مقالة منهجية

إنتاج الكولاجين النانوي الليفي المزخرف لهندسة الأنسجة

1.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67165

⸱

سبتمبر 20, 2024

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يقدم البروتوكول التالي طريقة بثق قائمة على القص لتصنيع هيدروجيل الكولاجين باستخدام ألياف منقوشة نانوية ، والتي يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من تطبيقات هندسة الأنسجة.

الملخص

تم تصميم المواد الحيوية المتجددة لتسهيل تفاعلات الخلايا والمواد لتوجيه إصلاح الأنسجة والأعضاء التالفة. تم تصميم هذه المواد لمحاكاة الخصائص الفيزيائية الحيوية للأنسجة الأصلية ، مما يوفر إرشادات مظهرية وصرفولوجية خلوية تساهم في استعادة مكانة الأنسجة المتجددة. الكولاجين ، وهو بروتين مصفوفة خارج الخلية السائد ، هو مكون شائع لهذه المواد الحيوية المتجددة نظرا لتوافقه الحيوي وخصائصه المواتية الأخرى. تصف الدراسة الحالية طريقة جديدة ومباشرة لتصنيع الكولاجين الليفي النانوي المصمم هندسيا مع زخرفة ليفية موجهة. من خلال التلاعب بإجهاد القص ودرجة الحرارة ودرجة الحموضة ، يتم التحكم بدقة في تكوين ألياف الكولاجين والمحاذاة دون الحاجة إلى معدات متخصصة. يسمح هذا النهج بإنشاء مواد حيوية من الكولاجين الليفي النانوي تحاكي البنية الأصلية للأنسجة التي تظهر خصائص متباينة الخواص أو متناحية. لا تسهل المرونة في زخرفة ألياف الكولاجين النانوية دراسة الزخرفة النانوية على سلوك الخلية فحسب ، بل توفر أيضا إمكانيات متنوعة لتطبيقات هندسة الأنسجة المزخرفة.

المقدمة

الهدف من الطب التجديدي هو تعزيز تجديد الأنسجة والشفاء من خلال تطبيق العلاجات الهندسية. يتضمن أحد الأساليب تصنيع تركيبات المواد الحيوية التي تحاكي عن كثب تكوين وهيكل الأنسجة الأصلية. عند تصميم هذه التركيبات ، فإن الاعتبار الحاسم هو المصفوفة الأساسية الأصلية خارج الخلية (ECM) ، والتي توفر إشارات تعليمية لتكاثر الخلايا وهجرتها وتمايزها ، مما يؤدي في النهاية إلى تجديد الأنسجة1،2. يتكون ECM الأصلي في الغالب من الكولاجين الليفي3،4. في الأنسجة عالية التنظيم مثل العضلات والأوتار الهيكلية ، تظهر هذه العضلات الهيكلية الوظيفية نمطا محاذا ، وهو المفتاح لدعم نقل القوة عبر الأنسجة وكذلك الوظيفة الحركية5،6.

تمتد فائدة الكولاجين كمادة حيوية لتطبيقات هندسة الأنسجة إلى ما هو أبعد من انتشاره الواسع في الأنسجة الأصلية ، حيث يعرض أيضا توافقا حيويا جيدا ، وقابلية للتحلل البيولوجي ، وتقارب الخلايا7،8،9. ركزت التطورات الحديثة في تطوير المواد الحيوية القائمة على الكولاجين على تحسين الخصائص الفيزيائية الحيوية لتوجيه الإشارات الميكانيكية والكيميائية الحيوية الضرورية لتجديد أنسجة معينة بشكل أفضل. يعد إنشاء مواد حيوية للكولاجين ذات بنية ليفية في المختبر أمرا بسيطا نسبيا ، حيث أن جزيئات الكولاجين القابلة للذوبان في الأحماض قادرة على التجميع الذاتي في ألياف نانوية عند تعرضها لدرجات حرارة دافئة ودرجة حموضة محايدة10،11. ومع ذلك ، بدون معالجة موجهة ، ستتشكل هذه الألياف في شبكات عشوائية ، مما يجعلها غير مناسبة لتطبيقات هندسة الأنسجة متباينة الخواص. تشمل التقنيات القادرة على إنتاج ألياف محاذاة الغزل الكهربائي والغزل الرطب ، جنبا إلى جنب مع تقنيات بثق المحلولالأخرى 12،13 ، والتجفيف بالتجميد14 ، والتصنيع الكهروكيميائي أو المغناطيسي15،16 ، وترسيب تدفقالقص 17 ، والتبلور الناجم عن التدفق18 ، والبثقالهلامي 19 ، والمحاذاة الناجمة عن الإجهاد20 ، والمحاذاة الموجهة بالقوة من خلال التلاعب بالسوائل تدفق21،22. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه الطرق إما غير متوافقة بشكل كبير مع الكولاجين ، أو تنتج محاذاة على نطاق دقيق ولكن ليس على نطاق نانوي ، أو تتطلب خطوات إضافية بعد المعالجة للحث على المحاذاة والاستقرار أو تتطلب معدات وكواشف عالية التخصص ، مما يجعل اعتمادها على نطاق واسع أمرا صعبا.

تقدم الدراسة الحالية طريقة سهلة قائمة على القص لتصنيع الكولاجين الليفي النانوي ، مع زخرفة ليفية محاذاة أو عشوائية التوجيه ، دون الحاجة إلى معدات متخصصة مثل مضخات الحقن أو المغازل الكهربائية. تستفيد هذه التقنية من اعتماد الأس الهيدروجيني لتكوين ليفي الكولاجين. يؤدي تطبيق قوة القص على الكولاجين الأحادي الحمضي داخل مخزن مؤقت محايد إلى تعزيز تكوين الليف المحاذاة على طول اتجاه القص. وبالمثل ، يمكن تحفيز الكولاجين على الخضوع لتكوين الليف في حالة عدم وجود القص ، والذي ينتج ألياف ذات أنماط عشوائية. يمكن أن تكون شرائط الكولاجين ثلاثية الأبعاد الناتجة ، والتي تتكون من كولاجين ليفي نانوي محاذاة أو منقوشة بشكل عشوائي ، بمثابة أدوات لدراسة تأثيرات الزخرفة النانوية على سلوك الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها توفر إمكانيات متنوعة لكل من تطبيقات هندسة الأنسجة متباينة الخواص والخواص23،24،25،26،27. يمكن تخصيص الزخرفة لتتناسب مع بنية الأنسجة الأصلية ذات الاهتمام. يمكن أيضا دمج شرائح الكولاجين في حزم مختلفة الأحجام لتكون بمثابة علاج هندسي مزروع بأحجام وأشكال مختلفة من الإصابات.

البروتوكول

1. تحضير الكولاجين المخلل (الشكل 1)

  1. قطع أنابيب غسيل الكلى بطول 3 بوصات تقريبا. استخدم الأنابيب بالمواصفات التالية: عرض مسطح 32 مم ، وقطر منتفخ 20 مم ، وحجم مسام 4.8 نانومتر.
  2. أعد ترطيب أنابيب غسيل الكلى في ماء فائق النقاء.
  3. قص أحد طرفي الأنبوب بمشبك أنبوب غسيل الكلى.
  4. انقل 5-6 مل من كولاجين ذيل الفئران من النوع الأول (التركيز: 9-10 مجم / مل في 0.02 نيوتن حمض الخليك) إلى الأنبوب باستخدام حقنة سعة 10 مل مزودة بإبرة 18 جرام. قص الطرف الآخر من الأنبوب لإغلاقه.
  5. ضع طبقة بسمك 0.5-1 سم من رقائق البولي إيثيلين جلايكول (PEG) في قاع طبق زجاجي ، ثم ضع أنبوب غسيل الكلى المملوء بالكولاجين فوق طبقة PEG.
    ملاحظة: يمكن أن يستوعب الطبق الزجاجي مقاس 13 بوصة × 9 بوصة × 2 بوصة عادة صفا من 4-5 أنابيب مملوءة بالكولاجين. يمكن تعديل حجم الطبق بناء على حجم الكولاجين المطلوب.
  6. أضف المزيد من رقائق PEG لتغطية الأنبوب بالكامل وضع الصينية في ثلاجة 4 درجات مئوية.
  7. كل 10-15 دقيقة ، قم بإزالة رقائق PEG المبللة من سطح أنبوب غسيل الكلى وأعد تغطية الأنبوب بطبقة جديدة من PEG الجاف. أعد الطبق إلى الثلاجة 4 درجات مئوية.
  8. كرر الخطوة 1.7 مرتين أخريين ، وبعد 30-35 دقيقة ، اشطف رقائق PEG المبللة باستخدام ماء الصنبور.
  9. اشطف الأنبوب مرة أخرى باستخدام ماء فائق النقاء وجفف الأنبوب بمنديل ورقي.
  10. قم بفك أحد طرفي الأنبوب وانقل الكولاجين المخلل (التركيز النهائي: ~ 30 مجم / مل) إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. قم بتدوير فقاعات الهواء في الكولاجين لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير (2,000 × جم ، ≤30 ثانية ، درجة حرارة الغرفة [RT]) وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامه لاحقا.
  11. قبل يوم واحد من الاستخدام ، قم بتحميل الكولاجين في المحاقن.
    1. باستخدام إبرة قياس 16 ، اسحب ~ 1 مل من الكولاجين المخلل في حقنة سعة 1 مل.
      ملاحظة: الكولاجين مادة لزجة. قد يحتاج رأس الإبرة إلى تحميله مسبقا بالكولاجين قبل إخراج المزيد من الكولاجين. قم بإزالة رأس الإبرة وطرد الجيوب الهوائية الكبيرة حسب الضرورة
    2. قم بإزالة الإبرة ولف رأس المحقنة بالبارافيلم.
    3. قم بتخزين المحقنة المملوءة بالكولاجين في وضع مستقيم على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل للسماح لفقاعات الهواء الصغيرة بالانفجار.

2. تحضير رقائق الزجاج (الشكل 1)

تنبيه: استخدم حماية العين لهذا الجزء من البروتوكول.

ملاحظة: تستخدم الشرائح الزجاجية الكارهة للماء المطلية بشكل خاص لتجارب زراعة الخلايا. يجب التعامل مع الشرائح بواسطة الحواف لمنع إزالة طلاء السطح. قم بإجراء قطع الزجاج على سطح قطع مناسب.

  1. قم بقياس وتمييز الأبعاد المطلوبة للرقاقة الزجاجية باستخدام علامة دائمة
    1. في حالة إنشاء سقالات مكونة من 8 شرائط ، ضع علامة بزيادات قدرها 1 سم تقريبا على طول الحافة الطويلة للشريحة. اضبط الأبعاد حسب الضرورة بناء على حجم السقالة المطلوب.
  2. باستخدام حافة مستقيمة (أي حافة لوحة 6 آبار) ، حرك قاطع الزجاج لأسفل بطول القياس الأول لتسجيل الزجاج.
  3. سوف تنكسر الشريحة إما على طول الخط المسجل من تلقاء نفسها أو تقلب الشريحة على نسيج (الجانب الكارهة للماء لأسفل) وتضغط يدويا على المنطقة المسجلة.
  4. ضع علامة على الجانب المطلي من الشريحة الزجاجية الكارهة للماء باستخدام قلم تحديد الإيثانول.
  5. اشطف الشريحة الزجاجية بالماء فائق النقاء لإزالة الغبار الزجاجي المتبقي.
  6. جفف الرقائق الزجاجية إما باستخدام فوهة منضدية للهواء المضغوط أو عن طريق تكديسها بزاوية في غطاء الدخان.
  7. كرر حسب الحاجة للعدد المطلوب من الرقائق. قم بتخزين الرقائق في RT. للحصول على أفضل نتائج زراعة الخلايا ، استخدم الرقائق المحضرة في غضون 7 أيام.

3. تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات 10x (PBS)

  1. املأ زجاجة زجاجية ب 500 مل من الماء فائق النقاء.
  2. أضف 10 أقراص PBS إلى الزجاجة.
    ملاحظة: يفترض هذا البروتوكول أن نسبة الكمبيوتر اللوحي ل 1x PBS هي 1 قرص لكل 500 مل. اضبط عدد الأجهزة اللوحية حسب الحاجة إذا كنت تستخدم مقاس أو علامة تجارية مختلفة للجهاز اللوحي.
  3. أضف قطعة تقليب إلى الزجاجة وضعها على طبق تقليب حتى تذوب الأقراص.
  4. في يوم تصنيع الهيدروجيل ، قم بنقل الحجم المطلوب من 10x PBS إلى 50 مل من الأنابيب المخروطية.
  5. ضع الأنابيب المملوءة ب PBS في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل تصنيع الكولاجين.

4. تصنيع ألياف الكولاجين النانوية المحاذاة (الشكل 2)

  1. أخرج حقنة من الكولاجين من الثلاجة وأرفق إبرة غير حادة 22 جم.
  2. ضع شريحة زجاجية في غطاء طبق مكون من 4 آبار.
  3. قم بتغطية الشريحة بما يكفي من 37 درجة مئوية 10x PBS الدافئة لغمرها (30-50 مل).
  4. أمسك المحقنة بزاوية 30-45 درجة تقريبا ، قم ببثق شرائح رقيقة من الكولاجين يدويا على الشريحة الزجاجية باستخدام سرعة ~ 340 مم / ثانية ومعدل تدفق ~ 3.2 مل / دقيقة.
    ملاحظة: أكمل بثق الكولاجين في غضون 30-60 ثانية من إضافة PBS الدافئ لضمان عدم تبريد PBS بشكل مفرط.
  5. انتظر لمدة 1-2 دقيقة للسماح للكولاجين بإكمال تكوين الليف أو حتى يتحول لون الكولاجين إلى اللون الأبيض المعتم.
  6. استخدم الملقط لقطع شرائح الكولاجين إلى الطول. تأكد من أن الشرائط طويلة بما يكفي بحيث يمكن طي 3-5 مم تحت طرفي الشريحة.
  7. واحدة تلو الأخرى ، قم بلف شرائح الكولاجين برفق بالطول (بالتوازي مع المنطقة المسجلة) فوق شريحة زجاجية جاهزة. دس الحواف تحت الشريحة.
  8. استمر في وضع شرائح الكولاجين حتى يتم تحقيق الأبعاد المرغوبة.
  9. ضع هيدروجيل الكولاجين المشكل حديثا عبر بئرين من صفيحة 12 بئرا. يتيح ذلك تدفق الهواء أثناء عملية التجفيف ويمنع أطراف ذيل الكولاجين من الالتصاق بالأسطح غير المرغوب فيها.
  10. اترك الهلاميات المائية على سطح الطاولة حتى تجف لمدة 1-3 ساعات أو حتى تغطي بلورات الملح PBS 50٪ -90٪ من سطح الهيدروجيل.
    ملاحظة: يختلف وقت التجفيف حسب حجم الهيدروجيل ووجود السوائل الزائدة.
  11. اغمر كل هيدروجيل في 1x PBS لمدة 30-60 ثانية أو حتى تذوب بلورات الملح.
  12. امسح برفق من PBS الزائد بمنديل ورقي.
  13. ضع الهلاميات المائية مرة أخرى على طبق البئر واتركها لتجف في غطاء الدخان طوال الليل.
  14. قم بتخزين الهلاميات المائية المجففة في RT لمدة أسبوع تقريبا.

5. تصنيع ألياف الكولاجين النانوية العشوائية (الشكل 3)

  1. أخرج حقنة من الكولاجين من الثلاجة وأرفق إبرة غير حادة 22 جم.
  2. قم بثق الكولاجين بمعدل ~ 3.2 مل / دقيقة على شريحة زجاجية جافة. قم بثق ما يكفي من الكولاجين للحصول على أبعاد مماثلة لهلاميات الكولاجين المائية. منع تراكم فقاعة الهواء حسب الضرورة.
  3. قم بثق الكولاجين الإضافي للالتفاف حول حواف الشريحة الزجاجية. هذا يقلل من خطر الانفصال العرضي.
  4. استخدم الملقط لغمر الكولاجين المبثوق في أنبوب سعة 50 مل من PBS 10x الدافئ.
  5. انتظر لمدة 45-60 ثانية حتى يكتمل الكولاجين في تكوين الرجفان أو حتى يتحول لون الكولاجين إلى اللون الأبيض المعتم.
  6. امسح برفق من PBS الزائد بمنديل ورقي.
  7. أكمل الخطوات 4.9-4.14 لشطف وتجفيف الهلاميات المائية

6. التعقيم والإماهة

ملاحظة: أكمل جميع الخطوات التالية في خزانة السلامة الحيوية

  1. عقم هيدروجيل الكولاجين ولوحة البئر المحيطة به في 70٪ إيثانول لمدة 15 دقيقة.
    1. ارفع الهلاميات المائية لفترة وجيزة في منتصف عملية التعقيم باستخدام الملقط للتأكد من أن كلا من الجانب السفلي من الشريحة الزجاجية والهيدروجيل ملامسان للإيثانول.
  2. قم بإزالة الإيثانول واترك الهلاميات المائية تجف في الهواء لمدة 10 دقائق.
  3. اغسل الهلاميات المائية 3 مرات في 1x PBS معقم ، لمدة 10 دقائق لكل منها ، لإزالة الإيثانول المتبقي وإعادة ترطيب الهلاميات المائية. الهلاميات المائية جاهزة الآن للاستخدام (زراعة الخلايا ، إلخ). يمكن ترك الهلاميات المائية لفترة وجيزة في PBS بعد خطوة الغسيل النهائية إذا لم تكن جاهزة للاستخدام على الفور.

النتائج

يصف هذا البروتوكول تقنية بثق مباشرة قائمة على القص لتصنيع هيدروجيل الكولاجين المكون إما من ألياف نانوية محاذاة (الشكل 2) أو عشوائيا (الشكل 3). يعتمد زخرفة الألياف النانوية على التحكم الدقيق في قوى القص ، والتي يتم تحقيقها من خلال التعديل المشترك لسرعة الحقنة ومعدل بثق الكولاجين. تم تحديد القيم المثلى لتحفيز محاذاة الألياف سابقا على أنها سرعة حقنة تبلغ 340 مم / ثانية ومعدل بثق الكولاجين 3.2 مل / دقيقة28,29. هذا التوازن أمر بالغ الأهمية ليس فقط لتكوين الألياف النانوية المحاذاة ولكن أيضا لضمان وظائف الهلاميات المائية على النطاق الكبير. إذا كانت هذه النسبة غير محاذاة ، فهناك خطر تصنيع الهلاميات المائية غير المنقوشة كما هو متوقع ، وكذلك الهلاميات المائية التي تحتوي على شرائح كولاجين رفيعة جدا (قطرها <0.5 مم) أو سميكة (قطر >1.5 مم) أو متموجة للاستخدام. على سبيل المثال ، تؤدي حركة المحقنة السريعة جدا ، إلى جانب معدل البثق البطيء جدا ، إلى شرائح رفيعة ، في حين أن النسبة المعاكسة تنتج شرائط سميكة أو متموجة (الشكل 4A-D) ، اعتمادا على درجة عدم التوازن في النسبة. يمكن أن تخلق هذه الاختلافات في الخصائص العيانية تباينا كافيا من شريط إلى شريط للتأثير على ترسب الخلية والالتصاق الموضعي.

بعد بثق الكولاجين وتجميعه ، يستمر تصنيع الهيدروجيل من خلال مرحلة التجفيف الأولية ، غالبا من 1 إلى 3 ساعات ، قبل الخضوع لخطوة غسيل في 1x PBS (الشكل 2 والشكل 3). يعتمد تحقيق النتائج الطبوغرافية المثلى على توازن دقيق بين توقيت وشدة خطوة الغسيل. يؤدي الغسيل غير الكافي أو المتأخر إلى تضاريس الألياف المعطلة ، والتي يشار إليها ببصمات بلورات ملح PBS على الألياف. في المقابل ، يؤدي الغسيل المفرط أو المبكر للكولاجين بعد التصنيع إلى طبقة مذابة من الكولاجين تغطي السمات الطبوغرافية (الشكل 4E ، F).

يؤكد الفحص المجهري الإلكتروني الماسح (SEM) وجود اتجاه ألياف نانوية محاذاة أو عشوائية داخل هيدروجيل الكولاجين. في كل من الهلاميات المائية المحاذاة والعشوائية ، تظهر الألياف النانوية أقطار ألياف تتراوح بين 30-50 نانومتر29. من الناحية النوعية ، من الواضح أن الهلاميات المائية المحاذاة تحتوي على ألياف نانوية محاذاة بشكل أحادي المحور (الشكل 5). تم تحديد هذه المحاذاة مسبقا باستخدام تحليل تحويل فورييه السريع ثنائي الأبعاد ، حيث تعرض مخطط المحاذاة قمتين متميزتين متباعدة بزاوية 180 درجة للهلاميات المائية المحاذاة ، على النقيض من الهلاميات المائية الموجهة عشوائيا والتي تظهر فقط قمم منخفضةالتردد 28.

توضح صور Brightfield للأرومات العضلية العضلية للعضلات الهيكلية الأولية للفأر أن التوجيه الطبوغرافي النانوي متباين الخواص لألياف الكولاجين يعزز المحاذاة الخلوية (الشكل 6). لقد ثبت أن هذه الهلاميات المائية للكولاجين ذات النمط النانوي تحفز المحاذاة الخلوية ليس فقط في الخلايا العضلية26 ولكن أيضا في أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا البطانية23،24.

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي للكولاجين عالي الكثافة وإعداد شرائح الزجاج المقطوع. (A-F) عملية غسيل الكلى بالكولاجين: (أ) تحضير أنابيب غسيل الكلى إلى شرائح مقاس 3 بوصات وتأمين المقطع الأول ، (ب) تحميل الكولاجين عالي الكثافة في الأنابيب وتأمين المقطع الثاني ، (ج) تغليف أنبوب غسيل الكلى المحمل برقائق البولي إيثيلين جلايكول (PEG) ، (د) إزالة رقائق PEG المشبعة ، (ه) شطف رقائق PEG بالماء ، و (F) تخزين الكولاجين فائق الكثافة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. (G-L) عملية قطع الشرائح الزجاجية: (ز) الحصول على شرائح زجاجية للدراسة ، (H ، I) تسجيل الشريحة الزجاجية باستخدام قاطع الزجاج ذو الطرف الماسي ، (ي) كسر الشريحة الزجاجية من الجانب غير المسجل ، (ك) شطف الزجاج المقطوع بالماء ، و (L) تجفيف الشريحة الزجاجية. مصنوع باستخدام BioRender. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: عملية تصنيع هيدروجيل الكولاجين المحاذاة. الخطوة 1: بثق الكولاجين تحت القص في المخزن المؤقت الدافئ 10x PBS وتحريض تكوين الليف. الخطوة 2: تركيب الكولاجين المبثوق على شرائح زجاجية مقطوعة ؛ الخطوة 3: تركيب كولاجين مقذوف إضافي لزيادة حجم الهيدروجيل ؛ والخطوة 4: تجفيف هيدروجيل الكولاجين. مصنوع باستخدام BioRender. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: عملية تصنيع هيدروجيل الكولاجين العشوائية. الخطوة 1: بثق الكولاجين على شرائح زجاجية مقطوعة (شريط واحد) ؛ الخطوة 2: يؤدي البثق المستمر للكولاجين إلى زيادة الحجم (شرائح متعددة) ؛ الخطوة 3: غمر الكولاجين المبثوق في مخزن مؤقت 10X PBS لبدء تكوين الليف. والخطوة 4: تجفيف الهلاميات المائية. مصنوع باستخدام BioRender. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: خطوات الخطأ المحتملة في عملية تصنيع هيدروجيل الكولاجين. (A-F) أمثلة على (أ) شرائح الكولاجين السميكة على النحو الأمثل ، (ب) شرائح الكولاجين السميكة بشكل مفرط ، (ج) شرائط الكولاجين غير السميكة بشكل كاف ، (د) شرائط الكولاجين المتعرجة ، و (E ، F) أسطح الكولاجين المغسولة بشكل مفرط الموضحة باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني الماسح. شريط المقياس = 1 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: مسح صور المجهر الإلكتروني لهيدروجيل الكولاجين المحاذاة والعشوائية. تم التقاط الصور باستخدام المجهر الإلكتروني. تم ضبط ظروف الحزمة على 2 كيلو فولت ، مع نطاق حالي من 25-100 باسكال ، ومسافة عمل 4-5 مم. تم حفظ الصور باستمرار بدقة 6144 × 4096 بكسل مع وقت مكوث يبلغ 1 ميكرو ثانية. شريط المقياس = 1 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: الخلايا العضلية الأولية للفئران المزروعة على هيدروجيل الكولاجين المحاذاة والعشوائية. تم زراعة الأرومات العضلية على الهلاميات المائية لمدة 3 أيام قبل التصوير. تم التقاط صور المجال الساطع بتكبير 10x باستخدام مجهر مقلوب. يشير السهم إلى اتجاه الألياف النانوية المحاذاة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

يمكن تقطير الخطوات الحاسمة للبروتوكول إلى ثلاثة أجزاء رئيسية: 1) تكوين ليفي الكولاجين ، 2) تركيب الهيدروجيل ، و 3) الغسيل. تحدث عملية تكوين ليفي الكولاجين تلقائيا في ظل ظروف تحييد وتعتمد على التجميع الذاتي لجزيئات الكولاجين الفردية في هياكل ليفية مستقرة أكبر10،11. يتم تحقيق ذلك من خلال تطبيق وسط معادل مؤقت مثل 10x PBS يتم تسخينه إلى 37 درجة مئوية وهو أمر بالغ الأهمية لتوجيه التفاعلات الكهروستاتيكية التي تضمن التطور الكامل للكولاجين إلى ألياف. يتم تحقيق المحاذاة الليفية النانوية من خلال تطبيق قوى القص في وقت واحد مع حدوث تكوين الليف. سيحدد وجود أو عدم وجود القص وكذلك معدل القص زخرفة الألياف. ثانيا ، يعد تركيب الهيدروجيل خطوة أساسية في تعزيز استقرار المادة من خلال توفير المراسي المادية أثناء عملية التجفيف ، والتي يحدث خلالها تقلص الكولاجين والجفاف. هذه الخطوة مهمة بشكل خاص إذا كان الاستخدام المقصود هو البذر في المختبر ، لأنه يؤمن الكولاجين بركيزة صلبة تمنع الانقباض غير المنضبط. تختلف عملية التركيب قليلا بين الهلاميات المائية العشوائية والمحاذاة. يتطلب الالتزام الصحيح للهلاميات المائية العشوائية ترسب إضافيا للكولاجين على طول حواف سطح التركيب (عادة زجاجي) قبل تكوين الليف لتثبيته على السطح. يتم لف الهلاميات المائية ذات الزخرفة المحاذاة حول حواف سطح التثبيت لخدمة نفس غرض التثبيت. أحد الاعتبارات الإضافية المهمة للهلاميات المائية المحاذاة هو أن الوضع الأولي لشريط الكولاجين يحدد شكل الهيدروجيل وتوحيده. يسترشد وضع الشريط اللاحق بالتوتر السطحي للكولاجين المودع ، مع الحرص على تجنب لمس الهيدروجيل بعد وضعه. أخيرا ، يعد التجفيف والغسيل المناسبان للهيدروجيل بعد التركيب أمرا حيويا للحفاظ على الميزات الطبوغرافية للهيدروجيل. قد يؤدي التجفيف غير الكافي متبوعا بالغسيل باستخدام 1x PBS أو الماء إلى طبقة من الكولاجين الذائبة أو تشبه الكيك. لمنع ذلك ، يعد التجفيف الكامل للهلاميات المائية أمرا ضروريا ويمكن تأكيده بصريا من خلال تكوين بلورات PBS وزيادة عتامة الكولاجين.

تم استخدام الهلاميات المائية للكولاجين في كل من الدراسات المختبرية والتطبيقات الهندسية المتجددة في الجسم الحي23،24،25،26،27. من المهم ملاحظة أن الهلاميات المائية يتم تصنيعها في ظل ظروف غير معقمة ويجب تعقيمها قبل أي شكل من أشكال زراعة الخلايا أو الزرع. الشكل الموصى به للتعقيم هو 70٪ من الإيثانول ، حيث أن الأشكال الأخرى للتعقيم ، مثل الأشعة فوق البنفسجية ، ستعطل نمط الألياف النانوية من خلال التشابك وتدهور جزيئات الكولاجين30. ومع ذلك ، فإن إزالة الإيثانول من خلال خطوات التبخر والغسيل أمر مهم لتقليل الإيثانول المتبقي ، والذي يمكن أن يضر بتوافق الخلايا. قد يؤدي التباين من دفعة إلى أخرى في كولاجين المخزون إلى تباين في تركيز عمل الكولاجين عالي الكثافة الذي تم تحلله، مما قد يؤثر على عملية تكوين الليف. اعتمادا على التطبيق ، قد يفضل الزخرفة التماثلية العشوائية على الزخرفة متباينة الخواص المحاذاة. لذلك ، في البروتوكول الحالي ، قمنا بتضمين كلا النهجين لتعديل تنظيم الليف.

يتمثل أحد قيود طريقة البثق القائمة على القص الموضحة في هذا البروتوكول في أن العملية يدوية للغاية وتعتمد على المستخدم. هناك حاجة إلى تدريب وممارسة كبيرين لمعايرة كل مشغل لتحقيق نتائج قابلة للتكرار. هذا يعني أن الإنتاجية يمكن أن تكون منخفضة وتستغرق وقتا طويلا لضمان الدقة. يمكن حل بعض هذه القيود باستخدام طرق تصنيع آلية للغاية قائمة على الماكينة مثل الطباعة ثلاثية الأبعاد والغزل الكهربائي والطباعة الحجرية الناعمة والسطحية. ومع ذلك ، على عكس هذه الطرق الأخرى ، لا يتطلب إجراء تصنيع الألياف النانوية اليدوي بالكامل معدات متخصصة ويمكن الوصول إليه وبأسعار معقولة. مع استمرار التقدم في منهجيات الطباعة ثلاثية الأبعاد وفعالية التكلفة في التحسن ، هناك إمكانية لتكييف هذا البروتوكول ودمجه مع تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد. ورغم أن هذا التكامل غير ممكن بعد، من شأنه أن يعزز اتساق هذا البروتوكول وإنتاجيته.

يوفر تصنيع اثنين من الطبوغرافيا الهيدروجيلية المتميزة فرصة فريدة للتعمق في التوجيه الطبوغرافي النانوي لألياف الكولاجين حول التشكل الخلوي والسلوك وتجديد الأنسجة. من خلال مراقبة الاستجابة لطبوغرافيا الألياف المختلفة ، يمكننا اكتساب نظرة ثاقبة حول كيفية تأثير الزخرفة النانوية للركيزة على النمط الظاهري للخلية. على سبيل المثال ، يشير العمل السابق إلى أنه عندما تتبنى الخلايا البطانية مورفولوجيا ممدودة فوق الألياف النانوية المحاذاة ، فإنها تظهر نمطا ظاهريا مضادا للالتهابات ومقاومة متزايدة لظروف التدفق المضطربة24. لا تعزز هذه النتائج فهمنا لتطور آفات تصلب الشرايين فحسب ، بل تبشر أيضا بتصميم طعوم مجازية واقية من الشرايين في المستقبل. يمكن استخدام هيدروجيل الكولاجين هذا في تطبيقات هندسة الأنسجة وإثرائه بعوامل النمو أو الخلايا قبل الزرع لتعزيز الفعالية العلاجية25،26،27. يكشف التحليل المقارن أن الهلاميات المائية ذات الطبوغرافيا المحاذاة تظهر تجديدا فائقا للعضلات والأوعية الدموية مقارنة بالهلاميات المائية ذات الطبوغرافيا العشوائية26 وأن هذه الهلاميات المائية يمكن استخدامها في شكل "خارج الرف" اللاخلوي إذا كانت محملة بعوامل نمو عضلية لتعزيز تجديد الأنسجة في نموذج إصابة الفأر27. في حين أن التركيز الأساسي حتى الآن كان على استخدام هذه الهلاميات المائية كعلاجات محتملة لإصابات العضلات ، إلا أنه يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من تطبيقات الهندسة التجديدية والأنسجة.

الإفصاحات

لا يوجد تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث جزئيا من خلال تمويل من التحالف لأبحاث وتدريب إعادة التأهيل التجديدي ، و MTF Biologics ، ومؤسسة جامعة أوريغون للصحة والعلوم ، وصندوق كولينز الطبي. تم دعم KMAH من قبل زمالة أبحاث الخريجين التابعة لمؤسسة العلوم الوطنية (DGE-1937961) وزمالة أبحاث التعلم والخبرة لطلاب أوريغون (OSLER) (5TL1TR2371-8). تم دعم K.H.N. بمنح من المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI (R00HL136701) و NIH / NIAMS (R01AR080150).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكولاجين الأول ، تركيز عال ، ذيل الفئرانCB354249
الكسوف TE-2000-U المجهرنيكونTE-2000-U ؛مجهر مقلوب
شرائح مجهر سميكة للغايةفيشر Scientific22-267-005يعمل بشكل جيد لسطح بثق الكولاجين
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamThermo Fisher ScientificN / Aمسح المجهر
أداة القاطع الزجاجي مجموعة أدوات 2 مم -20 مم قلم رصاص نمط تغذية الزيت رأسأمازون / MOARMORB07Y1D243H خيار لقاطع الزجاج
إبر هاميلتون Kel-F Hub Blunt Point (Luer Lock ، 22 ز)فيشر ساينتفيك14-815-574إبر لبثق الكولاجين
Nexterion Slide H 3-DSchottNC0782819الشرائح الكارهة للماء
أقراص PBSThermo Fisher Scientific18912014
البولي إيثيلين جلايكول 8000فيشر الكواشف الحيويةBP233-1
أنابيب غسيل الكلى السليلوز غير الملحومة   ؛S25645Gالعلمي
SnakeSkin مقاطع غسيل الكلىThermo Fisher ScientificPI68011
Synthware Glass CutterSynthware31-501-927خيار لقاطع الزجاج
الإلكتروني كربيد فيشر

المراجع

  1. Padhi, A., Nain, A. S. ECM in differentiation: A review of matrix structure, composition and mechanical properties. Ann Biomed Eng. 48 (3), 1071-1089 (2020).
  2. Schlie-Wolter, S., Ngezahayo, A., Chichkov, B. N. The selective role of ECM components on cell adhesion, morphology, proliferation and communication in vitro. Exp Cell Res. 319 (10), 1553-1561 (2013).
  3. Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978(2011).
  4. Shoulders, M. D., Raines, R. T. Collagen structure and stability. Annu Rev Biochem. 78, 929-958 (2009).
  5. Gillies, A. R., Lieber, R. L. Structure and function of the skeletal muscle extracellular matrix. Muscle Nerve. 44 (3), 318-331 (2011).
  6. Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. J Biomech. 36 (10), 1529-1553 (2003).
  7. Friess, W. Collagen-biomaterial for drug delivery. Eur J Pharm Biopharm. 45 (2), 113-136 (1998).
  8. Lee, C. H., Singla, A., Lee, Y. Biomedical applications of collagen. Int J Pharm. 221 (1-2), 1-22 (2001).
  9. Liu, X., Zheng, C., Luo, X., Wang, X., Jiang, H. Recent advances of collagen-based biomaterials: Multi-hierarchical structure, modification and biomedical applications. Mater Sci Eng C. 99, 1509-1522 (2019).
  10. Harris, J. R., Reiber, A. Influence of saline and pH on collagen type I fibrillogenesis in vitro: Fibril polymorphism and colloidal gold labelling. Micron. 38 (5), 513-521 (2007).
  11. Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. Collagen fibril formation. Optimal in vitro conditions and preliminary kinetic results. J Biol Chem. 253 (18), 6578-6585 (1978).
  12. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. J Biomed Mater Res A. 79A (3), 456-463 (2006).
  13. Malladi, S., et al. Continuous formation of ultrathin, strong collagen sheets with tunable anisotropy and compaction. ACS Biomater Sci Eng. 6 (7), 4236-4246 (2020).
  14. Lowe, C. J., Reucroft, I. M., Grota, M. C., Shreiber, D. I. Production of highly aligned collagen scaffolds by freeze-drying of self-assembled, fibrillar collagen gels. ACS Biomater Sci Eng. 2 (4), 643-651 (2016).
  15. Torbet, J., Ronzière, M. C. Magnetic alignment of collagen during self-assembly. Biochem J. 219 (3), 1057-1059 (1984).
  16. Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3d cell migration. Curr Protoc Cell Biol. Chpater 10 (Unit 10.17), (2010).
  17. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomater. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  18. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: A potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  19. Yunoki, S., Hatayama, H., Ebisawa, M., Kondo, E., Yasuda, K. A novel method for continuous formation of cord-like collagen gels to fabricate durable fibers in which collagen fibrils are longitudinally aligned. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 107 (4), 1011-1023 (2019).
  20. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS One. 4 (6), e5902(2009).
  21. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3d collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), (2022).
  22. Su, C. Y., et al. Engineering a 3D collective cancer invasion model with control over collagen fiber alignment. Biomaterials. 275, 120922(2021).
  23. Nakayama, K. H., et al. Bilayered vascular graft derived from human induced pluripotent stem cells with biomimetic structure and function. Regen Med. 10 (6), 745-755 (2015).
  24. Nakayama, K. H., et al. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano Lett. 16 (1), 410-419 (2016).
  25. Nakayama, K. H., et al. Rehabilitative exercise and spatially patterned nanofibrillar scaffolds enhance vascularization and innervation following volumetric muscle loss. NPJ Regen Med. 3, 16(2018).
  26. Nakayama, K. H., et al. Treatment of volumetric muscle loss in mice using nanofibrillar scaffolds enhances vascular organization and integration. Commun Biol. 2 (1), 170(2019).
  27. Alcazar, C. A., Hu, C., Rando, T. A., Huang, N. F., Nakayama, K. H. Transplantation of insulin-like growth factor-1 laden scaffolds combined with exercise promotes neuroregeneration and angiogenesis in a preclinical muscle injury model. Biomater Sci. 8 (19), 5376-5389 (2020).
  28. Lai, E. S., Huang, N. F., Cooke, J. P., Fuller, G. G. Aligned nanofibrillar collagen regulates endothelial organization and migration. Regen Med. 7 (5), 649-661 (2012).
  29. Huang, N. F., et al. Spatial patterning of endothelium modulates cell morphology, adhesiveness and transcriptional signature. Biomaterials. 34 (12), 2928-2937 (2013).
  30. Weadock, K. S., Miller, E. J., Bellincampi, L. D., Zawadsky, J. P., Dunn, M. G. Physical crosslinking of collagen fibers: Comparison of ultraviolet irradiation and dehydrothermal treatment. J Biomed Mater Res. 29 (11), 1373-1379 (1995).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

إنتاج الكولاجين النانوي الليفي المزخرف لهندسة الأنسجة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.