologies and Applications. , Elsevier. 185-223 (2007).
  2. Hernandez-Lopez, A., et al. Quantification of reducing sugars based on the qualitative technique of Benedict. ACS Omega. 5 (50), 32403-32410 (2020).
  3. Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).
  4. Deshavath, N. N., Mukherjee, G., Goud, V. V., Veeranki, V. D., Sastri, C. V. Pitfalls in the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) assay for the reducing sugars: interference of furfural and 5-hydroxymethylfurfural. Int J Biol Macromol. 156, 180-185 (2020).
  5. De Abreu, J. R., Santos, C. D. D., De Abreu, C. M. P., Corrêa, A. D., De Oliveira Lima, L. C. Sugar fractionation and pectin content during the ripening of guava cv. Pedro Sato. Food Sci Technol. 32 (1), 156-162 (2020).
  6. Dubois, M., Gilles, K. -A., Hamilton, J. K., Roberts, P. A., Smith, F. A colorimetric method for the determination of sugars. Nature. 168 (4265), 167(1951).
  7. Gonzalez, N. M., Fitch, A., Al-Bazi, J. Development of a RP-HPLC method for determination of glucose in Shewanella oneidensis cultures utilizing 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatization. PLoS ONE. 15 (3), e0229990(2020).
  8. Galant, A. L., Kaufman, R. C., Wilson, J. D. Glucose: Detection and analysis. Food Chem. 188, 149-160 (2015).
  9. Bergmeyer, H. U. Methods of enzymatic analysis. 2, Elsevier Inc. (2012).
  10. Guía técnica sobre trazabilidad e incertidumbre en las mediciones analíticas que emplea la técnica de espectrofotometría de ultravioleta-visible. , CENAM-EMA. (2008).
  11. Yuen, V. G., McNeill, J. H. Comparison of the glucose oxidase method for glucose determination by manual assay and automated analyzer. J Pharmacol Toxicol Methods. 44 (3), 543-546 (2000).
  12. Hansen, O. Specificity of glucose oxidase reaction and interference with quantitative glucose oxidase-peroxidase-O-dianisidine method. Scand J Clin Lab Investig. 14 (6), 651-655 (1962).
  13. Kumar, V., Gill, K. D. Estimation of blood glucose levels by glucose oxidase method. Basic concepts in clinical biochemistry: A practical guide. , Springer eBooks. 57-60 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bergmeyer Glucose QuantificationGlucose Oxidase MethodMicrobiological SamplesGlucose ConcentrationEnzymatic Glucose AssayPeroxidase EnzymeSpectrophotometric AnalysisBacterial Glucose MeasurementYeast Glucose MeasurementIntracellular Glucose

Related Articles