مقالة منهجية

في الجسم الحي التصور العابرين للكالسيوم أثناء الإخصاب والتطور المبكر في C. ايليجانس

1.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67141

⸱

يوليو 12, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Florida Institute of Technology

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولات وأدوات لتصور الكالسيوم أثناء الإخصاب والتطور الجنيني المبكر باستخدام مراسل الكالسيوم المشفر وراثيا المعبر عنه في السلالة الجرثومية لنموذج الديدان الخيطية C. ايليجانس.

الملخص

الكالسيوم هو جزيء إشارة مهم أثناء الانتقال من البويضة إلى الجنين (OET) والتطور الجنيني المبكر. توفر الديدان الخيطية الخنثى Caenorhabditis elegans العديد من المزايا الفريدة لدراسة OET لأنها شفافة ولها غدد تناسلية مرتبة تنتج بويضة ناضجة واحدة كل ~ 23 دقيقة عند 20 درجة مئوية. لقد قمنا بتعديل مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا jGCaMP7s للإشارة بشكل فلوري إلى لحظة الإخصاب داخل الكائن الحي. لقد أطلقنا على هذا المراسل اسم "CaFE" للكالسيوم أثناء الإخصاب في C. ايليجانس. تم تصميم مراسل CaFE في موقع ملاذ آمن في نسخة واحدة ، وليس له تأثير كبير على علم وظائف الأعضاء أو الخصوبة ، وينتج إشارة قوية عند الإخصاب. هنا ، يتم تقديم سلسلة من البروتوكولات لاستخدام مراسل CaFE كأداة في الجسم الحي لتشريح OET والتطور الجنيني. نقوم بتضمين طرق مزامنة الديدان ، وفحص تأثيرات ضربة قاضية من RNAi ، وتركيب الديدان للتصوير ، وتصور الكالسيوم في البويضات والأجنة. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم توليد سلالات دودية إضافية للمساعدة في هذا النوع من التحليل. لتوضيح فائدة مراسل CaFE لتصور توقيت الإخصاب ، أبلغنا أن الإباضة المزدوجة تحدث عندما يتم استهداف IPP-5 بواسطة RNAi وأن البويضة الأولى فقط هي التي تخضع للتخصيب الفوري. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ هنا عن اكتشاف عابرات الكالسيوم أحادية الخلية أثناء التطور الجنيني المبكر ، مما يدل على أن مراسل CaFE يستمر في التطور المبكر. الأهم من ذلك ، أن مراسل CaFE في الديدان بسيط بما يكفي لاستخدامه لدمجه في فصول مختبر البحث الجامعي المستندة إلى الدورة التدريبية (CURE). يسهل مراسل CaFE ، إلى جانب الغدد التناسلية المرتبة وسهولة الحمض النووي الريبي في الديدان ، الاستفسار في ديناميكيات الخلية الخلوية المطلوبة لتنظيم الإخصاب الداخلي والتطور الجنيني المبكر.

المقدمة

يمثل الإخصاب بداية دورة حياة جديدة ، لكن تحديد اللحظة الدقيقة للتخصيب يمثل تحديا. السمة المحفوظة للتخصيب هي موجة من الكالسيوم عبر البويضة مباشرة بعد اندماج المنوية1. على الرغم من أن طبيعة موجة الكالسيوم ، من حيث التردد والسرعة ، تختلف باختلاف الأنواع ، إلا أن جميع الكائنات الحية تقريبا تظهر زيادة مؤقتة في الكالسيوم داخل الخلايا بعد الإخصاب. تلعب موجة الكالسيوم دورا مهما في كتلة تعدد المنوية وتنشيط البويضات والأحداث الخلوية المهمةالأخرى 2. نظرا لأن موجة الكالسيوم تبدأ في موقع اندماج المنوية ، فإن الكالسيوم يعمل كعلامة للتخصيب3.

Caenorhabditis elegans هو كائن حي نموذجي مثالي لدراسة التطور المبكر. الديدان عبارة عن خنثى شفافة قابلة للتتبعوراثيا 4. الأهم من ذلك بالنسبة لدراسة الإخصاب ، C. ايليجانس البالغين ينتجون البويضات باستمرار باستخدام غدد تناسليةمرتبة بدقة 5. في الواقع ، البويضات هي الخلايا الجديدة الوحيدة التي يتم إنتاجها لأن سوما ما بعد الانقسام في مرحلة البلوغ6. يسلط الشكل 1 الضوء على الغدد التناسلية ، والتي تتكون من أنبوبين متماثلين على شكل حرف U من البويضات النامية. تسمى البويضة الأقرب إلى المنوية (عضو تخزين المنوية) البويضة -1. يعمل تصميم خط التجميع هذا للدودة التناسلية على إباضة بويضة ناضجة في المنوية كل ~ 23 دقيقة عند 20 درجة مئوية عند الشباب7. ثم ينتقل الجنين المخصب حديثا إلى رحم مشترك قبل وضعه في فرج واحد.

التقنيات السابقة لتصور الكالسيوم أثناء الإخصاب في C. ايليجانس اعتمدت على الحقن المجهري للأصباغ الحساسة للكالسيوم3،8. لعرض موجة الكالسيوم بسهولة أكبر عند اندماج المنوية والبويضات ، تم إدخال مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا على أساس jGCaMP7s في نسخة واحدة في موضع الملاذ الآمن باستخدام تكرارات مجانسة قصيرة متباعدة بانتظام (CRISPR) 7،9. أطلق على المراسل اسم CaFE للكالسيوم أثناء الإخصاب في C. ايليجانس. لا يظهر المراسل أي عيوب كبيرة في علم وظائف الأعضاء أو الخصوبة.

هنا ، يتم تقديم بروتوكولات لتصور موجة الكالسيوم في البويضات والأجنة من C. ايليجانس باستخدام مراسل CaFE. إلى جانب الأدوات التي لا تعد ولا تحصى المتوفرة في مجتمع الدودة ، مثل تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) وعلامات الغدد التناسلية mCherry ، يسهل مراسل CaFE التحقيق في تنظيم أحداث الإخصاب الداخلي ، وخاصة كفاءة الإخصاب وتوقيت الإخصاب. بالإضافة إلى ذلك ، يستمر مراسل CaFE في التطور المبكر وهو أداة فريدة للتحقيق في التطور الجنيني.

البروتوكول

1. صيانة C. elegans

  1. تحضير لوحة نمو الديدان الخيطية المتوسطة (NGM)
    1. يمزج 3 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) و 2.5 جم من Bacto-Peptone و 20 جم من Agar و 1 لتر من الماء منزوع الأيونات في قارورة سعة 4 لتر (انظر جدول المواد). قم بتغطية الجزء العلوي من القارورة بورق الألمنيوم قبل التعقيم.
    2. الأوتوكلاف للتعقيم باستخدام إعدادات دورة التعقيم السائل. يوصى بضبط دورة التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. اترك الخليط يبرد إلى ~ 50 درجة مئوية ، حوالي 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    4. أضف 25 مل من 1 M KH2PO4 المعقم (مذاب في الماء ، الرقم الهيدروجيني = 6) ، 1 مل من 1 M CaCl2 المعقم (مذاب في الماء) ، 1 مل من 1 M MgSO4 المعقم (مذاب في الماء) ، و 1 مل من 5 مجم / مل من الكوليسترول (مذاب في 100٪ إيثانول) ، مع الدوران برفق بعد كل إضافة (انظر جدول المواد).
    5. باستخدام تقنية معقمة ، انقل جزءا من الخليط إلى دورق معقم سعة 300 مل لتسهيل سكبه. صب الوسائط الدافئة لتغطية قاع الطبق.
      ملاحظة: ما يقرب من 10 مل لكل لوحة في ألواح بتري معقمة مقاس 60 مم × 15 مم (انظر جدول المواد) ستنتج 100 لوحة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام أطباق بتري معقمة مقاس 35 مم × 10 مم ، حيث ينتج ~ 4 مل لكل طبق ~ 250 لوحا.
    6. اترك ألواح NGM تجف في RT لمدة يوم واحد على الأقل قبل البذر بالبكتيريا. قم بتخزين الأطباق رأسا على عقب عند 4 درجات مئوية للاستخدام في المستقبل.
  2. تحضير العشب البكتيري OP50
    1. اصنع مرق لوريا (LB) عن طريق الجمع بين 5 جم من مستخلص الخميرة ، و 10 جم من Bacto-Tryptone ، و 5 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1 لتر من الماء منزوع الأيونات في قارورة سعة 2 لتر (انظر جدول المواد). باستخدام طبق التحريك وشريط التقليب ، اخلطي حتى يذوب.
    2. Aliquot LB في زجاجات وأوتوكلاف باستخدام إعدادات دورة التعقيم السائل. يوصى بضبط دورة التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إذا كنت تستخدم حاوية بغطاء لولبي ، فقم بفك الغطاء اللولبي ربع دورة للتهوية المناسبة أثناء دورة الأوتوكلاف.
    3. اترك المرق يبرد حتى يصل إلى RT قبل الاستخدام.
    4. باستخدام تقنية معقمة ، قم بتلقيح 50 مل من LB في قارورة Erlenmeyer سعة 250 مل ببكتيريا OP50 وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الرج.
    5. باستخدام تقنية معقمة ، انقل 300 ميكرولتر من المزرعة المشبعة إلى وسط صفيحة NGM مقاس 60 مم × 15 مم. بالنسبة للألواح مقاس 35 مم × 10 مم ، يوصى باستخدام 100 ميكرولتر من الثقافة المشبعة.
    6. اترك الألواح تجف عند RT لمدة 1-3 أيام حتى تختفي البقعة البكتيرية OP50 سائلة. تأكد من جفاف الألواح وخلوها من التلوث قبل الاستخدام. قم بتخزين الأطباق في درجة حرارة 4 درجات مئوية للاستخدام في المستقبل. يقلل تخزين الألواح رأسا على عقب من التكثيف على سطح اللوحة.
  3. بناء اختيار الدودة
    1. قم بفك الياقة الفضية باتجاه رأس مقبض التقاط الدودة (انظر جدول المواد) عن طريق فك البراغي برفق حتى تتفكك الأقسام الأربعة.
    2. قطع 1.5 بوصة (حوالي طول الإبهام) من السلك البلاتيني (انظر جدول المواد) باستخدام المقص ووضعه في منتصف الأقسام الأربعة ؛ حوالي بوصة واحدة سوف تبرز من المقبض.
    3. امسك السلك في المنتصف أثناء شد الياقة ؛ ستجتمع الأقسام الأربعة معا في المنتصف وتثبت السلك البلاتيني في مكانه.
    4. قم بتشكيل السلك بعناية باستخدام زوج من كماشة الأنف المسطح. يميل شكل قوس قزح أو القوس إلى العمل بشكل أفضل للقطف.
    5. قم بإنشاء حوالي 2-3 مم "قدم" في نهاية السلك عن طريق تضييق الخناق بشكل متكرر باستخدام كماشة الأنف المسطح. استخدم هذه "القدم" لالتقاط الديدان والحفاظ على "القدم" مسطحة على سطح اللوحة.
      ملاحظة: سيؤدي التثبيت بقوة إلى قطع السلك البلاتيني. تجنب إنشاء حواف حادة باستخدام كماشة الأنف المسطح (أو ما يعادلها) لمنع ثقب الديدان أو الألواح.
  4. التعامل مع الدودة
    1. أمسك الدودة على غرار قلم رصاص وقم بتعقيم "القدم" عن طريق وضع السلك في لهب مصباح الإيثانول بنسبة 95٪ حتى يصبح لونه برتقاليا فاتحا.
    2. ضع صفيحة مصنفة OP50 على مرحلة نطاق التشريح وقم بإزالة الغطاء. المس برفق "قدم" المعول إلى منطقة من العشب البكتيري واستخدم حركة تمرير لطيفة لجمع البكتيريا في القاع. ستعمل البكتيريا العالقة في المعول (يشار إليها باسم "goo") كغراء لالتقاط الديدان.
    3. انقل صفيحة من الديدان إلى مرحلة نطاق التشريح وقم بإزالة الغطاء مع منع المعول من لمس الأسطح الأخرى. المس بسرعة وبلطف "قدم" المعول على دودة لالتقاطها. تتيح هذه التقنية نقل ديدان متعددة بين الصفائح في وقت واحد.
    4. المس برفق "قدم" المعول إلى الجزء غير المصنف من لوحة جديدة لنقل الديدان. عادة ما تكون هذه هي نفس اللوحة التي أخذت منها البكتيريا في القسم 1.4.2.
    5. عقم المعول بين كل صفيحة و / أو سلالة دودة لتجنب التلوث واترك المعول يبرد بعد التعقيم.
      ملاحظة: سيؤدي لمس معول ساخن على دودة إلى إجهاد أو قتله. سوف يبرد معول الدودة بعد لمس العشب البكتيري لالتقاط "المادة اللزجة" لنقل الديدان.
  5. الحفاظ على الديدان عند 20 درجة مئوية على ألواح NGM (الخطوة 1.1) المصنفة ببكتيريا الإشريكية القولونية OP50 (الخطوة 1.2). يمر الديدان 2-3 مرات في الأسبوع عن طريق نقل العديد من البالغين إلى أطباق جديدة (60 مم × 15 مم) باستخدام معول دودة (الخطوات 1.3-1.4) لتجنب الجوع ، والذي يمكن أن يغير علم وظائف الأعضاء.
    ملاحظة: C. ايليجانس السلالات وبكتيريا OP50 متوفرة من خلال مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة (CGC).

2. C. اإلكترونيات تزامن النمو

  1. مزامنة الديدان مع العمر باستخدام وضع البيض في الوقت المناسب (الموصوف هنا). إذا كانت هناك حاجة إلى عدد كبير من الديدان لفصل دراسي أو لغرض آخر ، فقم بإجراء مزامنة المبيض كما هو موضح في Golden et al.10.
  2. انقل الديدان البالغة إلى صفيحة OP50 جديدة مصنفة باستخدام معول سلك بلاتيني (موضح في القسم 1). يتم تحديد عدد الديدان من خلال الحاجة التجريبية. تضع الديدان في اليوم 1 ما يقرب من 3 بيضات في الساعة. لذلك ، ستولد 10 ديدان ما يقرب من 30 بيضة في 1 ساعة. يفضل استخدام الديدان في اليوم الأول من مرحلة البلوغ (اليوم 1).
  3. بعد حوالي 1 ساعة ، قم بإزالة الديدان البالغة من الطبق ، مع ترك البيض فقط.
    ملاحظة: يعد ترك دودة عن غير قصد خطأ شائعا. ستستمر الديدان المتبقية في وضع البيض وتعطيل التزامن. تنضج الديدان في اليوم الأول للبالغين على بعد حوالي 72 ساعة من وضعها عند تحضينها عند 20 درجة مئوية.

3. تركيب الديدان للتصوير

  1. عند تصوير أحداث الإخصاب ، استخدم البالغين في اليوم الأول لزيادة فرص التصور.
    ملاحظة: في اليوم الأول للبالغين ، يتم تخصيب البويضة كل ~ 23 دقيقة. ومع ذلك ، تتباطأ الإباضة مع تقدم العمر ، وسيتوقف الخنثى النموذجي عن وضع البيض بعد اليوم 4.
  2. تحضير محلول 3٪ من الاغاروز في الماء عن طريق خلط 3 جم من الاغاروز في 100 مل من الماء. سخني محلول الاغاروز باستخدام الميكروويف حتى يذوب الاغاروز تماما. لإعادة استخدام محلول صلب ، سخنيها حتى تذوب تماما. بعد عدة استخدامات ، قم بإنشاء حل جديد.
  3. ضع شريحة مجهر فارغة للتصوير بين شريحتين مجهريين أخريين تحتوي على طبقة واحدة من شريط المختبر عبر المحور الطويل للشريحة (انظر جدول المواد). ينشئ الشريط فاصلا لوسادة الاغاروز ، مما يسمح بالتوزيع المتساوي والعرض الموحد. تأكد من أن الشرائح الثلاث متتالية مع لمس الجوانب الطويلة: شريحتان بشريط يحيطان بشريحة مجهرية فارغة.
    1. قم بإسقاط محلول الاغاروز الساخن بنسبة 3٪ (~ 100-150 ميكرولتر) على مركز شريحة المجهر الموجودة بين الشرائح المسجلة باستخدام ماصة سعة 1 مل.
    2. ضع شريحة مجهرية جديدة بسرعة على قطرة الاغاروز ، مما يضمن أن الشريحة الجديدة عمودية على الشريحة مع قطرة الاغاروز وتستريح عبر الشرائح المسجلة المجاورة.
    3. افصل الشرائح برفق. تجنب تمزيق الوسادة.
    4. تحضير ضمادات الاغاروز طازجة كل يوم من التصوير. يوصى بعمل ضمادات متعددة عند التحضير للتصوير ، ولكن الامتناع عن تعريض أكثر من وسادة في نفس الوقت. سوف تجف الفوط المكشوفة بسرعة.
  4. باستخدام ماصة سعة 20 ميكرولتر، أضف قطرة صغيرة (~7 ميكرولتر) من 1 ملي مولار من الليفاميزول في المخزن المؤقت M9 إلى مركز وسادة الاغاروز لشل الديدان. استخدم محلول مخزون معقم بالفلتر 100 ملي من الليفاميزول لعمل محلول عمل 1 ملم.
    1. لعمل المخزن المؤقت M9 ، امزج 6 جم من Na2HPO4 ، و 3 جم من KH2PO4 ، و 0.5 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1 جم من NH4Cl ، و 1 لتر من الماء منزوع الأيونات في وعاء مناسب (انظر جدول المواد).
    2. قم بتعقيم المحلول باستخدام إعدادات دورة التعقيم السائل واترك المحلول يبرد إلى RT قبل الاستخدام. إذا كنت تستخدم حاوية بغطاء لولبي ، فقم بفك الغطاء اللولبي حوالي ربع دورة للتهوية المناسبة. يوصى بضبط دورة التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. اختر ما لا يقل عن 5 ديدان متزامنة ولمس "القدم" برفق إلى قطرة الليفاميزول لنقل جميع الديدان. استخدم ما لا يقل عن 5 ديدان لكل شريحة ، حيث يمكن أن يتسبب اتجاه الجسم في حجب الأمعاء للخط الجرثومي ، مما يمنع تصور موجة الكالسيوم في البويضة.
    ملاحظة: تأكد من نقل الديدان بسرعة لأن الليفاميزول سوف يتبخر إذا ترك جالسا على وسادة الاغاروز لمدة تزيد عن 5 دقائق.
  6. قم بتغطية وسادة الاغاروز بعناية بغطاء. تحقق من موقع الديدان ، حيث قد يتسبب الغطاء في تشتت الديدان من الموضع الأولي. قم بتسمية شريحة المجهر بالتفاصيل المناسبة ، مثل اسم السلالة الدودية (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تأكد من إجراء التصوير في أسرع وقت ممكن بعد تركيب الديدان ، لأن التعرض المطول لليفاميزول سام

4. تصوير الكالسيوم أثناء الإخصاب في  C. ايليجانس

  1. حدد موقع الديدان باستخدام هدف منخفض الطاقة ، مثل 4x ، على المجهر المفضل. استخدم إضاءة المجال الساطع.
  2. استخدم هدفا هواءيا لا يقل عن 20x لتصور موجة الكالسيوم في البويضات بوضوح. استخدم هدف الانغماس بمقدار 40 ضعفا أو أكثر.
  3. اعتمادا على النظام الذي يستخدمه المرء ، عادة ما تكون شدة الإثارة قيمة ثابتة. للحصول على التصور الأمثل لمراسلي الفلورسنت ، اضبط وقت الكسب أو التعرض.
    ملاحظة: سيؤدي الضوء المستمر عالي الكثافة إلى إتلاف العينة وهو ضار بصحة الديدان. إذا رغبت في ذلك ، قم بإيقاف تشغيل الليزر أثناء انتظار حدث الإخصاب لتجنب إضاءة GFP المستمرة. انظر السمات المميزة لحدث الإخصاب في الأقسام 4.8 - 4.9.
  4. تأكد من ضبط قناة GFP 488 نانومتر على طاقة ليزر حيث تكون إشارة مراسل CaFE مرئية بسهولة.
    1. للحصول على المسح الضوئي بالليزر ECLIPSE Ti2 من نيكون ، اكتشف مراسل CaFE بقوة ليزر تبلغ 30٪ لقناة GFP وكسب 75. حجم الثقب للمسح الضوئي بالليزر ECLIPSE Ti2 من نيكون هو 30 ميكرومتر.
    2. بالنسبة لقرص الغزل Andor Dragonfly متحد البؤر باستخدام كاميرا Zyla ، اكتشف مراسل CaFE بقوة ليزر تبلغ 30٪ لقناة GFP. حجم الثقب لقرص الغزل Andor Dragonfly متحد البؤر هو 40 ميكرومتر.
    3. اضبط إعدادات الليزر ووقت التعرض لكل عينة يتم فحصها.
  5. في حالة استخدام EAG28 (CaFE; PH-mCherry) أو EAG25 (CaFE ؛ H2B-mCherry) ، تأكد من ضبط القناة الحمراء على طاقة الليزر حيث تكون إشارة mCherry مرئية بسهولة بالإضافة إلى قناة GFP.
    1. بالنسبة لكونفوكال المسح الضوئي بالليزر ECLIPSE Ti2 من نيكون ، اكتشف مراسل mCherry بقوة ليزر تبلغ 15 لقناة RFP وكسب قدره 130.
    2. بالنسبة لقرص الغزل Andor Dragonfly متحد البؤر باستخدام كاميرا Zyla ، اكتشف مراسل mCherry بقوة ليزر تبلغ 30٪ لقناة RFP.
    3. اضبط إعدادات الليزر ووقت التعرض لكل عينة يتم فحصها.
  6. اضبط معدل الإطارات أو الإطارات في الثانية (fps) بالسرعة التي يسمح بها النظام.
    ملاحظة: عادة ما يتم ملاحظة مراسل CaFE بمعدل 1 إطارا في الثانية تقريبا للمسح الضوئي بالليزر ECLIPSE Ti2 من نيكون و 10 إطارات في الثانية لقرص الغزل Andor Dragonfly متحد البؤر مع كاميرا Zila.
  7. حدد الفاصل الزمني أو بروتوكول السلسلة الزمنية واضبط على الإعدادات المطلوبة. احصل على صور بفاصل زمني لمدة 30 دقيقة أو أقل، مع ضبط خيار التكرارات على "1".
    ملاحظة: إذا حدث الإخصاب يحدث قبل اكتمال الفاصل الزمني، فقم بإيقاف الفيديو للحفاظ على حجم الملف.
  8. حدد موقع الفيروسات المتنقلة على الشريحة وحدد دودة حيث يكون الغدد التناسلية القريبة مرئية. تلتف الأمعاء والغدد التناسلية حول بعضهما البعض داخل الدودة. على هذا النحو ، غالبا ما يتم حجب ذراع الغدد التناسلية بواسطة الأمعاء ، مما يمنع تصور الإخصاب. إذا كانت البويضة -1 محجوبة ، فحدد دودة أخرى للتصور. لزيادة احتمالية وجود ذراع الغدد التناسلية للدودة المحددة ، قم بتركيب ما لا يقل عن 5 ديدان لكل شريحة. استخدم البالغين في اليوم الأول المبكر لتصور الإخصاب.
  9. افحص كل -1 بويضة في أذرع الغدد التناسلية للدودة لتحديد ما إذا كان حدث الإخصاب وشيكا.
    ملاحظة: قبل الإخصاب ، أثناء النضج الانتصافي ، ستنتقل النواة الموجودة في البويضة -1 إلى الجزء الخلفي من البويضة ، ويذوب الغلاف النووي. تظهر هذه الأحداث في كل من قنوات Nomarksi و GFP باستخدام مراسل CaFE ، وتشير مثل هذه الأحداث إلى أن الإباضة ستحدث خلال ~ 10 دقائق القادمة.
  10. بعد انهيار الغلاف النووي ، سيتم إعادة ترتيب الهيكل الخلوي للبويضة الأكثر قربا ، -1 ، واتخاذ مظهر مستدير ، وفصله عن البويضة -2. في هذه المرحلة ، ستحدث الإباضة وشيكة. ابدأ في تسجيل الفيديو على الفور إذا لوحظت هذه الأحداث. التقط مقاطع فيديو في إعداد واسع المدى.
    ملاحظة: إذا كانت حركة النواة أو تقريب البويضة غير مرئية بعد 20 دقيقة ، فمن غير المرجح أن يحدث حدث الإباضة. ركز على دودة مختلفة و / أو قم بإعداد شريحة جديدة.

5. التقدير الكمي للعابرين من الكالسيوم في C. ايليجانس الإخصاب

  1. قم بقياس عابرات الكالسيوم من مقاطع فيديو الإخصاب باستخدام برنامج نظام المجهر مثل Nikon NIS Elements (الموضح هنا). ImageJ / FIJI مناسبة أيضا لتحليل الصور11.
  2. لتقدير التغيير في مضان مقاطع فيديو الإخصاب ، استخدم قيم الإشارة التالية: الإشارة في الوقت 0 ، والإشارة من إطار الاهتمام ، وإشارة خط الأساس.
  3. حدد الوقت والإطار اللذين يلتقطان أول انفجار من التألق يحدث في البويضة -1. حدد هذا الإطار على أنه الوقت 0.
  4. للحصول على الإشارة من إطار الاهتمام ، ارسم منطقة الاهتمام (ROI) لتشمل المناطق التالية: البويضة -1 قبل الإخصاب ، المنوية ، والبويضة المخصبة حديثا في الرحم. تسمى الإشارة المعروضة في عائد الاستثمار F1.
    ملاحظة: تأكد من أن عائد الاستثمار يغطي المنطقة التي تتاجر بها البويضة بأكملها. يجب أن يكون عائد الاستثمار متطابقا في كل إطار من تسجيل اللقطات المتتابعة الذي يتم تحليله.
  5. حدد مساحة فارغة من الصورة بدون مضان باستخدام نفس أبعاد عائد الاستثمار المحدد في الخطوة 5.4 لحساب إشارة الخلفية في كل إطار. اطرح إشارة الخلفية من كل إطار.
  6. للحصول على إشارة خط الأساس (F0)، حدد موقع الإطار في ما لا يقل عن 15 إطارا قبل الوقت 0. باستخدام نفس عائد الاستثمار كما في الخطوة 5.4 ، لاحظ الإشارة في كل إطار حتى الوقت 0. متوسط الإشارات (مع طرح الخلفية) من إطار البداية حتى الوقت 0 لحساب إشارة خط الأساس.
  7. احسب التغير في التألق (ΔF) باستخدام الصيغة التالية: figure-protocol-1. يتم تعريف F1 في كل رتل على أنه الإشارة في عائد الاستثمار بدون إشارة الخلفية. هو F0 هو متوسط إشارة الفلورسنت الأساسية البالغة ≥15 إطارا قبل الوقت 0 ، كما هو محسوب في القسم 5.6.
  8. حدد معدل التغيير بين الإطارات عن طريق طرح التغيير في التألق بين إطارين والقسمة على الوقت.

6. الحمض النووي الريبي في C. ايليجانس

  1. تحضير لوحات RNAi
    1. قم بإعداد الألواح وفقا للخطوة 1.1 وأضف الكواشف الإضافية التالية للسماح بالضربة القاضية للجينات عبر RNAi في الخطوة 6.1.4.
    2. أضف 1 مل من 1 M من الأيزوبروبيل المعقم المصفى ب 1 M β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (المذاب في الماء منزوع الأيونات) للحصول على تركيز نهائي قدره 1 ملي مولار IPTG في الوسائط (انظر جدول المواد).
    3. أضف 1 مل من الأمبيسلين المصفى بمقدار 100 مجم / مل (المذاب في الماء منزوع الأيونات) للحصول على تركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين في الوسائط (انظر جدول المواد). بدلا من ذلك ، استخدم 40 ميكروغرام / مل كاربينيسيلين12.
    4. قم بالتدوير برفق ولكن جيدا لخلط الأطباق وصبها كما هو موضح في الخطوات 1.1.4 - 1.1.5.
  2. تحضير مزرعة الحمض النووي الريبي المشبعة
    1. احسب كمية الاستزراع المشبع بضرب عدد ألواح الحمض النووي الريبي المصنفة المطلوبة في 300 ميكرولتر عند استخدام ألواح 60 مم × 15 مم أو بمقدار 100 ميكرولتر عند استخدام ألواح 35 مم × 10 مم.
    2. باستخدام تقنية معقمة ، تنمو بكتيريا الحمض النووي الريبي المرغوبة في LB (الموصوفة في الخطوات 1.2.1-1.2.3) التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية حتى تشبع. قم بتضمين سلالة بكتيرية تحتوي على ناقل L4440 الفارغ كعنصر تحكم سلبي وسلالة بكتيرية تحتوي على تحكم إيجابي في RNAi (على سبيل المثال ، بيضة -5) للتحقق من عمل RNAi. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتضمين حالة "فارغة" تحتوي على LB فقط للتحقق من عدم وجود تلوث في المخزون LB.
    3. أضف IPTG المصفى معقم إلى التركيز النهائي البالغ 1 ملي مولار إلى الثقافة الليلية المشبعة لتحريض تعبير dsRNA واحتضانها لمدة 2 ساعة و 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية قبل البذر. بدلا من ذلك ، قم بتخفيف الثقافة المشبعة بين عشية وضحاها خارج مرحلة السجل قبل الحث على IPTG.
      ملاحظة: يتم تضمين IPTG في كل من اللوحات والثقافة المشبعة للحصول على التعبير الأمثل ل dsRNA.
    4. باستخدام تقنية معقمة ، انقل 300 ميكرولتر من الثقافة المستحثة إلى مركز صفيحة RNAi مقاس 60 مم × 15 مم (صلبة). بدلا من ذلك ، استخدم 100 ميكرولتر من المزرعة المشبعة لصفيحة 35 مم × 10 مم.
    5. اترك الألواح تجف عند RT لمدة 1-3 أيام حتى تصبح بقعة بكتيريا RNAi سائلة. تأكد من جفاف الأطباق وخلوها من التلوث قبل الاستخدام. قم بتخزين الأطباق على حرارة 4 درجات مئوية رأسا على عقب لاستخدامها في المستقبل.
      ملاحظة: استخدم ألواح RNAi في أسرع وقت ممكن للحصول على ضربة قاضية مثالية ، حيث تقل فعالية RNAi بمرور الوقت. تخلص من إذا كان عمره >1 شهرا.
  3. كما هو موضح في القسم 2 ، قم بمزامنة الديدان مع ألواح RNAi.
    1. افحص الديدان بعد 1-2 أيام من تزامن وضع البيض بحثا عن تأخر النمو.
    2. قد تسبب بعض الحمض النووي الريبي عيوبا في النمو عندما تبدأ الضربة القاضية عند وضع البيض. إذا لزم الأمر ، ضع الديدان على ألواح RNAi في مرحلة لاحقة ، مثل L3.
  4. كما هو موضح في القسمين 3 و 4 ، قم بتركيب الديدان واستعد للتصوير باستخدام أي نظام مجهر مجهز للكشف عن تألق GFP.

7. تصوير الكالسيوم أثناء التطور الجنيني المبكر في C. ايليجانس

  1. مزامنة الفيروسات المتنقلة كما هو موضح في القسم 2. استخدم سلالة EAG28 ، التي تجمع بين مراسل CaFE وعلامة pleckstrin-homology domain-mCherry التي تسلط الضوء على حدود غشاء البلازما. بدلا من ذلك ، لتصور الأجنة المخصبة خارج الرحم ، اقطع الدودة برفق على طول الرحم باستخدام إبرة حقنة معقمة لتحرير الأجنة.
  2. قم بإعداد الديدان أو الأجنة للتصوير كما هو موضح في القسم 3 ، واتبع نفس التعليمات الموضحة في القسم 4 لتعيين معلمات التصوير.
  3. قم بتوسيط منطقة الاهتمام على رحم الدودة لتصور الأجنة أو البيضة الموضوعة.
    1. بالنسبة للأجنة في الرحم ، تأكد من أن الرحم ليس خلف الأمعاء ، وأن الرحم ليس مزدحما ، وأن الخلايا الفردية في الجنين واضحة في المستوى البؤري.
    2. بالنسبة للبويضات خارج الرحم ، تأكد من أن مراحل الخلايا لم تتجاوز مرحلة الفاصلة من دورة حياة الدودة.
  4. حدد الفاصل الزمني أو بروتوكول السلسلة الزمنية واضبط على الإعدادات المطلوبة.
    1. للحصول على التصور الأمثل لعابرة الكالسيوم الجنينية ، قم بزيادة إعدادات الوقت للأفلام المطولة. ضع في اعتبارك أن التعرض المستمر لليزر سيضر بالجنين على مدى فترات طويلة من الزمن.
  5. التقط مقاطع فيديو أو صورا من خلال التركيز على الخلايا الموجودة في الأجنة في مرحلة الخلية المطلوبة.
  6. استخدم هدف غمر 40x أو أكبر للتصوير ، على الرغم من أنه يتم اكتشاف العابرين بسهولة باستخدام هدف جوي 20x.

النتائج

باستخدام البروتوكولات الموضحة في هذه المخطوطة ، لوحظت الأنماط الديناميكية لإشارات الكالسيوم في الإخصاب والتطور الجنيني في C. ايليجانس.

يظهر تسلسل الإخصاب النموذجي في الديدان التي تحتوي على مراسل CaFE في الشكل 2. لتسهيل التحليل ، تم استخدام سلالة EAG28 التي تجمع بين مراسل CaFE ومجال التماثل pleckstrin (PH-mCherry) الجينالمعدل 13. يتم توطين علامة PH-mCherry في غشاء البلازما وتسمح بتصور أسهل لحدود الخلية ، لا سيما في ذراع الغدد التناسلية. تم إنشاء سلالة EAG28 عن طريق عبور سلالة EAG16 التي تحتوي على مراسل CaFE مع سلالة مراسل OD70 PH-mCherry13. في C. ايليجانس، تحدث الإباضة والتخصيب بشكل متزامن. يعتبر الوقت 0 من الإخصاب هو الإطار الأول حيث يتم اكتشاف إشارة مضان في بويضة الإباضة (الشكل 2). يحدث انفجار لامع من التألق في موقع اندماج المنوية بمجرد دخول الحافة الأمامية للبويضة إلى المنوية ، وهو عضو تخزين المنوية7. تظهر الإشارة قبل اكتمال الإباضة. موجة الكالسيوم ثنائية الطور ، مع انفجار أولي سريع تليها موجة من التألق من نقطة الدخول باتجاه القطب المقابل. تصبح البويضة بأكملها فلورية في <30 ثانية.

لاحظ أن مراسل CaFE موجود في نسخة واحدة ، وبالتالي ، فإن الإشارة ليست ساطعة مثل الجينات المعدلة وراثيا الأخرى. لا ينصح بالفاصل الزمني Z-stack أثناء الإباضة ما لم يكن قرص الدوار متحد البؤر متاحا ومحسنا. يمكن الحصول على صور مكدس Z قبل أو بعد الفيلم لالتقاط التغييرات ثلاثية الأبعاد في مورفولوجيا الغدد التناسلية. على الرغم من أن الصور هنا تم التقاطها باستخدام مجهر متحد البؤر ، فقد لوحظت أيضا أن العابرين باستخدام الفحص المجهري الفلوري واسع المجال وهو أكثر شيوعا وبأسعار معقولة من الكونفوكال. باستخدام كونفوكال المسح الضوئي بالليزر ، يبلغ معدل الإطارات حوالي 1 إطارا في الثانية. باستخدام قرص دوار ، يكون معدل الإطارات 10 إطارات في الثانية أو أسرع. إشارة الخلفية لمراسل CaFE كافية لإلقاء الضوء على البويضات الناضجة في ذراع الغدد التناسلية. عند الإخصاب ، عادة ما يتم ملاحظة زيادة 1.5-2x في شدة إشارة GFP.

توجد عدة طرق بديلة للقياس الكمي. على سبيل المثال ، برنامج تحليل الصور Imaris ، الذي أنشأته شركة Oxford Instruments (نفس الشركة الأم مثل المجهر متحد البؤر للقرص الدوار Andor Dragonfly) ، لديه القدرة على تحديد الإشارة في كل إطار من البويضة العابرة فقط بدلا من عائد استثمار أكبر. ومع ذلك ، فإن برنامج Imaris ليس مجانيا. بالإضافة إلى ذلك ، تم وصف استراتيجية تحليل الصور التفصيلية لقياس موجات الكالسيوم في البويضة بتفصيل ممتاز بواسطة Takayama و Fujita و Onami وتستخدم ImageJ ، وهي متاحة مجانا14. بدلا من ذلك ، تتطلب أجهزة التصوير الحرجي لتوضيح موجة إشارة الفلورسنت عبر بويضة واحدة معالجة صورة أكثر شمولا مما هو موصوف هنا ولكن تم وصفها في Takayama و Onami3.

ميزة مميزة ل C. ايليجانس هي قدرتها على التخلص من التعبير عن أي جين تقريبا عن طريق تغذية بكتيريا الديدان التي تعبر عن dsRNA لتحفيز RNAi الداخلي15،16. للحصول على التعبير الأمثل عن dsRNA ، تحتوي كل من ألواح RNAi وثقافة RNAi المشبعة على IPTG. يتم إنتاج dsRNA عن طريق التعبير عن الجين محل الاهتمام مع المحفزات المرافقة. هنا ، استخدمنا مكتبة Ahringer التي تستهدف معظم جينوم الدودة من خلال استخدام 16،256 سلالة بكتيرية17. بدلا من ذلك ، تم إنشاء ORFeome من ~ 11,000 نسخة RNAi بواسطة مختبر Vidal باستخدام نظام Gateway وهو متاح للشراء من خلال Horizon Discovery18.

لإثبات فائدة مراسل CaFE بالاشتراك مع RNAi ، قمنا بفحص الإباضة المبكرة. يؤدي الحذف الجزئي في ipp-5 إلى حدث إباضة مزدوج حيث تدخل كل من البويضة -1 والبويضة -2 إلى المنوية خلال نفس الإباضة19. IPP-5 هو فوسفاتيز يعمل على IP3 ويقلل بشكل فعال من مستويات الرسول الثاني IP3. وجدنا أن ضربة قاضية من RNAi ل ipp-5 تثير نمطا ظاهريا مزدوجا للإباضة مشابها للمتحور.

كشف تحليل مراسل CaFE أثناء الإباضة المزدوجة الناجمة عن ضربة قاضية IPP-5 RNAi عن جوانب جديدة من OET. أولا ، لوحظت إشارة الكالسيوم فور دخولها إلى المنوية في البويضة الرائدة -1 ولكن ليس في البويضة الزائدة -2 (الشكل 3). على الرغم من أن 2 بويضات يتم إباضةها ، إلا أن البويضة -1 لا تزال البويضة الوحيدة التي تظهر علامات النضج السليم ، على وجه الخصوص ، انهيار الغلاف النووي (NEBD). تشير هذه البيانات إلى أنه على الرغم من أن البويضة -2 في وجود المنوية ، إلا أنها ليست مؤهلة للتخصيب لأنها لم تنضج بشكل صحيح بعد. ثانيا ، تظهر البويضة -2 موجة كالسيوم متأخرة ، عادة عندما تخرج البويضة من المنوية للرحم. على الرغم من أن نضوج البويضات عادة ما يكون شرطا أساسيا للإباضة ، إلا أن هذه البيانات تشير إلى أن نضوج البويضة وكفاءة الإخصاب لا يزال من الممكن أن يحدث بعد الإباضة. يسلط تصور موجة الكالسيوم المتأخرة أثناء ضربة قاضية IPP-5 الضوء على مزايا مراسل CaFE لاستجواب كفاءة الإخصاب وتوقيته.

علاوة على ذلك ، اكتشفنا أن مراسل CaFE يمكن اكتشافه في البيض الموضوع ويكشف عن عابرين الكالسيوم أحادي الخلية أثناء التطور الجنيني المبكر في C. ايليجانس. أجنة من اليوم 1 المتزامن للبالغين EAG28 (CaFE; PH-mCherry) تم تصوير الديدان باستخدام البروتوكولات من الأقسام 1-5 باستخدام قرص الغزل Andor Dragonfly متحد البؤر باستخدام كاميرا Zyla (الشكل 4). تقتصر عابرات الكالسيوم على خلايا مفردة وتستغرق وقتا أقل من موجة الكالسيوم الإخصاب لإكمالها (~ 9 ثوان ، ن = 11). ومع ذلك ، لا يبدو أن موجة الكالسيوم أثناء التطور الجنيني ثنائية الطور. لم يتم ملاحظة عابرات الكالسيوم قبل المرحلة المكونة من 8 خلايا. والجدير بالذكر أن الكالسيوم لا يتوطن في ثلم الانقسام في C. ايليجانس، كما هو موضح في العديد من الكائنات الحية الأخرى ، بما في ذلك البشر و Xenopus20،21،22. لوحظت عابرة الكالسيوم أحادية الخلية بعد المعدة بفترة طويلة (~ 200 دقيقة بعد الإخصاب) وفي البيض الموضوع. يعرض جنين واحد العديد من العابرين من الكالسيوم بمرور الوقت ولكن في خلايا مختلفة وعادة ما يكون خلية واحدة في كل مرة. لاحظ أن التعرض المستمر للتحفيز بالليزر سيتلف الأجنة. يوصى إما بانخفاض طاقة LED / الليزر أو التعرض المتقطع. ومع ذلك ، نظرا لأن موجات الكالسيوم قصيرة نسبيا عند ~ 9 ثوان ، فإننا لا نوصي بأبطأ من 2 ثانية بين أحداث تحفيز LED / الليزر.

figure-results-1
الشكل 1: C. ايليجانس ذراع الغدد التناسلية. صورة لذراع الغدد التناسلية من سلالة دودة EAG25 ، تظهر مراسل CaFE GFP (أخضر) وعلامة هيستون 2B-mCherry (أحمر) ، والتي تسلط الضوء على النوى في السلالة الجرثومة. يشار إلى البويضة القريبة ب -1 مباشرة قبل المنوية ، حيث يتم تخزين المنوية (السهم). الجنين الأقرب إلى المنوية ولكن داخل الرحم هو أحدث جنين. تم التقاط الصورة باستخدام المسح الضوئي بالليزر Nikon ECLIPSE Ti2. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تصور موجة الكالسيوم أثناء الإخصاب. صور السلسلة الزمنية للتألق التي تعكس الكالسيوم داخل الخلايا أثناء الإخصاب في سلالة دودة EAG28. تحتوي سلالة EAG28 على كل من مراسل CaFE (أخضر) ومجال التماثل pleckstrin-mCherry fusion (أصفر) ، والذي يسلط الضوء على أغشية البلازما. يشير الوقت 0 إلى الإطار الأول الذي يصور زيادة واضحة في إشارة الفلورسنت في البويضة. يعكس الوقت 24.4 ثانية الإطار الأول الذي يظهر مضان البويضة الكاملة. تم التقاط صور السلسلة الزمنية باستخدام قرص الغزل Andor Dragonfly متحد البؤر مع كاميرا Zila. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: موجات الكالسيوم أثناء حدث الإباضة المزدوجة الناجم عن ipp-5 RNAi. صور بفاصل زمني لموجات الكالسيوم المتسلسلة للبويضة -1 والبويضة -2 في سلالة EAG16 (CaFE باللون الأخضر GFP) المعرضة ل ipp-5 RNAi. يشتمل الإطار -40.0 s على ملصقات ل -1 بويضة (-1) و -2 بويضة (-2) و spermatheca (*) و +1 جنين (+1). يعرض الوقت 0 ثانية الزيادة الأولية في مضان موجة الكالسيوم للبويضة -1. يظهر الوقت 4.5 ثانية موجة الكالسيوم المنتشرة باتجاه القطب المقابل في البويضة -1. يعرض الوقت 70.5 ثانية مضان الخلية الكاملة في البويضة -1 مصحوبة بالبويضة -2 عند إشارة GFP الأساسية ؛ كلتا البويضات موجودتان في المنوية. تدخل البويضة المخصبة -1 والبويضة -2 غير المخصبة الرحم في وقت 158.3 ثانية. عند 219.3 ثانية ، تعرض البويضة -2 موجة كالسيوم فلورية متأخرة. تم التقاط الصور باستخدام قرص الغزل Andor Dragonfly متحد البؤر مع كاميرا Zila. شريط المقياس = 30 ميكرومتر الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: عابرات الكالسيوم أحادية الخلية في التطور الجنيني المبكر. (أ) عرضت الأجنة في الرحم و (ب) خارج الرحم (البيضة الموضوعة) إشارة فلورية في خلية واحدة أثناء التطور الجنيني. تم التقاط الصور باستخدام قرص الغزل Andor Dragonfly متحد البؤر مع كاميرا Zila. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

الأداة البسيطة ذات البروتوكول القوي هي مزيج قوي لمعالجة الأسئلة العلمية الصعبة. هنا ، يتم تقديم طرق تصور الكالسيوم كوكيل يمكن اكتشافه بسهولة للتخصيب باستخدام مراسل CaFE. يستمر هذا المراسل نفسه في التطور الجنيني المبكر ويسمح أيضا بتصور عابرات الكالسيوم في التطور. تعمل إشارات الكالسيوم كرسول ثان حاسم يحدد التحولات الرئيسية في الوظيفة الخلوية ، خاصة بالنسبة لعلم الأحياء التنموي. في البويضة ، لا تشير مرحلة الانفجار الأولى لموجة الكالسيوم إلى توقيت الإخصاب فحسب ، بل تشير أيضا إلى موقع اندماج المنوية3. في C. ايليجانس، يتم تحديد محور AP أيضا من خلال موقع اندماج المنوية23. لذلك ، فإن القدرة على تصور الكالسيوم في البويضات والأجنة تسمح بالتحقيق في الأسئلة المعقدة التي تعتبر أساسية لبيولوجيا الخلية والتنمو.

يجب أن تكون الطريقة الموضحة هنا مع مراسل CaFE واضحة بما يكفي للمبتدئين في الديدان الخيطية. الطرق السابقة للكشف عن موجات الكالسيوم في بويضات C. ايليجانس اعتمدت على حقن الصبغة3،8،14. في حين أن هذه الدراسات كانت مهمة ومضيئة ، إلا أن حقن الصبغة يتطلب عمالة مكثفة ، ولا تتوفر معدات الحقن في كل مختبر.

تم تحسين البروتوكولات المعروضة هنا للديدان السليمة. لتحقيق أقصى قدر من فرصة النجاح ، تأكد من عدم وجود تلوث على وسط الدودة أو في عشب البكتيريا الذي تتغذى عليه الديدان. لا تعرض الديدان لظروف الإجهاد ، مثل درجة الحرارة ، لأنها ستؤثر على الإباضة والإخصاب. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تضمين ضوابط فعالية الحمض النووي الريبي مع كل تجربة حيث تقل الفعالية بمرور الوقت. استخدم تحكما إيجابيا لفعالية الحمض النووي الريبي مثل البيض -5 ، الذي يولد أجنة ، ولكن لا يوجد ذرية قابلة للحياة حيث يتم اختراق تكوين قشرالبيض 24. علاوة على ذلك ، يجب تحسين معلمات التقاط الصور لكل نظام فحص مجهري. يتم تضمين مواصفاتنا هنا كمرجع ، ولكن من المتوقع حدوث انحرافات. على الرغم من أن هذا النظام يكتشف بسهولة الكالسيوم السيتوبلازمي كبديل للتخصيب ، إلا أنه لا يمثل بالضرورة حدث اندماج المنوية والبويضات حسن النية.

تعمل المجموعة الواسعة من الأدوات والطفرات الموزعة بحرية داخل مجتمع الدودة على تعزيز فائدة مراسل CaFE. يتم دمج المراسل في جينوم الدودة ويمكن عبوره بسهولة إلى سلالات أخرى متحولة أو مراسلة C. ايليجانس سلالات 25. تم الإبلاغ هنا عن إنشاء EAG25 الذي يعبر عن مراسل CaFE بعلامة هيستون H2B-mCherry لتصور النوى (الشكل 1) و EAG28 مع كل من مراسل CaFE وعلامة مجال التماثل pleckstrin-mCherry ، والتي تسلط الضوء على محيط الخلية (الشكل 2) 13،26. تساعد كلتا السلالتين في تصور الخلايا في السلالة الجرثومية وأثناء التطور الجنيني. علاوة على ذلك ، فإن مرفق RNAi في
C. ايليجانس، عند استخدامه مع مراسل CaFE ، كشفت عن رؤى جديدة حول كفاءة الإخصاب. كما هو موضح في الإباضة المزدوجة الناجمة عن ضربة قاضية ipp-5 RNAi في الشكل 3 ، فإن وجود المنوية والبويضة المبوضة غير كاف لتحفيز حدث الإخصاب.

تشير هذه النتائج إلى أنه يجب أن تكون هناك إشارة أخرى ، أو عدم وجود مثبط ، تسمح للبويضة بالتخصيب. تظهر البويضة المبيضة قبل الأوان تأخر عابر الكالسيوم عندما تنتقل البويضة إلى الرحم. تشير موجة الكالسيوم المتأخرة هذه إلى أن البويضة -2 المبيضة قبل الأوان يمكن أن تطور كفاءة الإخصاب بمرور الوقت. نتوقع أن يتم دعم الدراسات حول توقيت الإخصاب ، لا سيما فيما يتعلق بإشارات الخلية وتنظيمها ، من خلال استخدام مراسل CaFE. بالإضافة إلى ذلك ، يستمر مراسل CaFE في التطور الجنيني ويعرض عابرات الكالسيوم أحادية الخلية. كما تم الإبلاغ عن إشارات الكالسيوم الجنينية هذه خلال ال 24 ساعة الأولى من تطور أسماك الزرد27. دور عابرات الكالسيوم غير معروف ، لكن الوجود يشير إلى حدث إشارات خلية أثناء التطور لم يتم استكشافه بعد. والجدير بالذكر أن العابرين للكالسيوم لم يلاحظ في البيضة الملقحة المخصبة حديثا. لذلك ، لا يتوطن الكالسيوم في ثلم الانقسام كما تم توثيقه في العديد من الكائنات الحية الأخرى ، بما في ذلك Xenopus والبشر20،21،22.

الأهم من ذلك ، أن مراسل CaFE سهل بما يكفي لاستخدامه من قبل الطلاب الجامعيين بأقل قدر من التدريب. لقد قمنا بتصميم وتنفيذ مختبر CURE (تجربة بحثية جامعية قائمة على الدورة) مكون من 1 ساعة معتمدة لطلاب علم الأحياء مع السلالات والبروتوكولات الموضحة هنا. على مدار الفصل الدراسي ، اجتمع الفصل مرة واحدة في الأسبوع لمدة 3 ساعات أو مرتين في الأسبوع لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة لكل منهما. تم منح الطلاب خيار العمل بأنفسهم أو في مجموعات من 2. اختار كل طالب / زوج جينا مختلفا للدراسة من قائمة منسقة. قاموا بإجراء RNAi ضد الجين الذي اختاروه في سلالة EAG28 وفحصوا الديدان بحثا عن تأثيرات على الخصوبة والتخصيب و / أو مورفولوجيا الغدد التناسلية. بناء على نتائجهم وقراءتهم للخلفية باستخدام الأدبيات الأولية ، طور الطلاب فرضيات يمكنهم اختبارها في التجارب اللاحقة. كان هذا التصميم التكراري حاسما لزيادة مشاركة الطلاب28. اكتسب الطلاب خبرة بحثية أصيلة واكتسبوا مهارات في الكائنات الحية النموذجية والشاشات الجينية والفحص المجهري الفلوري. نظرا لسهولة استخدام مراسل CaFE ، تمكن الطلاب الذين ليس لديهم خبرة بحثية من النجاح. بعد ذلك ، أعرب الطلاب بأغلبية ساحقة عن تفضيلهم لتنسيق CURE على فصول المختبر التقليدية ، حيث أعرب العديد من الطلاب عن رغبتهم في مواصلة البحث. مجتمعة ، تساعد هذه الأدوات والبروتوكولات في كل من التعليم والبحث في عمليات التنمية المبكرة.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة أو مالية.

شكر وتقدير

تم تمويل KSKG بمنحة من معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (R15HD111986). تم توفير بعض السلالات من قبل CGC ، والتي يمولها مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD4010440). نشكر WormBase.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أجارفيشر العلميDF0140-07-42 كجم ؛ يذوب المسحوق أسهل من الرقائق
AgaroseMidSciBE-A125500 جرام
مصباح كحولفيشر ScientificS13475استخدم مع 95٪ إيثانول
كلوريد الأمونيوم (NH4Cl)فيشر AAA1500030 العلمي250 جم
أمبيسلينفيشر ScientificBP1760-55 جم
AMSCO 400 Series معقم بخار صغيرSteris الرعاية الصحيةغير متوفرة باكتو
ببتونفيشر ScientificBP1420-500500 جم
باكتو تريبتونفيشر ScientificDF0123-17-3500 جم
كلوريد الكالسيوم (CaCl2) فيشرScientificC69-500500 جم
كوليسترولحراري علميA11470.1850 جم
اليعسوب 200 قرص دوارة متحد البؤرأكسفورد إنسترومنتس أندورN / Aتستخدم مع مجهر لايكا
فيشربراند سوبر فروست Cytogenics مجهر شرائحفيشر ساينتفيك22-035-900144 شريحة لكل عبوة
كماشة أنف مسطحة ، فك ناعمهومديبوت 305530604تأكد من أن الكماشة فك ناعم
الأيزوبروبيل بيتا ؛ - d-1-thiogalactopyranoside   ؛ ( IPTG)فيشر ScientificBP1755-1010 جم ؛ شريط مختبر خال من الديوكسان
يستخدم شريط فيشر Scientific15-901-10R0.5 بوصة لشريط شرائح المجهر
ليفاميزولفيشر ScientificAC18787010010 جم
كبريتات المغنيسيوم (MgSO4) فيشرScientificM63-500500 جم
غطاء مجهر زجاجيفيشر Scientific12541016عبوة 1 أونصة
من نيكون ECLIPSE Ti2 المسح الضوئي بالليزرنيكونN / A
برنامج Nikon NIS ElementsنيكونN / Aمتحد البؤر
OP50 الإشريكية القولونيةمركز Caenorhabditis لعلم الوراثة (CGC)OP50
Platinum WireTriTechPT-9010
ثنائي القاعدة فوسفات البوتاسيوم (K2HPO4)فيشر ScientificP288-500500 جم
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (KH2PO4)فيشر ساينتفيكAA1159436500 جم
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)فيشرساينتفيكS271-500500 جم
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة سباعي الهيدرات (Na2HPO4)فيشر ساينتفيكS471-33 كجم
مجهر ستيريولايكاKL300 LED
بتري معقم طبق (35 مم × 10 مم)CellTreat229638960 طبق بتري لكل علبة
طبق بتري معقم (60 مم × 15 مم)CellTreat229665 500 طبق بتري لكل علبة
سلالة EAG16 spn-4p :: jGCaMP7s: :p ie-1u< / em>مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة (CGC) EAG16تم إنشاؤه بواسطة Kim Guisbert Lab
Strain EAG25 spn-4p :: jGCaMP7s :: فطيرة -1 يو ؛ ujIs113 II.< / em>مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة (CGC)EAG25تم إنشاؤه بواسطة Kim Guisbert
Lab Strain EAG28 spn-4p :: jGCaMP7s: :p ie-1u ؛ unc-119 (ed3) III ؛ ltIs44 V.< / em>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)EAG28تم إنشاؤه بواسطة Kim Guisbert Lab
Strain JIM113 ujIs113 II [pie-1p:: mCherry:: H2B: :p ie-1 3'UTR + nhr-2p :: his-24 :: mCherry :: let-858 3'UTR + unc-119 (+)] < / em>مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة (CGC)JIM113تم إنشاؤه بواسطة E. Preston - سلالة مختبر
موراي OD70 unc-119 (ed3) III ؛ ltIs44 V [pie-1p :: mCherry: :P H (PLC1delta1) + unc-119 (+)]< / em>مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة (CGC)OD70تم إنشاؤه بواسطة Audhya / Oegema - Greenstein Lab
Tritech Worm Pick HandleTriTechTWPH1
مستخلص الخميرةIBI ScientificIB49160500 جم

المراجع

  1. Stein, P., Savy, V., Williams, A. M., Williams, C. J. Modulators of calcium signalling at fertilization. Open Biol. 10 (7), 200118(2020).
  2. McAvey, B. A., Wortzman, G. B., Williams, C. J., Evans, J. P. Involvement of calcium signaling and the actin cytoskeleton in the membrane block to polyspermy in mouse eggs. Biolo Reprod. 67 (4), 1342-1352 (2002).
  3. Takayama, J., Onami, S. The sperm TRP-3 channel mediates the onset of a Ca 2+ wave in the fertilized C. elegans oocyte. Cell Rep. 15 (3), 625-637 (2016).
  4. Yamamoto, I., Kosinski, M. E., Greenstein, D. Start me up: Cell signaling and the journey from oocyte to embryo in C. elegans. Dev Dyn. 235 (3), 571-585 (2006).
  5. Hubbard, E. J. A., Greenstein, D. The Caenorhabditis elegans gonad: A test tube for cell and developmental biology. Dev Dyn. 218 (1), 2-22 (2000).
  6. Korta, D. Z., Hubbard, E. J. A. Soma-germline interactions that influence germline proliferation in Caenorhabditis elegans. Dev Dyn. 239 (5), 1449-1459 (2010).
  7. Toperzer, K. M., Brennan, S. J., Carroll, D. J., Guisbert, E. A., Kim Guisbert,, S, K. Visualization of the biphasic calcium wave during fertilization in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded calcium indicator. Biol Open. 12 (9), 059832(2023).
  8. Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. Calcium dynamics during fertilization in C. elegans. BMC Dev Biol. 1 (1), 8(2001).
  9. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  10. Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (161), e61030(2020).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Kamath, R., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  13. Kachur, T. M., Audhya, A., Pilgrim, D. B. UNC-45 is required for NMY-2 contractile function in early embryonic polarity establishment and germline cellularization in C. elegans. Dev Biol. 314 (2), 287-299 (2008).
  14. Takayama, J., Fujita, M., Onami, S. In vivo live imaging of calcium waves and other cellular processes during fertilization in Caenorhabditis elegans. Bio Protoc. 7 (7), e2205(2017).
  15. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  16. Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. RNA Interference in Caenorhabditis elegans. Curr Protoc Mol Biol. 109, 1-30 (2015).
  17. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  18. Reboul, J., et al. elegans ORFeome version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression. Nat Genet. 34 (1), 35-41 (2003).
  19. Bui, Y. K., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans inositol 5-phosphatase homolog negatively regulates inositol 1,4,5-triphosphate signaling in ovulation. Mol Biol Cell. 13 (5), 1641-1651 (2002).
  20. Muto, A., Kume, S., Inoue, T., Okano, H., Mikoshiba, K. Calcium waves along the cleavage furrows in cleavage-stage Xenopus embryos and its inhibition by heparin. J Cell Biol. 135 (1), 181-190 (1996).
  21. Paudel, S., Sindelar, R., Saha, M. Calcium signaling in vertebrate development and its role in disease. Int J Mol Sci. 19 (11), 3390(2018).
  22. Paudel, S., Yue, M., Nalamalapu, R., Saha, M. S. Deciphering the calcium code: A review of calcium activity analysis methods employed to identify meaningful activity in early neural development. Biomolecules. 14 (1), 138(2024).
  23. Goldstein, B., Hird, S. N. Specification of the anteroposterior axis in Caenorhabditis elegans. Development. 122 (5), 1467-1474 (1996).
  24. Johnston, W. L., Dennis, J. W. The eggshell in the C. elegans oocyte-to-embryo transition. Genesis. 50 (4), 333-349 (2012).
  25. Stevenson, Z. C., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Jamison, B., Phillips, P. C. Rapid self-selecting and clone-free integration of transgenes into engineered CRISPR safe harbor locations in Caenorhabditis elegans. G3. 10 (10), Bethesda. 3775-3782 (2020).
  26. Zacharias, A. L., Walton, T., Preston, E., Murray, J. I. Quantitative differences in nuclear β-catenin and TCF pattern embryonic cells in C. elegans. PLoS Genet. 11 (10), e1005585(2015).
  27. Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during zebrafish embryonic development. BioEssays. 22 (2), 113-123 (2000).
  28. Wiseman, E., Carroll, D. J., Fowler, S. R., Guisbert, E. Iteration in an inquiry-based undergraduate laboratory strengthens student engagement and incorporation of scientific skills. J Scholarsh Teach Learn. 20 (2), 99-112 (2020).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

C elegans RNAi

مقالات ذات صلة