مقالة منهجية

إعداد مكتبة (كدنا) فائقة الحساسية لتسلسل الجيل التالي من الحمض النووي الريبي الصغير من الحويصلات الصغيرة خارج الخلية

DOI:

10.3791/67154

⸱

يونيو 13, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health (HMH), 2Oncology department, Georgetown University, 3Department of Medicine B, Hadassah - Hebrew University Medical Center, 4EValuate Diagnostics LLC, 5Jersey Shore University Medical Center (JSUMC), 6Illumina Inc.

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحتوي الحويصلات خارج الخلية (EVs) على microRNAs خاصة بالخلايا تنظم الخلايا المتلقية ، والتي قد يلقي تحديدها الضوء على وظيفتها ودورها كمؤشرات حيوية. يقدم بروتوكول إعداد مكتبة (كدنا) المحسن الخاص بنا رموزا شريطية فريدة تتيح مضاعفة العينات والمعالجة المحسنة للمركبات الكهربائية منخفضة المدخلات أثناء استخدام الرموز الشريطية ذات الفهرس المزدوج المقترنة للتوافق مع أجهزة تسلسل Illumina.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر الدراسات الحديثة أن الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) ، الموجودة في جميع السوائل الحيوية ، تلعب أدوارا حاسمة في الاتصال بين الخلايا عن طريق توجيه البروتينات والحمض النووي والحمض النووي الريبي. ظهرت MicroRNAs (miRNAs) التي يتم تعبئتها في sevs كمنظمات مهمة قابلة للتسليم في الخلايا المتلقية. نظرا لأن sevs التي تفرزها الخلايا الطبيعية والمريضة تحمل شحنات miRNA مختلفة ، فإن دراسات التنميط الحديثة sEV-miRNA تشير إلى أنها قد تساعد في تحديد المؤشرات الحيوية المتداولة الجديدة. ومع ذلك ، فإن sEVs الخاصة بالخلية / المرض التي تدور في سوائل حيوية متنوعة ، بمجرد عزلها ، توفر كميات منخفضة من miRNA ، والتي يصعب تحديدها بشكل عام باستخدام منهجيات القياس الطيفي التقليدية. يوفر تسلسل الجيل التالي من الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (NGS) ، والذي يسمح بتضخيم تسلسلات miRNA المستنسخة ، فرصة ثمينة لتقييم شحنات miRNA الخاصة بمركبات sev. لسوء الحظ ، غالبا ما تتطلب إجراءات إعداد مكتبة (كدنا) التجارية مدخلات الحمض النووي الريبي أعلى بكثير من الكميات غير القابلة للقياس الكمي المتاحة من المركبات الكهربائية المعزولة.

وبالتالي ، بالنظر إلى المتانة وقدرات تعدد الإرسال لإجراء إعداد مكتبة (كدنا) الحالي (على سبيل المثال ، تم تحسينه في البداية لتحليل الحمض النووي الريبي المضمن في البارافين منخفض المدخلات ، وشديد التحلل ، والثابت بالفورمالين ، والحمض النووي الريبي (FFPE) ) ، سعينا إلى تقييم قابليته للتطبيق على تحليل sEV miRNAs. الأهم من ذلك ، مع الأخذ في الاعتبار التحسينات التقنية الأخيرة لرقائق التسلسل ، سعينا إلى تكييف نهج الترميز الشريطي للنسخ الخاص بنا ضمن سير عمل إعداد مكتبة (كدنا) مزدوجة ومتوافقة مع الفهرس لتعزيز قدراتنا على التسلسل وتعدد الإرسال. باستخدام الحمض النووي الريبي المستخرج من 8.4 × 109 sevs في 16 تكرارا ، ومن انخفاض كميات sEVs من 1010 sevs إلى 2.5 × 10 sevs ، قمنا بتقييم قابلية استنساخ وحساسية هذه المنهجية. توضح البيانات أن الرموز الشريطية للحمض النووي 16 3 'تسمح بالكشف القابل للتكرار والحساسية العالية لملفات تعريف sEV-miRNA عبر التكرارات باستخدام ما يصل إلى 3.15 بيكوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر أو 1.35 بيكوغرام من miRNAs.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) هي جزيئات مشتقة من الخلايا بحجم نانوي (~ 30-200 نانومتر في القطر) محاطة بغشاء ثنائي الطبقة الفوسفوليبيد ، والذي يتم توريثه من خليتها الأصلية ويحمي بقوة حمولتها الجزيئية1،2. من المقبول جيدا أن جميع الخلايا تقريبا تنتج وتطلق sevs في الحيز بين الخلايا ، والتي يمكن اكتشافها بدورها في معظم السوائل الحيوية (مثل الدم والبول واللعاب وما إلى ذلك)2،3،4. أظهرت الدراسات الحديثة أن الشحنات الجزيئية المغلفة بثبات (مثل الحمض النووي ، الحمض النووي الريبي ، البروتينات ، الدهون ، إلخ) 5،6،7 من sevs ، بمجرد ملامستها أو تسليمها إلى الخلايا المتلقية تتوسط الاتصال بين الخلايا8. ركزت الجهود البحثية الحالية على تحسين عزل المركبات الكهربائية الخاصة بالخلايا عن السوائل الحيوية المتنوعة ، لتحديد ومراقبة هذه الشحنات الجزيئيةبدقة 9،10. بالنظر إلى أن sEVs تحتوي على RNAs صغيرة غير مشفرة وخاصة microRNAs (miRNAs) ، والتي تحتفظ بوظيفتها التنظيمية عند التسليم الخلوي ، فقد ركزت العديد من الدراسات على تقييم فائدة miRNAs كمؤشرات حيوية يمكن أن تكشف عن حالة خليتها الأصلية11،12،13.

تمثل MicroRNAs (miRNAs) فئة كبيرة (~ 2,000 معروفة في البشر) من الحمض النووي الريبي الصغيرة غير المشفرة بأحجام تتراوح بين 19 و 25 نيوكليوتيد (nt) ، والتي ترتبط بمواقع تكميلية غير كاملة في المناطق 3 'غير المترجمة من أهداف mRNA الخاصة بهم وتوجه تدهورها و / أو قمع ما بعدالنسخ 14،15. من الناحية الوظيفية ، تم وصف miRNAs للتحكم في العديد من العمليات البيولوجية ، وقد ارتبط تحرير التعبير عنها بتغيرات في العمليات الجزيئية والكيميائية الحيوية والفسيولوجية التي تساهم في بدء الأمراض وتطورها ، بما في ذلك السرطان16،17،18. الأهم من ذلك ، أظهرت الدراسات أن الخلايا المريضة وخاصة الخلايا السرطانية ، لا تعبر فقط عن miRNAs بشكل تفاضلي مقارنة بالخلايا الطبيعية18 ، ولكن عبواتها في sevs تختلف أيضا19،20.

بينما تركز العديد من الدراسات على إنشاء العمليات والمسارات الجزيئية التي توجه تغليف sevs في الخلايا الطبيعية والمريضة19،21،22 ، تركز دراسات المؤشرات الحيوية حاليا على تحديد توقيعات الحمض النووي الريبي الصغيرة غير المشفرة و / أو miRNA التي يتم تعبئتها وإفرازها بواسطة خلايا مريضة / سرطانية معينة عبر sevs. وبالتالي فإن العزل المستهدف للمركبات الكهربائية المركبة الخاصة بالخلايا المريضة من السوائل الحيوية البشرية المتنوعة وتقييم شحناتها الجزيئية متعددة الأوميك قد يمكن من تطوير فحوصات تشخيصية وتنبؤية للكشف غير الجراحي عن الأمراض البشرية والسرطانات المتنوعة23،24،25،26. على الرغم من أن sEV-miRNAs هي أكثر النصوص غير المشفرة التي تمت دراستها ، إلا أن أنواع الحمض النووي الريبي الصغيرة الأخرى غير المشفرة (مثل الأشكال الإسوية miRNA (isomiRs) ، و piwiRNAs ، وجزء نقل الحمض النووي الريبي (tRFs) ، و rRNAs ، و RNAs غير المشفرة اليتيمة (oncRNAs) ...) يتم تقييمها أيضا لفائدتها المحتملة كمؤشرات حيوية sEV منتشرة ، مع التركيز بشكل خاص على الكشف عن السرطانات المختلفة27،28،29،30،31،32.

من المفيد أن تحليل تسلسل الجيل التالي (NGS) لنصوص الحمض النووي الريبي الصغيرة غير المشفرة (بما في ذلك miRNAs) ، بعد إعداد مكتبة الترميز الشريطي ومكتبة (كدنا) ، مثالي لاستكشاف أنواع الحمض النووي الريبي الصغيرة غير المشفرة المعروفة و / أو غير المعروفة الموجودة في sEVs المنتشرة ، والتي قد تكون مرتبطة بالأمراض27. في الواقع ، يوفر sEV small-RNA NGS نهجا عالي الإنتاجية لاكتشاف نصوص الحمض النووي الريبي الصغيرة غير المشفرة الخاصة بالخلية والتي ستظل غير معروفة ، إذا تم تقييمها عالميا باستخدام تقنيات محددة للهدف (مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال ، والمصفوفات الدقيقة ، واللوحات المخصصة ، وما إلى ذلك)32،33،34. بالنظر إلى أننا قمنا سابقا بتحسين بروتوكول إعداد مكتبة (كدنا) شديد الحساسية وقابل للتكرار بدرجة كبيرة ، والذي طورناه لتحليل الحمض النووي الريبي المدمج في البارافين الثابت بالفورمالين (FFPE)35،36 ، فقد سعينا إلى تكييفه لتحليل الحمض النووي الريبي الصغيرة غير المشفرة و miRNAs المغلفة داخل sEVs37،38،39،40.

مع إيقاف أداة Illumina HiSeq2500 ، التي زودتنا بسنوات من تحليل miRNA ثنائي المؤشر أحادي الطرف عالي الجودة لشحنات sEV37,40 ، سعينا إلى استكشاف قابلية تكرار وحساسية بروتوكولنا عند تكييفه مع أدوات التسلسل المحدثة باستخدام كيمياء المؤشر المزدوج المزدوجة المزدوجة الآن. بهدف الاحتفاظ بقدرات تعدد الإرسال للبروتوكول الأصلي ، حافظنا على 16 رمزا شريطيا موجودا لإعداد نصوص الحمض النووي الريبي (cDNA) الصغيرة قبل دمجها في كيمياء الفهرس المزدوج المزدوج. باستخدام زوج فقط من الرموز الشريطية i5 و i7 ، نمكن من إعداد مكتبة (كدنا) قوية قائمة على المختبر حيث تعمل المعالجة والتحليل المتزامنين لما يصل إلى 16 عينة فردية على تحسين قابلية التكرار التحليلي للحمض النووي الريبي sEV منخفض المدخلات. وبالتالي ، نقدم العمليات الكيميائية الحيوية ، والرموز الشريطية المحدثة ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل وبادئات علامات الحجم ، وخطوات العزل اللازمة لإنشاء مكتبات (كدنا) قابلة للتكرار بدرجة عالية باستخدام كميات منخفضة للغاية من miRNAs المعزولة من مركبات المركبات الكهربائية بالبلازما البشرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. يتم تحضير جميع الكواشف وقليل النوكليوتيدات على النحو التالي:

ملاحظة: تم تفصيل جميع النيوكليوتيدات المستخدمة في هذا البروتوكول في الشكل 1 والملف التكميلي 1 بالتركيزات المستخدمة لتنفيذ هذا البروتوكول. انظر الملف التكميلي 2 للحصول على تسلسلات التمهيدي.

  1. قم بإعداد محلول مخزون من كوكتيل المعاير ، والذي سيتم استخدامه في كل ربط فردي كعنصر تحكم في التفاعلات الأنزيمية المختلفة:
    1. أعد تعليق قليل النوكليوتيد الناقل (0.5 ميكرومتر) (الملف التكميلي 1) بالماء الخالي من RNase.
    2. اجمع بين أجهزة المعايرة ال 10 (10 ميكرولتر لكل منها ، الملف التكميلي 1) في أنبوب واحد سعة 1.5 مل للوصول إلى مخزون 100 ميكرومتر ، وقم بتخفيفه باستخدام قليل النوكليوتيد الناقل للوصول إلى محلول 0.0052 نانومتر ، وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
  2. أعد تعليق كل من 17 محولا فريدا (16 محول تجريبي و 1 محول شريطي تجريبي) محويا بمقدار 3 بوصات (الشكل 1 أ) بماء خال من النوكلياز بتركيز 50 ميكرومتر.
    ملاحظة: يتم تقسيم كل محول في أنابيب فردية تحتوي على 2.5 ميكرولتر للتخزين عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عامين ، لمنع دورات التجميد والذوبان للمخزون الأكبر.
  3. قم بإعادة تعليق قليل النوكليوتيدات التجريبية المختلفة من الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك حامل استخراج الحمض النووي الريبي (الملف التكميلي 1) ، وحامل ربط الحمض النووي الريبي 3 '(الملف التكميلي 1) ، واختبار ربط الحمض النووي الريبي (الملف التكميلي 1) ، والربط 3 '(الملف التكميلي 1 ؛ محول 19 nt-3 'و 24 nt-3'حول) و 5' ربط (الملف التكميلي 1 ؛ محول 5'محول -19 nt-3' ومحول 5'محول -24 nt-3') علامات حجم الحمض النووي ، إلى 250 نانوغرام / ميكرولتر.
  4. قم بتخفيف محول 5 بوصات المنقى HPLC إلى 100 ميكرومتر بالماء الخالي من النوكلياز (الشكل 1 أ).
  5. أعد تعليق RT والبادئات الأولى PCR 5 'و 3' RT / PCR إلى 100 ميكرومتر بماء خال من النوكلياز (الشكل 1 ب).
  6. أعد تعليق قليل النوكليوتيدات PCR 5 'و 3' PCR i7 و i5 إلى 100 ميكرومتر بالماء الخالي من النوكلياز (الشكل 1 ب).
    ملاحظة: قم بتخزين كل مادة أولية من الحمض النووي لمدة تصل إلى 10 تجارب وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  7. تحضير صبغة تحميل هلام بولي أكريلاميد (PAA) ، وخلطها ، وكمية 1 مل في أنابيب وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
    1. قم بإعداد محلول 0.5 M Na2H2 EDTA عن طريق إضافة 18.6 جم من Na2H2 EDTA إلى 50 مل من الماء الخالي من النوكلياز. أضف كريات هيدروكسيد الصوديوم ببطء إلى محلول Na2H2 EDTA المحضر للوصول إلى درجة حموضة 8.0. قم بتكوين الحجم حتى 100 مل باستخدام ddH2O للحصول على محلول مخزون 0.5 M Na2H2 EDTA (درجة الحموضة 8.0)
    2. قم بوزن 15 مجم من Bromophenol Blue في أنبوب سعة 15 مل ، وأعد تعليق المسحوق في 600 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز ، وأضف 14.25 مل من الفورماميد منزوع الأيونات. أخيرا ، أضف 150 ميكرولتر من محلول 0.5 M Na2H2 EDTA ، درجة الحموضة 8.0. قم بتقسيم محلول PAA النهائي في أنابيب سعة 1 مل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
    3. تحضير صبغة تحميل هلام الاغاروز 5x.
      1. قم بوزن وإذابة 1.86 جم من Na2H 2-EDTA في 50 مل من الماء الخالي من RNase واضبط الرقم الهيدروجيني على 8.0 عن طريق إضافة كريات هيدروكسيد الصوديوم. أضف الماء الخالي من RNase إلى 100 مل للحصول على محلول 50 ملي Na2H2 EDTA.
      2. إلى 5 مل من 50 ملي Na2H2 EDTA ، أضف 20 مجم من Bromophenol Blue ، و 20 مجم من Xylene Cyanol FF ، و 2 جم من Ficoll type-400. دوامة الأنبوب الذي يحتوي على الأصباغ الثلاثة لخلط وإضافة 5 مل إضافية من 50 ملي Na2H2 EDTA. Aliquot الفردية 1 مل أنابيب من 5x هلام الاغاروز تحميل الصبغة وتخزينها في -80 درجة مئوية.

2. تحضير عينات الحمض النووي الريبي EV

  1. بعد عزل sevs ، قم بتقييم مورفولوجيتها باستخدام المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM; الشكل 2) ، التركيز باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA; الشكل 3) ، وتوزيع البروتين السطحي باستخدام التصوير النانوي فائق الدقة (الشكل 4) ، أو تقنية القياس الكمي المكافئة ل sEV.
  2. اقتبس عددا مكافئا من sEVs في أنابيب مختلفة ، أضف RNase-A (12.5 ميكروغرام / مل) واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. ابدأ في استخراج الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر ، بما في ذلك miRNAs ، من sevs باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الصغير وبدء عزل طور الحمض النووي الريبي.
  4. افصل المرحلة المائية السفلية من المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي ، وأضفها إلى أنبوب جديد ، ثم أضف 4 نانوغرام من قليل النوكليوتيد الحامل للحمض النووي الريبي (الملف التكميلي 1) إلى كل عينة من الحمض النووي الريبي ، قبل إجراء عزل العمود باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  5. قم بتفريغ كل عينة من الحمض النووي الريبي الفردية بسرعة إلى 9.5 ميكرولتر لبدء بروتوكول إعداد مكتبة (كدنا).

3. قم بإعداد روابط المحول الشريطي 3 بوصات مع 16 عينة من الحمض النووي الريبي وعينة اختبار واحدة

  1. حدد 16 عينة فردية من sEV-RNA ، وقم بتقسيمها في 9.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز في أنابيب طرد مركزي دقيقة من السيليكون سعة 1.5 مل ، وضعها على الجليد قبل 10 دقائق على الأقل من بدء التجارب.
  2. قم بإعداد 10x RNA Ligase Buffer (بدون ATP) طازجا قبل التجربة.
    1. في أنبوب سيليكوني سعة 1.5 مل ، امزج 343 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج الخالي من النوكلياز (ddH2O) ، و 500 ميكرولتر من 1 M Tris pH 7.5 ، و 100 ميكرولتر من 1 M MgCl2 ، و 50 ميكرولتر من 20 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار ، و 7 ميكرولتر من 14 M 2-mercaptoethanol.
    2. امزج المحلول عن طريق تحريك الأنبوب ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 2 ثانية عند 2,000 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT) على جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة ، ثم ضعه على الجليد.
      ملاحظة: تتم جميع الخطوات التي تصف "جهاز طرد مركزي لمدة 2 ثانية" باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق عند RT بسرعة لا تزيد عن 2,000 × جم.
  3. قم بإذابة كوكتيل المعاير 0.0052 نانومتر عن طريق وضع الأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق.
  4. قم بإعداد Ligation Master Mix ل 18 تفاعلا في أنبوب سيليكون سعة 1.5 مل عن طريق الجمع بين 40 ميكرولتر من 10x RNA Ligase Buffer ، و 10 ميكرولتر من كوكتيل معاير 0.0052 نانومتر ، و 40 ميكرولتر من ddH2O الخالي من النوكلياز.
  5. قم بنقر الأنبوب سعة 1.5 مل وقم بتدويره على الجليد.
  6. أضف 4.5 ميكرولتر من مزيج الربط الرئيسي إلى كل من عينات sEV RNA البالغ عددها 16 عينة منفصلة بشكل فردي ، وتفاعل ربط الاختبار الذي يحتوي على 100 نانوغرام من قليل النوكليوتيد لاختبار ربط الحمض النووي الريبي (الملف التكميلي 1) المقتبس مسبقا وبحجم 9.5 ميكرولتر. قم بالنقر لخلط الأنابيب وتدويرها قبل وضعها مرة أخرى على الجليد.
  7. انقل العينات ال 16 واختبر التفاعل إلى كتلة حرارية لمدة دقيقة واحدة عند 90 درجة مئوية وانقلها مرة أخرى إلى الجليد.
  8. انقل بشكل فردي 4 ميكرولتر من 50٪ PEG إلى كل أنبوب ، ونقر للخلط ، وقم بتدوير الأنابيب قبل وضعها مرة أخرى على الجليد.
  9. قم بإذابة 2.5 ميكرولتر من كل من المحولات الشريطية 17 3 بوصات (16 تجريبية (# 1 إلى # 16) ومحول اختبار (# 17)) وضعها على الجليد لإذابة الجليد.
  10. نقل 1 ميكرولتر من كل من المحولات ال 17 إلى العينات ال 16 المقابلة التي تحتوي على sEV-RNA وعينة اختبار واحدة ، مع مزيج Ligation Master Mix (أي 4.5 ميكرولتر) ، و 50٪ PEG (أي 4 ميكرولتر).
    ملاحظة: يتم خلط جميع المحاليل والتفاعلات عن طريق تحريك الأنابيب وتدويرها، بدلا من سحب المحاليل لأعلى ولأسفل، لمنع فقدان المواد.
  11. قم بإعداد إنزيم ربط T4 RNA Ligase 2 المقطوع K227Q المخفف عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من الإنزيم مع 10 ميكرولتر من ddH2O الخالي من النوكلياز في أنبوب جديد من السيليكون سعة 1.5 مل.
  12. نقل 1 ميكرولتر من إنزيم ربط T4 RNA Ligase 2 المقطوع K227Q المخفف إلى كل أنبوب من الأنبوبين ال 17 (16 عينة تجريبية و 1 عينة اختبار من الحمض النووي الريبي). لا تقم بسحب الماصة لأعلى ولأسفل ، وقم بتغيير الأطراف بين كل أنبوب ، واحتفظ بالأنابيب على الجليد ، وخلط النقر ، وجهاز الطرد المركزي ، ووضع الأنابيب على الجليد.
  13. ضع الأربطة على ثلج طازج في حامل أنبوب في دلو ثلج في الغرفة الباردة ، طوال الليل لمدة تصل إلى 18 ساعة.

4. عزل PAGE من 3 'محول ربط الحمض النووي الريبي الصغير

  1. ضع الأنابيب ال 17 على كتلة حرارية عند 90 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة لإلغاء تنشيط T4 RNA Ligase 2 ، وضعها على الثلج لمدة دقيقتين لتبرد.
  2. امزج 1 ميكرولتر من GlycoBlue و 26 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم الخالي من النوكلياز في أنبوب جديد وانقل 1.2 ميكرولتر من محلول الترسيب هذا إلى كل أنبوب من الأنبوبين ال 17.
  3. أضف 63 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى كل أنبوب من الأنابيب ال 17 ، وأغلقها ، ونقرها ، وقم بالدوران لأسفل لمدة ثانية قبل وضعها مرة أخرى على الجليد.
  4. اجمع محتوى 16 أنبوبا من الحمض النووي الريبي sEV في أنبوب واحد من السيليكون سعة 1.5 مل ، مع الحفاظ على أنبوب ربط الحمض النووي الريبي الاختباري منفصلا.
  5. اقلب الأنبوب الذي يحتوي على العينات المدمجة 3x للخلط ، وجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 2 ثانية ، واضبطه على الجليد لمدة 60 دقيقة حتى يترسب.
  6. قم بإعداد جل كبير (16 × 20 سم2) 15٪ بولي أكريلاميد (PAGE) على النحو التالي:
    1. قم بالسيليكون (أي باستخدام محلول قائم على السيليكون) وصب الألواح الزجاجية القصيرة والطويلة مع فواصل 0.1 سم.
    2. قم بإعداد مزيج هلام PAGE بنسبة 15٪ من خلال الجمع بين 9 مل من مخفف النظام ، وتركيز نظام 18 مل ، و 3 مل من المخزن المؤقت للنظام ، و 240 ميكرولتر من APS (9٪) ، و 12 ميكرولتر من TEMED في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
    3. انقل المحلول بسرعة بين الألواح الزجاجية باستخدام ماصة سعة 30 مل. قبل أن يتبلمر الجل ، أضف مشطا بسعة 14 بئرا (بسمك 0.1 سم) ، واضبط الجل في وضع مستقيم لمدة 30 دقيقة في RT.
  7. استرجع الأنبوب بعينات الحمض النووي الريبي المدمجة من الجليد وقم بالطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  8. وفي الوقت نفسه ، قم بإنهاء إعداد 15٪ PAGE عن طريق إزالة المشط برفق ، وتنظيف الآبار باستخدام H2O الخالي من النوكلياز باستخدام زجاجة بخاخ فوق الحوض ، قبل التجفيف وإعداد 15٪ PAGE على جهاز الجل ، حيث يتم ملء كل من الخزانات العلوية والسفلية بمحلول 0.5x Tris-Borate EDTA (TBE) ، قبل التشغيل المسبق لمدة 30 دقيقة عند 450 فولت.
  9. قم بإزالة الأنبوب من جهاز الطرد المركزي (الخطوة 4.6) وجفف حبيبات الحمض النووي الريبي بعناية باستخدام ماصة باستور بطرف غير مرشح سعة 10 ميكرولتر في نهايته متصل بنظام تفريغ ، دون إزعاج الحبيبات.
  10. أعد تعليق حبيبات الحمض النووي الريبي التي تحتوي على 16 ربط RNA المترسبة في 20 ميكرولتر من ddH2O الخالي من النوكلياز وأضف 20 ميكرولتر من محلول تحميل هلام PAA. انقر فوق الأنبوب للخلط ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 2 ثانية واضبطه على الجليد.
  11. استبدل 0.5x TBE من جهاز الجل ب 0.5x TBE الطازج.
  12. قم بإعداد أنبوب به سلم بحجم 20 نقطة أساس من الحمض النووي الريبي ، وأبوبين مع كل من علامتي حجم الحمض النووي القصيرة ذات الربط 3 بوصات (الملف التكميلي 1) ، وأنبوب واحد يحتوي على قليل النوكليوتيد لاختبار ربط الحمض النووي الريبي (أي مرتبط بمحول مشفر # 17).
  13. إلى كل أنبوب من الأنابيب (على سبيل المثال ، سلم ، قلات الحمض النووي القصيرة 3 بوصات ، واختبار ربط الحمض النووي الريبي) ، أضف 20 ميكرولتر من محلول تحميل هلام PAA.
  14. اضبط أنبوب عينة الحمض النووي الريبي 16 مربوطا وأنبوب اختبار ربط الحمض النووي الريبي 1 على 90 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة وأعد إلى الجليد.
  15. استبدل 0.5x TBE buffer من كل من الخزانات السفلية والعلوية (على سبيل المثال ، أضف عازلة أقل من مستوى البئر حتى لا يكون هناك تلوث متبادل بين الآبار أثناء التحميل) وقم بتحميل السلم على نهايات الجل ، وربط اختبار الحمض النووي الريبي ، وعلامتي حجم الحمض النووي القصيرتين على جانبي البئر اللذان يحتويان على 16 ربط RNA مشفر 3 بوصات (انظر الشكل 5).
  16. قم بتشغيل جل PAGE بنسبة 15٪ مع جميع العينات لمدة 90 دقيقة عند 450 فولت (~ 35 مللي أمبير) في ظل ظروف مبردة (أي مع نفخ المراوح الهواء على الألواح الزجاجية).
  17. قم بإزالة 15٪ PAGE من الزجاج ورشها برفق بمحلول SYBR Gold (10 ميكرولتر SYBR Gold في 25 مل من 0.5x TBE) واتركها مائلة لمدة 5 دقائق في الظلام.
  18. اضبط الجل على مصباح ضوئي أزرق (الشكل 5) وقم بمحاذاة كل من محول 19 nt-3 'وكل من علامة حجم المحول 24 nt-3' قليلة النوكليوتيدات قصيرة من الحمض النووي مع مسطرة واستئصال منطقة الجل التي تحتوي على تركيبات miRNA المربوطة (يعرض الشكل 6 الربط 3 'والبناء الناتج). بشكل منفصل ، قم باستئصال النطاق العلوي لربط اختبار الحمض النووي الريبي ، والذي سيتم استخدامه أيضا لاختبار ربط 5 بوصات في اليوم التالي.
  19. ضع قطعتي الهلام المستقرتين المنفصلتين (أي ل 16 عينة من الحمض النووي الريبي ولاختبار الربط) في أنابيب مختلفة لكسارة الجل سعة 0.5 مل موضوعة في أنابيب سيليكون سعة 1.5 مل ، وأجهزة الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 3 دقائق في RT ثم أعد تعليق قطعتي الهلام المجزأتين ب 300 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم 400 ملي ، وأغلق الأنابيب ، وختمها بالبارافيلم
  20. اضبط الأنابيب على شاكر مع تحريك عند 1,100 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية ، بين عشية وضحاها (16-17 ساعة).

5. ربط محول 5 بوصات

  1. انقل اثنين من المواد الهلامية المجزأة المنفصلة ومحالولهما (عينة مشفرة مقاس 16 × 3 بوصة (الرموز الشريطية # 1 إلى # 16) و 3 'RNA للاختبار المشفر (الباركود # 17)) على أنبوبين منفصلين من الترشيح 5 ميكرومتر ، كل منهما في أنابيب سيليكون سعة 1.5 مل ، وإغلاقهما بالبارافيلم ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 2,300 × جم في RT.
  2. أضف 950 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى كل محلول مفلتر ، وأغلق الأنابيب ، واقلبها للخلط ، وقم بالدوران لأسفل لمدة 2 ثانية ، وأغلق الأنابيب بالبارافيلم ، وضعها على الجليد لمدة 1 ساعة.
  3. قم بإعداد مخزون DMSO مائي بنسبة 50٪ طازجا عن طريق الجمع بين 1 مل من الماء الخالي من النوكلياز مع 1 مل من DMSO ، ولف الأنبوب بورق الألمنيوم ، وتخزينه في RT في الظلام.
  4. قم بإعداد جل PAGE بنسبة 15٪ وقم بتشغيله مسبقا ، باتباع الخطوات الموضحة في القسم 4.6.
  5. الطرد المركزي الأنابيب التي تحتوي على 3 'ربط 16 عينات من الحمض النووي الريبي واختبار ربط الحمض النووي الريبي عند 16,000 × غرام لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية لترسيب الحمض النووي الريبي المربوط.
  6. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون لمس كريات الحمض النووي الريبي ، وجففها بالمكنسة الكهربائية.
  7. أعد تعليق الحبيبات المربوطة 3 بوصات المكونة من 16 عينة من الحمض النووي الريبي واختبر الحمض النووي الريبي لكل منها 8 ميكرولتر من ddH2O الخالي من النوكلياز دون سحب العينة لأعلى ولأسفل. قم بنقر الأنابيب برفق للخلط ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 2 ثانية (2,000 × جم) في RT ، واضبط الأنابيب على الجليد.
  8. قم بإعداد 10x RNA Ligase Buffer (مع ATP) عن طريق خلط 500 ميكرولتر من 1 M Tris (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، 100 ميكرولتر من 1 M MgCl2 ، 50 ميكرولتر من 20 مجم / مل أسيتيل BSA ، 200 ميكرولتر من 10 ملي مولار ATP ، 7 ميكرولتر من 2-mercaptoethanol 14 M ، و 143 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase في أنبوب 1.5 مل.
  9. أضف 2 ميكرولتر من 10x RNA ligase buffer (أي مع ATP) ، و 1 ميكرولتر من محول 100 ميكرومتر 5 بوصات ، و 4 ميكرولتر من DMSO مائي بنسبة 50٪ لكل أنبوب. قم بالتمرير للخلط ، ثم قم بالدوران لمدة 2 ثانية في RT ، ثم قم بإعداد الأنبوب عند 90 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة لتغيير طبيعة الحمض النووي الريبي ، ووضعه مرة أخرى على الجليد.
  10. أضف 3 ميكرولتر من 50٪ DMSO ، ونفض الغبار للخلط ، وتدور إلى الحبيبات ، وأضف 3 ميكرولتر من T4 RNA Ligase إلى كل أنبوب ، ونفض الغبار عن الأنابيب ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 2 ثانية في RT ، واضبط الأنابيب على شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة 75 دقيقة.
    ملاحظة: لا تقم بسحب الماصة لأعلى ولأسفل.
  11. قم بإعداد سلم الحمض النووي 20 nt وأبوبين منفصلين يحتويان على قليل النوكليوتيدات الطويلة من الحمض النووي بحجم 5 بوصات (الملف التكميلي 1 ؛ محول 5 'محول -19 nt-3' ، و 5'محول -24 nt-3'حول) ، وأضف 20 ميكرولتر من PAA إلى كل من الأنابيب.
  12. بمجرد اكتمال ربط المحول 5 بوصات ، أضف 20 ميكرولتر من PAA إلى كل من الرابطين (أي 16 عينة من الحمض النووي الريبي واختبار الحمض النووي الريبي) ، واخلطها عن طريق النقر ، والدوران لأسفل ، واضبطها على 90 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، وبعد ذلك ضع الأنابيب مرة أخرى على الجليد.
  13. قم بإفراغ الخزانات العلوية والسفلية لجهاز الهلام وإضافة محلول TBE طازج 0.5x تحت مستوى آبار الخزان العلوي.
  14. قم بتحميل السلم على نهاية الهلام ، وعينة الحمض النووي الريبي للاختبار 5 بوصات ، وقليل النوكليوتيدات الطويلة من الحمض النووي (على سبيل المثال ، محول 5 'محول -19 nt-3' ، ومحول 5 'محول -24 nt-3') في الآبار المحيطة بالبئر حيث سيتم تحميل عينات الحمض النووي الريبي 16 المربوطة 5 بوصات (يعرض الشكل 6 ربط 5 'والبناء الناتج). قم بتشغيل الجل لمدة 90 دقيقة عند 450 فولت.
  15. بمجرد اكتمال التشغيل ، قم بإزالة الجل من الجهاز والزجاج ورشه بمحلول SYBR Gold (أي 10 ميكرولتر من SYBR Gold في 25 مل من 0.5x TBE) ، واتركه في الظلام لمدة 5 دقائق.
  16. باستخدام محول 5 'محول -19 nt-3' وعلامات حجم المحول 5'- محول -24 nt-3 'علامات قليلة النوكليوتيدات طويلة الحمض النووي كأدلة للحجم ، قم باستئصال قسم الجل الذي يحتوي على عينات RNA مقيدة 5 بوصات (الشكل 7).
    ملاحظة: يتم تقييم اختبار ربط الحمض النووي الريبي على الجل لإثبات أن ربط المحول 5 بوصات يسمح بتحول مكافئ في الحجم لعلامات الحجم. لا يتم استئصال اختبار ربط الحمض النووي الريبي من الجل. فقط 16 عينة من الحمض النووي الريبي المجمعة.
  17. انقل قطعة الجل المستأصلة التي تحتوي على 16 عينة من الحمض النووي الريبي المرتبط إلى أنبوب قاطع هلام سعة 0.5 مل في أنبوب سعة 1.5 مل ، وقم بالدوران عند 16,000 × جم لمدة 3 دقائق في RT ، ثم أضف 300 ميكرولتر من 300 ملي كلوريد الصوديوم و 1 ميكرولتر من 100 ميكرومتر 3 'RT / PCR التمهيدي (الشكل 1 ب) إلى قطع الهلام المكسرة في الأنبوب.
  18. أغلق الأنبوب بالبارافيلم وضعه على شاكر يتحرك عند 1,100 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية ، طوال الليل (17-18 ساعة) في غرفة باردة.

6. النسخ العكسي للحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر 5 'و 3' المربوطة و miRNAs

  1. ماصة المحلول من الأنبوب الذي يحتوي على الجل المسحوق على أنبوب مرشح 5 ميكرومتر يتم إدخاله في أنبوب خال من السيليكون 1.5 مل وتدور لفترة وجيزة للسماح للمحلول بالمرور عبر الفلتر.
  2. أضف 950 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى هذا المحلول المصفى ، واقلب الأنبوب للخلط ، وقم بالدوران لمدة 2 ثانية ، ثم ضعه على الثلج لمدة 60 دقيقة.
  3. قم بترسيب حبيبات الحمض النووي الريبي عن طريق الطرد المركزي للأنبوب عند 16,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. استرجع الأنبوب, قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون لمس الحبيبات, وجفف الحبيبات بالمكنسة الكهربائية قبل تعليقها في 5.6 ميكرولتر من H2O الخالي من النوكلياز.
  5. قم بإعداد تفاعل RT عن طريق إضافة 3 ميكرولتر من 5x المخزن المؤقت الأول للخيط ، و 4.2 ميكرولتر من 10x dNTPs (كل منها عند 2 ملليمتر) ، و 1.5 ميكرولتر من Dithiothreitol (DTT) إلى الأنبوب. نفض الغبار للخلط ، وتدور لمدة 2 ثانية.
  6. قم بإعداد التفاعل عند 90 درجة مئوية لمدة 30 ثانية بالضبط ثم انقل الأنبوب إلى كتلة عند 50 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
  7. ابدأ تفاعل RT عن طريق إضافة 0.75 ميكرولتر من إنزيم النسخ العكسي إلى المحلول ، ونقر للخلط ، واضبطه على 50 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة.
  8. انقل الأنبوب عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة لتشويه طبيعة الإنزيم وخيوط cDNA / RNA ، ثم أضف 95 ميكرولتر من H2O الخالي من RNase ، وقم بنفض الغبار عن الأنبوب للخلط ، وضعه على الجليد لمدة دقيقتين. يحتوي هذا الأنبوب على (كدنا) تم إنشاؤه من 16 عينة من الحمض النووي الريبي ، كل منها مشفر بشكل منفصل في 3 '.

7. إجراء اختبار PCR والتضخيم على نطاق واسع

  1. قم بإعداد مخزن مؤقت جديد 10x PCR عن طريق الجمع بين 304 ميكرولتر من H2O الخالي من النوكلياز ، و 125 ميكرولتر من 2 M KCl ، و 50 ميكرولتر من 1 M Tris pH 8.0 ، و 10 ميكرولتر من 1 M MgCl2 ، و 5 ميكرولتر من 1٪ Triton X-100 ، و 6 ميكرولتر من 1 M 2-mercaptoethanol في أنبوب يمكن تخزينه على الجليد.
  2. قم بتجميع تفاعل PCR تجريبي / اختبار ل (cDNA) المنتج في الخطوة 6.8 (أعلاه) من خلال الجمع بين 67 ميكرولتر من H2O الخالي من Nuclease مع 10 ميكرولتر من 10x PCR Buffer ، و 10 ميكرولتر من 10x dNTPs ، و 0.5 ميكرولتر من 100 ميكرومتر 5 'PCR التمهيدي ، 0.5 ميكرولتر من 100 ميكرومتر 3' PCR التمهيدي ، 10 ميكرولتر من مكتبة مخزون (كدنا) ، و 2 ميكرولتر من 50x Taq polymerase في أنبوب PCR جديد.
    ملاحظة: قبل إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد الجهاز عن طريق إنشاء ملفين مختلفين على النحو التالي: للملف # 1: 94 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، و 50 درجة مئوية لمدة 85 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية لمدة 12 دورة ، و 4 درجات مئوية ؛ وللملف # 2: 94 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، و 50 درجة مئوية لمدة 85 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية لمدة دورتين ، و 4 درجات مئوية.
  3. بالنسبة لتفاعل PCR التجريبي / الاختباري ، ضع أنبوب PCR الذي يحتوي على 100 ميكرولتر من تفاعل PCR في Thermocycler وقم بتشغيل File # 1.
  4. بمجرد اكتمال الملف # 1 ، افتح أنبوب PCR وانقل 12 ميكرولتر من التفاعل إلى جهاز طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 3 ميكرولتر من صبغة تحميل الهلام 5x. أغلق الأنبوب واكتب "12 دورة" على الغطاء.
  5. خذ أنبوب PCR ، واضبطه في جهاز التدوير الحراري وابدأ الملف # 2.
  6. بمجرد اكتمال الملف # 2 ، انقل 12 ميكرولتر من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 3 ميكرولتر من صبغة تحميل هلام 5x ، واكتب "14 دورة" على غطاءه.
  7. كرر تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل أربع مرات متتالية (أي دورتان لكل منهما) ، مع نقل 12 ميكرولتر من منتج PCR في نهاية كل تضخيم ، وبالتالي الحصول على أربعة أنابيب مختلفة ، تسمى 16 و 18 و 20 و 22 دورة.
  8. قم بتحميل سلم بحجم 20 nt ، وكل منتج من منتجات PCR المضخمة على agarose بنسبة 2.5٪ وقم بتشغيل الجل في 0.5x TBE لمدة 30 دقيقة عند 120 فولت.
  9. حدد دورة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المثلى (الشكل 8 أ) ، بناء على نسبة ووجود ثنائيات التمهيدي (النطاق السفلي) والحمض (كدنا) المضخم (النطاق العلوي).
    ملاحظة بالنظر إلى أن إجمالي مدخلات الحمض النووي الريبي مع 16 عينة قد يكون أقل من 1 نانوغرام ، فمن المتوقع أن تولد ثنائيات التمهيدي منتجا أسرع وبكميات أكبر من الحمض النووي (كدونا) المنقى. وبالتالي ، يتم اختيار دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل المناسبة بشكل عام بين 18 و 22 دورة. في الشكل 8 أ ، دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل المناسبة لهذه المكتبة هي 20. في الشكل 8 ب ، يتم تفصيل حجم بنية PCR.
  10. بمجرد تحديد دورة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المناسبة ، قم بتعيين تفاعل البوليميراز المتسلسل السلبي (بدون cDNA) وأربعة تفاعلات تفاعلية إيجابية 100 ميكرولتر (أي يحتوي كل منها على 12 ميكرولتر من الحمض النووي).
    1. لتبسيط تحضير تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد مزيج PCR Master Mix (أي ل 4.5 تفاعلات) في أنبوب 1.5 مل عن طريق الجمع بين 292.5 ميكرولتر من H2O الخالي من النوكلياز ، و 45 ميكرولتر من 10x PCR المؤقت ، و 45 ميكرولتر من 10x dNTPs ، و 3.25 ميكرولتر من 3 'RT / PCR التمهيدي (الشكل 1 ب) و 2.25 ميكرولتر من 5 'PCR التمهيدي (الشكل 1 ب). اقلب هذا الأنبوب للخلط والدوران ليتجمع في الجزء السفلي من الأنبوب.
    2. انقل 86 ميكرولتر من PCR Master Mix إلى كل من أربعة أنابيب PCR سعة 0.5 مل.
    3. أضف 12 ميكرولتر من مكتبة (كدنا) (المخزنة على الجليد) ، ثم 2 ميكرولتر من بوليميراز التيتانيوم Taq 50x في كل من أنابيب PCR الأربعة ، واخلطها عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
    4. قم بإعداد أنبوب تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بدون قالب عن طريق إضافة 77 ميكرولتر من H2O الخالي من النوكلياز ، و 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x PCR ، و 10 ميكرولتر من 10x dNTPs ، و 0.5 ميكرولتر من 5 'PCR التمهيدي ، و 0.5 ميكرولتر من 3 'PCR التمهيدي ، و 2 ميكرولتر من 50x Taq polymerase إلى أنبوب PCR منفصل وسحب العينة لأعلى ولأسفل للخلط.
    5. قم بإعداد أنابيب PCR في جهاز التدوير الحراري باستخدام دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل المحددة في الخطوة 7.9 وقم بتعيين برنامج جديد على جهاز تدوير حراري لتضخيمه حسب الضرورة.
  11. قم بإعداد جل الاغاروز بنسبة 2.5٪ مع 0.5x TBE وبروميد الإيثيديوم ، وانقل 12 ميكرولتر من كل أنبوب PCR إلى أنابيب فردية تحتوي على 3 ميكرولتر من صبغة تحميل الهلام 5x.
  12. قم بإعداد سلم 20 nt عن طريق الجمع بين 3 ميكرولتر من السلم مع 9 ميكرولتر من H2O الخالي من النوكلياز و 3 ميكرولتر من صبغة تحميل الجل.
  13. قم بتحميل الجل ، وقم بتشغيله لمدة 30 دقيقة عند 120 فولت ، وتحقق من أن تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل مشابه بين التفاعلات الأربعة المختلفة وأن عنصر التحكم بدون قالب فارغ (الشكل 8C).
  14. اجمع تفاعلات تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الأربعة بين أنبوبين من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المصنوعة من السيليكون سعة 1.5 مل (أي أنبوبان يحتوي كل منهما على 90 ميكرولتر من المنتج) ، وأضف 18 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم ، و 800 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ في كل من الأنبوبين.
    1. اقلب الأنابيب لخلطها وتخزينها عند -20 درجة مئوية لتترسب طوال الليل.

8. تنقية مكتبة تفاعل البوليميراز المتسلسل المضخم

  1. جهاز الطرد المركزي الأنبوبين اللذين يحتويان على تفاعلات تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الإيجابية المختلطة عند 16,000 × جم لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  2. بعد 60 دقيقة ، قم بإزالة المادة الطافية ، وجفف كريات الحمض النووي بالمكنسة الكهربائية ، وأعد تعليقها في 19.5 ميكرولتر من 1x مخزن مؤقت ، ثم أضف 0.5 ميكرولتر من إنزيم PmeI.
  3. قم بإعداد ملخصات PmeI عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين لإزالة أي من علامات حجم الحمض النووي التي تعمل في الآبار المجاورة (على سبيل المثال ، محول 19 nt-3 '، 24 nt-3'adapter) أو ناقلات الحمض النووي الريبي (أي حامل استخراج الحمض النووي الريبي ، حامل ربط الحمض النووي الريبي بعد 3) الملوثات المحتملة (على سبيل المثال ، انظر مواقع PmeI المضمنة في بادئات الحمض النووي الريبي والحمض النووي في الملف التكميلي 1)
  4. قم بتشغيل الهضمين في ثلاثة آبار مختلفة من هلام الاغاروز بنسبة 2.5٪ باستخدام 0.5x TBE لتجنب تراكم فائض من ثنائيات التمهيدي في بئر واحد وإنشاء مسحة.
    1. أضف 3 ميكرولتر من صبغة تحميل الهلام 5x إلى كل من الهضم، واجمع بين الهضمين، ثم قم بتحميل 16.5 ميكرولتر في ثلاثة آبار منفصلة متجاورة.
    2. قم بتحميل سلم حجم الحمض النووي 20 nt في الآبار النهائية للهلام وقم بتشغيل الجل لمدة 90 دقيقة عند 150 فولت (الشكل 8 د).
  5. لتنقية مكتبات الحمض النووي ، قم باستئصال نطاقات PCR العلوية من الممرات الثلاثة المجاورة للهلام ، ونقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
  6. قم بتنقية مكتبة تفاعل البوليميراز المتسلسل المضخم باستخدام مجموعة استخراج الهلام، باتباع تعليمات الشركة المصنعة، وحدد كمية منتج الحمض النووي المنقى باستخدام مقياس الفلور، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

9. تضخيم PCR النهائي لإضافة الباركود المتوافق مع جهاز التسلسل

  1. قم بإعداد مزيج مخزن مؤقت جديد 10x PCR كما هو موضح في الخطوة 7.1.
  2. قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من خلال تضمين عنصر تحكم سلبي واحد (بدون مكبرات صوت) وثلاثة تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام 0.75 نانوغرام من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى من أول تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في كل أنبوب من الأنابيب الثلاثة على النحو التالي:
    1. قم بإعداد ثلاثة تفاعلات تفاعلية عن طريق خلط 75 ميكرولتر من ddH2O ، و 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x PCR ، و 10 ميكرولتر من 10x dNTPs ، و 1 ميكرولتر من التمهيدي 5 '2ثانية PCR (أي التمهيدي i503 (الشكل 1 ب)) ، 1 ميكرولتر من التمهيدي 3 'PCR 2الثاني (أي التمهيدي i702 (الشكل 1 ب)) ، 1 ميكرولتر من منتج PCR (أي ، 0.75 نانوغرام من منتج 1ST PCR المنقى بالهلام) ، و 2 ميكرولتر من بوليميراز التيتانيوم.
    2. قم بإعداد التحكم السلبي في تفاعل البوليميراز المتسلسل (أي لا يوجد قالب DNA) عن طريق خلط 76 ميكرولتر من ddH2O ، و 10 ميكرولتر من 10x PCR buffer ، و 10 ميكرولتر من 10x dNTPs ، و 1 ميكرولتر من 5 '2nd PCR التمهيدي (أي التمهيدي i503 (الشكل 1 ب)) ، 1 ميكرولتر من 3 'PCR 2nd التمهيدي (أي التمهيدي i702 (الشكل 1 ب)) ، و 2 ميكرولتر من بوليميراز Taq.
    3. قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الأربعة (أي عنصر تحكم سلبي واحد ، وثلاثة إيجابيات) على جهاز تدوير حراري مبرمج على النحو التالي: 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، و 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية لمدة 9 دورات ، ثم 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وتعليق نهائي عند 10 درجات مئوية.
  3. بمجرد اكتمال دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، خذ 10 ميكرولتر من خليط التفاعل وأضف 3 ميكرولتر من صبغة التحميل ، وقم بتقييم المنتجات على هلام الاغاروز بنسبة 2.5٪ كما هو موضح في الشكل 9 أ ، جنبا إلى جنب مع سلم 20 nt.
  4. عند التحقق من صحة حجم منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (أي النطاق العلوي لتفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يعمل عند 164 نقطة أساس كما هو موضح في الشكل 9 ب والشكل 6 للحجم والتفاصيل حول البناء النهائي) وتوزيع النطاق ، اجمع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنبوبين عن طريق إضافة 135 ميكرولتر من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (أي 90 ميكرولتر + 45 ميكرولتر) ، 13.5 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم. و 650 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ ، وتترسب عند -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  5. في اليوم التالي ، قم بتدوير أنبوبي PCR عند 16,000 × جم لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  6. جفف كل حبيبات ، وأعد تعليقها باستخدام 19.5 ميكرولتر من 1x PmeI المؤقت ، وأضف 0.5 ميكرولتر من PmeI لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية على شاكر للتخلص بشكل أكبر من أي من علامات الحجم التي تعمل في الآبار المجاورة (على سبيل المثال ، محول 19 nt-3 '، محول 24 nt-3') أو ناقلات الحمض النووي الريبي (أي حامل استخراج الحمض النووي الريبي ، حامل ربط الحمض النووي الريبي بعد 3 ') الملوثات.
  7. قم بإعداد المنتجات المهضومة في ثلاثة آبار من جل الاغاروز بنسبة 2.5٪ وافصلها عند 150 فولت لمدة 90 دقيقة.
  8. استئصال النطاق العلوي ، الذي يعمل عند 164 نقطة أساس (الشكل 9 ج) ، وتنقية منتج الحمض النووي باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي وتحديد الكمية باستخدام مقياس الفلور.
  9. قم بتشغيل منتج PCR النهائي على شريحة DNA للتحقق من حجم المكتبة وتركيزها ونقائها قبل التخفيفات والتحليل باستخدام جهاز التسلسل.
  10. انقل ملف بيانات FASTQ إلى خط أنابيب RNAworld لقص المحول ، وإزالة تعدد الإرسال ، والمحاذاة مع الجينوم البشري ، قبل تحليلات miRNA ، كما هو موضحسابقا 41. بدلا من ذلك ، باستخدام البرنامج النصي المقدم في الملف التكميلي 3 ، قم بإلغاء تعدد إرسال القراءات من ملف FASTQ وقم بإجراء المزيد من المعالجة باستخدام خط أنابيب تحليلي صغير للحمض النووي الريبي المفضل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما هو مفصل في البروتوكول أعلاه ، نصف المعالجة المتزامنة لما يصل إلى 16 عينة من الحويصلة الصغيرة خارج الخلية (sEV) من عينات الحمض النووي الريبي الصغيرة خارج الخلية (أي لتحليل الحمض النووي الريبي الصغيرة غير المشفرة و miRNAs) ، والتي يتم تحليلها معا داخل مكتبة واحدة ، بعد الخضوع للترميز الشريطي 3 بوصات. تم عزل sEVs التي تم اختيارها لتحليلاتنا عن طريق الطرد المركزي الفائق ، كما هو موضح سابقا37،40 ، من 45 مل من البلازما التي تم جمعها من النساء اللواتي تم تشخيص إصابت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد طورنا بروتوكول إعداد مكتبة (كدنا) لتسلسل الجيل التالي القابل للتكرار والحساس (NGS) للحمض النووي الريبي غير المشفر ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي الصغير (miRNAs) المعزول بكفاءة من الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs). بالنظر إلى أنه يمكن استرداد كمية محدودة من الحمض النووي الريبي الصغيرة غير المشفرة و miRNAs من sEVs المعزولة عالميا أو بشكل انتقائي ، فقد سعينا إلى تحسين إجراء إعداد مكتبة (كدنا) الخاص بنا والذي يتيح التحليل القابل للتكرار والحساس لشحنات sEVs miRNA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O.L. هو مؤسس غير موظف لشركة EValuate Diagnostics، Inc مع نسبة صغيرة من الأسهم في الشركة. المؤلفون الآخرون ليس لديهم تضارب في المصالح للإعلان عنهم.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر مختبر الدكتور توماس توشل على دعمهم وعلى توفير الوصول إلى التكنولوجيا الأصلية التي تم تطويرها في مختبرهم ، فضلا عن منحنا إمكانية الوصول إلى خط أنابيب RNAworld.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1٪ Triton X-100   ؛InvitrogenHFH10
10 mM ATP AmbionAM8110G
10x dNTPs AmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14 M MercaptoethanolSigmaO3445I-100   ؛
20 NT سلم  جينا بيوساينسM-232S
20 ملغم / مل ألبومين مصل الأبقارسيجماB8894-5ML 
50x التيتانيوم Taq مختبرات Clontech 639208
بيرسولفات الأمونيومفيشر العلمية 7727-54-0
مصباح الضوء الأزرق- تصوير آمن 2.0 العمودي ThermofisherG6600
BRL مع ألواح زجاجية وأمشاطGIBCOV16
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)SigmaD9170-5VL
Eppendorf جهاز طرد مركزي دقيق 5424Rالولايات المتحدة الأمريكية علمي4054-4537Q
Eppendorf Thermomixerالولايات المتحدة الأمريكية العلمية4053-8223Q
أنبوب تصفية مع مرشح 5 ممIST Engineering Inc.5388-50
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة الاحتجاز من السيليكون من فيشربراند 1.5 ملفيشر ساينتفيك02-681-320
أنبوب قواطع الجل 0.5 ملIST Engineering Inc.3388-100
جهاز الرحلان الكهربائي جل 7 سم × 10 سم - Mini-sub Cell GT مع صواني وأمشاط هلام Biorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Illumina NextSeq 1000/2000 Sequencer Illumina20047256
Jersey-Cote (حل قائم على السيليكون)LabScientific, Inc 1188
KCl 2 MAmbionAM9640G
MgCl 2< / sub> 1 MAmbionAM9530G
Minifuge جهاز طرد مركزي شخصي مزدوج الدوارالولايات المتحدة الأمريكية علمي2641-0016
نموذج V16 جهاز الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد ، نظارات ، أمشاط ، وفواصلCiore Life Science21070010
قليل النوكليوتيداتIDTمحدد أثناء الطلب
نظام الرحلان الكهربائي الصغير Owl EasyCast B2 - مع صواني وأمشاط هلامThermofisher ScientificB2
Qiaquick Gel Extraction Kit   ؛Qiagen28704
كيوبت مقياس الفلورThermofisher ScientificQ33238
إنزيم التقييد PmeI و 10x Cut Smart BufferNEBR0560S
النسخ العكسي- Superscript IIIThermoFisher12574026
ماء خال من RNase  AmbionAM9932
Shaker- Eppendorf ThermomixerEppendorf5385000024
SeaKem LE agarose Lonza50002
Superscript III مجموعة النسخ العكسي  Invitrogen18080-044
SYBR GoldLife Technologies S11494
التيتانيوم Taq بوليميرازتاكارا639208
T4 RNA Ligase 1 & nbsp ؛NEBM0204S
T4 RNA Ligase 2 مقطوعة K227Q NEB0351L
TEMEDفيشر العلمية O3446I-100
Themocycler بغطاء ساخن4359659النظام الحيوي المطبق
Tris 1 M pH 7.5   ؛Invitrogen15567027
Tris 1 M pH 8.0AmbionAM9855G
نظام Sequagel فائق النقاء مركز ومخفف ومخزن مؤقتNational DiagnosticsEC-833
نظام الرحلان الكهربائي للهلام

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2 (8), 569-579 (2002).
  2. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  4. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nat Protoc. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  5. Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. J Clin Invest. 126 (4), 1139-1143 (2016).
  6. Raposo, G., Stahl, P. D. Extracellular vesicles: a new communication paradigm. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (9), 509-510 (2019).
  7. Liu, Y. J., Wang, C. A review of the regulatory mechanisms of extracellular vesicles-mediated intercellular communication. Cell Commun Signal. 21 (1), 77(2023).
  8. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell Commun Signal. 19 (1), 104(2021).
  9. Shami-Shah, A., Travis, B. G., Walt, D. R. Advances in extracellular vesicle isolation methods: a path towards cell-type specific EV isolation. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 4, 447-460 (2023).
  10. Jiang, C., Fu, Y., Liu, G., Shu, B., Davis, J., Tofaris, G. K. Multiplexed profiling of extracellular vesicles for biomarker development. Nanomicro Lett. 14 (1), 3(2021).
  11. O'Brien, K., Breyne, K., Ughetto, S., Laurent, L. C., Breakefield, X. O. RNA delivery by extracellular vesicles in mammalian cells and its applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 585-606 (2020).
  12. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandão, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: from biomarkers to mediators of physiology and disease. Cell Metab. 30 (4), 656-673 (2019).
  13. Xu, D., et al. MicroRNAs in extracellular vesicles: sorting mechanisms, diagnostic value, isolation, and detection technology. Front Bioeng Biotechnol. 10, 948959(2022).
  14. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of microRNA biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
  15. O'Brien, J., Hayder, H., Zayed, Y., Peng, C. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 9, 402(2018).
  16. Ardekani, A. M., Naeini, M. M. The role of microRNAs in human diseases. Avicenna J Med Biotechnol. 2 (4), 161-179 (2010).
  17. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am J Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  18. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  19. Dellar, E. R., Hill, C., Melling, G. E., Carter, D. R. F., Baena-Lopez, L. A. Unpacking extracellular vesicles: RNA cargo loading and function. J Extracell Biol. 1 (5), e40(2022).
  20. Lee, Y. J., Shin, K. J., Chae, Y. C. Regulation of cargo selection in exosome biogenesis and its biomedical applications in cancer. Exp Mol Med. 56 (4), 877-889 (2024).
  21. Barman, B., et al. VAP-A and its binding partner CERT drive biogenesis of RNA-containing extracellular vesicles at ER membrane contact sites. Dev Cell. 57 (8), 974-994.e8 (2022).
  22. Oka, Y., Tanaka, K., Kawasaki, Y. A novel sorting signal for RNA packaging into small extracellular vesicles. Sci Rep. 13 (1), 17436(2023).
  23. Wang, X., Tian, L., Lu, J., Ng, I. O. Exosomes and cancer - diagnostic and prognostic biomarkers and therapeutic vehicle. Oncogenesis. 11 (1), 54(2022).
  24. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835(2023).
  25. Chatterjee, M., et al. Circulating extracellular vesicles: an effective biomarker for cancer progression. Front Biosci (Landmark Ed). 29 (11), 375(2024).
  26. Asleh, K., et al. Extracellular vesicle-based liquid biopsy biomarkers and their application in precision immuno-oncology. Biomark Res. 11 (1), 99(2023).
  27. Wang, J., et al. Systematic assessment of small RNA profiling in human extracellular vesicles. Cancers (Basel). 15 (13), 3446(2023).
  28. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int J Biochem Cell Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  29. Avendaño-Vázquez, S. E., Flores-Jasso, C. F. Stumbling on elusive cargo: how isomiRs challenge microRNA detection and quantification, the case of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1784617(2020).
  30. Goh, T. X., Tan, S. L., Roebuck, M. M., Teo, S. H., Kamarul, T. A systematic review of extracellular vesicle-derived Piwi-interacting RNA in human body fluid and its role in disease progression. Tissue Eng Part C Methods. 28 (10), 511-528 (2022).
  31. Liu, D. S. K., Yang, Q. Z. C., Asim, M., Krell, J., Frampton, A. E. The clinical significance of transfer RNAs present in extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 23 (7), 3692(2022).
  32. Teng, M., Liu, L. Y., Hua, J. T., Chen, S., He, H. H. Orphan noncoding RNAs: novel regulators and cancer biomarkers. Ann Transl Med. 7 (Suppl 1), S21(2021).
  33. von Felden, J., et al. Unannotated small RNA clusters associated with circulating extracellular vesicles detect early stage liver cancer. Gut. , (2021).
  34. Dogra, N., et al. Extracellular vesicles carry transcriptional 'dark matter' revealing tissue-specific information. J Extracell Vesicles. 13 (8), 12481(2024).
  35. Loudig, O., et al. Evaluation and adaptation of a laboratory-based cDNA library preparation protocol for retrospective sequencing of archived microRNAs from up to 35-year-old clinical FFPE specimens. Int J Mol Sci. 18 (3), 627(2017).
  36. Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective microRNA sequencing: complementary DNA library preparation protocol using formalin-fixed paraffin-embedded RNA specimens. J Vis Exp. (135), e57471(2018).
  37. Mitchell, M. I., et al. Extracellular vesicle capture by antibody of choice and enzymatic release (EV-CATCHER): a customizable purification assay designed for small-RNA biomarker identification and evaluation of circulating small-EVs. J Extracell Vesicles. 10 (8), e12110(2021).
  38. Mitchell, M. I., et al. Customizing EV-CATCHER to purify placental extracellular vesicles from maternal plasma to detect placental pathologies. Int J Mol Sci. 25 (10), 5102(2024).
  39. Mitchell, M. I., et al. Non-invasive detection of orthotopic human lung tumors by microRNA expression profiling of mouse exhaled breath condensates and exhaled extracellular vesicles. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 5 (1), 138-164 (2024).
  40. Mitchell, M. I., et al. Exhaled breath condensate contains extracellular vesicles (EVs) that carry miRNA cargos of lung tissue origin that can be selectively purified and analyzed. J Extracell Vesicles. 13 (4), e12440(2024).
  41. Farazi, T. A., et al. Bioinformatic analysis of barcoded cDNA libraries for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 171-187 (2012).
  42. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): from basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  43. Kim, J. A., et al. Small RNA sequencing of circulating small extracellular vesicles microRNAs in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 13 (1), 5528(2023).
  44. Llorens-Revull, M., et al. Comparison of extracellular vesicle isolation methods for miRNA sequencing. Int J Mol Sci. 24 (15), 12183(2023).
  45. Crossland, R. E., et al. MicroRNA profiling of low concentration extracellular vesicle RNA utilizing NanoString nCounter technology. J Extracell Biol. 2 (1), e72(2023).
  46. Miceli, R. T., et al. Extracellular vesicles, RNA sequencing, and bioinformatic analyses: challenges, solutions, and recommendations. J Extracell Vesicles. 13 (12), e70005(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة