هنا ، نقدم مقايسة التحول الحراري ، وهي تقنية عالية الإنتاجية قائمة على التألق تستخدم للتحقيق في ارتباط الجزيئات الصغيرة بالبروتينات ذات الأهمية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام مقايسة التحول الحراري لفحص ارتباط الركيزة بالسيلينوبروتين O
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يشكل تحديد الأهمية البيولوجية للبروتينات ذات الوظائف غير المعروفة عقبة كبيرة في فهم العمليات الخلوية. على الرغم من أن التنبؤات المعلوماتية الحيوية والهيكلية قد ساهمت في دراسة البروتينات غير المعروفة ، إلا أن عمليات التحقق من الصحة التجريبية في المختبر غالبا ما تعوقها الظروف المثلى والعوامل المساعدة اللازمة للنشاط الكيميائي الحيوي. ارتباط العامل المساعد ليس ضروريا فقط لنشاط بعض الإنزيمات ولكنه قد يعزز أيضا الاستقرار الحراري للبروتين. يكمن أحد التطبيقات العملية لهذه الظاهرة في الاستفادة من التغير في الاستقرار الحراري ، كما تم قياسه من خلال التغيرات في درجة حرارة انصهار البروتين ، لاستكشاف ارتباط الليجند.
يمكن استخدام مقايسة التحول الحراري (TSA) لتحليل ارتباط الروابط المختلفة بالبروتين محل الاهتمام أو إيجاد حالة استقرار لإجراء تجارب مثل علم البلورات بالأشعة السينية. سنصف هنا بروتوكولا ل TSA باستخدام السودوكيناز ، Selenoprotein O (SelO) ، للحصول على طريقة بسيطة وعالية الإنتاجية لاختبار ارتباط المعادن والنيوكليوتيدات. على عكس الكينازات المتعارف عليها ، يربط SelO ATP في اتجاه مقلوب لتحفيز نقل AMP إلى سلاسل الهيدروكسيل الجانبية للبروتينات في تعديل ما بعد الترجمة يعرف باسم البروتين AMPylation. من خلال الاستفادة من التحول في درجات حرارة الانصهار ، نقدم رؤى مهمة حول التفاعلات الجزيئية الكامنة وراء وظيفة SelO.
المقدمة
لا يزال الكثير من البروتينات البشرية ضعيف التوصيف. يشير "تأثير ضوء الشارع" الذي وصفه دنهام وكوستاتشر وآخرون إلى الظاهرة التي تحظى فيها البروتينات التي تم بحثها على نطاق واسع بمزيد من الاهتمام ، تاركة البروتينات غير المدروسة يتم تجاهلها 1,2. تشمل العوامل التي تساهم في هذا التأثير الأهمية البيولوجية وأهمية المرض لبعض البروتينات. علاوة على ذلك ، فإن الأبحاث السابقة التي تقدم المعرفة الأساسية ، فضلا عن توفر أدوات للتحليل الوظيفي ، تحفز البحث في البروتينات المدروسةللغاية 1,2. تهدف مشاريع مثل مبادرة البروتينات غير المدروسة ،....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الإعداد التجريبي
- استخدم جهاز تدوير حراري يمكنه اكتشاف التألق ، مثل أداة RT-PCR ، لتنفيذ البروتوكول الموصوف. في حالة استخدام SYPRO Orange ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، استخدم وضع المسح الذي يسمح بالإثارة حوالي 470 نانومتر واكتشاف الانبعاثات حوالي 570 نانومتر. برمجة جهاز التدوير الحراري للاحتفاظ بالعينة عند 20 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها زيادة في درجة الحرارة بمقدار 0.5 درجة مئوية / 1 دقيقة حتى 95 درجة مئوية ؛ قياس شدة التألق كل 1 درجة مئوية.
ملاحظة: نوصي بخطوة اختيارية في نهاية الدورة لإعادة كتلة العينة إلى 20 درجة مئوية (الشكل 1). - يحتوي كل تفاعل على أربعة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتكون Euckaryotic SelO من تسلسل استهداف الميتوكوندريا N-terminal ، ومجال يشبه الكيناز ، وسيلينوسيستين محفوظ للغاية في المحطة C للبروتين23. يشفر هذا الإنزيم المقيم في الميتوكوندريا مجال السودوكيناز المحفوظ من البكتيريا إلى البشر23. كشف التحليل الهيكلي لمتماثل SelO من Pseudomonas syringae عن تغيرات الأحماض الأمينية في الموقع النشط التي تسهل ربط ATP في اتجاه مقلوب مقارنة بالكينازات الكنسية25. وفقا لذلك ، يحفز SelO AMPylation ، بدلا من الفسفرة ،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعمل اختبار التحول الحراري (TSA) كطريقة فعالة لفحص تفاعلات البروتين والليجند ، بما في ذلك تلك التي تحتوي على العوامل المساعدة والمثبطات. في هذا البروتوكول ، استخدمنا TSA لقياس ارتباط السودوكيناز SelO بالنيوكليوتيدات والكاتيونات ثنائية التكافؤ. تظهر النتائج التي توصلنا إليها أن SelO يظهر استقرارا حراريا متزايدا في وجود ATP و Mg2 + / Mn2+. تتوافق هذه الملاحظة مع التقارير السابقة التي تشير إلى أن متجانسات SelO من E. coli و S. cerevisiae و H. sapiens ت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
إيه إس هو باحث دبليو دبليو كاروث جونيور في الأبحاث الطبية الحيوية ، وباحث معهد الوقاية من السرطان والبحوث في تكساس (CPRIT) ، ومركز تشارلز وجين باك لاستقلاب المعادن وباحث كلية البحوث السريرية. تم دعم هذا العمل من قبل NIH Grant K01DK123194 (AS) ، و CPRIT GRANT RR190106 (AS) ، و Welch (I-2046-20200401) و Welch (I-2046-20230405).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأدينوزين 5 & رئيس ؛ -ثلاثي الفوسفات ملح ثنائي الصوديوم هيدرات | Sigma Aldrich | A2383-10G | يستخدم للحصول على نتائج تمثيلية ولكن ليس مطلوبا لأداء TSA |
| Avanti J-15R مع مجموعة حامل صفيحة دقيقة | Beckman Coulter | C19416 | |
| CFX Opus 384 نظام PCR في الوقت الحقيقي | Bio-Rad | 12011452 | |
| Hard-Shell 384-Well لوحات PCR ، جدار رقيق ، ملتوي ، شفاف / أبيض | يستخدم Bio-Rad | HSP3805 | |
| كلوريد المغنيسيوم | Sigma Aldrich | M8266-100G | للحصول على نتائج تمثيلية ولكنه غير مطلوب لأداء TSA |
| المنغنيز (II) كلوريد رباعي الهيدرات | Sigma Aldrich | M3634-500G | المستخدم للحصول على نتائج تمثيلية ولكن ليس مطلوبا لأداء TSA |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film ، لاصق ، بصري | Bio-Rad | MSB1001 | |
| SYPRO جل بروتين البرتقال صبغة | سيجما ألدريتش | S5692-500UL | |
| Uridine 5 & -triphosphate ثلاثي الفوسفات ملح الهيدرات | Sigma Aldrich | U6625-100MG | تستخدم للحصول على نتائج تمثيلية ولكن ليست مطلوبة لأداء TSA |
المراجع
- Dunham, I. Human genes: Time to follow the roads less traveled. PLoS Biol. 16 (9), e3000034(2018).
- Kustatscher, G., et al. An open invitation to the understudied proteins initiative. Nat Biotechnol. 40 (6), 815-817 (2022).
- Jones, M. M., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
