يصف هذا البروتوكول تصميم وإنشاء وتطبيق الفوسفاتيز الخاضع للتنظيم بالرابامايسين. توفر هذه الطريقة خصوصية عالية وتحكما زمنيا صارما لتنشيط الفوسفاتيز في الخلايا الحية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تطوير وتطبيق فوسفاتيز التيروزين المنظم بالراباميسين
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
فوسفاتيز التيروزين هي عائلة مهمة من الإنزيمات التي تنظم الوظائف الفسيولوجية الحرجة. غالبا ما تكون غير منظمة في الأمراض البشرية ، مما يجعلها أهدافا رئيسية للدراسات البيولوجية. الأدوات التي تمكن من تنظيم نشاط الفوسفاتيز مفيدة في تشريح وظيفتها. تفتقر الأساليب التقليدية ، مثل الإفراط في التعبير عن الطفرات السلبية النشطة أو المهيمنة ، أو تقليل التنظيم باستخدام siRNA ، إلى التحكم الزمني. غالبا ما يكون لمثبطات الفوسفاتيز خصوصية ضعيفة ، وتسمح فقط للباحثين بتحديد العمليات التي تتأثر بتثبيط الفوسفاتيز.
لقد طورنا نهجا كيميائيا ، وهو نظام الراباميسين المنظم (RapR) ، والذي يسمح بالتنظيم الخيفي للمجال التحفيزي للفوسفاتيز الذي يتيح تحكما زمنيا صارما لتنشيط الفوسفاتيز. يتكون نظام RapR من مجال iFKBP يتم إدخاله في موقع خيفي في الفوسفاتيز. تعطل الديناميكيات الهيكلية الجوهرية لمجال RapR المجال التحفيزي ، مما يؤدي إلى تعطيل الإنزيم. تتوسط إضافة الرابامايسين في تكوين مركب بين iFKBP وبروتين FRB المعبر عنه ، والذي يعمل على استقرار iFKBP واستعادة النشاط إلى المجال التحفيزي للفوسفاتيز.
يوفر هذا النظام خصوصية عالية وتحكما زمنيا صارما لتنشيط الفوسفاتيز في الخلايا الحية. تتيح القدرات الفريدة لهذا النظام تحديد الأحداث العابرة واستجواب مسارات الإشارات الفردية في اتجاه مجرى الفوسفاتيز. يصف هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية لتطوير RapR-phosphatase ، وتوصيفه الكيميائي الحيوي ، وتحليل آثاره على الإشارات النهائية وتنظيم الديناميكا مورفو للخلية. كما يوفر وصفا تفصيليا لاستراتيجية هندسة البروتين ، والمقايسات المختبرية التي تحلل نشاط الفوسفاتيز ، وتجارب تصوير الخلايا الحية التي تحدد التغيرات في مورفولوجيا الخلية.
المقدمة
فوسفاتيز بروتين التيروزين هي عائلة مهمة من البروتينات المشاركة في عدد كبير من أحداث إشارات الخلية. لقد ثبت أنها تلعب دورا رئيسيا في تنظيم تكاثر الخلايا والهجرة وموت الخلاياالمبرمج 1،2،3. وبالتالي ، فإن خلل تنظيم بروتين التيروزين فوسفاتيز يؤدي إلى مجموعة متنوعة من الأمراض والاضطرابات المنهكة4،5،6،7. لقد أعاقت دراسة الوظيفة الفسيولوجية لفوسفاتيز التيروزين ودورها في تطور هذه الأمراض تاريخيا بسبب نقص الأدوات اللازمة للتحقيق في تعقيدات إشارات الفوسفاتيز<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تصميم RapR-phosphatases
- تخطيط
ملاحظة: باستخدام RapR-Shp2 كمثال ، يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل الخطوات المهمة لإنشاء فوسفاتيز التيروزين المنظم بالراباميسين. تم تحسين البروتوكول الموصوف ل Shp2 وقد تكون هناك حاجة إلى تعديلات إضافية لتناسب خصائص محددة للفوسفاتيز الفردي.- للتأكد من أن النشاط التحفيزي ل Shp2 يتم التحكم فيه بحتة بواسطة الرابامايسين وليس عن طريق الآليات الداخلية ، أدخل طفرة في الفوسفاتيز لإبقائه في شكل نشط أساسي. في حالة Shp2 ، أدخل طفرة D61A.
ملاحظة: إذا لم يتم إدخال طفرة منشطة ل PTPase معين ، فسيعمل متغير RapR الخاص به كنظام AND مسور ينظمه الإشارات الداخلية والرابامايسين. - تحديد مواقع إدخال iFKBP في المجال....
- للتأكد من أن النشاط التحفيزي ل Shp2 يتم التحكم فيه بحتة بواسطة الرابامايسين وليس عن طريق الآليات الداخلية ، أدخل طفرة في الفوسفاتيز لإبقائه في شكل نشط أساسي. في حالة Shp2 ، أدخل طفرة D61A.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح الشكل 4 النتائج التي يمكن توقعها من مقايسة نشاط الفوسفاتيز القائم على الباكسيلين. في هذه التجربة ، تمت مقارنة نشاط الفوسفاتيز السلبي النشط والمهيمن من Shp2 بنشاط RapR-Shp2 النشط وغير النشط باستخدام فوسفو باكسيلين كقراءة. تم ترسيب تركيبات Shp2 مناعية وإخضاعها لمقايسة النشاط كما هو موضح في البروتوكول. كانت قراءات الفوسفو-باكسيلين ل Shp2 النشط بشكل أساسي و RapR-Shp2 النشط متشابهة ، مما يشير إلى أن RapR-Shp2 النشط لم يتأثر سلبا بإدخال مجال RapR واحتفظ بالنشاط الكامل بمجرد تنشيطه. كان Shp2 ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوفر هذا البروتوكول خطوات مفصلة لتطوير وتوصيف وتطبيق الفوسفاتيز التي يتم التحكم فيها كيميائيا. تعتمد أداة RapR-Shp2 على مفتاح منظم بالرابامايسين يتم إدخاله في المجال التحفيزي Shp2. تكمن قوة هذه الأداة في الخصوصية والتحكم الزمني الصارم في نشاط الفوسفاتيز. الأداة قابلة للتطبيق على الفوسفاتاز الأخرى ، وبالاقتران مع تقنية RapR-TAP الموصوفة سابقا ، تسمح بإعادة بناء مسارات الإشارات الفردية26. سمحت القدرات الفريدة لنهج RapR للباحثين بتحديد الأحداث العابرة الناجمة عن تنشي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
يقر المؤلفون بالدكتورة جوردان فوزر لمساهمتها في تطوير RapR-Shp2 والبروتوكولات المرتبطة بها. تم دعم العمل بجائزة 5R35GM145318 من NIGMS ، وجائزة R33CA258012 من NCI ، وجائزة P01HL151327 من NHLBI.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| # 1.5 أغطية زجاجية 25 مم أدوات وارنر المستديرة | 64-0715 | ||
| 1.5 مل أنابيب الولايات | المتحدة الأمريكية العلمية | cc7682-3394 | |
| 2x Laemmli Buffer | ل 500 مل: 5.18 جم Tris-HCL ، 131.5 مل جلسرين ، 52.5 مل 20٪ SDS ، 0.5 جم بروموفينول أزرق ، درجة الحموضة النهائية 6.8 | ||
| 4-20٪ Mini-PROTEAN TGX جل مسبقة الصب | Biorad | 4561096 | |
| 5x Phusion Plus Buffer | Thermo Scientific | F538L | |
| A431 Cells | ATCC | CRL-1555 | |
| Agarsose | GoldBiotech | A-201 | |
| Attofluor Cell Chamber | invitrogen | A7816 | |
| Benchmark Fetal Fibro Serum (FBS) | Gemini Bio-products | 100-106 | الحرارة المعطلة الثلاثية 0.1 & micro ؛ م العميد المعقم |
| المصفى 35،30 w / v ٪ | Acros | 329581000 | |
| BSA | GoldBiotech | A-420 | |
| CellGeo | N / A | N / | A نشرت في 10.1083 / jcb.201306067 |
| CellMask صبغة غشاء البلازما الأحمر العميق | invitrogen | c10046 | |
| Colony Screen MasterMix | Genesee | 42-138 | |
| DH5a المختصة الخلايا | NEB | C2987H | |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| DMSO | Thermo Scientific | F-515 | |
| سلم الحمض النووي | GoldBio | D010-500 | |
| dNTPs | NEB | N04475 | |
| DpnI إنزيم | NEB | R01765 | |
| DTT | GoldBio | DTT10 | DL-Dithiothreitol ، كواشف كليلاند |
| EGTA | Acros | 409910250 | |
| Fibronectin من بلازما الأبقار | Sigma | F1141 | |
| FuGENE (R) 6 كاشف التعداء | Promega | E2692 | كاشف |
| طقم استخراج جل | Thermo Scientific | K0692 | GeneJET Gel |
| Gel Stain Green | Nucleic Stain GoldBio | G-740-500 | |
| صبغة تحميل جل أرجواني 6x | NEB | B7024A | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | GlutaMAX-l (100x) 100 مل |
| خلايا HEK 293T ATCC | CRL-11268 | ||
| HeLa Cells | ATCC | CRM-CCL-2 | |
| HEPES | Fischer | BP310-500 | |
| ImageJ Foam | Software N / A | N / A | |
| Igepal CA-630 (NP40) | Sigma | I3021 | |
| Imidazole Buffer | 25 mM Imidazole pH 7.2 ، 2.5 mM EDTA ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي DTT | ||
| KCl | Sigma | P-4504 | |
| L-15 1x | Corning | 10-045-CV | |
| LB Agar | Fisher | BP1425-2 | |
| عازلة | التحلل20 ملي مولار Hepes-KOH ، درجة الحموضة 7.8 ، 50 ملي كلوميشان ، 1 ملي مولار EGTA ، 1٪ NP40 | ||
| تحديث MATLAB | MathWorks N | / A | R 2022b لتشغيل وظائف CellGeo |
| أتمتة الفحص المجهري المتحول وتحليل الصور | N / A | N / A | |
| MgCl2< / sub> | Fisher Chemical | M33-500 | |
| زيت معدني | Sigma | M5310 | |
| MiniPrep Kit | Gene Choice | 96-308 | |
| Mini-PROTEAN TGX المواد الهلامية مسبقة الصب 12 بئر | Bio-Rad | 4561085 | |
| البيولوجيا الجزيئية الصف Water | Corning | 46-000-CV | |
| متعددة النطاقات مرآة متعددة الأحرف | تقنية | كروما 89903BS | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-3 | |
| أوليمبوس UPlanSAPO 40x الموضوع | أوليمبوس | N / A | |
| PBS w / o Ca و Mg | Corning | 21-031-CV | |
| أنابيب PCR | labForce | 1149Z65 | 0.2 مل أنابيب وأغطية 8 شرائط ، شريط صلب متصل بشكل فردي قبة أغطية |
| Phusion Plus DNA Polymerase | Thermo Scientific | F630S | |
| بادئات | IDT | ||
| Protein-G Sepharose | Millipore | 16-266 | |
| أغشية PVDF | BioRad | 1620219 | Immun-Blot PVDF / شطائر ورق الترشيح |
| Rapamycin | Fisher | AAJ62473MF | |
| 0.25٪ تريبسين ، 2.21 ملي EDTA ، 1x [-] الصوديوم | Corning | 25-053-CI | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x | Fischer | BP1332-1 | للعزلان |
| الكهربائي Wash Buffer | 20 mM Hepes-KOH ، درجة الحموضة 7.8 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 100 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار EGTA ، 1٪ NP40 | ||
| بيتا ؛ -Mercaptoethanol | Fisher Chemical | O3446I-100< | |
| قوي > الأجسام المضادة < / قوي > | |||
| إشارات خلية | الأجسام المضادة | 2232 | |
| إشارات خلية الأجسام المضادة المضادة للإيرك 1/2 | 9102 | ||
| الأجسام المضادة للعلم | Millipore-Sigma | F3165 | |
| الأجسام المضادة المضادة ل GAPDH | invitrogen | AM4300 | |
| الأجسام المضادة ل GFP | Clontech | 632380 | |
| الأجسام المضادة ل mCherry | invitrogen | M11217 | |
| الأجسام المضادة | للبكسيلين Thermo Fischer | BDB612405 | |
| المضادة للفوسفو EGFR Y992 إشارات الخلايا المضادة للجسم المضاد | 2235 | ||
| مضاد للفوسفو Erk 1/2 T202 / Y204 إشارات خلايا الأجسام المضادة | 9101 | ||
| المضادة للفوسفو باكسيلين Y31 الأجسام المضادة | Millipore-Sigma | 05-1143 | |
| Anti-phospho-PLC & gamma ؛ Y783 إشارات خلية الأجسام المضادة | 14008 | ||
| مكافحة PLC & جاما ؛ إشارات خلايا الأجسام المضادة | 5690 |
المراجع
- Amin, A. R. M. R., et al. SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).
- Niogret, C., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
