يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تطوير وتطبيق فوسفاتيز التيروزين المنظم بالراباميسين

1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67142

⸱

سبتمبر 6, 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Regenerative Medicine, University of Illinois at Chicago

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول تصميم وإنشاء وتطبيق الفوسفاتيز الخاضع للتنظيم بالرابامايسين. توفر هذه الطريقة خصوصية عالية وتحكما زمنيا صارما لتنشيط الفوسفاتيز في الخلايا الحية.

الملخص

فوسفاتيز التيروزين هي عائلة مهمة من الإنزيمات التي تنظم الوظائف الفسيولوجية الحرجة. غالبا ما تكون غير منظمة في الأمراض البشرية ، مما يجعلها أهدافا رئيسية للدراسات البيولوجية. الأدوات التي تمكن من تنظيم نشاط الفوسفاتيز مفيدة في تشريح وظيفتها. تفتقر الأساليب التقليدية ، مثل الإفراط في التعبير عن الطفرات السلبية النشطة أو المهيمنة ، أو تقليل التنظيم باستخدام siRNA ، إلى التحكم الزمني. غالبا ما يكون لمثبطات الفوسفاتيز خصوصية ضعيفة ، وتسمح فقط للباحثين بتحديد العمليات التي تتأثر بتثبيط الفوسفاتيز.

لقد طورنا نهجا كيميائيا ، وهو نظام الراباميسين المنظم (RapR) ، والذي يسمح بالتنظيم الخيفي للمجال التحفيزي للفوسفاتيز الذي يتيح تحكما زمنيا صارما لتنشيط الفوسفاتيز. يتكون نظام RapR من مجال iFKBP يتم إدخاله في موقع خيفي في الفوسفاتيز. تعطل الديناميكيات الهيكلية الجوهرية لمجال RapR المجال التحفيزي ، مما يؤدي إلى تعطيل الإنزيم. تتوسط إضافة الرابامايسين في تكوين مركب بين iFKBP وبروتين FRB المعبر عنه ، والذي يعمل على استقرار iFKBP واستعادة النشاط إلى المجال التحفيزي للفوسفاتيز.

يوفر هذا النظام خصوصية عالية وتحكما زمنيا صارما لتنشيط الفوسفاتيز في الخلايا الحية. تتيح القدرات الفريدة لهذا النظام تحديد الأحداث العابرة واستجواب مسارات الإشارات الفردية في اتجاه مجرى الفوسفاتيز. يصف هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية لتطوير RapR-phosphatase ، وتوصيفه الكيميائي الحيوي ، وتحليل آثاره على الإشارات النهائية وتنظيم الديناميكا مورفو للخلية. كما يوفر وصفا تفصيليا لاستراتيجية هندسة البروتين ، والمقايسات المختبرية التي تحلل نشاط الفوسفاتيز ، وتجارب تصوير الخلايا الحية التي تحدد التغيرات في مورفولوجيا الخلية.

المقدمة

فوسفاتيز بروتين التيروزين هي عائلة مهمة من البروتينات المشاركة في عدد كبير من أحداث إشارات الخلية. لقد ثبت أنها تلعب دورا رئيسيا في تنظيم تكاثر الخلايا والهجرة وموت الخلاياالمبرمج 1،2،3. وبالتالي ، فإن خلل تنظيم بروتين التيروزين فوسفاتيز يؤدي إلى مجموعة متنوعة من الأمراض والاضطرابات المنهكة4،5،6،7. لقد أعاقت دراسة الوظيفة الفسيولوجية لفوسفاتيز التيروزين ودورها في تطور هذه الأمراض تاريخيا بسبب نقص الأدوات اللازمة للتحقيق في تعقيدات إشارات الفوسفاتيز8.

تقليديا ، تتم دراسة الفوسفاتيز باستخدام طرق لا تتمتع بالخصوصية المطلوبة و / أو لا توفر تحكما زمنيا في نشاطها. هذه القيود الحرجة للأدوات المتاحة تجعل من الصعب تشريح أدوار محددة للفوسفاتيز في مسارات الإشارات. يوفر الإفراط في التعبير عن الطفرات السلبية النشطة والمهيمنة أو تقليل تنظيم التعبير عن الفوسفاتيز الخصوصية ولكنها تفتقر إلى التحكم الزمني وغالبا ما يمكن أن تؤدي إلى آليات تعويضية تخفي الوظيفة الحقيقية للإنزيم.

تسمح المثبطات الدوائية بالتنظيم الزمني للفوسفاتيز. ومع ذلك ، فإن العديد من مثبطات الفوسفاتيز معروفة بأنها غير محددة بسبب التركيب المحفوظ جيدا للموقع النشط في فوسفاتيز التيروزين9. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لقيود التصميم ، تظهر المثبطات التي تستهدف الموقع التحفيزي نفاذية غشاء الخلية الضعيفة10. قيد آخر للمثبطات هو أنها تسمح فقط بفحص آثار تعطيل الفوسفاتيز11. وبالتالي ، هناك حاجة إلى أدوات تمكن من تنشيط الفوسفاتيز بشكل محدد وقابل للتنظيم مؤقتا. ستسمح هذه الأدوات للباحثين بتحديد التأثيرات المباشرة لتنشيط الفوسفاتيز ، وفصلها عن شلالات إشارات متوازية متعددة غالبا ما يتم تنشيطها بواسطة المحفزات البيولوجية. الأهم من ذلك ، أن التحكم الزمني الصارم في النشاط يتيح تحديد الأحداث العابرة التي يسببها الفوسفاتيز ويفصل بين تأثيرات نشاط الفوسفاتيز الحاد والمطول. سيسمح الجمع بين التنظيم الزمني والتحليل الطفري بتشريح مفصل للأدوار المحددة للمجالات الفردية للفوسفاتيز واستجواب إشارات المصب12.

لمعالجة نقص القدرات المطلوبة في الأدوات الحالية ، طورت مجموعة Karginov نظام Rapamycin المنظم (RapR)13،14،15. يستخدم نظام RapR مجال تبديل هندسي ، iFKBP ، والذي يسمح بالتنظيم الخيفي للبروتين محل الاهتمام (POI). إن إدخال مجال iFKBP في موضع مقترن بشكل متساوي بالموقع التحفيزي ل POI يجعله عرضة للتنظيم بواسطة الرابامايسين. في حالة عدم وجود الرابامايسين ، يعطل iFKBP الموقع التحفيزي بسبب الديناميكيات الهيكلية العالية جوهريا ل iFKBP وبالتالي يعطل نقطة الاهتمام. تؤدي إضافة الرابامايسين إلى تفاعل iFKBP مع البروتين المعبر عنه المشترك FRB (الشكل 1). يؤدي هذا إلى استقرار مجال التبديل ، مما يؤدي بالتالي إلى استعادة بنية ووظيفة المجال التحفيزي ل POI. على هذا النحو ، تسمح الأداة بتنشيط محدد وقابل للتنظيم مؤقتا لنقطة الاهتمام.

figure-introduction-1
الشكل 1: تخطيطي للنظام المنظم بالرابامايسين RapR-Shp2. يسمح RapR بالتنشيط الخيفي للبروتين المعني بإضافة الراباميسين. تم تعديل هذا الرقم من Fauser et al.12. الاختصارات: iFKBP = FKBP12 قابل للإدخال. FRB = مجال ربط FKBP-rapamycin; R = رابامايسين ؛ Shp2 = تماثل Src -2 يحتوي على مجال بروتين التيروزين فوسفاتيز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يمكن تطبيق أداة RapR على عائلات البروتين المختلفة. يمكن استخدامه لتنظيم كينازات البروتين وكذلك الفوسفاتيز12،14. سيركز هذا البروتوكول على تطبيق أداة RapR للتحكم في Shp2 phosphatase. Shp2 هو بروتين تيروزين فوسفاتيز معبر عنه في كل مكان يشارك في عمليات الإشارات مثل الانتشار والهجرة والتعديل المناعي والتمايز1،16،17،18. ارتبط خلل تنظيم Shp2 بعدد من السرطانات الصلبة وسرطان الدم النخاعي واضطرابات النمو5،7. ومع ذلك ، فقد وقع Shp2 ضحية لنفس أوجه القصور في الأداة كما هو موضح أعلاه. لمكافحة هذه القيود ، تم تطوير RapR-Shp2 ، وهو بناء Shp2 قابل للتنظيم على وجه التحديد ومؤقتا ، وتميز12.

قبل تطوير RapR-Shp2 ، كان من المعروف أن Shp2 كان متورطا في هجرة الخلايا19،20،21. ومع ذلك ، فإن دورها المحدد في الإشارات التي تنطوي عليها هذه العملية لم يكن معروفا. كما لم يكن معروفا على أي مقياس زمني Shp2 ينظم هجرة الخلايا وما هي التغييرات الديناميكية المورفولوجية المحددة التي يسببها في نقاط زمنية مختلفة من تنشيطها. علاوة على ذلك ، لم يكن من الواضح ما إذا كان التنشيط الحاد والمطول ل Shp2 سيسبب آثارا مختلفة. باستخدام RapR-Shp2 ، وجد أن التنشيط الحاد ل Shp2 يؤدي إلى انتشار الخلايا العابرة ، وزيادة النتوءات ، واستقطاب الخلايا ، والهجرة. كما تم تحديد مسارات محددة في اتجاه مجرى Shp2 تنظم التغيرات الديناميكية المورفولوجيةالمميزة 12. يوفر هذا البروتوكول تفاصيل لتصميم وتوصيف RapR-Shp2 ، والتي يمكن استخدامها لتوجيه تطوير وتطبيق فوسفاتيز RapR الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تصميم RapR-phosphatases

  1. تخطيط
    ملاحظة: باستخدام RapR-Shp2 كمثال ، يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل الخطوات المهمة لإنشاء فوسفاتيز التيروزين المنظم بالراباميسين. تم تحسين البروتوكول الموصوف ل Shp2 وقد تكون هناك حاجة إلى تعديلات إضافية لتناسب خصائص محددة للفوسفاتيز الفردي.
    1. للتأكد من أن النشاط التحفيزي ل Shp2 يتم التحكم فيه بحتة بواسطة الرابامايسين وليس عن طريق الآليات الداخلية ، أدخل طفرة في الفوسفاتيز لإبقائه في شكل نشط أساسي. في حالة Shp2 ، أدخل طفرة D61A.
      ملاحظة: إذا لم يتم إدخال طفرة منشطة ل PTPase معين ، فسيعمل متغير RapR الخاص به كنظام AND مسور ينظمه الإشارات الداخلية والرابامايسين.
    2. تحديد مواقع إدخال iFKBP في المجال التحفيزي للفوسفاتيز باستخدام التركيب البلوري لتوجيه الاختيار كما هو موضح سابقا13. إذا لم يكن الهيكل متاحا ، فقم بإجراء محاذاة تسلسل الأحماض الأمينية مع المجال التحفيزي ل Shp2 phosphatase لتحديد مواقع الإدخال (الشكل 2 أ). تأكد من أن موقع الإدخال يقع في حلقة مرنة مقترنة هيكليا بالجيب التحفيزي ولكن يتم وضعها بعيدا عن الجيب لمنع العوائق الفراغية لربط الركيزة بواسطة iFKBP.
      ملاحظة: تمت مناقشة المزيد من التفاصيل حول الإدراج في المناقشة.
    3. ضع في اعتبارك نوع تسلسل الرابط الذي سيتم استخدامه بين مجال iFKBP المدرج والفوسفاتيز المعني. يعد اختيار تسلسل الرابط الأمثل أمرا مهما للغاية لنجاح أداة RapR ويتم مناقشته بمزيد من التفصيل في المناقشة (الشكل 2 ب).

figure-protocol-1
الشكل 2: تخطيطي للاعتبارات عند تصميم RapR-phosphatase. (أ) محاذاة Shp2 (أرجواني) و PTP1B (أخضر) و PTP-PEST (وردي) مع مواقع الإدراج المحفوظة التي تم تسليط الضوء عليها. (ب) تمثيل إدخال الرابط بين Shp2 و iFKBP. (ج) مجال الفوسفاتيز ل Shp2 باللون البيج مع مواقع الإدراج المشار إليها باللون الأزرق. تم تعديل هذا الرقم من Fauser et al.12. الاختصارات: Shp2 = تماثل Src-2 يحتوي على مجال بروتين التيروزين فوسفاتيز. iFKBP = FKBP12 قابل للإدخال؛ PTP = بروتين التيروزين فوسفاتيز. RapR = منظم الراباميسين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. إنشاء RapR-phosphatase

  1. إدخال iFKBP في الفوسفاتيز ذي الأهمية باستخدام الطفرات المعدلة الموجهة للموقع
    1. قم بإنشاء "megaprimer" ترميز iFKBP عبر PCR.
      1. تصميم بادئات لتخليق "megaprimer" التي تحتوي على 20-25 نيوكليوتيد تلدين إلى نهاية 5 'أو 3' من iFKPB ، وهو تسلسل رابط يربط iFKPB بالفوسفاتيز محل الاهتمام ، و 28-32 نيوكليوتيد يتوافق مع موقع الإدراج (الشكل 3). تأكد من أن المنتج الناتج يحتوي على iFKPB محاط بشظايا صلبة قبل وبعد موقع الإدخال في الفوسفاتيز محل الاهتمام.
      2. قم بتجميع iFKBP الذي يحتوي على "megaprimer" عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (10 ميكرولتر من 5x بوليميراز عازلة ، 1 ميكرولتر من 50 نانوغرام / ميكرولتر من الحمض النووي القالب الذي يحتوي على iFKBP ، 2 ميكرولتر من 10 ملي مولار dNTP ، 0.5 ميكرولتر من مخزون 100 ميكرومتر من كل "megaprimer" التمهيدي [إلى الأمام والخلف] ، 35 ميكرولتر من الماء ، 1 ميكرولتر بوليميراز الحمض النووي). قسم تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل هذا إلى تفاعلين منفصلين سعة 25 ميكرولتر قبل تشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بتشغيل دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا لتوصيات الشركة المصنعة لبوليميراز الحمض النووي أو دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسية التالية: (1) 98 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، (2) 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، (3) 55-70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، (4) 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، (v) كرر الخطوات من الثاني إلى الرابع 25x ، (vi) 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
      3. قم بتنقية "megaprimer" باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. قم بتحميل محتويات PCR من الخطوة السابقة في جل الاغاروز 1٪ وقم بتطبيق 120 فولت لمدة 30 دقيقة تقريبا. ابحث عن "megaprimer" بطول 400 نيوكليوتيدات في الجل ، واستئصال الجزء ، وتنقية باستخدام مجموعة استخراج الهلام (انظر جدول المواد).
        ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
    2. الطفرات المعدلة الموجهة بالموقع
      1. قم بإعداد تفاعل الطفرات الموجه للموقع المعدل باستخدام بلازميد يحتوي على جين الفوسفاتيز ذي الأهمية كقالب (5 ميكرولتر من 5x بوليميراز عازلة ، 2 ميكرولتر من قالب 50 نانوغرام / ميكرولتر ، 2 ميكرولتر من 10 ملي مولار dNTP ، 10 ميكرولتر من "megaprimer" المستخرج ، 2.5 ميكرولتر من الماء ، 2.5 ميكرولتر من DMSO ، 1 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي).
        ملاحظة: تؤدي إضافة DMSO في خليط التفاعل إلى خفض درجة حرارة التلدين22.
      2. قم بتشغيل دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية: خطوة التمسخ الأولية عند 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، تليها 18 دورة من خطوات الحضانة المتتالية عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 65 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 55 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 50 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 18 دقيقة. قم بتشغيل الدورة بين عشية وضحاها (وقت الدورة 7 ساعات). بمجرد اكتمال الدورة ، قم بتخزين تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل عند 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
      3. بعد اكتمال الدورة ، أضف 1 ميكرولتر من إنزيم DpnI واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
        ملاحظة: سيقوم DpnI بهضم القالب المتبقي ، مما يزيد من إنتاجية المنتج المركب حديثا.
      4. قم بتحويل المنتج المهضوم إلى DH5α الخلايا المختصة باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بلوحة التحول على ألواح أجار LB مع المضاد الحيوي المناسب للاختيار (كاربينيسيلين لبناء pcDNA RapR-Shp2). احتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل. بمجرد نمو المستعمرات ، قم بتخزين ألواح LB عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
        ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  2. عزل بنية الحمض النووي المطلوبة التي تحتوي على RapR-phosphatase
    1. إجراء فحص PCR للمستعمرات البكتيرية23. نظرا لأن جميع المستعمرات المزروعة على صفيحة LB لن تحتوي على البلازميد المطلوب ، تأكد من الفحص قبل عزل الحمض النووي البلازميد.
      ملاحظة: استخدم الاشعال للشاشة التي ستلدن بالقالب وفي جين iFKBP. يمكن عمل الشاشة باستخدام Taq polymerase mastermix (انظر جدول المواد).
    2. بمجرد تحديد المستعمرات الإيجابية ، قم بتلقيح مستعمرة إيجابية واحدة في 3 مل من مرق LB بما في ذلك المضاد الحيوي المناسب ، واحتضانه ، ورجه عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
    3. استخرج الحمض النووي البلازميد من المزرعة السائلة باتباع تعليمات الشركة المصنعة لمجموعة استخراج الحمض النووي البلازميد (انظر جدول المواد)
      ملاحظة: يوصى بتسلسل بنية RapR PTPase التي تم إنشاؤها حديثا قبل المتابعة في التقييم في المختبر .

figure-protocol-2
الشكل 3: تخطيطي لتصميم التمهيدي واستراتيجية استنساخ الطفرات المعدلة الموجهة بالموقع. الخطوة 1 هي تخليق iFKBP الذي يحتوي على "megaprimer" مع "نهايات لزجة" تلدين إلى موقع إدخال الفوسفاتيز محل الاهتمام ، والخطوة 2 هي إدخال "megaprimer" في الفوسفاتيز محل الاهتمام. تم تعديل هذا الرقم من Karginov et al.13. الاختصار: iFKBP = FKBP12 قابل للإدخال. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تقييم RapR-PTPase عن طريق فحص النشاط في المختبر

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول لتقييم تنظيم نشاط RapR-PTPase المصمم هندسيا. فيما يلي وصف لتحليل Shp2 المترسب المناعي باستخدام جزء طرفي N من باكسيلين كركيزة. قد يلزم اختيار ركيزة مختلفة لمعين من PTPase ذي أهمية.

  1. اليوم 1
    1. صفيحة 800,000 خلية HEK293T / بئر في صفيحة زراعة أنسجة مكونة من 6 آبار في وسائط DMEM مكملة بمكملات L-glutamine (التركيز النهائي 2 ملليمتر) و 10٪ FBS من حيث الحجم. ضعها في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 طوال الليل.
  2. اليوم 2
    1. بمجرد أن تصبح الخلايا ~ 60-80٪ ملتقية ، قم بنقلها وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للوصي المفضل (انظر جدول المواد).
      1. مثال على بروتوكول التعدين: أضف 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (pcDNA-mCherry-FRB و pcDNA-flag-RapR-Shp2 ، لكل منهما) إلى 200 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل و 6 ميكرولتر من كاشف التعداء واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أضف 100 ميكرولتر من خليط التعداء لكل بئر من الخلايا. قم بتضمين العينات المنقولة مع تركيبات Shp2 السلبية النشطة والمهيمنة بشكل أساسي كضوابط. احتضن طوال الليل في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 .
  3. اليوم 3
    1. تحضير البروتين-G السيفاروز
      ملاحظة: قم بإعداد أطراف الماصة المقطوعة قبل التعامل مع السيفاروس. يجب استخدام أطراف القطع في كل خطوة يتم فيها التعامل مع السيفاروس. يجب إعادة تعليق سيفاروس تماما في كل خطوة قبل سحب العينات.
      1. أعد تعليق وخذ الكمية المناسبة من Protein-G Sepharose في أنبوب سعة 1.5 مل. لكل بئر في طبق 6 آبار ، استخدم 10 ميكرولتر من Protein-G Sepharose. للحصول على طبق كامل مكون من 6 آبار ، استخدم 60 ميكرولتر من السيفاروس.
      2. اغسل السيفاروس ب 1 مل من محلول التحلل (انظر جدول المواد). جهاز طرد مركزي دقيق لمدة دقيقة واحدة عند 2,000 × جم وقم بإزالة عازلة التحلل بعناية. كرر 2x.
      3. أعد تعليق السيفاروس في 380 ميكرولتر من محلول التحلل. أضف BSA إلى التركيز النهائي 1 مجم / مل والجسم المضاد (0.5 ميكرولتر لكل عينة IP ، الجسم المضاد المضاد للعلم [انظر جدول المواد]). اقلب على دوار عند 4 درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة.
        ملاحظة: يجب تحديد الكمية المثلى للجسم المضاد تجريبيا لكل جسم مضاد مستخدم.
    2. تحضير الخلايا للترسيب المناعي.
      1. أضف كمية مناسبة من الرابامايسين (محلول مخزون 1 ملي مولار في الإيثانول) إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر أو أضف نفس الحجم من الإيثانول (التحكم السلبي) إلى العينات. احتضان لمدة 1 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 .
      2. ضع الطبق المكون من 6 آبار مع الخلايا على الثلج واغسل الخلايا برفق باستخدام 3 مل من PBS البارد. قم بشفط PBS وإضافة 300 ميكرولتر من Lysis Buffer (إما مع 1 ميكرومتر رابامايسين لعينة الفوسفاتيز المنشطة أو حجم مكافئ من الإيثانول في عينة التحكم السلبية) واكشط باستخدام مكشطة الخلية. انقل العينات إلى أنابيب سعة 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي دقيقة لمدة 10 دقائق عند 1,000 × جم عند 4 درجات مئوية.
      3. انقل 20 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل للتحقق من مستويات التعبير. أضف 20 ميكرولتر من 2x Laemmli Buffer مع 5٪ β-mercaptoethanol إلى كل أنبوب لاستخدامه للتحقق من التعبير واحتضانه عند 95-100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. استخدم المادة الطافية المتبقية للترسيب المناعي في الخطوة 3.3.3.3.
    3. الترسيب المناعي ل RapR-SHP2
      1. اغسل البروتين-G Sepharose من الخطوة 3.3.1.3. مع 1 مل من Lysis Buffer. جهاز طرد مركزي دقيق لمدة دقيقة واحدة عند 2,000 × جم عند 4 درجات مئوية في كل مرة واستنشق بعناية عازلة التحلل. كرر هذه الخطوة 2x.
      2. باستخدام أطراف القطع ، أعد تعليق السيفاروز في محلول التحلل (50 ميكرولتر لكل عينة ، لذلك بالنسبة للوحة 6 آبار ، أعد تعليقها في 300 ميكرولتر من محلول التحلل). الماصة 50 ميكرولتر من خليط السيفاروز المعلق في أنبوب جديد منفصل سعة 1.5 مل لكل عينة.
        ملاحظة: سيكون هناك تعليق من Sepharose في محلول Lysis Buffer المتبقي بسبب حجم Sepharose.
      3. أضف المادة الطافية المتبقية من الخلايا المحضرة من الخطوة 3.3.2.3 في كل أنبوب من أنابيب Sepharose. قم بالتدوير عند 4 درجات مئوية لمدة 1.5-2 ساعة.
    4. فحص نشاط الفوسفاتيز
      ملاحظة: يجب تحضير ركيزة Shp2 عن طريق فسفرة جزء N-terminal المنقى من باكسيلين باستخدام كيناز Src النشط بشكل أساسي باتباع بروتوكول تفاعل كيناز الموصوفسابقا 12.
      1. قرب نهاية الخطوة 3.3.3.3 ، قم بإعداد محلول الفوسفو-باكسيلين. لكل عينة ، أضف محلول فوسفو باكسيلين (التركيز النهائي 3 ميكروغرام / مل) إلى 40 ميكرولتر من إجمالي عازلة إيميدازول (انظر جدول المواد). أضف الرابامايسين إلى التركيز النهائي البالغ 1 ميكرومتر إلى كمية محلول الفوسفو-باكسيلين لعينات RapR-Shp2 المنشطة وحجم مكافئ من الإيثانول لمحلول العينات غير المنشطة.
      2. اضبط شاكر التسخين على 32 درجة مئوية.
        ملاحظة: قد تحتاج الفوسفاتيز الأخرى إلى درجة حرارة مختلفة لتحقيق النشاط الأمثل.
      3. اغسل السيفاروس بعينات من الخطوة 3.3.3.3 2x مع 0.5 مل من محلول التحلل (انظر جدول المواد). اغسل العينات 2x باستخدام 0.5 مل من محلول الغسيل. وينبغي أن يحتوي كل مخزن مؤقت إما على رابامايسين عند 1 ميكرومتر للعينات المنشطة أو حجم مكافئ من الإيثانول للعينات غير المنشطة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت بعد الغسيل النهائي.
        ملاحظة: بمجرد الوصول إلى هذه الخطوة، قد يكون من المفيد استخدام ماصة لإزالة الكميات النهائية من العازلة ببطء وحذر للتأكد من عدم استنشاق أي من السيفاروس. سيؤثر أي مخزن مؤقت متبقي على تركيز الفوسفو باكسيلين ويؤدي إلى قراءة غير دقيقة.
      4. أضف 40 ميكرولتر من خليط فوسفو باكسيلين إيميدازول العازلة المحضر إلى كل عينة ، مع أو بدون رابامايسين (يعتمد على العينة). انقر برفق شديد للخلط وضعه على الفور في شاكر التسخين واحتضانه لمدة 40 دقيقة عند 32 درجة مئوية. اضبط شاكر التسخين على 1,000 دورة في الدقيقة كحد أدنى لضمان تحريك العينة بالكامل طوال مدة الحضانة.
      5. أوقف التفاعل بإضافة 40 ميكرولتر من 2x Laemmli Buffer إلى كل عينة. احتضان العينات عند 95-100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تبريد العينات.
      6. قم بتحميل 15 ميكرولتر من كل عينة (بما في ذلك عينات المحللة من الخطوة 3.3.2.3) على هلام SDS-polyacrylamide متدرج بنسبة 4-15٪ وقم بتشغيل بروتوكول اللطخة الغربية القياسي باستخدام أغشية PVDF.
      7. لطخة باستخدام جسم مضاد مضاد للعلم للكشف عن بنية RapR-Shp2 ، ومضاد mCherry للكشف عن mCherry-FRB ، ومضاد pY118 أو مضاد pY31 باكسيلين للكشف عن فسفرة الباكسيلين.
        ملاحظة: يجب أن تبدو البقع الغربية الناتجة مشابهة للشكل 4.

4. تحليل نشاط RapR-Shp2 في الخلايا الحية

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول لتحديد قدرة RapR-Shp2 على إزالة الفوسفور من الركائز الداخلية وتحفيز الإشارات النهائية. ستتطلب RapR-PTPases الأخرى تحليلا لركائزها ومساراتها المحددة.

  1. اليوم 1
    1. صفيحة 198,000 خلية A431 / بئر في صفيحة زراعة أنسجة مكونة من 6 آبار في وسائط DMEM مكملة بنسبة 10٪ FBS و L-glutamine (التركيز النهائي 2 ملليمتر). ضعها في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 طوال الليل.
  2. اليوم 2
    1. قم بإصابة الخلايا بتركيبات الفيروسات الغدية التي تعبر عن RapR-Shp2 و FRB عن طريق إضافة الفيروس الغدي مباشرة إلى الوسائط الموجودة بالفعل في الطبق. اترك الفيروس الغدي على الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 طوال الليل. استخدم الخلايا المصابة ب FRB فقط كتحكم سلبي.
      ملاحظة: يجب تحديد كميات الفيروس الغدي على أساس كل حالة على حدة اعتمادا على العيار.
  3. اليوم 3
    1. تجويع خلايا A431 عن طريق الحضانة في DMEM مع 0.5٪ FBS لمدة 4 ساعات قبل التجربة.
    2. أضف الرابامايسين إلى التركيز النهائي البالغ 1 ميكرومتر أو نفس الحجم من الإيثانول (التحكم السلبي) إلى الخلايا لمدة 2-4 ساعات.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف الحضانة عن الفوسفاتيز الأخرى.
    3. ضع الطبق المكون من 6 آبار مع الخلايا على الثلج واغسل الخلايا برفق باستخدام 3 مل من PBS البارد. قم بشفط PBS ، وأضف 300 ميكرولتر من Lysis Buffer (انظر جدول المواد) ، وكشط بقوة باستخدام مكشطة الخلية. انقل العينات إلى أنابيب سعة 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي الدقيقة لمدة 5 دقائق عند 2,000 × جم عند 4 درجات مئوية.
    4. انقل 250 ميكرولتر من كل عينة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. أضف 250 ميكرولتر من 2x Laemmli Buffer مع 5٪ β-mercaptoethanol واحتضنه عند 95-100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    5. قم بتحميل 25 ميكرولتر من كل عينة على جل SDS-PAGE متدرج بنسبة 4-15٪ وقم بتشغيل بروتوكول لطخة غربية قياسي باستخدام أغشية PVDF.
    6. تقييم إزالة الفسفرة بوساطة RapR-Shp2 من EGFR و PLCγ باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل pY992 EGFR والأجسام المضادة ل pY783 PLCγ. تقييم التنشيط النهائي ل MAP kinase Erk1 / 2 من خلال تقييم فسفرته على بقايا pT202 / pY204.
      ملاحظة: يجب أن تبدو البقع الغربية الناتجة مشابهة للشكل 5.

5. تحليل التغيرات الديناميكية المورفولوجية الناتجة عن تنشيط RapR-Shp2 في خلايا HeLa باستخدام تصوير الخلايا الحية

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول لتحديد تأثير تنشيط RapR-Shp2 على تكوين نتوءات الخلايا وانتشار الخلايا والهجرة.

  1. اليوم 1
    1. لوحة 700,000 خلية هيلا في طبق ثقافة خلية 35 مم وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 . اسمح للخلايا بالالتصاق بالطبق (~ 2-3 ساعات).
    2. قم بنقل الخلايا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لكاشف التعداء المفضل (انظر جدول المواد).
      1. مثال على بروتوكول التعدي: أضف 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي (pcDNA-mCherry-FRB و pcDNA-Venus-RapR-Shp2 البلازميدات، لكل منهما) إلى 100 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل و 6 ميكرولتر من كاشف التعداد. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أضف خليط التعداء إلى الخلايا واحتضنه طوال الليل في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 . استخدم الخلايا المنقولة باستخدام pcDNA-mCherry-FRB فقط كعنصر تحكم سلبي.
    3. قم بتغطية غطاء زجاجي دائري للتصوير المباشر # 1.5 مقاس 25 مم بالفبرونيكتين (5 مجم / لتر) عن طريق الحضانة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
  2. اليوم 2
    1. اغسل الغطاء الزجاجي المطلي باستخدام PBS.
    2. قم بوضع خلايا HeLa المنقولة على الغطاء الزجاجي المطلي في وسائط DMEM المكملة بنسبة 10٪ FBS و L-glutamine (التركيز النهائي 2 ملليمتر) لتحقيق التقاء 30٪ قبل 4 ساعات من التصوير.
    3. بعد ساعتين من الطلاء ، قم بتبديل الوسائط الموجودة في اللوحة برفق إلى وسائط Leibovitz L-15 الخالية من المصل لمدة ساعتين.
    4. قم بتلطيخ الخلايا بصبغة غشاء البلازما CellMask Deep Red وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    5. ضع الغطاء في حجرة خلية تصوير نظيفة (انظر جدول المواد). أضف 1 مل من وسائط L-15 المسخنة مسبقا وقم بتغطيتها ب 1 مل من الزيت المعدني الدافئ مسبقا لمنع التبخر. احتفظ بالغرفة عند 37 درجة مئوية حتى التصوير.
    6. صور الخلايا عند 37 درجة مئوية باستخدام مرحلة ساخنة.
      1. حدد القنوات المناسبة لتصوير بنية RapR و CellMask للتصوير العرضي الفلوري. لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم الهدف 40x المشار إليه (انظر جدول المواد) ومجموعات المرشحات التالية: مرشحات الإثارة 514/10 و 540/21 للتصوير Venus-RapR-Shp2 ، ومرشحات الإثارة 561/10 و 595/40 للتصوير mCherry-FRB ، ومرشحات الإثارة 640/20 و 655LP لتصوير CellMask Deep Red. استخدم مرآة متعددة النطاقات متعددة النطاقات لجميع قنوات الفلورسنت (انظر جدول المواد).
      2. التقط الصور كل دقيقتين لمدة 4-4.5 ساعات.
        ملاحظة: ستتطلب التغييرات الديناميكية المورفوديناميكية الأسرع اكتسابا أكثر تكرارا.
      3. بعد ساعة واحدة من التصوير ، أضف الرابامايسين إلى التركيز النهائي البالغ 1 ميكرومتر لتحفيز RapR-Shp2.

6. تحليل الصور

ملاحظة: سيصف هذا البروتوكول إنشاء أقنعة الخلية بناء على . ملفات مكدس TIF التي تم جمعها من تجارب التصوير المباشر. سيصف بعد ذلك كيفية إنشاء ماكرو في ImageJ لتحليل الأقنعة ، مما سينتج عنه جدول بيانات لمنطقة الخلية يتم تحليله بعد ذلك بحثا عن التغييرات بمرور الوقت. أخيرا ، سيتم تحليل النشاط البارز والانكسافي للخلية باستخدام التحول.

  1. قم بإنشاء قناع ثنائي لصور CellMask باستخدام الدالة MovThresh من حزمة برامج CellGeo24.
  2. انسخ مجلد MovThresh إلى مجلد تحليل الصور.
  3. انسخ صور قناة CellMask أو غيرها من صور قناة علامة الغشاء إلى مجلد MovThresh.
    1. إذا تم تصوير خلايا متعددة في موضع واحد، فقم بقص الصور لإنشاء ملفات تحتوي على خلية واحدة فقط قبل إنشاء القناع في MatLab.
  4. تأكد من تعيين الدليل بشكل صحيح إلى مجلد MovThresh في MatLab.
  5. قم بتشغيل MovThresh.
  6. استيراد مكدسات الصور واحدة تلو الأخرى.
  7. حدد منحنى مسطح ثم قم بتشغيل Rethreshold.
  8. احفظ كرقم Mask_Image في مجلد جديد يسمى أقنعة.
  9. بمجرد تحويل جميع مجموعات الصور إلى أقنعة ، افتح مكدسات الصور في برنامج ImageJ25.
    1. تحليل مساحة الخلية في ImageJ
      1. افتح جميع مجموعات صور القناع في ImageJ.
      2. اضبط ضبط القياسات على المنطقة.
      3. انقر فوق الإضافات | وحدات الماكرو | سجل.
      4. انقر فوق عملية | ثنائي | جعل ثنائية.
        1. حدد الخيار الافتراضي .
          ملاحظة: لا تنقر على أي شيء إضافي أثناء تسجيل الماكرو. إذا تم تضمين خطوات إضافية، فمن المستحسن إعادة التشغيل من الخطوة 6.9.1.3.
      5. انقر فوق تحليل | تحليل الجسيمات.
        1. قم بإلغاء تحديد جميع المربعات باستثناء الملخص.
      6. قم بإنهاء التسجيل وانقر فوق إنشاء إنشاء الماكرو.
      7. اضغط على تشغيل لكل مكدس صور بعد تحديده واحفظ جدول النتائج لكل مكدس صور. سيتم حفظ الخيار الافتراضي كملف csv.
      8. احفظ الماكرو وأعد استخدامه للتحليلات المستقبلية (اختياري).
    2. معالجة بيانات المنطقة في جدول بيانات
      1. لكل خلية تم تحليلها ، قم بحساب متوسط مساحة الخلية من الصور الملتقطة قبل التنشيط باستخدام الرابامايسين.
      2. اقسم جميع قيم المنطقة على متوسط مساحة الخلية التي تسبق إضافة الرابامايسين.
      3. احسب متوسط القيمة لكل نقطة زمنية لجميع الخلايا المصورة وحدد فترات الثقة بنسبة 90٪. ارسم البيانات.
    3. تحليل نشاط الخلية البارزة
      1. انسخ المجلد ProActive إلى مجلد تحليل الصور.
      2. انسخ مكدسات الصور المقنعة من MovThresh إلى مجلد ProActive الذي تم إنشاؤه حديثا.
      3. افتح MatLab وقم بتعيين الدليل إلى المجلد ProActive.
      4. قم بتشغيل ProActive.
      5. قم باستيراد ملفات مكدس صور الخلية المقنعة إلى واجهة المستخدم الرسومية ProActive.
      6. حدد نوع النشاط. سيولد تحليل النشاط البارز بيانات المكتسبة في المنطقة ؛ سيؤدي تحليل النشاط التراجع إلى إنشاء بيانات المنطقة المفقودة ؛ وسيولد النشاط الكلي بيانات تغيير المنطقة الإجمالية (المفقودة والمكتسبة).
      7. تعيين المنطقة لتعريف التطبيع.
      8. منحنى سلس إما باستخدام قيم العتبة المقترحة أو باستخدام المتوسط لإعادة عتبة كل نقطة زمنية. يؤدي هذا إلى متوسط العتبات عبر نافذة معينة ، مما يقلل من التناقضات في العتبة بين النقاط الزمنية.
      9. انقر فوق ملف | حفظ باسم | النتائج (.mat)
        1. في حالة معالجة جميع أنواع نشاط المنطقة الثلاثة، قم بتسمية ملفات البيانات المعالجة على النحو التالي: ProResultData # أو RetResultData # أو ResultData #.
          ملاحظة: قم بتضمين المسافة قبل الرقم ورقم البيانات بدءا من 1.
      10. كرر من الخطوة 6.9.3.6. لجميع مكدسات الصور المقنعة التي تم استيرادها.
      11. بمجرد معالجة جميع الخلايا، أغلق واجهة المستخدم الرسومية ProActive GUI.
      12. افتح DataToFileTotalArea في محرر Matlab لمعالجة إجمالي نشاط ملفات "ResultData".
      13. قم بتغيير عدد الخلايا لمطابقة عدد ملفات النتائج التي تم إنشاؤها. إذا تمت معالجة 7 خلايا في الخطوات 6.9.3.5–6.9.3.10 ، فتأكد من أن الأسطر الثلاثة الأولى من البرنامج النصي هي كما يلي:
        اسم الملف = 'بيانات النتيجة' ؛
        الخلايا = 1: 7 ؛
        تأخر = 1 ؛
      14. اضغط على تشغيل وكرر هذا ل DataToFileProtArea و DataToFileRetArea لمعالجة البيانات البارزة والانسحابية ، على التوالي. سينتج عن هذا التحليل ثلاثة ملفات نصية "AllCells.txt" و "AllCellsPro.txt" و "AllCellsRet.txt"
      15. افتح ملفات .txt في جدول بيانات وقم بتطبيعها كما في القسم 6.9.2. احسب متوسط القيمة لكل نقطة زمنية لجميع الخلايا المصورة وحدد فترات الثقة بنسبة 90٪. ارسم البيانات.
        ملاحظة: يجب أن تبدو المخططات الناتجة من الخطوات المذكورة أعلاه مشابهة للشكل 6.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح الشكل 4 النتائج التي يمكن توقعها من مقايسة نشاط الفوسفاتيز القائم على الباكسيلين. في هذه التجربة ، تمت مقارنة نشاط الفوسفاتيز السلبي النشط والمهيمن من Shp2 بنشاط RapR-Shp2 النشط وغير النشط باستخدام فوسفو باكسيلين كقراءة. تم ترسيب تركيبات Shp2 مناعية وإخضاعها لمقايسة النشاط كما هو موضح في البروتوكول. كانت قراءات الفوسفو-باكسيلين ل Shp2 النشط بشكل أساسي و RapR-Shp2 النشط متشابهة ، مما يشير إلى أن RapR-Shp2 النشط لم يتأثر سلبا بإدخال مجال RapR واحتفظ بالنشاط الكامل بمجرد تنشيطه. كان Shp2 ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول خطوات مفصلة لتطوير وتوصيف وتطبيق الفوسفاتيز التي يتم التحكم فيها كيميائيا. تعتمد أداة RapR-Shp2 على مفتاح منظم بالرابامايسين يتم إدخاله في المجال التحفيزي Shp2. تكمن قوة هذه الأداة في الخصوصية والتحكم الزمني الصارم في نشاط الفوسفاتيز. الأداة قابلة للتطبيق على الفوسفاتاز الأخرى ، وبالاقتران مع تقنية RapR-TAP الموصوفة سابقا ، تسمح بإعادة بناء مسارات الإشارات الفردية26. سمحت القدرات الفريدة لنهج RapR للباحثين بتحديد الأحداث العابرة الناجمة عن تنشي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

يقر المؤلفون بالدكتورة جوردان فوزر لمساهمتها في تطوير RapR-Shp2 والبروتوكولات المرتبطة بها. تم دعم العمل بجائزة 5R35GM145318 من NIGMS ، وجائزة R33CA258012 من NCI ، وجائزة P01HL151327 من NHLBI.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
# 1.5 أغطية زجاجية 25 مم أدوات وارنر المستديرة64-0715
1.5 مل أنابيب الولاياتالمتحدة الأمريكية العلميةcc7682-3394
2x Laemmli Bufferل 500 مل: 5.18 جم Tris-HCL ، 131.5 مل جلسرين ، 52.5 مل 20٪ SDS ، 0.5 جم بروموفينول أزرق ، درجة الحموضة النهائية 6.8
4-20٪ Mini-PROTEAN TGX جل مسبقة الصبBiorad4561096
5x Phusion Plus BufferThermo ScientificF538L
A431 CellsATCCCRL-1555
AgarsoseGoldBiotechA-201
Attofluor Cell ChamberinvitrogenA7816
Benchmark Fetal Fibro Serum (FBS)Gemini Bio-products100-106الحرارة المعطلة الثلاثية 0.1 & micro ؛ م العميد المعقم
المصفى 35،30 w / v ٪Acros329581000
BSAGoldBiotechA-420
CellGeoN / AN /A نشرت في 10.1083 / jcb.201306067
CellMask صبغة غشاء البلازما الأحمر العميقinvitrogenc10046
Colony Screen MasterMixGenesee42-138
DH5a المختصة الخلاياNEBC2987H
DMEMCorning15-013-CV
DMSOThermo ScientificF-515
سلم الحمض النوويGoldBioD010-500
dNTPsNEBN04475
DpnI إنزيمNEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-Dithiothreitol ، كواشف كليلاند
EGTAAcros409910250
Fibronectin من بلازما الأبقارSigmaF1141
FuGENE (R) 6 كاشف التعداءPromegaE2692كاشف
طقم استخراج جلThermo ScientificK0692GeneJET Gel
Gel Stain GreenNucleic Stain GoldBioG-740-500
صبغة تحميل جل أرجواني 6xNEBB7024A
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (100x) 100 مل
خلايا HEK 293T ATCCCRL-11268
HeLa CellsATCCCRM-CCL-2
HEPESFischerBP310-500
ImageJ FoamSoftware N / AN / A
Igepal CA-630 (NP40)SigmaI3021
Imidazole Buffer25 mM Imidazole pH 7.2 ، 2.5 mM EDTA ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي DTT
KClSigmaP-4504
L-15 1xCorning10-045-CV
LB AgarFisherBP1425-2
عازلةالتحلل20 ملي مولار Hepes-KOH ، درجة الحموضة 7.8 ، 50 ملي كلوميشان ، 1 ملي مولار EGTA ، 1٪ NP40
تحديث MATLABMathWorks N/ AR 2022b لتشغيل وظائف CellGeo
أتمتة الفحص المجهري المتحول وتحليل الصورN / AN / A
MgCl2< / sub>Fisher ChemicalM33-500
زيت معدنيSigmaM5310
MiniPrep KitGene Choice96-308
Mini-PROTEAN TGX المواد الهلامية مسبقة الصب 12 بئرBio-Rad4561085
البيولوجيا الجزيئية الصف WaterCorning46-000-CV
متعددة النطاقات مرآة متعددة الأحرفتقنيةكروما 89903BS
NaClFisher ChemicalS271-3
أوليمبوس UPlanSAPO 40x الموضوعأوليمبوسN / A
PBS w / o Ca و MgCorning21-031-CV
أنابيب PCRlabForce1149Z650.2 مل أنابيب وأغطية 8 شرائط ، شريط صلب متصل بشكل فردي قبة أغطية
Phusion Plus DNA PolymeraseThermo ScientificF630S
بادئاتIDT
Protein-G SepharoseMillipore16-266
أغشية PVDFBioRad1620219Immun-Blot PVDF / شطائر ورق الترشيح
RapamycinFisherAAJ62473MF
0.25٪ تريبسين ، 2.21 ملي EDTA ، 1x [-] الصوديومCorning25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50xFischerBP1332-1للعزلان
الكهربائي Wash Buffer20 mM Hepes-KOH ، درجة الحموضة 7.8 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 100 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار EGTA ، 1٪ NP40
بيتا ؛ -MercaptoethanolFisher ChemicalO3446I-100<
قوي > الأجسام المضادة < / قوي >
إشارات خليةالأجسام المضادة2232
إشارات خلية الأجسام المضادة المضادة للإيرك 1/29102
الأجسام المضادة للعلمMillipore-SigmaF3165
الأجسام المضادة المضادة ل GAPDHinvitrogenAM4300
الأجسام المضادة ل GFPClontech632380
الأجسام المضادة ل mCherryinvitrogenM11217
الأجسام المضادةللبكسيلين Thermo FischerBDB612405
المضادة للفوسفو EGFR Y992 إشارات الخلايا المضادة للجسم المضاد2235
مضاد للفوسفو Erk 1/2 T202 / Y204 إشارات خلايا الأجسام المضادة9101
المضادة للفوسفو باكسيلين Y31 الأجسام المضادةMillipore-Sigma05-1143
Anti-phospho-PLC & gamma ؛ Y783 إشارات خلية الأجسام المضادة14008
مكافحة PLC & جاما ؛ إشارات خلايا الأجسام المضادة5690
التعداء Acid Processing تم استخدام برنامج مضاد ل EGFR المضادة

المراجع

  1. Amin, A. R. M. R., et al. SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).
  2. Niogret, C., et al. Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
  3. Wang, Y. -C., et al. Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling. J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).
  4. Yu, M., et al. The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK. Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).
  5. Lauriol, J., et al. Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines. J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).
  6. Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nat Genet. 29, 465-468 (2001).
  7. Xu, R., et al. Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia. Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).
  8. Mustelin, T., et al. Protein tyrosine phosphatases. Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).
  9. Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma. Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).
  10. Guo, M., et al. Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials. Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).
  11. Weiser, D. C., Shenolikar, S. Use of protein phosphatase inhibitors. Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).
  12. Fauser, J., et al. Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity. J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).
  13. Karginov, A. V., Hahn, K. M. Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).
  14. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).
  15. Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineering proteins for allosteric control by light or ligands. Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).
  16. Wang, Y., et al. Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth. EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).
  17. Wang, L., et al. SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation. FASEB J. 35, e21106(2021).
  18. Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).
  19. Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials. Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).
  20. Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration. Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).
  21. Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion. J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).
  22. Kramer, M. F., Coen, D. M. Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).
  23. Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies. Biotechniques. 7, 689-690 (1989).
  24. Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
  25. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  26. Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. Kinase Signaling Networks. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).
  27. Mercan, F., Bennett, A. M. Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).
  28. Karginov, A. V., et al. Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP. J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).
  29. Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. Optochemical activation of kinase function in live cells. Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تنظيم الراباميسينالأدوات الكيميائية الجينيةتنشيط الفوسفاتازالتنظيم التفارغيفوسفاتاز SHIP-2خلايا HEK-293Tمقايسة الترسيب المناعيلطخة ويسترنالديناميكا المورفولوجية للخلايا
تطوير وتطبيق فوسفاتيز التيروزين المنظم بالراباميسين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.