تطوير وتطبيق فوسفاتيز التيروزين المنظم بالراباميسين

Summary

يصف هذا البروتوكول تصميم وإنشاء وتطبيق الفوسفاتيز الخاضع للتنظيم بالرابامايسين. توفر هذه الطريقة خصوصية عالية وتحكما زمنيا صارما لتنشيط الفوسفاتيز في الخلايا الحية.

Abstract

فوسفاتيز التيروزين هي عائلة مهمة من الإنزيمات التي تنظم الوظائف الفسيولوجية الحرجة. غالبا ما تكون غير منظمة في الأمراض البشرية ، مما يجعلها أهدافا رئيسية للدراسات البيولوجية. الأدوات التي تمكن من تنظيم نشاط الفوسفاتيز مفيدة في تشريح وظيفتها. تفتقر الأساليب التقليدية ، مثل الإفراط في التعبير عن الطفرات السلبية النشطة أو المهيمنة ، أو تقليل التنظيم باستخدام siRNA ، إلى التحكم الزمني. غالبا ما يكون لمثبطات الفوسفاتيز خصوصية ضعيفة ، وتسمح فقط للباحثين بتحديد العمليات التي تتأثر بتثبيط الفوسفاتيز.

لقد طورنا نهجا كيميائيا ، وهو نظام الراباميسين المنظم (RapR) ، والذي يسمح بالتنظيم الخيفي للمجال التحفيزي للفوسفاتيز الذي يتيح تحكما زمنيا صارما لتنشيط الفوسفاتيز. يتكون نظام RapR من مجال iFKBP يتم إدخاله في موقع خيفي في الفوسفاتيز. تعطل الديناميكيات الهيكلية الجوهرية لمجال RapR المجال التحفيزي ، مما يؤدي إلى تعطيل الإنزيم. تتوسط إضافة الرابامايسين في تكوين مركب بين iFKBP وبروتين FRB المعبر عنه ، والذي يعمل على استقرار iFKBP واستعادة النشاط إلى المجال التحفيزي للفوسفاتيز.

يوفر هذا النظام خصوصية عالية وتحكما زمنيا صارما لتنشيط الفوسفاتيز في الخلايا الحية. تتيح القدرات الفريدة لهذا النظام تحديد الأحداث العابرة واستجواب مسارات الإشارات الفردية في اتجاه مجرى الفوسفاتيز. يصف هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية لتطوير RapR-phosphatase ، وتوصيفه الكيميائي الحيوي ، وتحليل آثاره على الإشارات النهائية وتنظيم الديناميكا مورفو للخلية. كما يوفر وصفا تفصيليا لاستراتيجية هندسة البروتين ، والمقايسات المختبرية التي تحلل نشاط الفوسفاتيز ، وتجارب تصوير الخلايا الحية التي تحدد التغيرات في مورفولوجيا الخلية.

Introduction

فوسفاتيز بروتين التيروزين هي عائلة مهمة من البروتينات المشاركة في عدد كبير من أحداث إشارات الخلية. لقد ثبت أنها تلعب دورا رئيسيا في تنظيم تكاثر الخلايا والهجرة وموت الخلايا^{المبرمج 1،2،3}. وبالتالي ، فإن خلل تنظيم بروتين التيروزين فوسفاتيز يؤدي إلى مجموعة متنوعة من الأمراض والاضطرابات المنهكة^4،5،6،7. لقد أعاقت دراسة الوظيفة الفسيولوجية لفوسفاتيز التيروزين ودورها في تطور هذه الأمراض تاريخيا بسبب نقص الأدوات اللازمة للتحقيق في تعقيدات إشارات الفوسفاتيز⁸.

تقليديا ، تتم دراسة الفوسفاتيز باستخدام طرق لا تتمتع بالخصوصية المطلوبة و / أو لا توفر تحكما زمنيا في نشاطها. هذه القيود الحرجة للأدوات المتاحة تجعل من الصعب تشريح أدوار محددة للفوسفاتيز في مسارات الإشارات. يوفر الإفراط في التعبير عن الطفرات السلبية النشطة والمهيمنة أو تقليل تنظيم التعبير عن الفوسفاتيز الخصوصية ولكنها تفتقر إلى التحكم الزمني وغالبا ما يمكن أن تؤدي إلى آليات تعويضية تخفي الوظيفة الحقيقية للإنزيم.

تسمح المثبطات الدوائية بالتنظيم الزمني للفوسفاتيز. ومع ذلك ، فإن العديد من مثبطات الفوسفاتيز معروفة بأنها غير محددة بسبب التركيب المحفوظ جيدا للموقع النشط في فوسفاتيز التيروزين⁹. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لقيود التصميم ، تظهر المثبطات التي تستهدف الموقع التحفيزي نفاذية غشاء الخلية الضعيفة¹⁰. قيد آخر للمثبطات هو أنها تسمح فقط بفحص آثار تعطيل الفوسفاتيز¹¹. وبالتالي ، هناك حاجة إلى أدوات تمكن من تنشيط الفوسفاتيز بشكل محدد وقابل للتنظيم مؤقتا. ستسمح هذه الأدوات للباحثين بتحديد التأثيرات المباشرة لتنشيط الفوسفاتيز ، وفصلها عن شلالات إشارات متوازية متعددة غالبا ما يتم تنشيطها بواسطة المحفزات البيولوجية. الأهم من ذلك ، أن التحكم الزمني الصارم في النشاط يتيح تحديد الأحداث العابرة التي يسببها الفوسفاتيز ويفصل بين تأثيرات نشاط الفوسفاتيز الحاد والمطول. سيسمح الجمع بين التنظيم الزمني والتحليل الطفري بتشريح مفصل للأدوار المحددة للمجالات الفردية للفوسفاتيز واستجواب إشارات المصب¹².

لمعالجة نقص القدرات المطلوبة في الأدوات الحالية ، طورت مجموعة Karginov نظام Rapamycin المنظم (RapR)^13،14،15. يستخدم نظام RapR مجال تبديل هندسي ، iFKBP ، والذي يسمح بالتنظيم الخيفي للبروتين محل الاهتمام (POI). إن إدخال مجال iFKBP في موضع مقترن بشكل متساوي بالموقع التحفيزي ل POI يجعله عرضة للتنظيم بواسطة الرابامايسين. في حالة عدم وجود الرابامايسين ، يعطل iFKBP الموقع التحفيزي بسبب الديناميكيات الهيكلية العالية جوهريا ل iFKBP وبالتالي يعطل نقطة الاهتمام. تؤدي إضافة الرابامايسين إلى تفاعل iFKBP مع البروتين المعبر عنه المشترك FRB (الشكل 1). يؤدي هذا إلى استقرار مجال التبديل ، مما يؤدي بالتالي إلى استعادة بنية ووظيفة المجال التحفيزي ل POI. على هذا النحو ، تسمح الأداة بتنشيط محدد وقابل للتنظيم مؤقتا لنقطة الاهتمام.

الشكل 1: تخطيطي للنظام المنظم بالرابامايسين RapR-Shp2. يسمح RapR بالتنشيط الخيفي للبروتين المعني بإضافة الراباميسين. تم تعديل هذا الرقم من Fauser et ^al.12. الاختصارات: iFKBP = FKBP12 قابل للإدخال. FRB = مجال ربط FKBP-rapamycin; R = رابامايسين ؛ Shp2 = تماثل Src -2 يحتوي على مجال بروتين التيروزين فوسفاتيز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يمكن تطبيق أداة RapR على عائلات البروتين المختلفة. يمكن استخدامه لتنظيم كينازات البروتين وكذلك الفوسفاتيز^12،14. سيركز هذا البروتوكول على تطبيق أداة RapR للتحكم في Shp2 phosphatase. Shp2 هو بروتين تيروزين فوسفاتيز معبر عنه في كل مكان يشارك في عمليات الإشارات مثل الانتشار والهجرة والتعديل المناعي والتمايز^{1،16،17،18}. ارتبط خلل تنظيم Shp2 بعدد من السرطانات الصلبة وسرطان الدم النخاعي واضطرابات النمو^5،7. ومع ذلك ، فقد وقع Shp2 ضحية لنفس أوجه القصور في الأداة كما هو موضح أعلاه. لمكافحة هذه القيود ، تم تطوير RapR-Shp2 ، وهو بناء Shp2 قابل للتنظيم على وجه التحديد ومؤقتا ، وتميز¹².

قبل تطوير RapR-Shp2 ، كان من المعروف أن Shp2 كان متورطا في هجرة الخلايا^19،20،21. ومع ذلك ، فإن دورها المحدد في الإشارات التي تنطوي عليها هذه العملية لم يكن معروفا. كما لم يكن معروفا على أي مقياس زمني Shp2 ينظم هجرة الخلايا وما هي التغييرات الديناميكية المورفولوجية المحددة التي يسببها في نقاط زمنية مختلفة من تنشيطها. علاوة على ذلك ، لم يكن من الواضح ما إذا كان التنشيط الحاد والمطول ل Shp2 سيسبب آثارا مختلفة. باستخدام RapR-Shp2 ، وجد أن التنشيط الحاد ل Shp2 يؤدي إلى انتشار الخلايا العابرة ، وزيادة النتوءات ، واستقطاب الخلايا ، والهجرة. كما تم تحديد مسارات محددة في اتجاه مجرى Shp2 تنظم التغيرات الديناميكية المورفولوجية^{المميزة 12}. يوفر هذا البروتوكول تفاصيل لتصميم وتوصيف RapR-Shp2 ، والتي يمكن استخدامها لتوجيه تطوير وتطبيق فوسفاتيز RapR الأخرى.

Protocol

1. تصميم RapR-phosphatases

1. تخطيط
   ملاحظة: باستخدام RapR-Shp2 كمثال ، يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل الخطوات المهمة لإنشاء فوسفاتيز التيروزين المنظم بالراباميسين. تم تحسين البروتوكول الموصوف ل Shp2 وقد تكون هناك حاجة إلى تعديلات إضافية لتناسب خصائص محددة للفوسفاتيز الفردي.
   1. للتأكد من أن النشاط التحفيزي ل Shp2 يتم التحكم فيه بحتة بواسطة الرابامايسين وليس عن طريق الآليات الداخلية ، أدخل طفرة في الفوسفاتيز لإبقائه في شكل نشط أساسي. في حالة Shp2 ، أدخل طفرة D61A.
      ملاحظة: إذا لم يتم إدخال طفرة منشطة ل PTPase معين ، فسيعمل متغير RapR الخاص به كنظام AND مسور ينظمه الإشارات الداخلية والرابامايسين.
   2. تحديد مواقع إدخال iFKBP في المجال التحفيزي للفوسفاتيز باستخدام التركيب البلوري لتوجيه الاختيار كما هو موضح سابقا¹³. إذا لم يكن الهيكل متاحا ، فقم بإجراء محاذاة تسلسل الأحماض الأمينية مع المجال التحفيزي ل Shp2 phosphatase لتحديد مواقع الإدخال (الشكل 2 أ). تأكد من أن موقع الإدخال يقع في حلقة مرنة مقترنة هيكليا بالجيب التحفيزي ولكن يتم وضعها بعيدا عن الجيب لمنع العوائق الفراغية لربط الركيزة بواسطة iFKBP.
      ملاحظة: تمت مناقشة المزيد من التفاصيل حول الإدراج في المناقشة.
   3. ضع في اعتبارك نوع تسلسل الرابط الذي سيتم استخدامه بين مجال iFKBP المدرج والفوسفاتيز المعني. يعد اختيار تسلسل الرابط الأمثل أمرا مهما للغاية لنجاح أداة RapR ويتم مناقشته بمزيد من التفصيل في المناقشة (الشكل 2 ب).

الشكل 2: تخطيطي للاعتبارات عند تصميم RapR-phosphatase. (أ) محاذاة Shp2 (أرجواني) و PTP1B (أخضر) و PTP-PEST (وردي) مع مواقع الإدراج المحفوظة التي تم تسليط الضوء عليها. (ب) تمثيل إدخال الرابط بين Shp2 و iFKBP. (ج) مجال الفوسفاتيز ل Shp2 باللون البيج مع مواقع الإدراج المشار إليها باللون الأزرق. تم تعديل هذا الرقم من Fauser et ^al.12. الاختصارات: Shp2 = تماثل Src-2 يحتوي على مجال بروتين التيروزين فوسفاتيز. iFKBP = FKBP12 قابل للإدخال؛ PTP = بروتين التيروزين فوسفاتيز. RapR = منظم الراباميسين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. إنشاء RapR-phosphatase

1. إدخال iFKBP في الفوسفاتيز ذي الأهمية باستخدام الطفرات المعدلة الموجهة للموقع
   1. قم بإنشاء "megaprimer" ترميز iFKBP عبر PCR.
      1. تصميم بادئات لتخليق "megaprimer" التي تحتوي على 20-25 نيوكليوتيد تلدين إلى نهاية 5 'أو 3' من iFKPB ، وهو تسلسل رابط يربط iFKPB بالفوسفاتيز محل الاهتمام ، و 28-32 نيوكليوتيد يتوافق مع موقع الإدراج (الشكل 3). تأكد من أن المنتج الناتج يحتوي على iFKPB محاط بشظايا صلبة قبل وبعد موقع الإدخال في الفوسفاتيز محل الاهتمام.
      2. قم بتجميع iFKBP الذي يحتوي على "megaprimer" عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (10 ميكرولتر من 5x بوليميراز عازلة ، 1 ميكرولتر من 50 نانوغرام / ميكرولتر من الحمض النووي القالب الذي يحتوي على iFKBP ، 2 ميكرولتر من 10 ملي مولار dNTP ، 0.5 ميكرولتر من مخزون 100 ميكرومتر من كل "megaprimer" التمهيدي [إلى الأمام والخلف] ، 35 ميكرولتر من الماء ، 1 ميكرولتر بوليميراز الحمض النووي). قسم تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل هذا إلى تفاعلين منفصلين سعة 25 ميكرولتر قبل تشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بتشغيل دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا لتوصيات الشركة المصنعة لبوليميراز الحمض النووي أو دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسية التالية: (1) 98 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، (2) 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، (3) 55-70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، (4) 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، (v) كرر الخطوات من الثاني إلى الرابع 25x ، (vi) 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
      3. قم بتنقية "megaprimer" باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. قم بتحميل محتويات PCR من الخطوة السابقة في جل الاغاروز 1٪ وقم بتطبيق 120 فولت لمدة 30 دقيقة تقريبا. ابحث عن "megaprimer" بطول 400 نيوكليوتيدات في الجل ، واستئصال الجزء ، وتنقية باستخدام مجموعة استخراج الهلام (انظر جدول المواد).
         ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
   2. الطفرات المعدلة الموجهة بالموقع
      1. قم بإعداد تفاعل الطفرات الموجه للموقع المعدل باستخدام بلازميد يحتوي على جين الفوسفاتيز ذي الأهمية كقالب (5 ميكرولتر من 5x بوليميراز عازلة ، 2 ميكرولتر من قالب 50 نانوغرام / ميكرولتر ، 2 ميكرولتر من 10 ملي مولار dNTP ، 10 ميكرولتر من "megaprimer" المستخرج ، 2.5 ميكرولتر من الماء ، 2.5 ميكرولتر من DMSO ، 1 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي).
         ملاحظة: تؤدي إضافة DMSO في خليط التفاعل إلى خفض درجة حرارة التلدين²².
      2. قم بتشغيل دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية: خطوة التمسخ الأولية عند 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، تليها 18 دورة من خطوات الحضانة المتتالية عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 65 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 55 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 50 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 18 دقيقة. قم بتشغيل الدورة بين عشية وضحاها (وقت الدورة 7 ساعات). بمجرد اكتمال الدورة ، قم بتخزين تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل عند 4 درجات مئوية.
         ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
      3. بعد اكتمال الدورة ، أضف 1 ميكرولتر من إنزيم DpnI واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
         ملاحظة: سيقوم DpnI بهضم القالب المتبقي ، مما يزيد من إنتاجية المنتج المركب حديثا.
      4. قم بتحويل المنتج المهضوم إلى DH5α الخلايا المختصة باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بلوحة التحول على ألواح أجار LB مع المضاد الحيوي المناسب للاختيار (كاربينيسيلين لبناء pcDNA RapR-Shp2). احتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل. بمجرد نمو المستعمرات ، قم بتخزين ألواح LB عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
         ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
2. عزل بنية الحمض النووي المطلوبة التي تحتوي على RapR-phosphatase
   1. إجراء فحص PCR للمستعمرات البكتيرية²³. نظرا لأن جميع المستعمرات المزروعة على صفيحة LB لن تحتوي على البلازميد المطلوب ، تأكد من الفحص قبل عزل الحمض النووي البلازميد.
      ملاحظة: استخدم الاشعال للشاشة التي ستلدن بالقالب وفي جين iFKBP. يمكن عمل الشاشة باستخدام Taq polymerase mastermix (انظر جدول المواد).
   2. بمجرد تحديد المستعمرات الإيجابية ، قم بتلقيح مستعمرة إيجابية واحدة في 3 مل من مرق LB بما في ذلك المضاد الحيوي المناسب ، واحتضانه ، ورجه عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
   3. استخرج الحمض النووي البلازميد من المزرعة السائلة باتباع تعليمات الشركة المصنعة لمجموعة استخراج الحمض النووي البلازميد (انظر جدول المواد)
      ملاحظة: يوصى بتسلسل بنية RapR PTPase التي تم إنشاؤها حديثا قبل المتابعة في التقييم في المختبر .

الشكل 3: تخطيطي لتصميم التمهيدي واستراتيجية استنساخ الطفرات المعدلة الموجهة بالموقع. الخطوة 1 هي تخليق iFKBP الذي يحتوي على "megaprimer" مع "نهايات لزجة" تلدين إلى موقع إدخال الفوسفاتيز محل الاهتمام ، والخطوة 2 هي إدخال "megaprimer" في الفوسفاتيز محل الاهتمام. تم تعديل هذا الرقم من Karginov et ^al.13. الاختصار: iFKBP = FKBP12 قابل للإدخال. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تقييم RapR-PTPase عن طريق فحص النشاط في المختبر

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول لتقييم تنظيم نشاط RapR-PTPase المصمم هندسيا. فيما يلي وصف لتحليل Shp2 المترسب المناعي باستخدام جزء طرفي N من باكسيلين كركيزة. قد يلزم اختيار ركيزة مختلفة لمعين من PTPase ذي أهمية.

1. اليوم 1
   1. صفيحة 800,000 خلية HEK293T / بئر في صفيحة زراعة أنسجة مكونة من 6 آبار في وسائط DMEM مكملة بمكملات L-glutamine (التركيز النهائي 2 ملليمتر) و 10٪ FBS من حيث الحجم. ضعها في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ طوال الليل.
2. اليوم 2
   1. بمجرد أن تصبح الخلايا ~ 60-80٪ ملتقية ، قم بنقلها وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للوصي المفضل (انظر جدول المواد).
      1. مثال على بروتوكول التعدين: أضف 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (pcDNA-mCherry-FRB و pcDNA-flag-RapR-Shp2 ، لكل منهما) إلى 200 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل و 6 ميكرولتر من كاشف التعداء واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أضف 100 ميكرولتر من خليط التعداء لكل بئر من الخلايا. قم بتضمين العينات المنقولة مع تركيبات Shp2 السلبية النشطة والمهيمنة بشكل أساسي كضوابط. احتضن طوال الليل في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ .
3. اليوم 3
   1. تحضير البروتين-G السيفاروز
      ملاحظة: قم بإعداد أطراف الماصة المقطوعة قبل التعامل مع السيفاروس. يجب استخدام أطراف القطع في كل خطوة يتم فيها التعامل مع السيفاروس. يجب إعادة تعليق سيفاروس تماما في كل خطوة قبل سحب العينات.
      1. أعد تعليق وخذ الكمية المناسبة من Protein-G Sepharose في أنبوب سعة 1.5 مل. لكل بئر في طبق 6 آبار ، استخدم 10 ميكرولتر من Protein-G Sepharose. للحصول على طبق كامل مكون من 6 آبار ، استخدم 60 ميكرولتر من السيفاروس.
      2. اغسل السيفاروس ب 1 مل من محلول التحلل (انظر جدول المواد). جهاز طرد مركزي دقيق لمدة دقيقة واحدة عند 2,000 × جم وقم بإزالة عازلة التحلل بعناية. كرر 2x.
      3. أعد تعليق السيفاروس في 380 ميكرولتر من محلول التحلل. أضف BSA إلى التركيز النهائي 1 مجم / مل والجسم المضاد (0.5 ميكرولتر لكل عينة IP ، الجسم المضاد المضاد للعلم [انظر جدول المواد]). اقلب على دوار عند 4 درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة.
         ملاحظة: يجب تحديد الكمية المثلى للجسم المضاد تجريبيا لكل جسم مضاد مستخدم.
   2. تحضير الخلايا للترسيب المناعي.
      1. أضف كمية مناسبة من الرابامايسين (محلول مخزون 1 ملي مولار في الإيثانول) إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر أو أضف نفس الحجم من الإيثانول (التحكم السلبي) إلى العينات. احتضان لمدة 1 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ .
      2. ضع الطبق المكون من 6 آبار مع الخلايا على الثلج واغسل الخلايا برفق باستخدام 3 مل من PBS البارد. قم بشفط PBS وإضافة 300 ميكرولتر من Lysis Buffer (إما مع 1 ميكرومتر رابامايسين لعينة الفوسفاتيز المنشطة أو حجم مكافئ من الإيثانول في عينة التحكم السلبية) واكشط باستخدام مكشطة الخلية. انقل العينات إلى أنابيب سعة 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي دقيقة لمدة 10 دقائق عند 1,000 × جم عند 4 درجات مئوية.
      3. انقل 20 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل للتحقق من مستويات التعبير. أضف 20 ميكرولتر من 2x Laemmli Buffer مع 5٪ β-mercaptoethanol إلى كل أنبوب لاستخدامه للتحقق من التعبير واحتضانه عند 95-100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. استخدم المادة الطافية المتبقية للترسيب المناعي في الخطوة 3.3.3.3.
   3. الترسيب المناعي ل RapR-SHP2
      1. اغسل البروتين-G Sepharose من الخطوة 3.3.1.3. مع 1 مل من Lysis Buffer. جهاز طرد مركزي دقيق لمدة دقيقة واحدة عند 2,000 × جم عند 4 درجات مئوية في كل مرة واستنشق بعناية عازلة التحلل. كرر هذه الخطوة 2x.
      2. باستخدام أطراف القطع ، أعد تعليق السيفاروز في محلول التحلل (50 ميكرولتر لكل عينة ، لذلك بالنسبة للوحة 6 آبار ، أعد تعليقها في 300 ميكرولتر من محلول التحلل). الماصة 50 ميكرولتر من خليط السيفاروز المعلق في أنبوب جديد منفصل سعة 1.5 مل لكل عينة.
         ملاحظة: سيكون هناك تعليق من Sepharose في محلول Lysis Buffer المتبقي بسبب حجم Sepharose.
      3. أضف المادة الطافية المتبقية من الخلايا المحضرة من الخطوة 3.3.2.3 في كل أنبوب من أنابيب Sepharose. قم بالتدوير عند 4 درجات مئوية لمدة 1.5-2 ساعة.
   4. فحص نشاط الفوسفاتيز
      ملاحظة: يجب تحضير ركيزة Shp2 عن طريق فسفرة جزء N-terminal المنقى من باكسيلين باستخدام كيناز Src النشط بشكل أساسي باتباع بروتوكول تفاعل كيناز الموصوف^{سابقا 12}.
      1. قرب نهاية الخطوة 3.3.3.3 ، قم بإعداد محلول الفوسفو-باكسيلين. لكل عينة ، أضف محلول فوسفو باكسيلين (التركيز النهائي 3 ميكروغرام / مل) إلى 40 ميكرولتر من إجمالي عازلة إيميدازول (انظر جدول المواد). أضف الرابامايسين إلى التركيز النهائي البالغ 1 ميكرومتر إلى كمية محلول الفوسفو-باكسيلين لعينات RapR-Shp2 المنشطة وحجم مكافئ من الإيثانول لمحلول العينات غير المنشطة.
      2. اضبط شاكر التسخين على 32 درجة مئوية.
         ملاحظة: قد تحتاج الفوسفاتيز الأخرى إلى درجة حرارة مختلفة لتحقيق النشاط الأمثل.
      3. اغسل السيفاروس بعينات من الخطوة 3.3.3.3 2x مع 0.5 مل من محلول التحلل (انظر جدول المواد). اغسل العينات 2x باستخدام 0.5 مل من محلول الغسيل. وينبغي أن يحتوي كل مخزن مؤقت إما على رابامايسين عند 1 ميكرومتر للعينات المنشطة أو حجم مكافئ من الإيثانول للعينات غير المنشطة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت بعد الغسيل النهائي.
         ملاحظة: بمجرد الوصول إلى هذه الخطوة، قد يكون من المفيد استخدام ماصة لإزالة الكميات النهائية من العازلة ببطء وحذر للتأكد من عدم استنشاق أي من السيفاروس. سيؤثر أي مخزن مؤقت متبقي على تركيز الفوسفو باكسيلين ويؤدي إلى قراءة غير دقيقة.
      4. أضف 40 ميكرولتر من خليط فوسفو باكسيلين إيميدازول العازلة المحضر إلى كل عينة ، مع أو بدون رابامايسين (يعتمد على العينة). انقر برفق شديد للخلط وضعه على الفور في شاكر التسخين واحتضانه لمدة 40 دقيقة عند 32 درجة مئوية. اضبط شاكر التسخين على 1,000 دورة في الدقيقة كحد أدنى لضمان تحريك العينة بالكامل طوال مدة الحضانة.
      5. أوقف التفاعل بإضافة 40 ميكرولتر من 2x Laemmli Buffer إلى كل عينة. احتضان العينات عند 95-100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تبريد العينات.
      6. قم بتحميل 15 ميكرولتر من كل عينة (بما في ذلك عينات المحللة من الخطوة 3.3.2.3) على هلام SDS-polyacrylamide متدرج بنسبة 4-15٪ وقم بتشغيل بروتوكول اللطخة الغربية القياسي باستخدام أغشية PVDF.
      7. لطخة باستخدام جسم مضاد مضاد للعلم للكشف عن بنية RapR-Shp2 ، ومضاد mCherry للكشف عن mCherry-FRB ، ومضاد pY118 أو مضاد pY31 باكسيلين للكشف عن فسفرة الباكسيلين.
         ملاحظة: يجب أن تبدو البقع الغربية الناتجة مشابهة للشكل 4.

4. تحليل نشاط RapR-Shp2 في الخلايا الحية

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول لتحديد قدرة RapR-Shp2 على إزالة الفوسفور من الركائز الداخلية وتحفيز الإشارات النهائية. ستتطلب RapR-PTPases الأخرى تحليلا لركائزها ومساراتها المحددة.

1. اليوم 1
   1. صفيحة 198,000 خلية A431 / بئر في صفيحة زراعة أنسجة مكونة من 6 آبار في وسائط DMEM مكملة بنسبة 10٪ FBS و L-glutamine (التركيز النهائي 2 ملليمتر). ضعها في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ طوال الليل.
2. اليوم 2
   1. قم بإصابة الخلايا بتركيبات الفيروسات الغدية التي تعبر عن RapR-Shp2 و FRB عن طريق إضافة الفيروس الغدي مباشرة إلى الوسائط الموجودة بالفعل في الطبق. اترك الفيروس الغدي على الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ طوال الليل. استخدم الخلايا المصابة ب FRB فقط كتحكم سلبي.
      ملاحظة: يجب تحديد كميات الفيروس الغدي على أساس كل حالة على حدة اعتمادا على العيار.
3. اليوم 3
   1. تجويع خلايا A431 عن طريق الحضانة في DMEM مع 0.5٪ FBS لمدة 4 ساعات قبل التجربة.
   2. أضف الرابامايسين إلى التركيز النهائي البالغ 1 ميكرومتر أو نفس الحجم من الإيثانول (التحكم السلبي) إلى الخلايا لمدة 2-4 ساعات.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف الحضانة عن الفوسفاتيز الأخرى.
   3. ضع الطبق المكون من 6 آبار مع الخلايا على الثلج واغسل الخلايا برفق باستخدام 3 مل من PBS البارد. قم بشفط PBS ، وأضف 300 ميكرولتر من Lysis Buffer (انظر جدول المواد) ، وكشط بقوة باستخدام مكشطة الخلية. انقل العينات إلى أنابيب سعة 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي الدقيقة لمدة 5 دقائق عند 2,000 × جم عند 4 درجات مئوية.
   4. انقل 250 ميكرولتر من كل عينة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. أضف 250 ميكرولتر من 2x Laemmli Buffer مع 5٪ β-mercaptoethanol واحتضنه عند 95-100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   5. قم بتحميل 25 ميكرولتر من كل عينة على جل SDS-PAGE متدرج بنسبة 4-15٪ وقم بتشغيل بروتوكول لطخة غربية قياسي باستخدام أغشية PVDF.
   6. تقييم إزالة الفسفرة بوساطة RapR-Shp2 من EGFR و PLCγ باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل pY992 EGFR والأجسام المضادة ل pY783 PLCγ. تقييم التنشيط النهائي ل MAP kinase Erk1 / 2 من خلال تقييم فسفرته على بقايا pT202 / pY204.
      ملاحظة: يجب أن تبدو البقع الغربية الناتجة مشابهة للشكل 5.

5. تحليل التغيرات الديناميكية المورفولوجية الناتجة عن تنشيط RapR-Shp2 في خلايا HeLa باستخدام تصوير الخلايا الحية

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول لتحديد تأثير تنشيط RapR-Shp2 على تكوين نتوءات الخلايا وانتشار الخلايا والهجرة.

1. اليوم 1
   1. لوحة 700,000 خلية هيلا في طبق ثقافة خلية 35 مم وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ . اسمح للخلايا بالالتصاق بالطبق (~ 2-3 ساعات).
   2. قم بنقل الخلايا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لكاشف التعداء المفضل (انظر جدول المواد).
      1. مثال على بروتوكول التعدي: أضف 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي (pcDNA-mCherry-FRB و pcDNA-Venus-RapR-Shp2 البلازميدات، لكل منهما) إلى 100 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل و 6 ميكرولتر من كاشف التعداد. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أضف خليط التعداء إلى الخلايا واحتضنه طوال الليل في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ . استخدم الخلايا المنقولة باستخدام pcDNA-mCherry-FRB فقط كعنصر تحكم سلبي.
   3. قم بتغطية غطاء زجاجي دائري للتصوير المباشر # 1.5 مقاس 25 مم بالفبرونيكتين (5 مجم / لتر) عن طريق الحضانة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
2. اليوم 2
   1. اغسل الغطاء الزجاجي المطلي باستخدام PBS.
   2. قم بوضع خلايا HeLa المنقولة على الغطاء الزجاجي المطلي في وسائط DMEM المكملة بنسبة 10٪ FBS و L-glutamine (التركيز النهائي 2 ملليمتر) لتحقيق التقاء 30٪ قبل 4 ساعات من التصوير.
   3. بعد ساعتين من الطلاء ، قم بتبديل الوسائط الموجودة في اللوحة برفق إلى وسائط Leibovitz L-15 الخالية من المصل لمدة ساعتين.
   4. قم بتلطيخ الخلايا بصبغة غشاء البلازما CellMask Deep Red وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
   5. ضع الغطاء في حجرة خلية تصوير نظيفة (انظر جدول المواد). أضف 1 مل من وسائط L-15 المسخنة مسبقا وقم بتغطيتها ب 1 مل من الزيت المعدني الدافئ مسبقا لمنع التبخر. احتفظ بالغرفة عند 37 درجة مئوية حتى التصوير.
   6. صور الخلايا عند 37 درجة مئوية باستخدام مرحلة ساخنة.
      1. حدد القنوات المناسبة لتصوير بنية RapR و CellMask للتصوير العرضي الفلوري. لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم الهدف 40x المشار إليه (انظر جدول المواد) ومجموعات المرشحات التالية: مرشحات الإثارة 514/10 و 540/21 للتصوير Venus-RapR-Shp2 ، ومرشحات الإثارة 561/10 و 595/40 للتصوير mCherry-FRB ، ومرشحات الإثارة 640/20 و 655LP لتصوير CellMask Deep Red. استخدم مرآة متعددة النطاقات متعددة النطاقات لجميع قنوات الفلورسنت (انظر جدول المواد).
      2. التقط الصور كل دقيقتين لمدة 4-4.5 ساعات.
         ملاحظة: ستتطلب التغييرات الديناميكية المورفوديناميكية الأسرع اكتسابا أكثر تكرارا.
      3. بعد ساعة واحدة من التصوير ، أضف الرابامايسين إلى التركيز النهائي البالغ 1 ميكرومتر لتحفيز RapR-Shp2.

6. تحليل الصور

ملاحظة: سيصف هذا البروتوكول إنشاء أقنعة الخلية بناء على . ملفات مكدس TIF التي تم جمعها من تجارب التصوير المباشر. سيصف بعد ذلك كيفية إنشاء ماكرو في ImageJ لتحليل الأقنعة ، مما سينتج عنه جدول بيانات لمنطقة الخلية يتم تحليله بعد ذلك بحثا عن التغييرات بمرور الوقت. أخيرا ، سيتم تحليل النشاط البارز والانكسافي للخلية باستخدام التحول.

1. قم بإنشاء قناع ثنائي لصور CellMask باستخدام الدالة MovThresh من حزمة برامج CellGeo²⁴.
2. انسخ مجلد MovThresh إلى مجلد تحليل الصور.
3. انسخ صور قناة CellMask أو غيرها من صور قناة علامة الغشاء إلى مجلد MovThresh.
   1. إذا تم تصوير خلايا متعددة في موضع واحد، فقم بقص الصور لإنشاء ملفات تحتوي على خلية واحدة فقط قبل إنشاء القناع في MatLab.
4. تأكد من تعيين الدليل بشكل صحيح إلى مجلد MovThresh في MatLab.
5. قم بتشغيل MovThresh.
6. استيراد مكدسات الصور واحدة تلو الأخرى.
7. حدد منحنى مسطح ثم قم بتشغيل Rethreshold.
8. احفظ كرقم Mask_Image في مجلد جديد يسمى أقنعة.
9. بمجرد تحويل جميع مجموعات الصور إلى أقنعة ، افتح مكدسات الصور في برنامج ImageJ²⁵.
   1. تحليل مساحة الخلية في ImageJ
      1. افتح جميع مجموعات صور القناع في ImageJ.
      2. اضبط ضبط القياسات على المنطقة.
      3. انقر فوق الإضافات | وحدات الماكرو | سجل.
      4. انقر فوق عملية | ثنائي | جعل ثنائية.
         1. حدد الخيار الافتراضي .
            ملاحظة: لا تنقر على أي شيء إضافي أثناء تسجيل الماكرو. إذا تم تضمين خطوات إضافية، فمن المستحسن إعادة التشغيل من الخطوة 6.9.1.3.
      5. انقر فوق تحليل | تحليل الجسيمات.
         1. قم بإلغاء تحديد جميع المربعات باستثناء الملخص.
      6. قم بإنهاء التسجيل وانقر فوق إنشاء إنشاء الماكرو.
      7. اضغط على تشغيل لكل مكدس صور بعد تحديده واحفظ جدول النتائج لكل مكدس صور. سيتم حفظ الخيار الافتراضي كملف csv.
      8. احفظ الماكرو وأعد استخدامه للتحليلات المستقبلية (اختياري).
   2. معالجة بيانات المنطقة في جدول بيانات
      1. لكل خلية تم تحليلها ، قم بحساب متوسط مساحة الخلية من الصور الملتقطة قبل التنشيط باستخدام الرابامايسين.
      2. اقسم جميع قيم المنطقة على متوسط مساحة الخلية التي تسبق إضافة الرابامايسين.
      3. احسب متوسط القيمة لكل نقطة زمنية لجميع الخلايا المصورة وحدد فترات الثقة بنسبة 90٪. ارسم البيانات.
   3. تحليل نشاط الخلية البارزة
      1. انسخ المجلد ProActive إلى مجلد تحليل الصور.
      2. انسخ مكدسات الصور المقنعة من MovThresh إلى مجلد ProActive الذي تم إنشاؤه حديثا.
      3. افتح MatLab وقم بتعيين الدليل إلى المجلد ProActive.
      4. قم بتشغيل ProActive.
      5. قم باستيراد ملفات مكدس صور الخلية المقنعة إلى واجهة المستخدم الرسومية ProActive.
      6. حدد نوع النشاط. سيولد تحليل النشاط البارز بيانات المكتسبة في المنطقة ؛ سيؤدي تحليل النشاط التراجع إلى إنشاء بيانات المنطقة المفقودة ؛ وسيولد النشاط الكلي بيانات تغيير المنطقة الإجمالية (المفقودة والمكتسبة).
      7. تعيين المنطقة لتعريف التطبيع.
      8. منحنى سلس إما باستخدام قيم العتبة المقترحة أو باستخدام المتوسط لإعادة عتبة كل نقطة زمنية. يؤدي هذا إلى متوسط العتبات عبر نافذة معينة ، مما يقلل من التناقضات في العتبة بين النقاط الزمنية.
      9. انقر فوق ملف | حفظ باسم | النتائج (.mat)
         1. في حالة معالجة جميع أنواع نشاط المنطقة الثلاثة، قم بتسمية ملفات البيانات المعالجة على النحو التالي: ProResultData # أو RetResultData # أو ResultData #.
            ملاحظة: قم بتضمين المسافة قبل الرقم ورقم البيانات بدءا من 1.
      10. كرر من الخطوة 6.9.3.6. لجميع مكدسات الصور المقنعة التي تم استيرادها.
      11. بمجرد معالجة جميع الخلايا، أغلق واجهة المستخدم الرسومية ProActive GUI.
      12. افتح DataToFileTotalArea في محرر Matlab لمعالجة إجمالي نشاط ملفات "ResultData".
      13. قم بتغيير عدد الخلايا لمطابقة عدد ملفات النتائج التي تم إنشاؤها. إذا تمت معالجة 7 خلايا في الخطوات 6.9.3.5–6.9.3.10 ، فتأكد من أن الأسطر الثلاثة الأولى من البرنامج النصي هي كما يلي:
          اسم الملف = 'بيانات النتيجة' ؛
          الخلايا = 1: 7 ؛
          تأخر = 1 ؛
      14. اضغط على تشغيل وكرر هذا ل DataToFileProtArea و DataToFileRetArea لمعالجة البيانات البارزة والانسحابية ، على التوالي. سينتج عن هذا التحليل ثلاثة ملفات نصية "AllCells.txt" و "AllCellsPro.txt" و "AllCellsRet.txt"
      15. افتح ملفات .txt في جدول بيانات وقم بتطبيعها كما في القسم 6.9.2. احسب متوسط القيمة لكل نقطة زمنية لجميع الخلايا المصورة وحدد فترات الثقة بنسبة 90٪. ارسم البيانات.
          ملاحظة: يجب أن تبدو المخططات الناتجة من الخطوات المذكورة أعلاه مشابهة للشكل 6.

Results

يوضح الشكل 4 النتائج التي يمكن توقعها من مقايسة نشاط الفوسفاتيز القائم على الباكسيلين. في هذه التجربة ، تمت مقارنة نشاط الفوسفاتيز السلبي النشط والمهيمن من Shp2 بنشاط RapR-Shp2 النشط وغير النشط باستخدام فوسفو باكسيلين كقراءة. تم ترسيب تركيبات Shp2 مناعية وإخضاعها لمقايسة النشاط كما هو موضح في البروتوكول. كانت قراءات الفوسفو-باكسيلين ل Shp2 النشط بشكل أساسي و RapR-Shp2 النشط متشابهة ، مما يشير إلى أن RapR-Shp2 النشط لم يتأثر سلبا بإدخال مجال RapR واحتفظ بالنشاط الكامل بمجرد تنشيطه. كان Shp2 السلبي السائد و RapR-Shp2 غير النشط متشابهين أيضا ، مما يشير إلى أن بناء RapR-Shp2 ليس له نشاط عندما يكون غير نشط. يشير هذا إلى التصميم الناجح ل RapR-phosphatase. قد تختلف الركيزة الفوسفورية المستخدمة في هذا الاختبار بناء على الفوسفاتيز المثير للاهتمام.

الشكل 5 ، على غرار الشكل 4 ، يقارن بين RapR-Shp2 النشط والسلبي المهيمن والنشط وغير النشط. أجريت هذه التجربة دون ترسيب مناعي للبنيات. بدلا من ذلك ، تم تصميمه لتوصيف تأثيرات الإشارات النهائية لبناء RapR-Shp2 داخل الخلايا. هنا ، تم التعبير عن تركيبات Shp2 في خلايا HEK293T. تبين أن المستجيب النهائي ERK1 / 2 يزداد في الفسفرة استجابة لتنشيط RapR-Shp2 ، تماما كما هو الحال في العينة النشطة بشكل أساسي. لم يحفز RapR-Shp2 غير النشط هذا التغيير. يشير هذا إلى أن الإشارات النهائية ل Shp2 يتم الحفاظ عليها مع دمج مجال RapR. وبالمثل ، تم إزالة الفسفرة من ركائز الفوسفو المعروفة EGFR و PLCγ استجابة لتنشيط RapR-Shp2 في خلايا A431.

أخيرا ، يعرض الشكل 6 نتائج تنشيط RapR-Shp2 على الديناميكا المورفولوجية لخلايا HeLa. بمجرد تنشيط RapR-Shp2 ، أظهرت الخلايا زيادة في النشاط البارز وكذلك مساحة الخلية. يشير هذا إلى أن تنشيط RapR-Shp2 كاف لإحداث تغييرات ديناميكية مورفوديناميكية في خلايا HeLa وقد يسمح للباحثين باستكشاف مسارات إشارات محددة في اتجاه مجرى النهر مسؤولة عن هذا التأثير.

الشكل 4: نتائج مقايسة النشاط المستند إلى باكسيلين: تم ترسيب RapR-Shp2 النشط بشكل أساسي ، والسلبي السائد ، و RapR-Shp2 وخضوعا لمقايسة النشاط باستخدام البروتوكول الموضح. كانت مستويات pY31 paxillin في كل من CA و RapR-Shp2 متشابهة ، مما يشير إلى أن بناء RapR-Shp2 كان له نشاط مماثل مقارنة ب CA Shp2 بمجرد تنشيطه. لم يكن لعينة RapR-Shp2 غير المنشطة أي نشاط ، على غرار عينة DN ، مما يشير إلى أنها لم تكن "متسربة". تم تعديل هذا الرقم من Fauser et ^al.12. الاختصارات: RapR = منظم الراباميسين. Shp2 = تماثل Src -2 يحتوي على مجال بروتين التيروزين فوسفاتيز ؛ DN = سلبي مهيمن ؛ CA = نشط بشكل أساسي ؛ FRB = مجال ربط FKBP-rapamycin. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: نتائج مقايسة محللة الخلية الكاملة: تم التعبير عن RapR-Shp2 النشط بشكل أساسي ، والسلبي السائد ، و RapR-Shp2 في الخلايا HEK293T وتم الانتهاء من بروتوكول التحلل للخلية بأكملها. عندما يكون غير نشط ، لم يقم RapR-Shp2 بتنشيط ERK1 / 2 عن طريق الفسفرة ، على غرار عينة DN Shp2. يشير هذا إلى أن RapR-Shp2 ليس له نشاط عندما يكون غير نشط. بمجرد تنشيطه ، كان مستوى فسفرة ERK1 / 2 مشابها لمستوى عينة CA Shp2 ، مما يشير إلى التنشيط الناجح والإشارات النهائية ل Shp2. وبالمثل ، أظهرت خلايا A431 التي تعبر عن RapR-Shp2 انخفاضا في فسفرة كل من EGFR و PLCγ ، وكلاهما ركائز معروفة ل Shp2. تم تعديل هذا الرقم من Fauser et ^al.12. الاختصارات: RapR = منظم الراباميسين. Shp2 = تماثل Src -2 يحتوي على مجال بروتين التيروزين فوسفاتيز ؛ DN = سلبي مهيمن ؛ CA = نشط بشكل أساسي ؛ ERK = كيناز منظم الإشارات خارج الخلية ؛ GAPDH = نازعة هيدروجين الجلسرالديهايد 3-الفوسفات. EGFR = مستقبلات عامل نمو البشرة. PLCγ = فوسفوليباز ج جاما ؛ FRB = مجال ربط FKBP-rapamycin. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تحليل بيانات مساحة الخلية والنشاط البارز بناء على التصوير الحي: تم نقل خلايا HeLa باستخدام RapR-Shp2 وإخضاعها لبروتوكول التصوير الحي المحدد. تم تحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول تحليل البيانات. بمجرد تنشيطها (يشار إليها بالخط الرمادي العمودي) ، أظهرت خلايا HeLa زيادات في كل من نشاط الخلية البارزة وكذلك مساحة الخلية. في العينات السلبية التي كانت تعبر عن FRB فقط ، لم يكن هذا النشاط موجودا. يشير هذا إلى أن تنشيط RapR-Shp2 يؤدي إلى تغييرات ديناميكية مورفوديناميكية سريعة داخل خلايا HeLa ويشجع انتشار الخلايا ونتوءها. تم تعديل هذا الرقم من Fauser et ^al.12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول خطوات مفصلة لتطوير وتوصيف وتطبيق الفوسفاتيز التي يتم التحكم فيها كيميائيا. تعتمد أداة RapR-Shp2 على مفتاح منظم بالرابامايسين يتم إدخاله في المجال التحفيزي Shp2. تكمن قوة هذه الأداة في الخصوصية والتحكم الزمني الصارم في نشاط الفوسفاتيز. الأداة قابلة للتطبيق على الفوسفاتاز الأخرى ، وبالاقتران مع تقنية RapR-TAP الموصوفة سابقا ، تسمح بإعادة بناء مسارات الإشارات الفردية²⁶. سمحت القدرات الفريدة لنهج RapR للباحثين بتحديد الأحداث العابرة الناجمة عن تنشيط Shp2 وتشريح مسارات إشارات مجرى النهر المحددة التي تنظم العمليات الديناميكية المورفولوجية الفردية.

تؤثر عدة عوامل حاسمة على تصميم فوسفاتيز RapR. يعد الهيكل البلوري الذي تم حله جيدا للمجال التحفيزي للفوسفاتيز محل الاهتمام مفيدا جدا في توجيه اختيار موقع الإدراج ل iFKBP. ومع ذلك ، نظرا للتشابه الهيكلي العالي بين فوسفاتيز التيروزين ، فإن محاذاة تسلسل الأحماض الأمينية للمجالات التحفيزية يمكن أن توفر معلومات كافية لتحديد موقع الإدراج كما هو موضح في محاذاة Shp2 إلى PTP1B و PTPPest (الشكل 2). بالنسبة إلى RapR-Shp2 ، تم اختيار Val406 ، الموجود في الموقع مقترنا بحلقة WPD التحفيزية الحرجة من خلال β حبلا ، كموقع الإدخال الأمثل. قد يؤدي موقع الإدراج نفسه إلى تنظيم ناجح ل PTPases الأخرى ، كما هو موضح ل PTP1B و PTP-PEST¹² (الشكل 2 أ).

إذا كان الفوسفاتيز محل الاهتمام عبارة عن بروتين متعدد المجالات ، فإن المعلومات الهيكلية حول تنظيم المجالات ستساعد في منع التدخل في الوظائف الأخرى ل PTPase. هناك عامل آخر يؤثر على تصميم RapR-PTPase الأمثل وهو عدد الأحماض الأمينية التي يجب استبدالها ب iFKBP المدرج. قد تتطلب حلقات الإدخال الأكبر والأكثر مرونة في PTPase تقصيرا إضافيا لضمان التنظيم الصارم للنشاط التحفيزي بواسطة iFKBP. وبالمثل، فإن طول وتكوين الوصلات التي تربط iFKBP ب PTPase سيؤثر على كفاءة التنظيم. ستوفر الروابط القصيرة المكونة من بقايا Gly واحدة تنظيما أكثر إحكاما ولكنها قد تقلل من الحد الأقصى لنشاط الإنزيم إذا أدخلت تشويها هيكليا مستمرا حتى عندما يرتبط iFKBP بالرابامايسين و FRB. توفر روابط Gly-Ser-Gly متوسطة الطول مزيدا من المرونة ولكنها قد لا تكون صلبة بما يكفي لبعض PTPases. ستساعد الروابط الطويلة المكونة من Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-Gly على منع تكوين الهياكل الثانوية غير المقصودة التي قد تؤثر على تنظيم PTPase. تم اختبار RapR-Shp2 مع جميع أنواع الروابط الثلاثة. تم العثور على رابط Gly-Ser-Gly ليكون الأمثل.

يتمثل أحد الجوانب الحاسمة التي تحدد التطوير الناجح لأدوات RapR في إنشاء اختبار قوي للفوسفاتيز ووجود عناصر تحكم مناسبة. توفر مقارنة نشاط RapR-phosphatase بنشاط الإصدارات السلبية المهيمنة والنشطة بشكل أساسي من POI تقييما لتسرب بنية RapR ومدى التنشيط. علاوة على ذلك ، فإن عدم وجود إزالة الفسفرة بواسطة الفوسفاتيز النشط بشكل أساسي أو انخفاض الفسفرة بواسطة الطفرة السلبية السائدة سيشير إلى ظروف تفاعل غير مناسبة.

بالنسبة لمقايسة الفوسفاتيز ، ستتطلب ظروف التفاعل تحسينا لكل PTPase. يعتمد ضبط درجة الحرارة ووقت رد الفعل وظروف المخزن المؤقت على PTPase محل الاهتمام. يعد التحريض القوي للعينات أمرا بالغ الأهمية لضمان الخلط الكافي ل PTPase المرتبط بالسيفاروز والركيزة الخاصة به. أخيرا ، إذا لم يكن اختبار الفوسفاتيز الموصوف هو الأمثل ل PTPase المعين المعني ، فيمكن استخدام تفاعل الفوسفاتيز باستخدام فوسفات p-nitrophenyl كركيزة كمقايسة بديلة²⁷.

في تجارب تصوير الخلايا الحية ، يجب مراعاة عدة معايير عند تحضير العينة. يستخدم البروتوكول الموضح وسائط L-15 القائمة على مخزن HEPES المؤقت ، وهو غير حساس لتركيز ثاني أكسيد الكربون₂ . إذا كان استخدام الوسائط القائمة على البيكربونات مطلوبا ، فيجب استكمال HEPES للحفاظ على درجة الحموضة للعينة أو يجب استخدام غرفة تصوير بيئية مكملة لثاني أكسيد الكربون₂ . يوصي البروتوكول بوضع طبقة من الزيت المعدني فوق العينة لمنع التبخر وتبسيط إضافة الرابامايسين. يمكن استخدام إعدادات أخرى تستخدم غرفة تصوير بيئية أو غرفة مغلقة ، ولكن إضافة الرابامايسين قد يكون أكثر صعوبة. عند إضافة الرابامايسين إلى الخلايا أثناء التصوير ، تأكد من عدم تحول المرحلة وعدم إزعاج الخلايا. أي حركات إضافية للعينة أثناء عملية التصوير ستعيق جمع البيانات. يجب أن تظل شدة الإضاءة ووقت التعرض منخفضين لتقليل السمية الضوئية ، خاصة للتصوير طويل المدى. تعد كفاءة التعداء الكافية للخلايا أمرا بالغ الأهمية أيضا. توفر نسبة 1: 1 من FRB إلى RapR-Shp2 DNA تعبيرا مناسبا ، ولكن بالنسبة للتركيبات الجديدة ، ستتطلب هذه النسبة تعديلا. لضمان التنشيط الفعال ، يجب التعبير عن FRB بمستوى أعلى من فوسفاتيز RapR.

أحد قيود الأدوات المستندة إلى RapR هو عدم القدرة على إلغاء التنشيط بسرعة. يؤدي تغيير الوسائط إلى إزالة الرابامايسين خارج الخلية ، ولكن قد يستغرق تعطيل تركيبات RapR ساعات بسبب الارتباط الضيق جدا للرابامايسين ببنية RapR. يمكن تحقيق التعطيل السريع عن طريق إضافة مثبط نشط للموقع من PTPase. ومع ذلك ، فإن الآثار المحتملة خارج الهدف للمثبط يمكن أن تجعل تفسير النتائج أمرا صعبا. علاوة على ذلك ، حتى بالاشتراك مع مثبط PTPase ، لا يمكن استخدام نهج RapR لتجارب التنشيط / التعطيل الدوري. هناك قيود أخرى لنظام RapR وهو الافتقار إلى التحكم المكاني. يتم التعبير عن تركيبات RapR عالميا وبالتالي يتم تنشيطها في كل مكان في الخلية. أحد الحلول المحتملة هو تطبيق الرابامايسين المحبوس في قفص الذي يمكن إطلاقه بواسطة ضوء الأشعة فوق البنفسجية القريب محليا في الخلية^28،29. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل أداة RapR لتحقيق تنشيط الفوسفاتيز ذي الأهمية في مركب بروتين معين أو في موقع خلوي معين. من خلال إرفاق شريك ملزم أو علامة خلوية فرعية ب FRB ، سيتم استهداف RapR-PTPase للبروتين أو الموقع المحدد في الخلية. أخيرا ، الرابامايسين هو مثبط مناعي جيد الخصائص عن طريق تثبيط mTOR ويمكن أن يؤثر على الإشارات الخلوية ، مما قد يؤدي إلى تعطيل إشارات PTPase المعنية. للتغلب على هذا القلق ، تمثل نظائر الرابامايسين غير المثبطة للمناعة (iRap و AP21967) بديلا جيدا. ثبت أن كلا المركبين ينظمان تركيبات RapR¹⁴.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
# 1.5 أغطية زجاجية 25 مم أدوات وارنر المستديرة		64-0715
1.5 مل أنابيب الولايات	المتحدة الأمريكية العلمية	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			ل 500 مل: 5.18 جم Tris-HCL ، 131.5 مل جلسرين ، 52.5 مل 20٪ SDS ، 0.5 جم بروموفينول أزرق ، درجة الحموضة النهائية 6.8
4-20٪ Mini-PROTEAN TGX جل مسبقة الصب	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Agarsose	GoldBiotech	A-201
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Fibro Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	الحرارة المعطلة الثلاثية 0.1 & micro ؛ م العميد المعقم
المصفى 35،30 w / v ٪	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N / A	N /	A نشرت في 10.1083 / jcb.201306067
CellMask صبغة غشاء البلازما الأحمر العميق	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a المختصة الخلايا	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
سلم الحمض النووي	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI إنزيم	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol ، كواشف كليلاند
EGTA	Acros	409910250
Fibronectin من بلازما الأبقار	Sigma	F1141
FuGENE (R) 6 كاشف التعداء	Promega	E2692	كاشف
طقم استخراج جل	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel
Gel Stain Green	Nucleic Stain GoldBio	G-740-500
صبغة تحميل جل أرجواني 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 مل
خلايا HEK 293T ATCC		CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
ImageJ Foam	Software N / A	N / A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Imidazole Buffer			25 mM Imidazole pH 7.2 ، 2.5 mM EDTA ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
عازلة			التحلل20 ملي مولار Hepes-KOH ، درجة الحموضة 7.8 ، 50 ملي كلوميشان ، 1 ملي مولار EGTA ، 1٪ NP40
تحديث MATLAB	MathWorks N	/ A	R 2022b لتشغيل وظائف CellGeo
أتمتة الفحص المجهري المتحول وتحليل الصور	N / A	N / A
MgCl2< / sub>	Fisher Chemical	M33-500
زيت معدني	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX المواد الهلامية مسبقة الصب 12 بئر	Bio-Rad	4561085
البيولوجيا الجزيئية الصف Water	Corning	46-000-CV
متعددة النطاقات مرآة متعددة الأحرف	تقنية	كروما 89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
أوليمبوس UPlanSAPO 40x الموضوع	أوليمبوس	N / A
PBS w / o Ca و Mg	Corning	21-031-CV
أنابيب PCR	labForce	1149Z65	0.2 مل أنابيب وأغطية 8 شرائط ، شريط صلب متصل بشكل فردي قبة أغطية
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
بادئات	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
أغشية PVDF	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF / شطائر ورق الترشيح
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0.25٪ تريبسين ، 2.21 ملي EDTA ، 1x [-] الصوديوم	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	للعزلان
الكهربائي Wash Buffer			20 mM Hepes-KOH ، درجة الحموضة 7.8 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 100 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار EGTA ، 1٪ NP40
بيتا ؛ -Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100<
قوي > الأجسام المضادة < / قوي >
إشارات خلية	الأجسام المضادة	2232
إشارات خلية الأجسام المضادة المضادة للإيرك 1/2		9102
الأجسام المضادة للعلم	Millipore-Sigma	F3165
الأجسام المضادة المضادة ل GAPDH	invitrogen	AM4300
الأجسام المضادة ل GFP	Clontech	632380
الأجسام المضادة ل mCherry	invitrogen	M11217
الأجسام المضادة	للبكسيلين Thermo Fischer	BDB612405
المضادة للفوسفو EGFR Y992 إشارات الخلايا المضادة للجسم المضاد		2235
مضاد للفوسفو Erk 1/2 T202 / Y204 إشارات خلايا الأجسام المضادة		9101
المضادة للفوسفو باكسيلين Y31 الأجسام المضادة	Millipore-Sigma	05-1143
Anti-phospho-PLC & gamma ؛ Y783 إشارات خلية الأجسام المضادة		14008
مكافحة PLC & جاما ؛ إشارات خلايا الأجسام المضادة		5690