تقنية السباحة الأفقية على شكل حرف U لإعداد منوية عالية الجودة بمؤشر تجزئة منخفض للحمض النووي

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة لفحص المنوية عالية الجودة ذات مؤشر تجزئة الحمض النووي المنخفض من خلال الاستفادة من خصائص حركة المنوية وتاكسي الغثرات. تستخدم الطريقة ممرا أفقيا للسباحة على شكل حرف U ، مما يمكن المنوية عالية الجودة من الوصول إلى الجانب الآخر من خلال قطرات عازلة ، بينما يتم استبعاد المنوية الميتة وحطام الخلايا والشوائب.

الملخص

السائل المنوي البشري عبارة عن خليط معقد يتكون من الحيوانات المنوية المتحركة تدريجيا ، والحيوانات المنوية المتحركة بشكل غير تدريجي ، والحيوانات المنوية غير المتحركة ، وبقايا الخلايا ، والبلازما المنوية اللزجة. تشير المنوية عالية الجودة إلى المنوية المتحركة تدريجيا ذات التشكل الطبيعي ، والتي غالبا ما تظهر مؤشر تجزئة الحمض النووي (DFI) أقل وإمكانية إخصاب أعلى. يعد تحضير المنوية عالية الجودة خطوة حاسمة في تكنولوجيا الإنجاب بمساعدة الإنسان. طريقة تحضير المنوية التقليدية ، الطرد المركزي المتدرج الكثافة المتقطعة (DGC) ، تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة. يمكن أن يؤدي الطرد المركزي المتكرر إلى إتلاف الحمض النووي للحيوانات المنوية ، مما يؤثر على الإخصاب اللاحق ونمو الجنين. تقدم هذه الدراسة طريقة السباحة الأفقية على شكل حرف U (UHS) لتحضير المنوية بحقن المنوية داخل الهيولى (ICSI) ، والتي تقضي بشكل كبير على الآثار الضارة للطرد المركزي على الحمض النووي للحيوانات المنوية. تتضمن طريقة UHS إنشاء ممر UHS باستخدام وسيط إخصاب داخل طبق تشغيل الحقن المجهري. يتم وضع قطرة دقيقة متوسطة تسميد سعة 10 ميكرولتر عند نقطة البداية على الجانب الأيسر من ممر UHS لتثبيت السائل المنوي. يتم وضع قطرتين إضافيتين من متوسطي التسميد سعة 10 ميكرولتر على فترات على طول الجزء الأوسط الأيسر من الممر ، مع توصيل جميع القطرات بواسطة وسط الإخصاب. ثم يغطى الطبق بزيت الاستزراع ويحضنه طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 6٪ ثاني أكسيد الكربون₂ للتوازن. بعد ذلك ، يضاف 3 ميكرولتر من السائل المنوي إلى القطرة الدقيقة عند نقطة البداية. تسبح المنوية عالية الجودة إلى الجانب الأيمن من حارة UHS ، مما يسهل شفطها في إبرة حقن الحقن المجهري. تبقى المنوية الميتة وبقايا الخلايا والشوائب اللزجة الأخرى إلى حد كبير عند النقطة الأولية أو في القطرات العازلة. قمنا في وقت واحد بمعالجة 21 عينة من السائل المنوي باستخدام كل من تقنيات UHS و DGC وقارنا DFI الخاصة بهم. أظهرت النتائج أن مؤشر DFI في مجموعة DGC كان 5.5٪ ± 3.2٪ ، بينما كان مؤشر DFI في مجموعة UHS 1.7٪ ± 1.1٪. كان الفرق بين المجموعتين يعتد به إحصائيا (P < 0.05).

المقدمة

تلعب تقنيات تحسين السائل المنوي وتحضير الحيوانات المنوية دورا مهما في الحصول على أجزاء خلوية غنية بالحيوانات المنوية المتفوقة هيكليا ووظيفيا ، وهي خطوة أساسية في تكنولوجيا الإنجاب بمساعدة^{الإنسان 1}. الغرض من تحسين السائل المنوي هو: (1) تقليل أو إزالة البروستاجلاندين والخلايا المناعية النشطة والأجسام المضادة للحيوانات المنوية والحيوانات المنوية منخفضة الجودة غير المتحركة والبكتيريا والحطام في البلازما المنوية. (2) تقليل أو القضاء على لزوجة السائل المنوي ؛ و (3) تعزيز سعة المنوية وتعزيز القدرة على الإخصاب. يجب أن تستعيد تقنية تحضير المنوية المثالية مجموعة من المنوية عالية الأداء تحافظ على سلامة الحمض النووي ولا تسبب خللا وظيفيا من خلال إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) بواسطة المنوية والكريات البيض².

تقنية تحضير المنوية الأكثر استخداما حاليا هي طريقة DGC. تتمثل مزايا هذه الطريقة في معدل الاسترداد المرتفع³ والتوحيد القياسي السهل. في الاستخدام العملي ، يمكن اختياره بمرونة بناء على جودة العينة لطريقة التدرج مزدوج الكثافة⁴ ، أو طريقة mini-DGC ، أو طريقة الطرد المركزي المتدرج أحادي^{الطبقة 5}. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحضير منوية عالية الجودة ذات حيوية جيدة وخالية من بقايا الخلايا وخلايا الدم البيضاء الملوثة والخلايا غير الجرثومية والخلايا الجرثومية المتدهورة. ومع ذلك ، فإن عيب هذه الطريقة هو أنها تتطلب الطرد المركزي ، والذي يمكن أن يتسبب في تلف الحمض النووي للحيوانات^{المنوية 6}.

تم تكييف الطريقة المعروضة هنا من الدراسة الأصلية التي أجراها Baldini et ^al.7 ، والتي ركزت على الهجرة الأفقية للحيوانات المنوية في أطباق الحقن. تشتمل هذه الطريقة المعدلة على ممر أفقي على شكل حرف U لفصل المنوية عالية الجودة مع حيوية قوية. يتجنب تلف الحمض النووي الناجم عن الطرد المركزي ويقلل من تأثير المنوية الميتة وبقايا الخلايا والشوائب اللزجة الأخرى أثناء إجراءات حقن المنوية داخل الهيولى (ICSI).

يتضمن النهج المحدد استخدام وسيط تسميد لإنشاء ممر UHS في طبق تشغيل الحقن المجهري. يتم وضع قطرة دقيقة متوسطة تسميد سعة 10 ميكرولتر عند نقطة البداية اليسرى لممر UHS لتثبيت السائل المنوي. يتم وضع قطرتين إضافيتين من متوسطي التسميد سعة 10 ميكرولتر على فترات في الجزء الأوسط الأيسر من ممر UHS ، ويتم توصيل جميع القطرات بواسطة وسط الإخصاب. بعد تغطية الإعداد بزيت الزراعة ، يتم تحضين الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 6٪ ثاني أكسيد الكربون₂ للتوازن. بعد ذلك ، يضاف 3 ميكرولتر من السائل المنوي إلى القطرة الدقيقة عند نقطة البداية على الجانب الأيسر من حارة UHS. تسبح المنوية عالية الجودة إلى المسار على الجانب الأيمن من ممر UHS ، مما يسهل جمعها بإبرة حقن الحقن المجهري. تبقى المنوية الميتة وبقايا الخلايا والشوائب اللزجة الأخرى في المقام الأول في الموقع الأصلي أو في القطرات العازلة.

تحاكي شريحة الموائع الدقيقة عملية الانتقاء الطبيعي في الجهاز التناسلي الأنثوي ، مما يتيح العزل الأمثل للحيوانات المنوية عالية الجودة من السائل المنوي دون الطرد المركزي. هذا أمر بالغ الأهمية لتحسين حركة المنوية⁸ ، وتقليل مؤشر تجزئة الحمض النووي للحيوانات المنوية⁹ ، وتعزيز نتائج الحمل¹⁰. ومع ذلك ، فإن تصنيع هذه الأجهزة معقد ومكلف ويصعب تنفيذه على نطاق واسع.

يقدم البروتوكول الموصوف هنا بديلا جديدا وبسيطا وممكنا. من خلال الاستفادة من خصائص حركة المنوية ، تحقق هذه الطريقة نتائج مماثلة لتلك الخاصة بتقنية الموائع الدقيقة. تظهر المنوية المحضرة حيوية قوية ، ومؤشرات تجزئة منخفضة للحمض النووي ، وهي مناسبة تماما للاستخدام في الحقن المجهري.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية التابعة لمستشفى Huai'an First People's التابع لجامعة نانجينغ الطبية (رقم الموافقة: KY-2024-181-01). تم الحصول على الموافقة المستنيرة من المرضى الذين تم استخدام عيناتهم في هذه الدراسة. يجب أن يتم إجراء الإجراء من قبل موظفين ذوي خبرة وفقا للممارسات المختبرية الجيدة والمبادئ التوجيهية^{السريرية 11 ، 12}. وترد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. تحضير طبق تشغيل الحقن المجهري

1. استخدم وسط إخصاب 20 ميكرولتر لإنشاء مسارات على شكل حرف U في طبق تشغيل الحقن المجهري (الشكل 1). يجب أن يكون طول المسار الأيسر للمسار على شكل حرف U حوالي 30 مم ، ويجب أن يكون طول المسار الأيمن حوالي 30 مم.
2. امتصاص وسط تسميد 10 ميكرولتر بماصة وقم بإنشاء قطرة دائرية عند نقطة البداية اليسرى للمسار على شكل حرف U. قم بتوصيله بنقطة البداية اليسرى للمسار على شكل حرف U لإضافة محلول مخزون السائل المنوي.
3. قم بإنشاء قطرتين عازلتين متوسطتين للتخصيب سعة 10 ميكرولتر على فترات على الجزء الأوسط الأيسر من حارة UHS. قم بتوصيل جميع القطرات بوسط الإخصاب.
4. قم بإنشاء شريط طويل من قطرة السائل على الجانب الأيمن من الممر على شكل حرف U باستخدام 2.5 ميكرولتر من البولي فينيل بيروليدون (PVP). تأكد من أن شريط PVP مواز للممر الأيمن للممر على شكل حرف U.
5. اصنع ست قطرات دقيقة باستخدام وسيط معالجة البويضات على الجانب الأيمن من شريط PVP ، مع 20 ميكرولتر لكل قطرة.
6. أضف 7 مل من زيت المزرعة إلى الطبق ، مع التأكد من أن الزيت يغطي أعلى نقطة من القطرة. ضعه في حاضنة 37 درجة مئوية ، 6٪ ثاني أكسيد الكربون₂ طوال الليل لتحقيق التوازن.

2. جمع عينة السائل المنوي

1. تزويد المرضى بتعليمات مكتوبة وشفهية واضحة فيما يتعلق بجمع عينة السائل المنوي. تأكد من اكتمال جمع العينة ، وتوجيه المرضى بالامتناع عن القذف لمدة 3-7 أيام قبل جمعها.
2. اجمع السائل المنوي عن طريق الاستمناء في كوب متخصص لجمع الحيوانات المنوية يمكن التخلص منه ومعقم وغير سام. تأكد من جمع القذف بالكامل ، واطلب من الفرد الإبلاغ عن أي فقدان لأي جزء من العينة.
3. التحقق من الأسماء والوثائق الثبوتية سارية المفعول وبصمات زوج المريض. ضع علامة على اسم ورقم السجل الطبي لزوج المريض على جسم وغطاء كوب جمع المنوية.
4. بعد أن يقوم المريض الذكر بجمع السائل المنوي ، قم بتسليم العينة وجها لوجه بين الموظفين والمريض. خذ كمية صغيرة من عينة السائل المنوي للتغليف والتخزين. تأكد من أن المريض يشير إلى منطقة التغليف.
5. قم بترقيم العينات المغلفة وتخزينها لمدة 2 سنوات. سجل معلومات المريض ورقم الهوية وتوقيعات المستلم والشهود في سجل معالجة السائل المنوي.
6. إذا اكتشف أي موظف في مركز الإنجاب هوية مريض مشبوه، توقف عن استلام العينة وأعد التحقق من هوية المريض. لا تتلقى عينتين أو أكثر في نفس الوقت. إذا كان هناك اشتباه في حدوث ارتباك في العينات ، فتوقف عن استلامها.

3. تحليل عينة السائل المنوي

1. راقب لون عينات السائل المنوي.
   ملاحظة: يبدو السائل المنوي الطبيعي متجانسا وأبيض رمادي بعد التسييل. قد يبدو السائل المنوي ذو التركيز المنخفض جدا للحيوانات المنوية شفافا. في حالة وجود خلايا الدم الحمراء ، قد يظهر السائل المنوي بني محمر. إذا كان المريض يعاني من اليرقان أو يتناول بعض الفيتامينات ، فقد يظهر السائل المنوي باللون الأصفر.
2. قم بقياس حجم السائل المنوي باستخدام طريقة الوزن بدقة تصل إلى 0.1 مل.
3. ضع عينة السائل المنوي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة. قم بشفيقها في ماصة بلاستيكية واسعة التجويف (قطرها حوالي 1.5 مم) ، مما يسمح للسائل المنوي بالسقوط عن طريق الجاذبية. راقب طول أي خيط.
   ملاحظة: يشكل القذف المسال الطبيعي قطرات صغيرة منفصلة. إذا كانت اللزوجة غير طبيعية ، فستشكل القطرة خيطا أطول من 2 سم.
4. إذا كان السائل المنوي لا يزال لا يذوب في غضون 60 دقيقة ، أضف كمية متساوية من وسط الإخصاب. بعد ذلك ، استنشق الخليط وزفيره بشكل متكرر باستخدام ماصة نقل بلاستيكية يمكن التخلص منها حتى يذوب تماما.
5. قم بقياس قيمة الأس الهيدروجيني للسائل المنوي باستخدام ورق اختبار الأس الهيدروجيني الدقيق (الرقم الهيدروجيني 6.0-10.0).
6. خذ 10 ميكرولتر من السائل المنوي المسال بالكامل وقم بتقطيره في غرفة عد ماكلر. تقييم حركة المنوية تحت مجال 200x باستخدام مجهر بصري. لاحظ وجود تراص المنوية والخلايا غير المنوية.
7. تقييم تركيز المنوية تحت مجال 200x باستخدام المجهر البصري.

4. التقاط البويضات

1. قم بإعداد طبق لالتقاط البويضات (OPD) في اليوم السابق لاسترجاع البويضات. أضف 2.5 مل من وسط معالجة البويضات إلى طبق ثقافة معقم مقاس 35 مم. ثم أضيفي 1.5 مل من الزيت وضعي الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل لتحقيق التوازن.
2. قم بإعداد طبقين لزراعة البويضات (OCD) في اليوم السابق لاسترجاع البويضات. أضف 1 مل من وسط التسميد إلى الحلقة الداخلية لطبق ثقافة البئر المركزي المعقم ، ثم أضف 1 مل من الزيت. أضف 4 مل من وسط التسميد إلى الحلقة الخارجية. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية ، 6٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لتحقيق التوازن طوال الليل.
3. قم بتشغيل جميع السخانات وألواح التسخين وقم بقياس درجة الحرارة قبل 30 دقيقة من استرجاع البويضات.
4. اغسل يديك بمعقم اليدين واشطفها جيدا بالماء الجاري. ارتد قفازات نظيفة ومعقمة وخالية من الغبار.
5. سخن طبق الثقافة المعقم على منصة تسخين 37 درجة مئوية.
6. التحقق بدقة من هوية المريض قبل استخراج البويضات.
7. استنشق السائل الجريبي في أنابيب اختبار معقمة من خلال الضغط السلبي ، ثم قم بتسليمه على الفور إلى أخصائيي الأجنة في المختبر.
8. صب كل السائل المسامي في أطباق مزرعة معقمة وابحث عن مجمعات البويضات الركامية (OCCCs) تحت مجهر مجسمة منخفض التكبير. التقط OCCCs باستخدام ماصة وضعها في عيادات الخارجية للتخزين المؤقت عند 37 درجة مئوية.
9. سجل كمية ولون وعدد البصيلات وعدد OCCCs في السائل الجريبي.
10. بعد استرجاع البويضات ، انقل OCCCs إلى الوسواس القهري باستخدام ماصة باستور معقمة. ضعها بسرعة في حاضنة استزراع (37 درجة مئوية ، 6٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، 5٪ O₂ ، والرطوبة المشبعة) لمدة ساعتين.
11. قم بإعداد طبق من أربعة آبار ، وأضف 0.5 مل من محلول الهيالورونيداز إلى البئر الأول ، و 1 مل من وسط معالجة البويضات لكل من الآبار الثلاثة المتبقية. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
12. استخدم ماصة باستور لنقل OCCCs من الخطوة 4.10 إلى هيالورونيداز يحتوي على الهيالورونيداز بشكل جيد لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، قم بنقل OCCCs إلى وسط معالجة البويضات الذي يحتوي بشكل جيد.
13. استخدم أنبوب تجريد البويضات بقطر 150 ميكرومتر لنفخ وشفط OCCCs لإزالة الخلايا الحبيبية. بعد ذلك، استخدم ماصة باستور جديدة لنقل البويضات إلى وسط معالجة البويضات للغسيل. انقلها إلى وسواس قهري آخر متوازن مسبقا وضعه في حاضنة 37 درجة مئوية ، 6٪ ثاني أكسيد الكربون₂ .

5. اختيار المنوية وعملية الحقن المجهري

1. أضف 5 ميكرولتر من السائل المنوي إلى القطرات الدقيقة لوسط الإخصاب عند نقطة البداية اليسرى للمسار على شكل حرف U في طبق التشغيل للحقن المجهري ، والذي تم إعداده من الخطوة 1.1 إلى الخطوة 1.6.
2. ضع طبق تشغيل الحقن المجهري في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 6٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 30-60 دقيقة.
3. افتح المجهر المقلوب ونظام تشغيل المجهر ومرحلة تسخين المرحلة لضمان استعادة جميع عناصر التحكم التشغيلية إلى نطاقها الأصلي الذي يمكن التحكم فيه ، مما يسمح بالتشغيل السلس والمريح.
4. قم بتثبيت إبرة الحقن المجهري في حامل الإبرة. قم بتثبيت حامل الإبرة على جهاز المعالجة الدقيقة ، واضبط إبرة الإمساك وإبرة الحقن في العدسة الموضوعية 4x ، واضبط زواياها ومواضعها بالتتابع بحيث تكون الإبرتان نسبتين وموازيتين للمرحلة. تحقق من نطاق حركة إبرة التشغيل تحت عدسة × 20 موضوعية.
5. اضبط زاوية وموضع إبرة البويضة وإبرة الحقن تحت العدسة الموضوعية 4x ، بحيث يكون رأسا الإبرة نسبيا وموازيا للمرحلة. حرك إبرة التشغيل للأمام والخلف واليسار واليمين. تحقق من نطاق حركة إبرة التشغيل تحت أهداف 10x و 20x.
6. ارفع إبرة حمل البويضة وإبرة الحقن للتأكد من أن الارتفاع بين طاولة العمليات وطاولة التسخين يسمح بوضع وعاء التشغيل بسهولة دون لمس إبرة التشغيل.
7. بعد الفحص المزدوج ، قم بنقل البويضات المختارة من الخطوة 4.12 إلى قطرات دقيقة متوسطة معالجة للبويضات في طبق تشغيل الحقن المجهري ، واحدة لكل قطرة.
8. ضع طبق التشغيل الذي يحتوي على البويضة على المرحلة الساخنة لمشغل المجهر المعد.
9. اضبط البعد البؤري للمجهر أسفل العدسة الموضوعية 10x لجعل حواف القطرات الدقيقة داخل طبق التشغيل واضحة ومرئية.
10. اخفض إبرة الحقن في شريط PVP لطبق تشغيل الحقن المجهري. اضبط المجهر لجعل إبرة الحقن مرئية بوضوح ، واستنشق كمية صغيرة من PVP في إبرة الحقن في نفس الوقت.
11. انقل إبرة الحقن إلى الشريط الطويل على الجانب الأيمن من المسار على شكل حرف U واستخرج المنوية عالية الجودة ذات التشكل الجيد والحركة التدريجية.
12. انقل المنوية إلى شريط PVP على الجانب الأيمن وضع المنوية في قاع طبق التشغيل.
13. اضغط برفق على إبرة الحقن في الجزء الأوسط أو السفلي من ذيل المنوية ، واسحب إبرة الحقن للخلف بسرعة ، وخدش المنوية لجعلها تتوقف.
14. استنشق المنوية من الذيل إلى الرأس في إبرة الحقن.
15. انقل إبرة الحقن إلى قطرة متوسطة معالجة البويضات التي تحتوي على البويضة على الجانب الأيمن.
16. اخفض إبرة حمل البويضة وحرك البويضة برفق لوضع الجسم القطبي الأول عند موضع الساعة 12 ، وتأمين البويضة.
17. اضبط إبرة الجراحة المجهرية وغشاء البويضة على نفس المستوى الأفقي. ادفع المنوية إلى طرف إبرة الحقن.
18. تمر عموديا عبر المنطقة الشفافة عند الساعة 3 على البويضة واستمر في حقن الإبرة حتى تصل إلى مركز البويضة أو تعبر قليلا الوضع المركزي ، مع تراجع طفيف لإبرة الحقن.
    ملاحظة: عندما يحدث الارتجاع السريع في السيتوبلازم المنوية ، فهذا يشير إلى أن غشاء البويضة قد انكسر وتوقف الشفط.
19. حقن المنوية ببطء في سيتوبلازم البويضة والخروج من إبرة الحقن. يجب أن يكون عمق حقن المنوية في السيتوبلازم حوالي 50٪ -75٪ من قطر البويضة.
20. بعد سحب إبرة الحقن ، اضبط الضغط السلبي لإبرة البويضات لتحرير البويضات.
21. كرر الخطوات المذكورة أعلاه حتى يتم حقن جميع البويضات الناضجة.
22. انقل طبق الحقن المجهري من اللوح الساخن بالمجهر إلى مجهر التشريح.
23. قم بإزالة طبق ثقافة الانقسام من الحاضنة.
24. انقل بويضة المنوية المحقونة إلى قطرة صغيرة في طبق مزرعة الانقسام.
25. ضع طبق ثقافة الانقسام مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية ، 6٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، 5٪ O₂ .

6. تحضير المنوية باستخدام طريقة DGC

1. أضف 1.5 مل من محلول الطرد المركزي المتدرج الكثافة بنسبة 45٪ إلى أنبوب اختبار سفلي مخروطي معقم سعة 15 مل.
2. أضف ببطء 1.5 مل من محلول الطرد المركزي المتدرج الكثافة بنسبة 90٪ إلى الجزء السفلي من محلول الطرد المركزي المتدرج بكثافة 45٪ ، مع الحفاظ على الواجهة بين السائلين.
3. أضف السائل المنوي المسال برفق إلى محلول الطرد المركزي المتدرج وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 15 دقيقة (في درجة حرارة الغرفة).
4. قم بإزالة المادة الطافية وأضف ما يقرب من 0.5 مل من رواسب المنوية المتبقية إلى 3 مل من وسط الإخصاب. انفخ واخلط جيدا.
5. جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
6. ماصة المادة الطافية وتترك حوالي 0.2 مل من الرواسب.
7. أضف كمية مناسبة من وسط الإخصاب لإعادة تعليق الرواسب ، وحساب تركيز المنوية وحيويتها ، وتسجيلها. ضعها في حاضنة 37 درجة مئوية ، 6٪ CO2 لاستخدامها لاحقا.

7. الكشف عن سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية (طريقة تشتت كروماتين المنوية ، SCD)

1. اضبط درجة الحرارة الداخلية على 20-28 درجة مئوية قبل إجراء التجربة. قم بإزالة مجموعة الكاشف واتركها تتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-60 دقيقة.
2. تحضير محلول تغيير الطبيعة: خذ 0.8 مل من محلول تغيير الطبيعة المركز وأضفه إلى 100 مل من الماء المقطر.
3. تحضير محلول الإيثانول بنسبة 70٪: خذ 26.65 مل من الماء المقطر و 70.35 مل من الإيثانول اللامائي لتحضير محلول الإيثانول بنسبة 70٪.
4. تحضير محلول الإيثانول بنسبة 90٪: خذ 9.55 مل من الماء المقطر و 90.45 مل من الإيثانول اللامائي لتحضير محلول الإيثانول بنسبة 90٪.
5. ضع أنبوب الاغاروز منخفض نقطة الانصهار (الذي يحتوي على 25 ميكرولتر من محلول الاغاروز منخفض نقطة الانصهار) في حمام مائي 90-100 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة حتى يذوب جل الاغاروز تماما. ثم ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق حتى تصبح درجة الحرارة ثابتة.
6. تناول 3-10 ميكرولتر من السائل المنوي قبل العلاج الأمثل وتعليق الحيوانات المنوية بعد العلاج الأمثل. أضفها إلى أنابيب الاغاروز ذات نقطة الانصهار المنخفضة المختلفة ، ثم اخلطيها جيدا.
7. خذ 30 ميكرولتر من معلق الاغاروز منخفض نقطة الانصهار الذي يحتوي على المنوية وقم بإسقاطه على شريحة زجاجية معالجة مسبقا في وضع أفقي.
8. قم بتغطية زجاج الغطاء برفق (بحجم 22 مم × 11 مم) بالشريحة ، وتجنب تكوين الفقاعات قدر الإمكان.
9. ضع الشريحة الزجاجية المعالجة مسبقا في الثلاجة عند 2-8 درجات مئوية لمدة 4 دقائق ، مع الحفاظ على الشريحة في وضع أفقي طوال العملية بأكملها. أخرج الشريحة الزجاجية من الثلاجة وانزلق برفق لإزالة زجاج الغطاء.
10. اغمر الشريحة الزجاجية المعالجة مسبقا بسرعة في محلول تغيير الطبيعة لمدة 7 دقائق.
11. قم بإزالة الشريحة الزجاجية المعالجة مسبقا وانقعها في الماء المقطر لمدة 5 ثوان.
12. قم بإزالة الشريحة الزجاجية المعالجة مسبقا واجعلها تقف في وضع مستقيم. استخدم ورق الترشيح لامتصاص أي قطرات ماء على سطح الشريحة ، وتجنب لمس منطقة العينة.
13. اغمر الشريحة الزجاجية المعالجة مسبقا في عازلة التحلل وتفاعل بدقة لمدة 20 دقيقة.
14. اغمر الأجزاء المعالجة مسبقا في محلول الغسيل لمدة 3 دقائق لغسل محلول التحلل.
15. قم بإزالة الشريحة الزجاجية المعالجة مسبقا واغمرها في محلول إيثانول بنسبة 70٪ لمدة دقيقتين.
16. قم بإزالة الشريحة الزجاجية المعالجة مسبقا واغمرها في محلول الإيثانول بنسبة 90٪ لمدة دقيقتين.
17. قم بإزالة الشريحة الزجاجية المعالجة مسبقا واغمرها في محلول الإيثانول اللامائي لمدة 2 دقيقة.
18. قم بإزالة الشريحة الزجاجية المعالجة مسبقا واتركها تجف في الهواء بشكل طبيعي.
19. تحضير محلول بقع رايت A والمحلول B في زجاجة بنية فارغة بنسبة 1: 1.
20. ضع الشريحة الزجاجية المعالجة مسبقا أفقيا وأضف محلول الصبغة المختلط على الشريحة ، مع التأكد من أن محلول الصبغة يغطي الشريحة بأكملها (حوالي 0.5-1 مل من محلول الصبغة).
21. بعد التلوين لمدة 5 دقائق ، اشطف شريحة الزجاج الملون برفق بالماء المقطر 10-15 مرة لإزالة عامل التلوين الزائد.
22. دع الزجاج ينزلق يجف بشكل طبيعي وراقبه تحت المجهر البصري عند 400×. عد أكثر من 200 منوي وحدد النسبة المئوية للحيوانات المنوية غير الطبيعية ذات حلقات الهالة الصغيرة ، وعدم وجود حلقات هالة ، والتنكس.

8. التحليل الإحصائي

1. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام البرامج المتاحة تجاريا.
2. قارن مؤشر DFI (٪) بين السائل المنوي الأصلي و DGC و UHS باستخدام اختبار فريدمان.
   ملاحظة: للمقارنات الزوجية لطريقتين ، استخدم اختبار Wilcoxon الموقع. ضع في اعتبارك قيمة p ≤ 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

تم استخدام طريقتي UHS و DGC لتحسين علاج 21 عينة ومقارنة مؤشر تجزئة الحمض النووي للحيوانات المنوية بين الطريقتين. يمكن أن تحل الطريقة التي تستخدم مسار UHS في طبق الحقن المجهري محل DGC ، مما قد يتسبب في تلف المنوية. تسبح المنوية عالية الجودة ذات الحركة التقدمية الجيدة بسلاسة على طول حافة المسار على شكل حرف U (الشكل 2) ، مما يسهل على إبرة الحقن المجهري الإمساك بها بشكل فردي. المنوية عالية الجودة المعزولة باستخدام مسار UHS لديها DFI أقل (الشكل 3).

المناقشة

تتمثل الخطوة الرئيسية في فصل المنوية عالية الجودة باستخدام طريقة UHS الموضحة في هذه المقالة في إنشاء ممر UHS مع قطرات عازلة. يتم إنشاء كل من ممر UHS والقطرات العازلة باستخدام السائل المنوي المغسول والمستقب. يوجه ممر UHS المنوية عالية الجودة للسباحة بحرية والتراكم على طول حافة المسار ، مما يسهل جمعها. تقلل القطرات العازلة من لزوجة السائل المنوي ، وتصفية الحيوانات المنوية الميتة ، وبقايا الخلايا ، والشوائب الأخرى. يجب تقليل المسافة بين الجانب الأيمن من حارة UHS وشريط PVP المتوازي لتقليل ال...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
7٪ محلول البولي فينيل بيروليدون	Vitrolife السويد AB	10111
شفاط	الحقن المجهري LABOTECT-Aspirator
منضدة عمل بيولوجية نظيفة	Suzhou Antai & nbsp ؛	-	منضدة بيولوجية نظيفة
ثقافة الكيسة الأريمية وسط	الجسم الحضيضي السويد AB	10132	وسط ثقافة الكيسة الأريمية
وسط ثقافة الانقسام	Vitrolife Sweden AB	10128	Cleavage culture medium
CO2 < / sub> حاضنة	حاضنة حراري		علمي-CO2
زيت ثقافة	زيت Vitrolife السويد AB	10029	OVOIL
ماصة نقل البلاستيك القابل للتصرف	BD Falcon	357575	ماصة نقل البلاستيك القابل للتصرف
التسميد	Vitrolife السويد AB	10136	G-IVF PLUS
ICSI	طبق تشغيل BD Falcon	351006	طبق بتري
الفوري الهيالورونيداز	Vitrolife السويد AB	10017	الهيالورونيداز الفوري
المجهر المقلوب	NIKON & nbsp ؛	-	المجهر المقلوب
محطة عمل التلقيح الاصطناعي	الدنمارك K-SYSTEM-IVF		محطة عمل
Makler غرفة العد	Sefi Medical Instruments		Makler
التشغيل الصغير	NIKON & nbsp ؛	-	نظام التشغيل الصغير
معالجة البويضات المتوسطة	Vitrolife السويد	AB 10130	G-MOPS PLUS
المجهر البصري	أوليمبوس	-
بصري مجهر تباين المرحلة   ؛		NIKON-Phase	مجهر التباين
مجلس عد المنوية	عد المنوية ماركلر
حل فصل تدرج المنوية	Vitrolife Sweden AB	10138	SpermGrad
مجموعة سلامة الحمض النووي لنواة المنوية	Shenzhen HuaKang & nbsp ؛	-	مجموعة سلامة الحمض النووي لنواة المنوية (SCD) المجهر
المجري   ؛	نيكون	المجهر	المجهري
جهاز طرد مركزي منضدية	HETTICH-Tabletop		جهاز طرد
رف أنبوب اختبار ثرموستاتي		GRANT-رف	أنبوب اختبار ثرموستاتي
حاضنة ثلاثي الغاز	ASTEC-Tri-Gas