مقالة منهجية

استخدام مقايسة التحول الحراري لفحص ارتباط الركيزة بالسيلينوبروتين O

DOI:

10.3791/67139

⸱

أغسطس 9, 2024

 , 
1Department of Physiology, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Charles and Jane Pak Center for Mineral Metabolism and Clinical Research, University of Texas Southwestern Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم مقايسة التحول الحراري ، وهي تقنية عالية الإنتاجية قائمة على التألق تستخدم للتحقيق في ارتباط الجزيئات الصغيرة بالبروتينات ذات الأهمية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكل تحديد الأهمية البيولوجية للبروتينات ذات الوظائف غير المعروفة عقبة كبيرة في فهم العمليات الخلوية. على الرغم من أن التنبؤات المعلوماتية الحيوية والهيكلية قد ساهمت في دراسة البروتينات غير المعروفة ، إلا أن عمليات التحقق من الصحة التجريبية في المختبر غالبا ما تعوقها الظروف المثلى والعوامل المساعدة اللازمة للنشاط الكيميائي الحيوي. ارتباط العامل المساعد ليس ضروريا فقط لنشاط بعض الإنزيمات ولكنه قد يعزز أيضا الاستقرار الحراري للبروتين. يكمن أحد التطبيقات العملية لهذه الظاهرة في الاستفادة من التغير في الاستقرار الحراري ، كما تم قياسه من خلال التغيرات في درجة حرارة انصهار البروتين ، لاستكشاف ارتباط الليجند.

يمكن استخدام مقايسة التحول الحراري (TSA) لتحليل ارتباط الروابط المختلفة بالبروتين محل الاهتمام أو إيجاد حالة استقرار لإجراء تجارب مثل علم البلورات بالأشعة السينية. سنصف هنا بروتوكولا ل TSA باستخدام السودوكيناز ، Selenoprotein O (SelO) ، للحصول على طريقة بسيطة وعالية الإنتاجية لاختبار ارتباط المعادن والنيوكليوتيدات. على عكس الكينازات المتعارف عليها ، يربط SelO ATP في اتجاه مقلوب لتحفيز نقل AMP إلى سلاسل الهيدروكسيل الجانبية للبروتينات في تعديل ما بعد الترجمة يعرف باسم البروتين AMPylation. من خلال الاستفادة من التحول في درجات حرارة الانصهار ، نقدم رؤى مهمة حول التفاعلات الجزيئية الكامنة وراء وظيفة SelO.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يزال الكثير من البروتينات البشرية ضعيف التوصيف. يشير "تأثير ضوء الشارع" الذي وصفه دنهام وكوستاتشر وآخرون إلى الظاهرة التي تحظى فيها البروتينات التي تم بحثها على نطاق واسع بمزيد من الاهتمام ، تاركة البروتينات غير المدروسة يتم تجاهلها 1,2. تشمل العوامل التي تساهم في هذا التأثير الأهمية البيولوجية وأهمية المرض لبعض البروتينات. علاوة على ذلك ، فإن الأبحاث السابقة التي تقدم المعرفة الأساسية ، فضلا عن توفر أدوات للتحليل الوظيفي ، تحفز البحث في البروتينات المدروسةللغاية 1,2. تهدف مشاريع مثل مبادرة البروتينات غير المدروسة ، واتحاد الجينوم الهيكلي ، ومبادرة وظيفة الإنزيم إلى توصيف البروتينات غير المدروسة باستخدام البروتينات الهيكلية والوظيفية2،3،4. يتمثل النهج التكميلي لتحديد الوظائف الجزيئية للبروتينات غير المدروسة في فحص تفاعلات هذه البروتينات مع الجزيئات الصغيرة لاكتساب رؤى قيمة حول التنظيم وخصوصية الركيزة.

يمكن أن يؤدي ربط الجزيئات الصغيرة إلى زيادة الاستقرار الحراري للبروتين5. غالبا ما تؤدي هذه الظاهرة ، المعروفة باسم تثبيت التشكل الناجم عن الرباط ، إلى زيادة في درجة حرارة انصهار البروتين ، مما يوفر مؤشرا قابلا للقياس على ارتباط الرباط6. يمكن قياس الاستقرار الحراري للبروتين باستخدام المسح الضوئي التفاضلي (DSF) ، المعروف أيضا باسم Thermofluor ، أو مقايسة التحول الحراري (TSA) 7،8،9،10. في TSA ، تتعرض عينة البروتين لدرجات حرارة متزايدة في وجود صبغة حساسة بيئيا6. عندما يتكشف البروتين ويتشوه ، ترتبط الصبغة بالمناطق الكارهة للماء المكشوفة للبروتين وتنبعث منها مضان. تفتقر أصباغ الفلورسنت الخارجية ، أو الأصباغ الحساسة بيئيا ، إلى التألق الداخلي وبدلا من ذلك تتألق عند التفاعل مع جزيئها المستهدف9،11،12. توفر الصبغة الأكثر استخداما ، SYPRO Orange ، العديد من المزايا مثل الاستقرار المعزز والحد الأدنى من مضان الخلفية8،9،12. والجدير بالذكر أن SYPRO Orange متوافق مع أنظمة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (RT-PCR) نظرا لأطوال موجات الإثارة والانبعاث حوالي 470 نانومتر و 570 نانومتر على التوالي. تسمح هذه الميزة الفريدة بإجراء قياسات عالية الإنتاجية ودقيقة وحساسة متوافقة مع أنظمة الكشف عن التألق المستخدمة بشكل شائع في أنظمة RT-PCR8.

TSA هي أداة متعددة الاستخدامات للتحقيق في تفاعلات البروتين مع العوامل المساعدة أو الأدوية المحتملة ولتحديد ظروف الاستقرار لعلم البلورات. بعض مزاياها على طرق الفحص الأخرى هي بساطتها النسبية في الإعداد والإنتاجية العالية مع لوحات 96 أو 384 بئرا13،14،15. كان تطوير هذه التقنية تحويليا لدراسات اكتشاف الأدوية ، حيث يوفر الراحة ويتيح دراسة الإضافات المتنوعة مثل الأيونات والروابط والأدوية6،16. علاوة على ذلك ، شجعت قدرة TSA على التكيف العلماء على توسيع فائدتها ، مما يسهل قياس الصلات الملزمة جنبا إلى جنب مع فحوصات الفحص17,18. TSA هي أداة فعالة في دراسات البيولوجيا الهيكلية لتحديد الظروف التي تعزز استقرار البروتين محل الاهتمام للتبلور19. وبالتالي ، فإن مرونته وسهولته النسبية قد وضعت TSA كتقنية أساسية في توصيف البروتينات. هنا ، سوف نستخدم TSA لتحليل ارتباط المعادن والنيوكليوتيدات بالسودوكيناز غير المدروس ، Selenoprotein O (SelO) ، كمثال.

Kinases هي واحدة من أكثر عائلات البروتين المستهدفة في اكتشاف الأدوية20. من المتوقع أن يكون ما يقرب من 10٪ من كينازات الإنسان غير نشط ويطلق عليه اسم pseudokinases لأنها تفتقر إلى المخلفات التحفيزية الرئيسية المطلوبة للحفز21,22. Selenoprotein O (SelO) هو سودوكيناز محفوظ تطوريا يفتقر إلى الأسبارتات المحفوظة في شكل HRD التحفيزي23. في حقيقيات النوى ، يتمركز SelO في الميتوكوندريا ويحمي الخلايا من الإجهاد التأكسدي24,25. تظهر التحليلات الهيكلية والكيميائية الحيوية أن SelO ينقل الأدينوزين أحادي الفوسفات (AMP) من ATP إلى ركائز البروتين في تعديل ما بعد الترجمة يعرف باسم AMPylation25. تشير الدراسات الحديثة إلى أن الإنزيمات التي تحفز AMPylation قد تربط النيوكليوتيدات البديلة مثل UTP في المختبر26,27. والجدير بالذكر أن الدراسات أظهرت أن متماثل SelO من السالمونيلا التيفية يحفز البروتين UMPylation ، أو نقل UMP ، بطريقة تعتمد علىالمنغنيز 28. بالنظر إلى هذه الملاحظات المثيرة للاهتمام ، نختبر ارتباط SelO ب ATP و UTP في وجود المغنيسيوم والمنغنيز ، بمثابة مثال تمثيلي لتطبيقات TSA. يمكن تكييف البروتوكول التالي بسهولة لتحسين وفحص تفاعلات البروتينات والمواد المضافة الأخرى ذات الأهمية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الإعداد التجريبي

  1. استخدم جهاز تدوير حراري يمكنه اكتشاف التألق ، مثل أداة RT-PCR ، لتنفيذ البروتوكول الموصوف. في حالة استخدام SYPRO Orange ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، استخدم وضع المسح الذي يسمح بالإثارة حوالي 470 نانومتر واكتشاف الانبعاثات حوالي 570 نانومتر. برمجة جهاز التدوير الحراري للاحتفاظ بالعينة عند 20 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها زيادة في درجة الحرارة بمقدار 0.5 درجة مئوية / 1 دقيقة حتى 95 درجة مئوية ؛ قياس شدة التألق كل 1 درجة مئوية.
    ملاحظة: نوصي بخطوة اختيارية في نهاية الدورة لإعادة كتلة العينة إلى 20 درجة مئوية (الشكل 1).
  2. يحتوي كل تفاعل على أربعة مكونات: المخزن المؤقت ، والبروتين محل الاهتمام ، والمضافات ، وصبغة الفلورسنت الخارجية. صمم التجربة لتشمل عناصر تحكم مثل عدم وجود بروتين ، وعدم صبغة ، وبروتين بدون إضافات ، والمواد المضافة وحدها لتحديد أي مضان في الخلفية قد يؤثر على تفسير النتائج. إذا كان ذلك متاحا ، فقم بتضمين عنصر تحكم إيجابي مثل مادة مضافة معروفة بربط واستقرار البروتين محل الاهتمام.
  3. استخدم البروتين المنقى للفحص. لاتباع هذا المثال ، استخدم E. coli SelO ، معبرا عنه ومنقى كما هو موضح سابقا25,29. باختصار ، عبر عن His-sumo الموسوم SelO (E. coli SelO ppSumo) في خلايا Rosetta DE3 وقم بتنقيتها باستخدام تقارب Ni2 + -NTA. قم بلصق علامة His-sumo باستخدام البروتياز Ulp وقم بتنقية SelO بشكل أكبر عن طريق كروماتوغرافيا ترشيح الهلام.
  4. يعتمد مضان SYPRO Orange على تفاعله مع البروتين محل الاهتمام. نظرا لأن هذه التفاعلات ستختلف من بروتين إلى بروتين ، قم بتحسين تركيز البروتين والصبغة للحصول على أقصى إشارة لضوضاء إشارة التألق.
    ملاحظة: SYPRO Orange غير متوافق مع بعض البروتينات والمواد المضافة مثل المنظفات11,30. يمكن فحص الأصباغ الخارجية الإضافية المدرجة في 12 حسب الضرورة.

2. تحديد تركيز الصبغة الأمثل (الشكل 2 أ)

  1. قم بإعداد تخفيفات 20 ميكرولتر من 50x و 40x و 30x و 20x و 10x SYPRO Orange من محلول المخزون ، والذي يتم توفيره عند 5000x في DMSO.
  2. قم بتوزيع 8 ميكرولتر من بروتين 6.25 ميكرومتر المخفف في مخزن TSA المؤقت في ستة آبار منفصلة من لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل 384 بئرا.
    ملاحظة: في مثالنا ، استخدمنا المخزن المؤقت TSA التالي لإجراء التخفيفات: 10 mM Tris pH 8 و 150 mM NaCl و 1 mM DTT. يمكن تشغيل العينات في ثلاث نسخ لتحسين موثوقية النتائج.
  3. أضف 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت TSA إلى كل بئر.
    ملاحظة: سيتم استبدال هذا الحجم من المخزن المؤقت بإضافة جزيئات صغيرة بعد تحسين تركيز الصبغة والبروتين.
  4. أضف 1 ميكرولتر من كل تخفيف تسلسلي لمحلول صبغة SYPRO Orange إلى كل بئر. أضف 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت بدون صبغة إلى البئر النهائي لعدم التحكم في الصبغة.
  5. قم بتغطية اللوحة بغشاء لاصق شفاف بصريا.
  6. قم بتدوير اللوحة لفترة وجيزة عند 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة في جهاز طرد مركزي مجهز بمحول لوحة PCR.
  7. ضع اللوحة في جهاز RT-PCR وابدأ بروتوكول الدورة الحرارية الموضح في الخطوة 1.1.

3. تحديد تركيز البروتين الأمثل (الشكل 2 ب)

  1. تحضير 20 ميكرولتر من التخفيفات التسلسلية من 25 ميكرومتر ، 12.5 ميكرومتر ، 6.25 ميكرومتر ، 3.125 ميكرومتر ، و 1.56 ميكرومتر من البروتين باستخدام المخزن المؤقت TSA (10 mM Tris pH 8 ، 150 mM NaCl ، و 1 mM DTT).
  2. قم بتوزيع 8 ميكرولتر من التخفيفات التسلسلية للبروتين في خمسة آبار منفصلة من صفيحة 384 بئرا.
  3. الاستغناء عن العازلة فقط في 6عشر جيدا كما لا يوجد بروتين السيطرة.
  4. أضف 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت TSA إلى كل بئر.
    ملاحظة: سيتم استبدال هذا الحجم من المخزن المؤقت بإضافة جزيئات صغيرة بعد تحسين تركيز الصبغة والبروتين.
  5. أضف 1 ميكرولتر من كل محلول صبغة برتقالية SYPRO 50x إلى كل بئر.
  6. قم بتغطية اللوحة بغشاء لاصق شفاف بصريا.
  7. قم بتدوير اللوحة لفترة وجيزة عند 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة في جهاز طرد مركزي مجهز بمحول لوحة PCR.
  8. ضع اللوحة في جهاز RT-PCR وابدأ بروتوكول الدورة الحرارية الموضح في الخطوة 1.1.

4. إعداد تجربة TSA (الشكل 3 أ)

ملاحظة: بعد تحسين تركيزات صبغة البروتين و SYPRO Orange ، يمكن إجراء الفحص بإضافة الجزيئات الصغيرة المطلوبة لتحليل الارتباط.

  1. حدد عدد الشروط من خلال النظر في النسخ المتماثلة والضوابط الكافية.
    ملاحظة: على سبيل المثال ، سنختبر ارتباط SelO بثمانية شروط في ثلاث نسخ. بما في ذلك عناصر التحكم (بدون مادة مضافة ، ولا بروتين ، ولا صبغة) ، لدينا 11 تفاعلا × 3 (ثلاث نسخ) = 33 تفاعلا كليا.
  2. بناء على التركيز الأمثل للبروتين والصبغة التي لوحظت ل SelO ، تأكد من أن كل تفاعل يحتوي على 8 ميكرولتر من 6.25 ميكرومتر بروتين ، و 1 ميكرولتر من المادة المضافة ، و 1 ميكرولتر من صبغة SYPRO Orange 50x لإجمالي حجم تفاعل 10 ميكرولتر. وبالتالي ، فإن التركيز النهائي المستخدم هو 5 ميكرومتر بروتين و 5x صبغة SYPRO برتقالية.
  3. تحضير 288 ميكرولتر من محلول بروتين 6.25 ميكرومتر باستخدام المخزن المؤقت TSA. يمثل هذا الحجم من محلول عمل البروتين 36 تفاعلا (33 تفاعلا مع 10٪ إضافية للاختلافات في الماصة).
  4. قم بتوزيع 8 ميكرولتر من بروتين 6.25 ميكرومتر في آبار منفصلة من صفيحة 384 بئر. الاستغناء عن العازلة فقط لعدم التحكم في البروتين.
  5. أضف 1 ميكرولتر من الجزيئات الصغيرة بتركيز 10x لتحقيق 1x النهائي. لاتباع هذا المثال ، أضف 1 ميكرولتر من 20 mM MgCl2 لتحقيق تركيز نهائي قدره 2 mM. الاستغناء عن المخزن المؤقت فقط للتحكم بدون إضافة.
  6. أضف 1 ميكرولتر من كل محلول صبغة برتقالية SYPRO 50x إلى كل بئر.
  7. قم بتغطية اللوحة بغشاء لاصق شفاف بصريا.
  8. قم بتدوير اللوحة لفترة وجيزة عند 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة في جهاز طرد مركزي مجهز بمحول لوحة PCR.
  9. ضع اللوحة في جهاز RT-PCR وابدأ بروتوكول الدورة الحرارية الموضح في الخطوة 1.1.

5. تحليل البيانات

  1. تصدير البيانات من جهاز RT-PCR لوحدات التألق النسبية (RFU) فيما يتعلق بدرجة الحرارة (درجة مئوية).
  2. استخدم البرنامج المفضل لاستخراج نقاط البيانات ورسمها حتى أعلى كثافة تم قياسها لكل منحنى ذوبان. الأهم من ذلك ، تأكد من أن عناصر التحكم في عدم وجود بروتين ولا صبغة تظهر مضان منخفض في الخلفية دون زيادات تعتمد على درجة الحرارة في التألق (الشكل 3A ، B والجدول التكميلي S1). قم بإجراء تحليل البيانات باستخدام برامج يمكن الوصول إليها مجانا مثل MoltenProt31 أو DSFWorld32.
  3. تحديد درجة حرارة الانصهار باستخدام Boltzmann Sigmoidal Fit للبيانات. تعرف درجة حرارة الانصهار (Tm) بأنها درجة الحرارة التي يلاحظ عندها تمسخ 50٪ أو نصف شدة قصوى (الشكل 3C).
  4. قد يشير التحول الحراري في منحنى الذوبان إلى إضافات استقرار أو زعزعة الاستقرار. لحساب تغير درجة حرارة الانصهار (Tm) ، استخدم الصيغة: Tm = Tm مضاف- Tm buffer. تصف القيمة الإيجابية حالة استقرار أو مادة مضافة متفاعلة ؛ تصف القيمة السالبة حالة مزعزعة للاستقرار (الشكل 3D).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتكون Euckaryotic SelO من تسلسل استهداف الميتوكوندريا N-terminal ، ومجال يشبه الكيناز ، وسيلينوسيستين محفوظ للغاية في المحطة C للبروتين23. يشفر هذا الإنزيم المقيم في الميتوكوندريا مجال السودوكيناز المحفوظ من البكتيريا إلى البشر23. كشف التحليل الهيكلي لمتماثل SelO من Pseudomonas syringae عن تغيرات الأحماض الأمينية في الموقع النشط التي تسهل ربط ATP في اتجاه مقلوب مقارنة بالكينازات الكنسية25. وفقا لذلك ، يحفز SelO AMPylation ، بدلا من الفسفرة ، للبروتينات المتعددة المشاركة في الإشارات المضادة للأكسدة لحماية الخلايا من الضرر التأكسدي وموت الخلايا25. بالإضافة إلى AMPylation ، ثبت أن بعض الأمبيلاز بدائية النواة وحقيقية النواة تحفز UMPylation27,28.

استخدمنا E. coli SelO المنقى المؤتلف في TSA لفحص ارتباط نيوكليوتيدات ATP و UTP ب SelO في وجود الكاتيونات ثنائية التكافؤ. على غرار الكينازات المتعارف عليها ، يؤوي SelO شكل DFG الذي يربط فيه الأسبارتات أيون المعدن لتنسيق النوكليوتيدات في الموقع النشط. أولا ، قمنا بتحسين تركيز البروتين والصبغة لقياسات مضان قوية في TSA ، وتحديد أن 5 ميكرومتر إلى 10 ميكرومتر E. coli SelO كان الأمثل مع 5x SYPRO Orange (الشكل 2). علاوة على ذلك ، أظهرنا أن عدم وجود بروتين ، بالإضافة إلى عدم وجود ضوابط صبغ ، كان لديه إشارة مضان منخفضة لم تكن تستجيب لزيادة درجة الحرارة. اكتشفنا ما يقرب من +4 درجة مئوية و +12 درجة مئوية زيادات في الاستقرار الحراري للإشريكية القولونية SelO في وجود ATP-Mg2+ و ATP-Mn2+ ، على التوالي (الشكل 3). ومع ذلك ، لم نلاحظ تحولا في الاستقرار الحراري عند الحضانة مع UTP ، مما يشير إلى أن E. coli SelO قد لا تظهر ارتباطا يمكن اكتشافه ب UTP.

figure-results-1
الشكل 1: إعداد دورة حرارية. مثال على برنامج التدوير الحراري المستخدم لزيادة درجة حرارة العينة بمقدار +0.5 درجة مئوية / دقيقة أثناء قياس مضان SYPRO Orange باستخدام قناة FRET. تتضمن التوصية أيضا حضانة درجة الحرارة المحيطة في بداية ونهاية البروتوكول. اختصار: FRET = نقل طاقة الرنين Förster. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تحسين تركيزات البروتين والصبغة. (أ) النتائج التمثيلية لتحسين تركيز صبغة SYPRO Orange باستخدام 5 ميكرومتر من الإشريكية القولونية SelO. (ب) النتائج التمثيلية لتحسين تركيز E. coli SelO باستخدام صبغة برتقالية 5x SYPRO. يصور منحنى التمسخ الحراري وحدات مضان نسبية (المحور ص) فيما يتعلق بدرجة الحرارة (المحور السيني). تمثل النتائج متوسط ± SD من الآبار الثلاثية (ن = 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: منحنيات التمسخ الحراري وتحليلات ΔTm ل SelO في وجود النيوكليوتيدات والكاتيونات ثنائية التكافؤ. (أ) البيانات الخام لمنحنيات التمسخ الحراري للعينات (5 ميكرومتر من الإشريكية القولونية SelO في وجود 200 ميكرومتر ATP أو UTP و 2 مللي متر كاتيونات ثنائية التكافؤ ، 5x SYPRO Orange) المصدرة من آلة RT-PCR ورسمها. يمثل SelO ATP-Mg عينات مع SelO و ATP و MgCl2 ، ويمثل SelO ATP-Mn عينات مع SelO و ATP و MnCl2 ، ويمثل SelO UTP-Mg عينات مع SelO و UTP و MgCl2 ، ويمثل SelO UTP-Mn عينات مع SelO و UTP و MnCl2. لاحظ أن عدم وجود صبغة ولا ضوابط بروتين تظهر مضان منخفض. تمثل النتائج متوسط ± SD من الآبار الثلاثية (ن = 3). (ب) منحنيات تمسخ حراري مرسومة بأعلى كثافة وتتناسب مع معادلة بولتزمان السيني. على الرغم من أن التمسخ الحراري ل SelO لم يتأثر ب UTP ، فقد لاحظنا تحولا ملحوظا في تمسخ الحرارة في وجود ATP (منحنيات أرجوانية). تمثل النتائج متوسط ± SD من الآبار الثلاثية (ن = 3). (ج) الرسم البياني الذي يصور قيم Tm على أنها مشتقة من ملاءمة بولتزمان السيني للبيانات الممثلة في الشكل 3B. تمثل النتائج متوسط ± SD من الآبار الثلاثية (ن = 3). SelO 39.2 درجة مئوية ± 0.085 ، SelO ATP-Mg 43.3 درجة مئوية ± 0.133 ، SelO ATP-Mn 50.9 درجة مئوية ± 0.085 ، SelO UTP-Mg 39.1 درجة مئوية ± 0.056 ، SelO UTP-Mn 39.9 درجة مئوية ± 0.087. (د) الرسم البياني الذي يصور التغير في درجة حرارة الانصهار ΔTm (Tm مضاف - Tm buffer). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي S1: مثال على بيانات TSA ل SelO في وجود المعادن والنيوكليوتيدات. جدول بيانات البيانات الأولية المصدرة من جهاز RT-PCR، والبيانات التي تتم معالجتها لحذف القيم بعد الحد الأقصى لكثافة RFU كما هو موضح في الخطوتين 5.1 و5.2 من البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعمل اختبار التحول الحراري (TSA) كطريقة فعالة لفحص تفاعلات البروتين والليجند ، بما في ذلك تلك التي تحتوي على العوامل المساعدة والمثبطات. في هذا البروتوكول ، استخدمنا TSA لقياس ارتباط السودوكيناز SelO بالنيوكليوتيدات والكاتيونات ثنائية التكافؤ. تظهر النتائج التي توصلنا إليها أن SelO يظهر استقرارا حراريا متزايدا في وجود ATP و Mg2 + / Mn2+. تتوافق هذه الملاحظة مع التقارير السابقة التي تشير إلى أن متجانسات SelO من E. coli و S. cerevisiae و H. sapiens تحفز نقل AMP من ATP إلى السلسلة الجانبية للهيدروكسيل لركائز البروتين25,29. على الرغم من أن TSA يوفر رؤى قيمة حول ارتباط النوكليوتيدات ، إلا أنه قد لا يحدد الركيزة في الجسم الحي. يمكن أن تؤثر الجزيئات الأخرى ، وليس فقط الركيزة ، على الاستقرار الحراري للبروتين. لتحديد الركيزة بدقة ، يجب مراعاة عوامل مثل التركيز الخلوي وتقارب الربط. ومع ذلك ، فإن TSA هي أداة ممتازة لفحص مجموعة كبيرة من الشروط ، مثل ربط الجزيئات الصغيرة ، باستخدام التثبيت الحراري كقراءة.

تمتد فائدة TSA إلى ما هو أبعد من تطبيقه في تحليل ارتباط الجزيئات الصغيرة بالمواقع النشطة أو التنظيمية للبروتينات. ساهمت TSA بشكل كبير في التوصيف الفيزيائي الحيوي للبروتينات من خلال توفير ظروف استقرار تجعل البروتين أكثر ملاءمة لتجارب علم البلورات. والجدير بالذكر أن TSA تقدم العديد من المزايا ، بما في ذلك الإعداد البسيط وقدرات الإنتاجية العالية باستخدام مواد معملية متاحة بشكل شائع مثل لوحات PCR وأجهزة RT-PCR. تسمح هذه المزايا باختبار العديد من الحالات التي قد لا تكون مجدية أو مباشرة مع التقنيات الأخرى. استخدمت دراسات متعددة TSA لقياس الاستقرار الحراري للبروتينات المؤتلفة مع مكتبة من المركبات لتحديد الظروف المثلى لبلورة البروتين19,33.

يعد تضمين الضوابط المناسبة ضروريا لتجنب سوء تفسير منحنيات الذوبان ، مع كون التألق الذاتي من الألواح أو المواد المضافة مصدر قلق مشترك. قد لا يكون TSA مناسبا للمركبات التي تظهر تألقا ذاتيا أو تروي مضان برتقال SYPRO. الحل المحتمل هو فحص الأصباغ البديلة الموصوفة في 12. يمكن تكييف بروتوكول TSA الموضح هنا بسهولة مع البروتينات والمواد المضافة الأخرى ذات الأهمية. لا تقتصر المواد المضافة فقط على المركبات القابلة للذوبان في الماء ، كما هو موضح في بروتوكولنا مع النيوكليوتيدات والكاتيونات ثنائية التكافؤ. بدلا من ذلك ، يمكن أن تشمل المواد المضافة مجموعة واسعة من الحالات مثل اختلاف درجة الحموضة أو الروابط أو الأدوية القابلة للذوبان في DMSO8. علاوة على ذلك ، قد توفر الحضانة المسبقة لليجند مع البروتين نتائج أكثر قابلية للتكرار عن طريق تقليل التداخل والتحف من الصبغة. قد تؤدي المواد المضافة مثل الدهون والمنظفات إلى ارتفاع معدل التألق بسبب تفاعلاتها مع SYPRO Orange. يظهر مثال على منحنى تمسخ في الشكل 3A الذي يصور مضان الخلفية المنخفض المقترن بزيادة كبيرة في التألق عند تمسخ البروتين الحراري. سيؤدي التركيز الأمثل للصبغة والبروتين إلى أقصى نسبة إشارة إلى ضوضاء مع الحفاظ على إشارة مضان متسقة عبر النسخ المتماثلة.

يوفر TSA ميزة البساطة مع الحد الأدنى من مكوناته ، وبالتالي تقليل عدد المتغيرات للتحسين. تشمل الخطوات الحاسمة تحديد التركيزات المثلى لكل من الصبغة والبروتين. من المهم ملاحظة أن TSA يتطلب بروتينا منقيا "حسن التصرف". يجب أن يكون البروتين والمواد المضافة مستقرين في المخزن المؤقت عند التركيزات المستخدمة في TSA. قد تؤدي البروتينات أو الحالات المعرضة للتجميع أو قلة القلة إلى قراءات مضان خاطئة. قد تظهر البروتينات المجمعة أو غير المطوية مضان عالي في البداية مع زيادة طفيفة فقط عند تمسخها. يمكن أن يؤدي قلة البروتينات أيضا إلى حالات انتقالية متعددة ، مما يعقد التحليل10. يمكن ضبط تركيز البروتين لمنع التجميع.

TSA متوافق مع مجموعة واسعة من المخازن المؤقتة والأملاح ، مما يسمح بتحسين ظروف الاستقرار للبروتين والمواد المضافة11. يمكن تعديل أحجام البروتين والمحاليل المضافة للتغلب على قيود البروتين وتركيزات المواد المضافة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام تركيزات أقل من المواد المضافة مثل 5x بدلا من محلول 10x المستخدم في النتائج التمثيلية. والجدير بالذكر أن الكمية النسبية من البروتين والمواد المضافة اللازمة لإجراء الفحص منخفضة لأن لوحات تفاعل البوليميراز المتسلسل المكونة من 384 بئرا يمكن أن تستوعب أحجاما منخفضة تصل إلى 10 ميكرولتر من إجمالي العينة.

نظرا لنقاط القوة في TSA ، فهو مثالي للتحقيق في البروتينات غير المدروسة مثل السودوكينازات. الإنزيمات الكاذبة هي بروتينات غير نشطة تحفيزيا متجانسة تركيبيا مع الإنزيمات النشطة34. أظهرت الدراسات الهيكلية والكيميائية الحيوية الحديثة أن عددا قليلا من الإنزيمات الزائفة هي إنزيمات نشطة بينما معظمها له وظائف غير تحفيزية35,36. على الرغم من عدم نشاطها التحفيزي ، إلا أن الإنزيمات الكاذبة متورطة في أمراض مختلفة وتلعب أدوارا مهمة بما في ذلك السقالات والتعديل الخيفي37. ومع ذلك ، فإن آلية العمل والأهمية الوظيفية للعديد من الإنزيمات الكاذبة غير معروفة. يتم تنظيم أنشطة بعض الإنزيمات الكاذبة عن طريق ربط الرباط مما يؤدي إلى زيادة الاستقرار الحراري المرتبط بالتغيرات التوافقية للبروتين14. نقترح أن TSA هي أداة قيمة لفحص ارتباط الروابط بالإنزيمات الكاذبة لتحديد الرباط الأمثل للنشاط الوظيفي.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إيه إس هو باحث دبليو دبليو كاروث جونيور في الأبحاث الطبية الحيوية ، وباحث معهد الوقاية من السرطان والبحوث في تكساس (CPRIT) ، ومركز تشارلز وجين باك لاستقلاب المعادن وباحث كلية البحوث السريرية. تم دعم هذا العمل من قبل NIH Grant K01DK123194 (AS) ، و CPRIT GRANT RR190106 (AS) ، و Welch (I-2046-20200401) و Welch (I-2046-20230405).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأدينوزين 5 & رئيس ؛ -ثلاثي الفوسفات ملح ثنائي الصوديوم هيدراتSigma AldrichA2383-10Gيستخدم للحصول على نتائج تمثيلية ولكن ليس مطلوبا لأداء TSA
Avanti J-15R مع مجموعة حامل صفيحة دقيقةBeckman CoulterC19416
CFX Opus 384 نظام PCR في الوقت الحقيقيBio-Rad12011452
Hard-Shell 384-Well لوحات PCR ، جدار رقيق ، ملتوي ، شفاف / أبيضيستخدم Bio-RadHSP3805
كلوريد المغنيسيومSigma AldrichM8266-100Gللحصول على نتائج تمثيلية ولكنه غير مطلوب لأداء TSA
المنغنيز (II) كلوريد رباعي الهيدراتSigma AldrichM3634-500Gالمستخدم للحصول على نتائج تمثيلية ولكن ليس مطلوبا لأداء TSA
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film ، لاصق ، بصريBio-RadMSB1001
SYPRO جل بروتين البرتقال صبغةسيجما ألدريتشS5692-500UL
Uridine 5 & -triphosphate ثلاثي الفوسفات ملح الهيدراتSigma AldrichU6625-100MGتستخدم للحصول على نتائج تمثيلية ولكن ليست مطلوبة لأداء TSA

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dunham, I. Human genes: Time to follow the roads less traveled. PLoS Biol. 16 (9), e3000034(2018).
  2. Kustatscher, G., et al. An open invitation to the understudied proteins initiative. Nat Biotechnol. 40 (6), 815-817 (2022).
  3. Jones, M. M., et al. The structural genomics consortium: A knowledge platform for drug discovery: A summary. Rand Health Q. 4 (3), 19(2014).
  4. Oberg, N., Zallot, R., Gerlt, J. A. Efi-est, efi-gnt, and efi-cgfp: Enzyme function initiative (efi) web resource for genomic enzymology tools. J Mol Biol. 435 (14), 168018(2023).
  5. Pace, C. N., Mcgrath, T. Substrate stabilization of lysozyme to thermal and guanidine hydrochloride denaturation. J Biol Chem. 255 (9), 3862-3865 (1980).
  6. Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).
  7. Huynh, K., Partch, C. L. Analysis of protein stability and ligand interactions by thermal shift assay. Curr Protoc Protein Sci. 79, 21-28 (2015).
  8. Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).
  9. Wu, T., et al. Conformationally responsive dyes enable protein-adaptive differential scanning fluorimetry. bioRxiv. , 10.1101/2023.01.23.525251 (2023).
  10. Wu, T., et al. Protocol for performing and optimizing differential scanning fluorimetry experiments. STAR Protoc. 4 (4), 102688(2023).
  11. Gao, K., Oerlemans, R., Groves, M. R. Theory and applications of differential scanning fluorimetry in early-stage drug discovery. Biophys Rev. 12 (1), 85-104 (2020).
  12. Hawe, A., Sutter, M., Jiskoot, W. Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization. Pharm Res. 25 (7), 1487-1499 (2008).
  13. Lucet, I. S., Murphy, J. M. Characterization of ligand binding to pseudokinases using a thermal shift assay. Methods Mol Biol. 1636, 91-104 (2017).
  14. Murphy, J. M., et al. A robust methodology to subclassify pseudokinases based on their nucleotide-binding properties. Biochem J. 457 (2), 323-334 (2014).
  15. Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 128-136 (2012).
  16. Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332 (1), 153-159 (2004).
  17. Bai, N., Roder, H., Dickson, A., Karanicolas, J. Isothermal analysis of thermofluor data can readily provide quantitative binding affinities. Sci Rep. 9 (1), 2650(2019).
  18. Vivoli, M., Novak, H. R., Littlechild, J. A., Harmer, N. J. Determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry. J Vis Exp. (91), e51809(2014).
  19. Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (43), 15835-15840 (2006).
  20. Taujale, R., et al. Informatic challenges and advances in illuminating the druggable proteome. Drug Discov Today. 29 (3), 103894(2024).
  21. Bailey, F. P., Byrne, D. P., Mcskimming, D., Kannan, N., Eyers, P. A. Going for broke: Targeting the human cancer pseudokinome. Biochem J. 465 (2), 195-211 (2015).
  22. Kung, J. E., Jura, N. Prospects for pharmacological targeting of pseudokinases. Nat Rev Drug Discov. 18 (7), 501-526 (2019).
  23. Dudkiewicz, M., Szczepinska, T., Grynberg, M., Pawlowski, K. A novel protein kinase-like domain in a selenoprotein, widespread in the tree of life. PLoS One. 7 (2), e32138(2012).
  24. Han, S. J., Lee, B. C., Yim, S. H., Gladyshev, V. N., Lee, S. R. Characterization of mammalian selenoprotein o: A redox-active mitochondrial protein. PLoS One. 9 (4), e95518(2014).
  25. Sreelatha, A., et al. Protein ampylation by an evolutionarily conserved pseudokinase. Cell. 175 (3), 809-821 (2018).
  26. Frese, M., et al. The alarmone diadenosine tetraphosphate as a cosubstrate for protein ampylation. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (8), e202213279(2023).
  27. Mostert, D., et al. Pronucleotide probes reveal a diverging specificity for ampylation vs umpylation of human and bacterial nucleotide transferases. Biochemistry. 63 (5), 651-659 (2024).
  28. Yang, Y., et al. The ydiu domain modulates bacterial stress signaling through Mn2+-dependent umpylation. Cell Rep. 32 (12), 108161(2020).
  29. Mukherjee, M., Sreelatha, A. Identification of selenoprotein o substrates using a biotinylated atp analog. Methods Enzymol. 662, 275-296 (2022).
  30. Kroeger, T., et al. Edta aggregates induce sypro orange-based fluorescence in thermal shift assay. PLoS One. 12 (5), e0177024(2017).
  31. Kotov, V., et al. In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with moltenprot. Protein Sci. 30 (1), 201-217 (2021).
  32. Wu, T., Gale-Day, Z. J., Gestwicki, J. E. Dsfworld: A flexible and precise tool to analyze differential scanning fluorimetry data. Protein Sci. 33 (6), e5022(2024).
  33. Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. Optimization of protein buffer cocktails using thermofluor. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69, Pt 2 209-214 (2013).
  34. Ribeiro, A. J. M., et al. Emerging concepts in pseudoenzyme classification, evolution, and signaling. Sci Signal. 12 (594), eaat9797 (2019).
  35. Goldberg, T., Sreelatha, A. Emerging functions of pseudoenzymes. Biochem J. 480 (10), 715-728 (2023).
  36. Pon, A., Osinski, A., Sreelatha, A. Redefining pseudokinases: A look at the untapped enzymatic potential of pseudokinases. IUBMB Life. 75 (4), 370-376 (2023).
  37. Murphy, J. M., Mace, P. D., Eyers, P. A. Live and let die: Insights into pseudoenzyme mechanisms from structure. Curr Opin Struct Biol. 47, 95-104 (2017).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Thermal Shift AssaySelenoprotein OProtein AMPylationLigand BindingMelting TemperatureNucleotide BindingMetal BindingPseudokinase ActivityHigh Throughput ScreeningProtein Stability

مقالات ذات صلة