فحص الشظايا التساهمية باستخدام مقايسة الربط الكمي الذي لا رجعة فيه

Summary

اختبار الربط الكمي الذي لا رجعة فيه (qIT) هو طريقة قائمة على التألق لتحديد الأجزاء التساهمية التي تتفاعل بشكل انتقائي مع البروتين المستهدف. هنا ، يتم تحديد بروتوكول مفصل لوصف مقايسة qIT ، مع تضمين أمثلة على النتائج.

Abstract

توفر المركبات التي تشكل روابط تساهمية مع بروتينات مستهدفة محددة مجموعة متنوعة من المزايا مثل المجسات الكيميائية والعوامل العلاجية. الأكثر شيوعا ، يتم استخدام الجزيئات الصغيرة المحبة للكهرباء بشكل معتدل لتشكيل روابط تساهمية مع سلاسل جانبية مختارة من السيستين في بروتينات معينة. أصبحت مناهج اكتشاف الترابط أولا ، حيث يتم فحص مكتبة من الجزيئات الصغيرة المحبة للكهرباء مقابل هدف بروتيني ، شائعة لأنها تتجنب الحاجة إلى تركيب رأس حربي محب للكهرباء يستغرق وقتا طويلا. ومع ذلك ، فإن مثل هذا الفحص معقد ، حيث يمكن أن تظهر الروابط المحبة للكهرباء مجموعة واسعة من المعدلات المختلفة للتفاعل التلقائي مع السيستين. يوفر الربط الكمي الذي لا رجعة فيه (qIT) طريقة قائمة على التألق لتحديد الضربات وتطويرها التي تطبيع البيانات لهذه الاختلافات في تفاعل المركب الجوهري. يتم تحديد معدلات تفاعل المركبات الفردية مع البروتين المستهدف ومقارنتها بالتفاعل المركب مع ثلاثي الببتيد الجلوتاثيون غير المنظم (وهذا وكيل للتفاعل المركب التلقائي) ، مما يتيح تحديد المركبات التي تتفاعل بشكل تفضيلي مع البروتين محل الاهتمام. تم تطبيق هذه المنهجية بنجاح لتحديد الشظايا التساهمية الانتقائية ضد العديد من الأهداف الدوائية ، بما في ذلك البروتياز الرئيسي SARS-CoV-2 ، وكيناز 2 المعتمد على السيكلين ، و RAP27A. هنا ، نوضح تطبيق qIT على البروتين المستهدف لإنشاء مجموعة بيانات كمية وقوية ، مما يسمح بتحديد أولويات الروابط الضاربة للتطوير المستقبلي.

Introduction

أصبحت الروابط التساهمية المستهدفة التفاعلية للسيستين (الجزيئات التي تمارس تأثيرا بيولوجيا من خلال التفاعل مع بقايا السيستين المختارة على بروتين معين) شائعة بشكل متزايد كأدوات كيميائية وعلاجات على مدى العقود^{الأخيرة 1}. تتكون هذه عادة من مادة كهربائية تفاعلية بشكل معتدل (مثل مادة الأكريلاميد أو الكلورو أسيتاميد أو سلفون الفينيل) ملحقة بجزء من الترابط مع تقارب عال لهدف البروتين². من الناحية المثالية ، يستمر تفاعل البروتين الترابط عبر آلية من خطوتين تتضمن ربط الترابط الأولي غير التساهمي ، متبوعا بتكوين رابطة تساهمية لا رجعة فيها بين السيستين المستهدف والمحبة للكهرباء³.

تم تطوير العديد من الروابط التساهمية المستهدفة المبكرة ، بما في ذلك مثبط التيروزين كيناز من بروتون ، من خلال تزويد ترابط قابل للانعكاس تم تحديده مسبقا بمقبض محب للكهرباء⁴. ومع ذلك ، فإن هذا النهج ليس ناجحا دائما ، وقد وجدت محاولات أخرى أن تثبيت الكهرباء يتطلب تحسينا كبيرا⁵. بدلا من ذلك ، أصبحت مناهج القطب أولا ، لا سيما باستخدام الشظايا المحبة للكهرباء ، أكثر شيوعا في السنوات الأخيرة. تتضمن هذه عادة احتضان مكتبة من المحببات الكهربائية بالبروتين ثم اختيار المركبات ذات معدل تفاعل محسن تجاه السيستين ، والذي يفترض أنه ناتج عن التفاعلات غير التساهمية المنتجة بين الترابط والجيب^{الملزم 6}. والجدير بالذكر أن هذه الطرق تم تطبيقها بنجاح أثناء تطوير مثبط KRAS (G12C) Sotorasib¹.

يطرح الفحص الكهربائي أولا العديد من التحديات الفريدة عند مقارنتها بفحص الترابط التقليدي غير التساهمي ، ويرجع ذلك أساسا إلى التباين الكبير في التفاعل داخل وبين فئات الرؤوس^{الحربية 7}. سوف تتفاعل معظم المحببات الكهربائية التفاعلية للسيستين ، بمرور الوقت ، مع جميع بقايا السيستين المعرضة للمذيبات ، بغض النظر عن أي تفاعل انتقائي للبروتين المستهدف. لذلك ، سيزداد شغل الترابط بمرور الوقت لجميع المحبين للكهرباء تقريبا ، وبدون التحكم في التفاعل ، غالبا ما يكون اختيار الضربة منحازا نحو شظايا أكثر تفاعلا تشتبك مع الهدف بسرعة^{أكبر 8}.

علاوة على ذلك ، غالبا ما تستخدم طرق الفحص الكهربية أولا قياس الطيف الكتلي للكشف عن تكوين التقريب البروتيني ، وهو محدود في الإنتاجية⁹. مطلوب أخذ عينات منتظمة من التفاعل على مدى فترة زمنية طويلة (من ساعات إلى أيام) لتوصيف حركية التفاعل بشكل صحيح لمكتبة من المركبات ذات الكهرباء^{المتنوعة 10}. وبالتالي ، فإن الشاشة المكونة من 300 جزء تم أخذ عينات منها في 10 نقاط زمنية تتطلب إجراء 3000 طيف كتلي ، مما يتجاوز إنتاجية معظم أنظمة قياس الطيف الكتلي للبروتين. لذلك ، من المستحسن استخدام طرق عالية الإنتاجية لمراقبة تكوين التقريب البروتيني.

النهج الموضح هنا ، مقايسة الربط الكمي الذي لا رجعة فيه (qIT) ، هو طريقة فحص محبة للكهرباء أولا تتحكم في التفاعل الجوهري وتستخدم قراءة مضان^{بسيطة 7}. يتم احتضان البروتين ، أو الجلوتاثيون (ثلاثي الببتيد غير المنظم المحتوي على الثيول يستخدم كعنصر تحكم في التفاعل الجوهري) بمكتبة من الشظايا المحبة للكهرباء ، ويتم أخذ عينات منتظمة للتبريد في محلول CPM (7-Diethylamino-3- (4'-Maleimidylphenyl) -4-Methylcoumarin ، وهو عامل قياس ثيول فلوروجيني). يقلل تكوين التقريب بين السيستين والجزء الكهربائي من كمية الثيول المتاحة للتفاعل مع CPM ، مما يقلل من التألق الناتج عند التبريد. وبالتالي ، يعمل مضان CPM كبديل للثيول غير المتفاعل ، مما يسمح بتحديد حركية تفاعل الثيول مع كل جزء محب للكهرباء. يتم اختيار الشظايا المحبة للكهرباء ذات تفاعل البروتين المعزز بشكل كبير على الجلوتاثيون كنتائج وإعطاء الأولوية لمزيد من التطوير (الشكل 1).

الشكل 1: تخطيطي qIT. نظرة عامة تخطيطية على مقايسة qIT. (تم إنشاؤه باستخدام BioRender). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حدد الضربات باستخدام قيم REF يتحكم في التفاعل الجوهري ويضمن تحديد الأجزاء فقط كنتائج إذا كانت تشكل تفاعلات غير تساهمية منتجة مع هدف البروتين. تعني قراءة التألق البسيطة أيضا أن مقايسة qIT قابلة للتطوير بدرجة كبيرة ولا تتطلب طرقا قائمة على قياس الطيف الكتلي لمراقبة التفاعل.

هنا ، يتم تحديد إجراء شامل لمقايسة qIT ، مع أمثلة على النتائج المضمنة لتوضيح أداء الفحص واختيار النتائج.

Protocol

1. بناء مكتبة الأجزاء

1. صمم مكتبة من الأجزاء المحبة للكهرباء وقم إما بتصنيعها أو شرائها. تتكون مكتبات الشظايا المحبة للكهرباء عادة من مواد محبة للكهرباء تفاعلية بشكل معتدل (مثل مادة الأكريلاميد والكلورو أسيتاميدات وسلفوناميدات الفينيل) الملحقة بمجموعة متنوعة من السقالات الكيميائية. تتوفر مكتبات الشظايا المحبة للكهرباء على نطاق واسع من الموردين التجاريين ، ويتم مراجعة المزيد من التفاصيل حول تصميمها وبنائها في مكان آخر^5،11.
2. قم بإذابة كل مركب في DMSO بتركيز 50 ملي مولار ، ثم قم بتوزيع مركب مختلف في كل بئر من الأعمدة من 3 إلى 22 من صفيحة خزان 384 بئرا ، تسمى لوحة مكتبة الشظايا.
   1. قم بتوزيع DMSO في كل بئر من الأعمدة 1 و 2 و 23 و 24 للعناصر الإيجابية والسلبية. يمكن أن يختلف تخطيط اللوحة اعتمادا على عدد المركبات التي يتم فحصها (الشكل 2). سيعتمد الحجم المضاف إلى لوحة المكتبة على عدد الشاشات التي سيتم إجراؤها ، مع الأخذ في الاعتبار أن ما يقرب من 1.8 ميكرولتر من كل بئر مطلوب لكل شاشة qIT. قم بإعداد لوحة مكتبة الأجزاء هذه مسبقا وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

الشكل 2: تخطيط اللوحة. نظرة عامة على تخطيط لوحة مقايسة qIT 384 بئر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. إعداد الفحص (الشكل 3)

1. قم بإعداد الحلول التالية: محلول البروتين المؤتلف (البروتين المستهدف في أي مخزن مؤقت) ، والمخزن المؤقت لفحص qIT (150 ملي كلوريد الصوديوم ، 25 ملي مولار Hepes (درجة الحوضة 8)) ، المخزن المؤقت لإخماد مقايسة qIT (150 ملي كلوريد الصوديوم ، 25 ملي مولار هيبس (الرقم الهيدروجيني 7.5)) ، ومحاليل المخزون المركب (جزء محب للكهرباء (50 مليمتر) في DMSO).
   ملاحظة: يتم استخدام الرقم الهيدروجيني 8 في المخزن المؤقت للتفاعل لتسريع التفاعل بين بقايا السيستين المستهدفة والشظايا ، مما يسمح بقياس معدل التفاعل حتى بالنسبة للشظايا شديدة التفاعل. يتم استخدام درجة حموضة أقل قليلا تبلغ 7.5 في المخزن المؤقت للإخماد حيث أن رابطة الثيوثير المتكونة بين ماليميد CPM وثيول السيستين عرضة للتحلل المائي عند درجة الحموضة الأساسية (على سبيل المثال ، وجد العمل السابق أن اقترانات السيستين والماليميد أكثر استقرارا عند الرقم الهيدروجيني 7.3 من الرقم الهيدروجيني 8¹²).
2. قم بإزالة محاليل مخزون شظايا DMSO من التخزين واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة على الأقل للسماح للمخزونات المركبة بالذوبان.
3. Degas qIT المخزن المؤقت عن طريق الفقاعات بغاز الأرجون لمدة 30 دقيقة تقريبا.
4. قم باستبدال محلول البروتين المستهدف بدقة في مخزن اختبار qIT منزوع الغازات. بشكل حاسم ، يجب إزالة عوامل الاختزال مثل DTT و TCEP تماما إلى تركيزات < 100 نانومتر لأنها ستتداخل مع قياس الثيول. يمكن تنفيذ هذه الخطوة عبر سلسلة متكررة من عمليات تبادل المخزن المؤقت ، كما هو موضح أدناه.
   1. قم بتخفيف محلول البروتين الزائد عن المخزن المؤقت لمقايسة qIT منزوع الغازات في وحدة مرشح الدوران ، والتركيز باستخدام الطرد المركزي (4000 × جم ، 4 درجات مئوية ، 15 دقيقة) وكرر. عادة ما تكون هناك حاجة إلى 4 جولات من 1 في 15 مخففا لإزالة DTT بشكل كاف (1 ملليمتر) من 1 مل من محلول مخزون البروتين المؤتلف ، على الرغم من أنه يمكن تعديل هذه الخطوة اعتمادا على تركيز عامل الاختزال في محلول البروتين المؤتلف الأصلي.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن أن يؤدي تحليل محلول البروتين المستهدف مقابل فائض كبير من المخزن المؤقت لمقايسة qIT منزوع الغازات إلى تحقيق نفس النتيجة.
5. قم بتخفيف محلول البروتين المستهدف (المنتج في الخطوة 2.1) إلى تركيز بروتين يبلغ 15 ميكرومتر في المخزن المؤقت لمقايسة qIT منزوع الغازات. مطلوب ما يقرب من 9 مل من محلول البروتين المستهدف لملء صفيحة 384 بئرا بحجم ميت كاف.
6. قم بإعداد تعليق بنسبة 1.5٪ (حجم حجمي) من TCEP-agarose في المخزن المؤقت لمقايسة qIT منزوع الغازات. مطلوب ما يقرب من 9 مل من معلق TCEP-agarose لكل لوحة غربلة.
7. قم بتوزيع 20 ميكرولتر من محلول TCEP-agarose في كل بئر من لوحين 384 بئرا.
8. قم بإعداد مخزون الجلوتاثيون 15 ميكرومتر في مخزن مؤقت لفحص qIT منزوع الغازات. يجب تحضير هذا مباشرة قبل الطلاء حيث يتأكسد الجلوتاثيون بسرعة في المحلول دون عامل مختزل.
9. قم بتوزيع 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفحص qIT في العمودين 1 و 2 من كلا اللوحين المكونين من 384 بئرا.
10. قم بتوزيع 20 ميكرولتر من محلول البروتين أو الجلوتاثيون 15 ميكرومتر (وفقا للوحة المقصودة) في الأعمدة 3-24 من اللوحة المكونة من 384 بئرا. تسمى هذه لوحة تفاعل البروتين ولوحة تفاعل الجلوتاثيون. اتركيه للتقليل عند RT لمدة 1 ساعة.
11. قم بتوزيع 58.2 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفحص qIT منزوع الغاز في كل بئر من لوحة 384 بئرا ، ثم انقل 1.8 ميكرولتر من كل بئر مقابل للوحة مكتبة الأجزاء لإنشاء لوحة تخفيف مركبة ، حيث يتم تخفيف كل مركب إلى تركيز 1.5 ملي مولار في المخزن المؤقت لفحص qIT بالإضافة إلى 3٪ DMSO.
    ملاحظة: أصبحت هذه الخطوة أسهل من خلال محطة سحب العينات 384 ، والتي تسمح بنقل المخزونات المركبة لكل بئر في عملية واحدة.
12. بعد 1 ساعة من حضانة البروتين والجلوتاثيون مع TCEP-agarose ، قم بنقل 20 ميكرولتر من المحلول المركب من كل بئر من لوحة التخفيف المركبة إلى كل من ألواح تفاعل البروتين والجلوتاثيون لبدء الفحص. أصبحت هذه الخطوة أسهل أيضا مع محطة سحب العينات 384. يتم تلخيص خطوات الفحص في الشكل 3.
    ملاحظة: يمكن تغيير تركيز الشظايا حسب الحاجة ، ويمكن تكرار فحوصات qIT للضربات بتركيزات أقل ، إذا رغبت في ذلك ، للتأكد من أن تقارب البروتين ليس قطعة أثرية لتركيز الشظايا العالي. يتم استخدام تركيز الشظايا المرتفع نسبيا لرفع k_pro و k_GSH لضمان إمكانية تحديد المعدلات الدقيقة للمركبات التفاعلية بشكل معتدل (والتي يمكن أن تعرض t_1/2 (GSH) > 24 ساعة في ظل ظروف الفحص). علاوة على ذلك ، على الرغم من ارتفاع تركيز الشظايا البالغ 500 ميكرومتر ، فقد استخدمت تركيزات عالية من ميكرو متر إلى منخفضة ملي في فحص الشظايا ، على سبيل المثال¹³.
13. ابدأ مؤقتا - بدأ الفحص ، ويجب إجراء عمليات التبريد في نقاط زمنية منتظمة وفقا للقسم أدناه.

الشكل 3: ملخص مقايسة qIT. ملخص يوضح الخطوات الرئيسية لإعداد تفاعل مقايسة qIT. (تم إنشاؤه باستخدام BioRender). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تبريد CPM

ملاحظة: يتم إجراء إخماد CPM لتحديد كمية الثيول غير المتفاعلة المتبقية في ألواح تفاعل البروتين والجلوتاثيون. يجب أن يتم إجراؤها في نقاط زمنية منفصلة (على سبيل المثال ، عادة ما يتم استخدام النقاط الزمنية التالية: 7 و 15 و 30 و 60 و 120 و 240 و 360 و 1220 و 1440 دقيقة) للسماح بمراقبة حركية التفاعل.

1. قم بإعداد محاليل مخزون CPM (500 ميكرومتر) في DMSO ، وقم بتوزيعها في 111.2 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، وقم بتخزينها عند -20 درجة مئوية. يمكن تحضير مخزونات CPM هذه مسبقا ، وستكون هناك حاجة إلى حصة واحدة لكل نقطة زمنية للإخماد.
2. قم بإعداد محلول إخماد CPM (1.4 ميكرومتر) عن طريق إذابة محلول مخزون CPM المجمد (500 ميكرومتر) وإضافته إلى 40 مل لمخزن إخماد مقايسة qIT.
3. قم بتوزيع 27 ميكرولتر من محلول التبريد CPM في كل بئر من لوحين بسعة 384 بئرا - اثنان مطلوبان لإخماد كل من ألواح تفاعل البروتين والجلوتاثيون. تسمى هذه لوحات CPM-Quench ، قم بإعدادها قبل الاستخدام لمدة 30 دقيقة كحد أقصى.
4. قم بالطرد المركزي للوحة تفاعل البروتين عند 200 × جم لمدة 3 دقائق لضمان تكوير TCEP-agarose.
5. في نقاط زمنية محددة مسبقا ، انقل 3 ميكرولتر من العينة من كل بئر من لوحة تفاعل البروتين إلى لوحة إخماد CPM مملوءة مسبقا. يتم تبسيط هذه الخطوة أيضا باستخدام محطة سحب 384.
6. امزج لوحة التبريد CPM عن طريق الشفط والتوزيع 3 × 25 ميكرولتر. من المهم إزالة العينة من أعلى البئر لتجنب شفط TCEP-agarose في الأسفل ، مما سيتداخل مع تبريد CPM.
7. كرر الخطوات 3.4-3.6 باستخدام لوحة تفاعل الجلوتاثيون.
8. احتضان ألواح إخماد CPM (المحضرة في 3.4-3.6) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
9. قم بقياس شدة التألق للوحة التبريد CPM (الإثارة عند 384 نانومتر والانبعاث عند 470 نانومتر).

4. تحليل البيانات واختيار النتيجة

1. لكل إخماد ، احسب Z' كمقياس لجودة الفحص. يجب تجاهل أي إخماد لكل ألف ظهور ب Z' < 0.5.
   Z '= 1 - ((3σ_{تحكم إيجابي} + 3σ_{تحكم سلبي}) / (μ_{تحكم إيجابي} - μ_{تحكم سلبي}))
   حيث σ = شدة التألق والانحراف المعياري و μ = متوسط شدة التألق
2. احسب متوسط قيم التألق لآبار التحكم السالبة والإيجابية (العمودان 1 و 2 و 23 و 24 على التوالي).
3. تطبيع كل تفاعل جيدا لمتوسط قيم التألق للعناصر الإيجابية والسلبية:
   ٪ معدلة = 100 × (مضان بئر مركب - مضان تحكم سلبي) / (مضان تحكم إيجابي - مضان تحكم سلبي)
4. رسم بشكل منفصل النسبة المعدلة مقابل الوقت لكل مركب يتفاعل مع الجلوتاثيون والبروتين المستهدف.
5. تناسب بيانات النسبة المئوية المعدلة مقابل الوقت مع نموذج اضمحلال أسي أحادي الطور لكل من التفاعل مع البروتين والجلوتاثيون باستخدام المعادلة:
   ٪ معدلة = ae ^{- kt + c}
   حيث a = نطاق القيم المعدلة ٪ ، k = معدل التفاعل ، t = الوقت ، c = النسبة المئوية للقيمة المعدلة في وقت لا نهائي. يمكن إجراء تركيب المنحنى وتحديد المعلمات باستخدام البرامج التجارية (مثل Graphpad).
6. استخدم المعدل الذي تتفاعل به الشظايا مع البروتين (k_pro) والجلوتاثيون (k_GSH) لحساب قيمة عامل تحسين المعدل (REF) لكل جزء:
   المرجع = ك_برو / ك_GSH
7. استخدم قيم REF لتحديد أجزاء الضربات. يمكن إجراء ذلك عن طريق تعيين عتبة REF (على سبيل المثال ، REF > 3) ، أو معدل ضرب تعسفي (على سبيل المثال ، أعلى 2٪) ، أو عن طريق تحديد الأجزاء ذات الانحرافات المعيارية REF 3 أكبر من المتوسط الهندسي.

Results

يتم استخدام مقايسة qIT هنا لتحديد ضربات الشظايا التساهمية لبروتين سيستين واحد غير مسمى. تمت إضافة MgCl₂ (10 ملي مولار) إلى مخازن التفاعل حيث من المعروف أن البروتين المستهدف يرتبط بأيونات Mg²⁺ . تم إجراء الفحص في ثلاث نسخ ، وتم تحديد معدل تفاعل كل جزء مع كل من البروتين المستهدف (k_pro) والجلوتاثيون (k_GSH). كانت قيم Z أكبر من 0.5 لجميع ألواح التبريد وبلغ متوسطها 0.75 لإخماد البروتين و 0.79 لإخماد الجلوتاثيون ، مما يشير إلى أداء فحص ممتاز. ثم تم حساب قيم REF لكل جزء ، وتم تحديد الزيارات حيث > REF 3.

تقدم النتائج التمثيلية (الشكل 4) مثالا على تحديد النتائج باستخدام مقايسة qIT. تفاعل المركب 1 بمعدل أكبر بمقدار 6.0 أضعاف مع بقايا السيستين على البروتين المستهدف مقارنة بالجلوتاثيون ، وباستخدام معيار REF > 3 ، تم اختياره كنتيجة (الشكل 4 ب). يشير تسارع المعدل هذا إلى وجود تأثير القوالب ، حيث تضع التفاعلات غير التساهمية 1 في الاتجاه الصحيح للسيستين على البروتين المستهدف للتفاعل مع الرأس الحربي الكلوروأسيتاميد. في المقابل ، 2 هو مثال على جزء غير مضرب حيث لا يتم تسريع التفاعل بين 2 وبقايا السيستين المستهدفة بالنسبة للتفاعل بين 2 والجلوتاثيون. يشير عدم وجود تسارع معدل إلى عدم وجود تفاعلات منتجة غير تساهمية تضع 2 في الاتجاه الصحيح للتفاعل مع بقايا السيستين المستهدفة.

الشكل 4: النتائج التمثيلية. تظهر النتائج مراقبة تفاعل البروتين والجلوتاثيون بواسطة qIT من أجل (أ) تفاعل جوهري عال ، وجزء إصابة إيجابي كاذب محتمل ، و (ب) جزء ضرب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يوفر اختبار qIT منصة فعالة ومريحة لفحص الشظايا المحبة للكهرباء التفاعلية مع السيستين مقابل البروتين المستهدف. ومع ذلك ، هناك اعتبارات حاسمة قد تعيق أداء الفحص إذا لم يتم أخذها في الاعتبار بشكل كاف. والجدير بالذكر أن البروتينات المستهدفة يجب أن تشتمل فقط على سيستين واحد مكشوف للسطح لتكون مناسبة لفحص qIT ، حيث ستتفاعل بقايا السيستين الأخرى مع CPM وتتداخل مع قياسات الفلورة. في الحالات السابقة التي تحتوي فيها البروتينات المستهدفة على العديد من السيستينات المعرضة للسطح (مثل البروتياز الرئيسي SARS-CoV-2 ، و GTPase RAP27A الصغير ، والكيناز المعتمد على Cyclin 2) ، تم استخدام تركيبات الفحص مع المخلفات المسببة للتدخل التي تمت إزالتها بنجاح. ومع ذلك ، فإن فعالية هذه الإستراتيجية ستختلف اعتمادا على البروتين^10،14،15.

بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن مقايسة qIT تقيس الانخفاض في الثيول المتاح للتفاعل مع CPM بمرور الوقت ، فإن أي عامل يقلل من نسبة الثيول المتاحة ، مثل أكسدة الثيول أو تراكم البروتين ، قد يعيق أداء الفحص. يضمن التفريغ العازل واستخدام عامل اختزال ثابت (TCEP-agarose) بطء أكسدة الثيول ، ويجب التخفيف من أي أكسدة متبقية عن طريق تطبيع قياسات التألق إلى قياسات آبار التحكم الإيجابية. ومع ذلك ، يمكن أن تنشأ مشاكل عندما يتسبب التوزيع غير المتكافئ ل TCEP-agarose بين الآبار في أكسدة الثيول غير المنتظمة. لذلك فإن الطلاء المتسق TCEP-agarose ضروري لأداء الفحص ، والذي يمكن أن يمثل تحديا حيث تغرق جزيئات TCEP-agarose في خزانات سحب العينات.

يمكن أن يكون تجميع البروتين مشكلة أيضا ، حيث أن ظروف الفحص (حضانة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة) قاسية نسبيا. يمكن أن تؤدي استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها مثل دمج البروتينات المستهدفة إلى العلامات القابلة للذوبان ، أو تغيير مخازن التفاعل ، أو إجراء الاختبار في درجات حرارة منخفضة إلى تقليل التجميع وقد تحل مشكلات استقرار البروتين. قد تؤدي بعض الأجزاء أيضا إلى تراكم البروتين ، مما يقلل مرة أخرى من نسبة الثيول المتاحة للتفاعل مع CPM ويخلق ضربات إيجابية كاذبة. يعد التحقق من صحة الضربات المتعامدة باستخدام قياس الطيف الكتلي البروتيني السليم طريقة فعالة للكشف عن هذه الحالات ، حيث أن الضربات الإيجابية الكاذبة ستخلق مجموعة صغيرة أو غير موجودة من الأنواع المصنفة عند احتضانها ببروتين مستهدف.

عندما يتم التحكم في هذه الاعتبارات ، فإن مقايسة qIT لها بعض المزايا الواضحة مقارنة بطرق فحص الشظايا التساهمية الأخرى. يضمن تحديد النتيجة باستخدام REF عدم تحديد الضربات إلا إذا كانت تشكل تفاعلات غير تساهمية منتجة مع البروتين المستهدف. تختلف الكهرباء في الشظايا على مدى نطاقات كبيرة ، سواء بين الرؤوس الحربية المختلفة أو داخل فئات الرؤوس الحربية. على سبيل المثال ، وجد العمل السابق عدة مئات من الاختلافات في معدل تفاعل الجلوتاثيون بين مادة الأكريلاميد¹⁰. يمكن أن تجعل هذه المجموعة الواسعة من المحبة للكهرباء من الصعب التمييز بين الأجزاء ذات القيم المرتفعة k_pro بسبب تأثير القوالب عن تلك التي تكون ببساطة شديدة التفاعل ، مما قد يؤدي إلى اختيار شظايا شديدة التفاعل كضربات إيجابية خاطئة. على سبيل المثال ، تفاعل 2 مع بقايا السيستين المستهدفة بسرعة أكبر من 1 ، ودون النظر في التفاعل الجوهري ، يمكن اختياره كضربة. ومع ذلك ، لا يتفاعل 2 مع بقايا السيستين المستهدفة بمعدل أكبر من الجلوتاثيون ، مما يشير إلى أن أكبر k_pro من 2 بالنسبة إلى 1 يرجع إلى تفاعل جوهري أكبر للجزء ، وليس تأثير النموذج.

كما أن قراءة التألق البسيطة التي يستخدمها مقايسة qIT لتحديد الثيول المتبقي مفيدة للغاية. تستخدم الطرق الأخرى لفحص الشظايا التساهمية قياس الطيف الكتلي البروتيني السليم لتحديد معدل تفاعل الشظايا مع البروتين المستهدف و LC-MS لتحديد معدل تفاعل الجلوتاثيون مع الشظايا - وكلاهما يتطلب معدات متخصصة ويفتقر إلى الإنتاجية^8،16. تجعل قراءة التألق المريحة اختبار qIT قابلا للتطوير بدرجة كبيرة ولا يتطلب سوى معدات المختبرات المتاحة بشكل شائع.

مجتمعة ، تخلق هذه الابتكارات طريقة قوية وقابلة للتطوير لفحص الشظايا التساهمية ، مما يلغي الحاجة إلى معدات قياس الطيف الكتلي.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Argon Gas	BOC	I1149
Corning 384 بئر ، منخفضة الحافة ، ألواح فحص مسطحة	القاع Corning	3575
CPM	Invitrogen	D346
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Immobilized TCEP-agarose	Pierce	77712
قارئ الألواح الدقيقة	CLARIOstar
أختام لوحة PCR	BioRad	MSA5001
مخفضة L-glutathione	Sigma-Aldrich	G4251
كلوريد الصوديوم	Sigma-Aldrich	S9888
هيبس الصوديوم	سيجما ألدريتش	RES6007H-A7