مقالة منهجية

أخذ عينات من تلف شبكية العين الناجم عن N-methyl-N-nitrosourea والتقييم متعدد المؤشرات للتغيرات المرضية

571 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67159

⸱

سبتمبر 13, 2024

 ,  ,  ,  , 
1School of Nursing, School of Pharmacy, Key Laboratory of Hui Ethnic Medicine Modernization, Ministry of Education, Ningxia Medical University, 2Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول إجراء لأخذ عينات من شبكية الفئران واستخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين ومقايسة TUNEL واللطخة الغربية للكشف عن التغيرات المرضية وموت الخلايا المبرمج في شبكية العين بعد الحقن داخل الصفاق ل N-Methyl-N-Nitrosourea.

الملخص

يمكن ملاحظة اعتلال الشبكية في معظم أمراض العين والمضاعفات المتأخرة لمرض السكري. تعد الخلايا الظهارية الصبغية المحددة وتلف الخلايا البصرية وتنكسها من السمات الرئيسية لاعتلال الشبكية. أظهرت العديد من الأدوية التقليدية فعالية سريرية كبيرة في علاج اعتلال الشبكية. تعد كيفية الحصول على شبكية العين بسرعة وبشكل كامل خطوة أساسية في أبحاث الطب التقليدي لعلاج اعتلال الشبكية. في هذه الدراسة ، نهدف إلى توفير إجراء موحد وقابل للممارسة لأخذ عينات من تلف شبكية العين الناجم عن N-methyl-N-nitrosourea (MNU) والتقييم متعدد المؤشرات للتغيرات المرضية. تم حقن الفئران داخل الصفاق ب 60 مجم / كجم MNU مرة واحدة للحث على تلف شبكية العين ، وتم الحصول على عينات شبكية العين بعد 7 أيام. بالإضافة إلى ذلك ، أجرينا تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين لتقييم التغيرات المرضية في الشبكية. تحديد معدل موت الخلايا المبرمج وبروتين موت الخلايا المبرمج بواسطة TUNEL و Western blot. تساعد هذه البروتوكولات الموحدة لأخذ عينات الشبكية وتقييم التغيرات المرضية في تعزيز استكشاف آلية اعتلال الشبكية واكتشاف أعشاب تقليدية جديدة وفعالة.

المقدمة

التهاب الشبكية الصباغي (RP) هو مرض وراثي ومسبب للعمى فيالشبكية 1. يتراوح معدل الإصابة ب RP بين 1/3500 و 1/5000 ، مما يؤثر على الوظيفة البصرية لحوالي 2.5 مليون شخص في العالم. إنه من أكثر الأمراض شهرة التي تؤدي إلى ضعف البصر لدى الإنسان ، مما يفرض عبئا كبيرا على المجتمع بأسره2. يتميز المرض بالفقدان التدريجي لوظيفة الخلايا الظهارية الصبغية في الشبكية وموت الخلايا المبرمج التدريجي للمستقبلات الضوئية. في المرحلة المبكرة ، يعاني المرضى من العمى الليلي ، والذي يتجلى في عيوب المجال البصري المحيطي ويؤدي في النهاية إلى فقدان الرؤية المركزية3. لذلك ، فإن تثبيط موت الخلايا المبرمج لمستقبلات ضوء الشبكية هو نقطة للوقاية والعلاج من RP.

موت الخلايا المبرمج لخلايا الشبكية هو سمة شائعة للحيوانات النموذجية النموذجية4. يمكن أن يؤدي الحقن داخل الصفاق ل 60 مجم / كجم N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU) في الفئران لمدة 7 أيام إلى موت الخلايا المبرمج وفقدان الخلايا المستقبلة للضوء في الشبكية ، وهو نموذج حيواني شائع الاستخدام ل RP5،6. يمكن أن يوفر تحليل التغيرات في التركيب المرضي ، وموت الخلايا المبرمج للخلايا المحددة ، والتعبير البروتيني المرتبط بموت الخلايا المبرمج لأنسجة الشبكية في النموذجية بيانات تجريبية فعالة ودعما نظريا في دراسة التسبب في RP البشري وأدويةالفحص 7،8. لذلك ، تحدد جودة عينات الشبكية موثوقية البيانات التجريبية. ومع ذلك ، نظرا لخصوصية أنسجة العين ، هناك عدد قليل جدا من التقارير حول كيفية الحصول على شبكية العين9.

توفر هذه الورقة إجراء بسيطا وسريعا وموحدا وقابلا للتشغيل لأخذ عينات الشبكية في الفئران للتغلب على أوجه القصور المذكورة أعلاه. يتم استخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين - اليوزين (HE) ، وتلوين ديوكسي نيوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي بوساطة ديوكسيوريال ثلاثي فوسفات - ديجوكسيجينين (TUNEL) ، واللطخة الغربية لتحليل التغيرات المرضية في تلف أنسجة الشبكية وموت الخلايا المبرمج في الفئران. جميع الأساليب مستمدة من خبرة مجموعتنا البحثية مع العمليات التشغيلية المحددة.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات والإجراءات الجراحية من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة نينغشيا الطبية (رقم الأخلاقيات: رقم 2020-Q066). تم شراء ذكور الفئران SPF Sprauge-Dawley (SD) ، التي تتراوح أعمارها بين 7 و 8 أسابيع ووزنها 200-220 جم ، من جامعة نينغشيا الطبية برقم ترخيص SCXK (Ning) 2020-0001. تم تربية جميع في مركز المختبر بجامعة نينغشيا الطبية. كانت درجة الحرارة والرطوبة مناسبتين ، وتم الحفاظ على دورة الضوء ليلا ونهارا ، وكان الطعام والماء مجانيين وكافيين.

1. التحضير قبل الجراحة

  1. تحضير المواد
    1. قم بإعداد ألواح الفئران ، وأجهزة التخدير الاستنشاقي ، والصناديق المدمجة ، وأنابيب التخزين المجمدة ، والقفازات والأقنعة الجراحية التي تستخدم لمرة واحدة ، والزجاجات ذات الفم الواسع ، و4٪ بارافورمالدهيد ، وكمادات الثلج ، ومقص العيون ، وملاقط العيون ، والشفرات الجراحية ومقابض السكاكين ، وأنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل وتعقيمها مسبقا (انظر جدول المواد).
  2. تحضير
    1. قسم بشكل عشوائي 20 من ذكور فئران SD إلى مجموعة نموذجية (ن = 10) ومجموعة ضابطة (ن = 10). حقن الفئران النموذجية داخل الصفاق مع 60 مجم / كجم MNU وحقن الفئران الضابطة داخل الصفاق بنفس حجم المحلول الملحي.
    2. بعد 7 أيام من الحقن ، صوم الفئران واتركها تشرب بحرية في الليلة السابقة لأخذ العينات.
    3. في اليوم التالي ، ضع الفئران على طاولة العمليات واستخدم قناعا لإدارة التخدير باستخدام 4٪ إيزوفلوران و 2 لتر / دقيقة من الأكسجين. قم بقياس عمق التخدير عن طريق الضغط على مركز القدم لمراقبة ردود فعل الفئران.

2. أخذ عينات الشبكية للكشف عن عامل البروتين

  1. قم بإصلاح محجر العين للفأر باليد اليسرى وإزالة العين بقوة معتدلة باليد اليمنى باستخدام ملقط ثني العين. ضع مقلة العين في وضع سهمي في طبق زجاجي بارد.
  2. مع إمساك اليد اليسرى بملاقط مستقيمة للعيون لإصلاح مقلة العين واليد اليمنى تمسك بالشفرة الجراحية ، قم بعمل شق طولي 2 مم بالقرب من موقع العدسة.
  3. اقطع القرنية بمقص العيون على طول الشق ، وقشر العدسة برفق ، والجسم الزجاجي ، وكشف كوب العين.
  4. ضع الجزء السفلي من كوب العين عند طرف أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل ، ثم اقلب كوب العين فوق الأنبوب ، وكشف الشبكية (شبكية العين صفراء باهتة).
  5. قم بإزالة شبكية العين بالكامل على طول الجدار الصلبي لمقلة العين باستخدام ملاقط ثني العين ، ثم ضعها في أنبوب مجمد وقم بتخزينها في خزان نيتروجين سائل لاستخدامها في المستقبل (الشكل 1).

3. أخذ عينات الشبكية للفحص المرضي وتلوين الخلايا المحددة

  1. باليد اليسرى ، استخدم ملاقط العين لرفع زاوية عين الفئران. باليد اليمنى ، استخدم شفرة جراحية لقطع فتحة 4 مم على طول زاوية عين الفئران.
  2. استخدم ملاقط العين لتثبيت حافة مقلة العين عند الفتحة في اليد اليسرى. استخدم مقص العيون لقطع الأنسجة المحيطة على طول حافة مقلة العين مع الانتباه إلى تنظيف الأنسجة المحيطة بمقلة العين.
  3. افصل الأنسجة حول العصب البصري في القطب الخلفي لمقلة العين باستخدام ملاقط العين ، وقطع العصب البصري ، وانتبه للحفاظ عليه. ثم قم بإزالة مقلة العين.
  4. اغسل مقلة العين التي تمت إزالتها في محلول ملحي لإزالة أي دم متبقي ، ولفها على ورق ترشيح لامتصاص الماء الزائد ، وضعها على ورق قصدير بارد.
  5. ثبت العين باستخدام ملاقط العيون. قم بعمل شق طولي 4 مم على طول تقاطع القرنية وشبكية العين بشفرة جراحية.
  6. قم بإزالة القرنية بمقص العيون ، وقم بعمل قطع دائري على طول الشق ، وقم بإزالة العدسة والجسم الزجاجي برفق.
  7. ضع كوب العين المتبقي مع عصب بصري في صندوق تضمين وثبته في 4٪ بارافورمالدهيد.
  8. قم بتضمين عينات مثبتة ببارافورمالدهايد في البارافين وتقطيعها إلى شرائح 4 ميكرومتر لتلوين HE وتلوين TUNEL7.

4. تلطيخ شبكية العين الفئران

  1. إزالة الشمع والترطيب: ضع الشرائح في الزيلين لمدة 10 دقائق ، كرر العملية لمدة 10 دقائق أخرى ، متبوعا بالإيثانول المطلق لمدة 5 دقائق ، كرر معالجة الإيثانول لمدة 5 دقائق أخرى ، متبوعا بالعلاج بالكحول بنسبة 95٪ لمدة 5 دقائق ، ثم في الكحول بنسبة 85٪ لمدة 5 دقائق ، وأخيرا في الكحول بنسبة 75٪ لمدة 5 دقائق.
  2. تلطيخ الهيماتوكسيلين: اشطف الشريحة بالماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق. استخدم 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين وصمة عار لمدة 5 دقائق ، ثم اشطفها بالماء منزوع الأيونات لمدة 5-10 ثوان. أضف 100 ميكرولتر من الإيثانول بحمض الهيدروكلوريك 1٪ لمدة 30 ثانية ، واشطفها بالماء منزوع الأيونات لمدة 20 دقيقة ، وأضف 100 ميكرولتر من ماء الأمونيا 0.2٪ لمدة دقيقة واحدة. اشطفه بالماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق.
  3. تلطيخ اليوزين: استخدم 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ اليوزين للتلطيخ لمدة 5 دقائق ثم اشطفه بالماء منزوع الأيونات لمدة 30 ثانية.
  4. الجفاف والختم: اغمر الشرائح في 70٪ كحول لمدة 5 دقائق ، ثم 85٪ كحول لمدة 5 دقائق ، متبوعا بالكحول 90٪ لمدة 5 دقائق ، والإيثانول المطلق لمدة 5 دقائق. كرر معالجة الإيثانول المطلقة لمدة 5 دقائق أخرى ، ثم اغمرها في الزيلين لمدة 5 دقائق ، وكرر العملية لمدة 5 دقائق أخرى. أخيرا ، قم بإغلاقها بإضافة ما يقرب من 100 ميكرولتر من الراتنج المحايد إلى سطح الشرائح ثم قم بتغطيتها بزجاج غطاء.
  5. تصوير الشرائح: ضع الشرائح الملطخة على المجهر ، واضبط تركيز المجهر حتى تصبح الصورة مرئية بوضوح ، واضبط التكبير على 400x ، والتقط الصورة.
  6. قياس إجمالي سمك الشبكية وسمك الشبكية الخارجي: قياس إجمالي سمك الشبكية وسماكة الشبكية الخارجية (سمك الطبقة النووية الخارجية وطبقة المستقبلات الضوئية) ، وحساب النسبة المئوية لسمك الشبكية الخارجية
    سمك الشبكية الخارجي (٪) = (سمك الشبكية الخارجي / إجمالي سمك الشبكية) × 100.

5. تحديد معدل موت الخلايا المبرمج لخلايا مستقبلات ضوء الشبكية بطريقة TUNEL

  1. إزالة الشمع والترطيب: ضع الشرائح في الزيلين لمدة 10 دقائق ، كرر العملية لمدة 10 دقائق أخرى ، ثم ضعها في الإيثانول المطلق لمدة 5 دقائق ، وكرر هذه الخطوة لمدة 5 دقائق أخرى. قم بإجراء الجفاف عن طريق وضع 95٪ كحول لمدة 5 دقائق ، و 90٪ كحول لمدة 5 دقائق ، و 80٪ كحول لمدة 5 دقائق ، و 70٪ كحول لمدة 5 دقائق ، ثم اشطفه بالماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق.
  2. اشطفها بمحلول كلوريد الصوديوم 0.85٪ لمدة 5 دقائق و PBS لمدة 5 دقائق. إصلاحه باستخدام بارافورمالدهيد باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة. اشطفها باستخدام PBS لمدة 5 دقائق ، وكرر العملية لمدة 5 دقائق أخرى.
  3. الحضانة والتوازن7: احتضان بمحلول بروتيناز K 20 ميكروغرام / مل للهضم لمدة 15 دقيقة ، والتوازن في المخزن المؤقت للتوازن لمدة 10 دقائق ، واحتضانه مع المخزن المؤقت deoxynucleotidyltransferase الطرفي المؤتلف (rTdT) عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  4. إيقاف التفاعل: أضف 100 ميكرولتر من محلول السترات القياسي (محلول 2x SSC) لمدة 15 دقيقة. اشطفها باستخدام PBS لمدة 5 دقائق ، وكرر العملية لمدة 5 دقائق أخرى.
  5. صبغة نووية: أضف 100 ميكرولتر 4 ′ ، كاشف 6-diamidine-2-phenindl (DAPI) لمدة 5 دقائق. يغسل بالماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق ، وكرر العملية لمدة 5 دقائق أخرى.
  6. الختم: امسح الزيلين الزائد حول الشرائح ، وأغلقه بإضافة ما يقرب من 100 ميكرولتر من الراتنج المحايد إلى سطح الشرائح ، ثم قم بتغطيته بغطاء زجاجي.
  7. الفحص المجهري: ضع الشرائح الملطخة على المجهر ، واضبط تركيز المجهر للحصول على رؤية واضحة ، واضبط التكبير على 400x ، والتقط الصورة. راقب التألق الأخضر عند 520 ± 20 نانومتر باستخدام مرشح مضان قياسي. راقب DAPI الأزرق عند 460 نانومتر.
  8. احسب معدل موت الخلايا المبرمج: قم بقياس قيم التألق الأخضر وقيم التألق الأزرق لطبقة نواة الشبكية الخارجية. احسب معدل موت الخلايا المبرمج على النحو التالي
    معدل خلايا موت الخلايا المبرمج = قيمة التألق الأخضر / قيمة التألق الأزرق × 100.

6. تحليل اللطخة الغربية 10

  1. العلاج العازل للتحلل: قم بفرم وتجانس شبكية واحدة مجمدة مع 50 ميكرولتر من محلول التحلل البارد (1 مل من محلول التحلل الذي يحتوي على 5 ميكرولتر من مثبط الفوسفاتيز ، و 1 ميكرولتر من مثبط الإنزيم البروتيني ، و 5 ميكرولتر من 100 ملي PMSF).
  2. تخضع لصوتنة 28 كيلو هرتز لمدة 5 ثوان على حمام جليدي ؛ كرر 3 مرات. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق عند 10,000 × جم لإزالة الحطام الخلوي. احتفظ بالمادة الطافية.
  3. em>6.3القياس الكمي للبروتين: تحديد تركيز البروتين باستخدام مجموعة كاشف فحص البروتين BCA.
  4. em>6.4الرحلان الكهربائي: قم بتحميل عينة بروتين 50 ميكروغرام وافصل عن الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد دوديسيل كبريتات الصوديوم بنسبة 12٪ (SDS-PAGE).
  5. النقل إلى الغشاء: النقل الكهربائي إلى أغشية PVDF باستخدام نظام النقل الكهربائي.
  6. تقسيم الأغشية: قسم الأغشية ، وقم بتحليل كل بروتين ذي أهمية ، β-أكتين و GAPDH من نقل واحد.
  7. الحظر: سد الأغشية لمدة ساعة واحدة في TBST التي تحتوي على 5٪ حليب خالي الدسم في درجة حرارة الغرفة.
  8. احتضان الجسم المضاد الأولي: احتضان بالجسم المضاد الأولي للكاسباز -9 المشقوق (تخفيف 1: 200) ، كاسباز -3 المشقوق (تخفيف 1: 200) ، كاسباز -7 المشقوق (تخفيف 1: 200) ، و β-أكتين (1: 1000 تخفيف) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. اغسل الأغشية باستخدام TBST لمدة 5 دقائق ، كرر 3 مرات.
  9. احتضان الجسم المضاد الثاني: احتضان بالأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع بيروكسيداز الفجل الحار (1: 2000) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأغشية باستخدام TBST لمدة 5 دقائق ، كرر 3 مرات.
  10. تعرض: تصور البروتينات المسمى باستخدام ركيزة اللطخة الغربية ، وأخيرا ، قم بتعريض الأغشية لتصور نطاقات البروتين في وضع التعرض التلقائي.
  11. احسب محتوى البروتين7 عن طريق قياس كثافة نطاق البروتين.

7. التحليل الإحصائي

  1. تحليل البيانات باستخدام برنامج SPSS 19.0 وتقديمها كمتوسط ± انحراف معياري. إجراء تحليلات إحصائية للقيم المرصودة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه. خذ p< 0.05 على أنه ذو دلالة إحصائية.

النتائج

بعد تلطيخ HE ، كان لجميع طبقات شبكية الفئران في المجموعة الضابطة بنية نسيجية واضحة ، وترتيب خلوي منظم ، وتلوين موحد ، في حين أن بنية شبكية الفئران في المجموعة النموذجية تضررت بشكل كبير ، وكانت طبقة الشبكية الخارجية أرق ، وتم دمج الطبقة النووية الخارجية بالكامل تقريبا مع الطبقة الأساسية الداخلية ، وكان ترتيب الخلايا في الطبقة مضطربا للغاية ، تم تقليل عدد طبقات الخلايا بشكل كبير ، وكان سمك طبقة الخلية الحساسة للضوء والطبقة النووية الخارجية أرق بشكل ملحوظ. كان سمك الطبقة الخارجية للشبكية في المجموعة الضابطة والمجموعة النموذجية 48٪ و 23٪ على التوالي (p < 0.01; p 0.01; p الشكل 2).

أظهرت طريقة TUNEL أنه لم يتم اكتشاف أي خلايا موت الخلايا المبرمج في المجموعة الضابطة ، ولكن كانت هناك بعض الخلايا المبرمجة في الطبقة النووية الخارجية للفئران في المجموعة النموذجية (ص < 0.01) ، وكانت النسبة الإيجابية ل TUNEL 9.6٪ (الشكل 3).

عائلة البروتينات الكاسباز هي واحدة من العائلات الرئيسية التي تنفذ موت الخلايا المبرمج. من بينها ، الكاسباز المشقوق 3 ، والكاسباز المشقوق 7 ، والكاسباز المشقوق 9 هي مؤشرات كلاسيكية تستخدم لتقييم موت الخلايا المبرمج7. أظهرت نتائج اللطخة الغربية أنه بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، زاد التعبير عن الكاسباز المشقوق 3 ، والكاسباز المشقوق 7 ، والكاسباز المشقوق 9 في شبكية العين من المجموعة النموذجية بشكل ملحوظ (p<0.01 ؛ ص 0.01 ؛ ص 0.01 ؛ ص 0.01 ؛ ص 0.01 ؛ ص 0.01 ؛ ص 0.01 ؛ ص 0.01 ؛ ص 0.01 ؛ ص 0.01 ؛ ص 0.01 ؛ ص 0.01 ؛ ص 0.01 ؛ ص 0. الشكل 4). يشير هذا إلى أن MNU يمكن أن يسبب بوضوح موت الخلايا المبرمج في شبكية العين.

figure-results-1
الشكل 1: سير العمل التجريبي. بعد الحقن داخل الصفاق من MNU لمدة 7 أيام (7 د) ، تم الحصول على شبكية العين من الفئران المخدرة لتلوين HE و TUNEL. الاختصارات: MNU = N-methyl-N-nitrosourea; HE = الهيماتوكسيلين - اليوزين ؛ TUNEL = ديوكسي نيوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي بوساطة ديوكسي يوريدين ثلاثي فوسفات ديجوكسيجينين ، وضع العلامات في نهاية النيك. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: صور تلطيخ HE النسيجية المرضية التمثيلية في اليوم 7 بعد حقن MNU. (أ) تلطيخ HE في 7 أيام (7 د) بعد إعطاء MNU. (ب) نسبة الشبكية الخارجية. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SD (n = 6). تم إجراء التحليلات الإحصائية للقيم المرصودة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه. ** ص < 0.01 مقابل التحكم. الاختصارات: GCL = طبقة الخلية العقدية. IPL = طبقة شبكية داخلية ؛ INL = طبقة النواة ؛ OPL = طبقة شبكية خارجية ؛ ONL = الطبقة النووية الخارجية. PRL = طبقة مستقبلات ضوئية. MNU = N-methyl-N-nitrosourea; HE = الهيماتوكسيلين يوزين. ن = 6. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: يظهر اختبار TUNEL موت الخلايا المبرمج للمستقبلات الضوئية الناجم عن MNU في الفئران. (أ) في 7 أيام (7 د) بعد حقن MNU ، تم تقديم الخلايا الإيجابية ل TUNEL (الخضراء) في ONL في الفئران المعالجة ب MNU. (ب) نسبة TUNEL-إيجابية. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SD (n = 6). تم إجراء التحليلات الإحصائية للقيم المرصودة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه. ** ص < 0.01 مقابل التحكم. الاختصارات: GCL = طبقة الخلية العقدية. IPL = طبقة شبكية داخلية ؛ INL = طبقة النواة ؛ OPL = طبقة شبكية خارجية ؛ ONL = الطبقة النووية الخارجية. PRL = طبقة مستقبلات ضوئية. MNU = N-methyl-N-nitrosourea; TUNEL = ديوكسي نيوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي بوساطة ديوكسي يوريدين ثلاثي فوسفات ديجوكسيجينين ، وضع العلامات في نهاية النيك. ن = 6. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: التعبير عن الكاسباز المشقوق 3 ، والكاسباز المشقوق 7 ، والكاسباز المشقوق 9 في شبكية الفئران في اليوم 7 بعد حقن MNU. (أ) البيانات التمثيلية لتعبير الكاسباز المشقوق. (ب) نسبة الكاسباز المشقوق 3/β-أكتين. (ج) نسبة الكاسباز المشقوق 7/β-أكتين. (د) نسبة الكاسباز المشقوق 9/β-أكتين. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SD (n = 6). تم إجراء التحليلات الإحصائية للقيم المرصودة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه. ** ص < 0.01 مقابل التحكم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

RP هو مرض شائع في الشبكية في العيادات. ترتبط بداية وشدة وتطور RP بالجينات والأنماط الجينية وتتأثر بالبيئة8،11. يشمل RP RP العائلي و RP العرضي ، حيث يمثل RP العائلي حوالي 60٪ من المرضى. من خلال تتبع التاريخ الجيني للعائلة ، تم تحديد 83 جينا مرتبطا ب RP حتى الآن ، بينما يمثل RP العرضي حوالي 40٪ ، مما يعني أن هذا النوع من المرضى يفتقر إلى تاريخ عائلي ولديه نمط وراثي غير منتظم2. على الرغم من أن موت الخلايا المبرمج لخلايا مستقبلات ضوء الشبكية ، مما يتسبب في فقدان الوظيفة البصرية لدى مرضى RP هو اعتراف عام ، إلا أن الآلية الأساسية لموت المستقبلات الضوئية في RP لا تزال غير واضحة12،13،14. نظرا لمحدودية الوصول إلى أنسجة الشبكية البشرية ، والتي يتم الحصول عليها بشكل أساسي أثناء استئصال الزجاجية ، لا يزال استخراج أنسجة الشبكية من النموذجية طريقة شائعة في البحث الأساسي ل RP14،15.

شبكية العين عبارة عن غشاء شفاف يقع في الطبقة الداخلية من بصلة العين ، مع تجويف الجسم الزجاجي بالداخل والغشاء المشيمي قريب من الخارج. تبدأ شبكية العين من الحافة المسننة في الأمام وتنتهي عند القرص البصري في الخلف. إنه الجزء الأول من تكوين الرؤية16. تستخدم عينات الشبكية للحيوانات النموذجية بشكل أساسي لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل لشبكية العين ، والكشف عن اللطخة الغربية ، ومراقبة بنية الأنسجة المرضية ، والتلوين الكيميائي المناعي ، وفحص التألق المناعي ، وتقييم كثافة الأوعية الدموية الدقيقة ، وعزل الخلايا ، والثقافة ، إلخ.17،18. تختلف متطلبات أخذ عينات الشبكية لفهارس الاختبار المختلفة. يعد أخذ عينات الشبكية للكشف عن عامل البروتين في النموذجية وأخذ عينات الشبكية للأقسام المضمنة في البارافين من التقنيات التشغيلية الشائعة لفحص الأدوية ل RP8. ومع ذلك ، نظرا للبنية الدقيقة والمعقدة للغاية لمقلة العين للحيوان النموذجي ، فإن عملية إزالة الأنسجة المتداخلة في العين والحصول على عينات الشبكية معقدة. أثناء عملية أخذ العينات ، قد يكون هناك فقدان لأنسجة الشبكية ، والتلوث ، وتدهور البروتين ، وانفصال الشبكية. سيكون لهذه العوامل تأثير على جودة وكمية استخراج بروتين الشبكية ، وكذلك تأثير تلطيخ المقطع ونتائج الكشف عن المؤشرات التجريبية. لذلك ، هناك حاجة إلى إجراء مناسب لأخذ عينات الشبكية.

من الأهمية بمكان تبسيط المجمع وفهم الرابط الرئيسي للحصاد من أجل تحسين تقنية حصاد الشبكية في النموذجية. يعد التعرض السريع لشبكية العين والإزالة الكاملة لشبكية العين قدر الإمكان من الخطوات الرئيسية لأخذ عينات الشبكية للكشف عن عامل البروتين في الفئران النموذجية. في هذه الدراسة ، تم استخراج مقل العيون مباشرة بعد التخدير لتوفير وقت أخذ العينات. تتمثل الحيلة لكشف شبكية العين في قلب كوب العين فوق أنبوب سعة 1.5 مل ، والذي كان فعالا من حيث التكلفة وعمليا ويمكن أن يقشر شبكية العين تماما من جدار الصلبة. إجراء التشغيل هذا بسيط وسريع وموفر للتكاليف ويفضي إلى ممارسة تشغيل الموظفين التجريبيين ، لذلك يمكن إكماله في 5 دقائق. في عملية أخذ عينات الشبكية للفحص المرضي وتلوين الخلايا المحددة ، يعد الحفاظ على نضارة شبكية العين وسلامتها الهيكلية خطوة أساسية للحصول على تلطيخ عالي الجودة. يعد التروية بالفورمالديهايد من الأذين الأيسر ثم الحصول على شبكية العين إحدى الطرق التي يستخدمها الباحثون في كثير من الأحيان ، ولكنها تستغرق وقتا طويلا ، ورائحة الفورمالديهايد كريهة وتجلب الانزعاج للمشغل19. في هذه الدراسة ، يتم فصل الأنسجة المحيطة بمقلة العين إلى حلقة بعد التخدير للحفاظ على سلامتها. بعد قطع العصب البصري والاحتفاظ به ، افصل الأنسجة المحيطة به في القطب الخلفي لمقلة العين وقم بإزالة مقلة العين. تم تحديد موقع أجزاء مختلفة من مقلة العين بدقة مع العصب البصري. أخيرا ، بدعم من محتويات العين ، تم إجراء شق ، وقطع القرنية في حلقة ، وتم تقشير العدسة والجسم الزجاجي ، وتم الحصول على كوب العين الذي يربط العصب البصري (تقع شبكية العين على جدار الصلبة داخل كوب العين). في هذه العملية ، يجب أن تكون العملية لطيفة للحفاظ على سلامة شبكية العين. لا يؤدي إجراء العملية إلى تحسين سرعة جمع المواد بشكل كبير فحسب ، بل يمكنه أيضا الحفاظ على الهيكل الطبيعي الكامل وشكل مقلة العين ويمكن تحديد موقعه بدقة في أجزاء مختلفة من مقلة العين بعد إخراج مقلة العين. بعد عملية ماهرة ، يمكن إكمال العملية في 8 دقائق. باستخدام طرق أخذ عينات الشبكية المذكورة أعلاه ، حصلت مجموعتنا البحثية على نتائج مثالية نسبيا للكشف عن عامل البروتين ، ونتائج تلطيخ HE ، ونتائج تلطيخ TUNEL.

على الرغم من أن طريقة أخذ عينات الشبكية الحالية لها بعض المزايا ، إلا أنها لا تزال بحاجة إلى تحسين. في عملية أخذ عينات الشبكية للكشف عن عامل البروتين ، بعد تعريض الشبكية ، هناك أيضا خطر تشريح الشبكية غير المكتمل أو فقدانها عند أخذ شبكية العين عن طريق ثني الملقط بسبب نقطة الدعم المحدودة لثني الملقط. لذلك ، من الضروري تحسين أدوات تشريح الشبكية. من ناحية أخرى ، في عملية استخراج الشبكية للفحص المرضي وتلوين الخلايا المحددة ، بعد عزل مقلة العين ، أثناء عملية تجريد العدسة والجسم الزجاجي ، سينهار جدار مقلة العين بسبب فقدان الدعم من العين ، مما يسهل التسبب في تجريد الشبكية. وبالتالي ، يجب أن تكون العملية سريعة ولطيفة وذات قوة مناسبة ، ويحتاج المشغل إلى التدرب بشكل متكرر. لذلك ، لا تزال إجراءات أخذ عينات الشبكية لدينا بحاجة إلى تحسين من أجل تعزيز البحث حول التأثير الوقائي وآلية الطب التقليدي ضد RP إلى حد كبير.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع البحث العلمي التابع لإدارة التعليم العالي في نينغشيا (NYG2022029).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Amersham ImagerGE680
أمونيوم بيرسلفات  بوستر بيولوجية التكنولوجيا المحدودةA8090
الميزان التحليليMettler توليدوME104E
BCA مجموعة تكميم البروتين  كين جين للتكنولوجيا الحيوية. المحدودةKGP902
إشارات الخلية للأجسام المضادة كاسباز -3 المشقوقة# 9664
إشارات الخلية للأجسام المضادة كاسباز -7 المشقوقة# 8438
إشارات الخلاياللأجسام المضادة الكاسباز -9 المشقوقة# 9507
نظام TUNEL الفلورومتري المسدودPromegaG3250
Glycine  بوستر التكنولوجيا البيولوجية المحدودةAR1200
الماعز المضادة للأرانب IgG H& L (HRP)Bioss Antibodiesbs-80295G-HRP
مصل الماعزBiosharpBL210A
كسارة عالية السرعة  كسارة ثيرمو فيشر   AG22331
Immobilon-P SQ أغشية نقل MerckMillipore. المحدودةISEQ00010
IsofluraneRWD Life ScienceR510-22-10
MethanolChengdu Kelong Chemical Co.، Ltd20230108
MicroplateReader Thermo Fisher   ؛ علمي1510
مجهرأوليمبوسIX73
مجهر الشريحةCitotest Labware Manufacturing Co.، Ltd7105P-G
Mini-PROTEAN TetraBIO-RAD1658001
N-Methyl-N-Nitrosoureasigma-AldrichN4766 & ndash ؛ 100G
فرنشنغهاي Yuejin المعدات الطبية المحدودةDHG-8145
صفحة الحل المسبق (30٪)Doublehelix علم الأحياء العلوم والتكنولوجيا المحدودةL3202A
PageRuler Prestained بروتين سلمThermo Fisher Scientific26617
PBS العازلةBiosharpG4202
SDS-PAGE بروتين تحميل المخزن المؤقت (5 & مرات ؛)Beyotime BiotechnologyP0015
مسحوق الحليب الخالي من الدسمBioFroxx1172GR500
Sprague Dawley ratsجامعة نينغشيا الطبيةSCXK (Ning) 2020-0001
TEMED  بوستر التكنولوجيا البيولوجية المحدودةAR1165
مجموع مجموعة استخراج البروتين  كين جين للتكنولوجيا الحيوية. المحدودةKGP2100
وحدة ترانس بلطةBIO-RAD1703935
قاعدة تريس  ؛ بوستر التكنولوجيا البيولوجية المحدودةAR1162
ملاقط  Changde BKMAM Biotechnology Co.، Ltd130302027
& beta - ActinCell SignalingTechnology # 4970
تكنولوجيا تقنية تقنية علمي

المراجع

  1. Cehajic-Kapetanovic, J., et al. Association of a novel intronic variant in RPGR with hypomorphic phenotype of X-linked retinitis pigmentosa. JAMA Ophthalmol. 138 (11), 1151-1158 (2020).
  2. Pan, M. Y., et al. Mice deficient in UXT exhibit retinitis pigmentosa-like features via aberrant autophagy activation. Autophagy. 17 (8), 1873-1888 (2021).
  3. Xiong, Y. C., et al. 17β-Oestradiol attenuates the photoreceptor apoptosis in mice with retinitis pigmentosa by regulating N-myc downstream regulated gene 2 expression. Neuroscience. 452, 280-294 (2021).
  4. Zhang, S., et al. Müller cell regulated microglial activation and migration in rats with -Methyl--Nitrosourea-Induced retinal degeneration. Front Neurosci. 14, 606486(2020).
  5. Karine, B., et al. Transferrin non-viral gene therapy for treatment of retinal degeneration. Pharmaceutics. 12 (9), 836(2020).
  6. Yan, W. M., et al. Protection of retinal function and morphology in MNU-induced retinitis pigmentosa rats by ALDH2: an in-vivo study. BMC Ophthalmol. 20 (1), 55(2020).
  7. Zhu, Y. F., et al. Lycium barbarum polysaccharides attenuates N-methy-N-nitrosourea-induced photoreceptor cell apoptosis in rats through regulation of poly (ADP-ribose) polymerase and caspase expression. J Ethnopharmacol. 191, 125-134 (2016).
  8. He, S. Q., et al. Effects and mechanisms of water-soluble Semen cassiae polysaccharide on retinitis pigmentosa in rats. Food Sci Technol. 40 (1), 84-88 (2020).
  9. Chen, Q., Cheng, Z. H., Hu, B. J. Current situation of vitreous and retinal related tissue specimens collection and application. Chinese J Ocular Fundus Dis. 36 (5), 396-399 (2020).
  10. Zhang, Y., et al. Salidroside modulates repolarization through stimulating Kv2.1 in rats. Eur J Pharmacol. 977, 176741(2024).
  11. Deng, F. Y., Han, M. Y., Deng, T. T., Jin, M. Research progress of gene therapy for retinitis pigmentosa. Int Eye Sci. 21 (7), 1205-1208 (2021).
  12. Lin, B., Youdim, M. B. H. The protective, rescue and therapeutic potential of multi-target iron-chelators for retinitis pigmentosa. Free Radic Biol Med. 174, 1-11 (2021).
  13. Carullo, G., et al. Retinitis pigmentosa and retinal degenerations: deciphering pathways and targets for drug discovery and development. ACS Chem Neurosci. 11 (15), 2173-2191 (2020).
  14. Zhang, Z. J., et al. Quantification of microvascular change of retinal degeneration in Royal College of Surgeons rats using high-resolution spectral domain optical coherence tomography angiography. J Biomed Opt. 28 (10), 106001(2023).
  15. Loiseau, A., Raîche-Marcoux, G., Maranda, C., Bertrand, N., Boisselier, E. Animal models in eye research: focus on corneal pathologies. Int J Mol Sci. 24 (23), 16661(2023).
  16. Gregory-Evans, K. A review of diseases of the retina for neurologists. Handb Clin Neurol. 178, 1-11 (2021).
  17. Li, X. M., et al. Targeting long noncoding RNA-AQP4-AS1 for the treatment of retinal neurovascular dysfunction in diabetes mellitus. EBioMedicine. 77, 103857(2022).
  18. Lee, D., et al. Retinal degeneration induced in a mouse model of ischemia-reperfusion injury and its management by pemafibrate treatment. FASEB J. 36 (9), e22497(2022).
  19. Zhang, Q. L., Zhao, N., Li, Z. J. Effects of salidroside on retinopathy in diabetic rats based on COX-2/PGE2/VEGF pathway. J China Medical Uni. 52 (8), 731-935 (2023).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

TUNEL
الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.