مقالة منهجية

استقطاب وتوصيف البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الوحيدة M1 و M2 على أسطح الزرع

2.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67180

⸱

ديسمبر 6, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Materials Science & Technology, Institute for Biomedical Engineering, University Hospital Tübingen, 2Department of Conservative Dentistry and Periodontology, University Hospital Tübingen

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لتقييم الإمكانات المناعية لأسطح الزرع في المختبر ، بهدف تحسين موثوقية وقابلية التكرار للبروتوكولات الحالية وتعزيز المزيد من البحث. تمت مراقبة ملامح السيتوكين الإفرازية ، وتعبير mRNA ، وعلامات سطح الخلية باستخدام البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة في الدم للتحقيق في استقطاب البلاعم المزروع على التيتانيوم.

الملخص

يلعب تفاعل الجسم الغريب (FBR) ، وهي عملية شفاء معقدة بوساطة المناعة ، دورا مهما في دمج الغرسات في الجسم. تلعب البلاعم ، باعتبارها الخط الأول لتفاعل الجهاز المناعي مع أسطح الزرع ، دورا ثنائي الاتجاه في تعديل توازن الالتهاب والتجديد. من أجل فهم عميق وتقييم التفاعلات بين مواد الزرع والاستجابات المناعية ، تعد الطرق والبروتوكولات الموثوقة في المختبر أمرا محوريا. من بين النماذج المختلفة في المختبر ، تقدم البلاعم الأولية المشتقة من الخلايا الوحيدة (MDMs) نموذجا ممتازا للتحقيق في تفاعلات البلاعم وغرسة. لقد قمنا بتنفيذ بروتوكول تجريبي لتقييم استقطاب MDMs إلى M1 (يتم تنشيطها كلاسيكيا) و M2 (تنشيطها بدلا من ذلك) على أسطح الزرع. قمنا بعزل خلايا الدم الوحيدة من المتبرعين الأصحاء وقمنا بتمييزها إلى ضامة باستخدام عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF). تم زراعة البلاعم المتمايزة على أسطح الزرع واستقطابها إلى أنواع فرعية M1 و M2. تم تحقيق استقطاب M1 في وجود الإنترفيرون (IFN)-γ وعديد السكاريد الدهني (LPS) ، بينما تم إجراء استقطاب M2 في وسط يحتوي على الإنترلوكين (IL) -4 و IL-13. قمنا بتقييم الأنماط الظاهرية للبلاعم عن طريق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، والفحص المجهري بالليزر متحد البؤر (CLSM) ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR) بناء على لوحات السيتوكينات المفرزة ، وعلامات سطح الخلية ، والجينات المعبر عنها. تم تحويل الحمض النووي الريبي المستخرج إلى حمض نووي تكميلي (cDNA) ، وتم استخدام qRT-PCR لتحديد كمية mRNA المرتبط بالضامة M1 و M2. وفقا لذلك ، تميزت البلاعم M1 بتعبير أعلى عن السيتوكين عامل نخر الورم المسبب للالتهابات (TNF-α) وعلامة سطح CCR7 مقارنة بالضامة M2 ، والتي أظهرت مستويات أعلى من CD209 و CCL13. وبالتالي ، تم تحديد CCR7 و CD209 كعلامات محددة وموثوقة لأنواع فرعية من البلاعم M1 و M2 عن طريق التلوين المناعي والتصور بواسطة CLSM. تم تحقيق مزيد من التأكيد من خلال ELISA للكشف عن ارتفاع مستوى TNF-ɑ في M1 وزيادة CCL13 في خلايا M2. يمكن استخدام العلامات المقترحة والإعداد التجريبي بشكل فعال لتقييم إمكانات التعديل المناعي للغرسات.

المقدمة

أصبحت المواد الحيوية القابلة للزرع حلا تقليديا لمختلف الأمراض البشرية وتلعب دورا كبيرا في البحوث الطبية الحيوية ، بما في ذلك هندسة الأنسجة وأنظمة توصيل الأدوية والغرسات1،2. هناك مجموعة واسعة من الغرسات المصنوعة من مواد مختلفة ذات هياكل ووظائف مختلفة ، مثل الأطراف الاصطناعية للورك أو الدعامات أو الشبكات أو صمامات القلب أو زراعة الأسنان. عند الزرع ، يثير ملامسة زرع الأنسجة استجابة مناعية ، تليها الحل وإعادة تشكيل الأنسجة والتوازن. تتأثر هذه العمليات بالخصائص الفيزيائية والكيميائية والنشطة بيولوجيا للمواد الحيوية المستخدمة. قد تؤثر هذه الخصائص على شدة وطيف الاستجابات المؤيدة والمضادة للالتهابات ، وتكوين الكبسولة الليفية ، وتدهور الأنسجة ، ومرحلةالشفاء 3،4. من أجل دعم وتحسين عملية الشفاء وتكامل الزرع على المدى الطويل ، يتمثل أحد الجوانب الناشئة في البحث الحالي في التحقيق والتوسط في التفاعل بين أسطح الزرع والخلايا المناعية.

من بين الخلايا المناعية الأخرى ، تعد البلاعم ، الموجودة في جميع أنحاء الجسم ، لاعبا رئيسيا في الالتهاب والدفاع المضاد للأمراض ، وكذلك في عمليات الشفاء والحفاظ على توازن الأنسجة5،6. بناء على لدونتها ومحفزات الأنسجة البيئية الدقيقة المحلية ، فإن البلاعم قادرة على الاستقطاب إلى أنماط ظاهرية وظيفية متميزة ، والتي تظهر اختلافات كبيرة في التمثيل الغذائي للخلايا ، والوظائف الخلوية ، وملامح إفراز السيتوكين. يمكن تمييز النمط الظاهري M1 المنشط بشكل كلاسيكي من خلال إفراز السيتوكينات المسببة للالتهابات ، مثل IL-1β و IL-6 و TNF-α ، ويشارك في الاستجابة الالتهابية الأولية والمزمنة للصدمات والمواد الحيوية الغريبة. في المقابل ، بدلا من ذلك ، فإن الضامة M2 المنشطة ، والتي يتم تشغيلها بواسطة السيتوكينات مثل IL-4 و IL-13 ، لها سمات مميزة مثل حل الالتهاب وتعزيز التئام الأنسجة. يمكن التعرف على البلاعم المستقطبة M2 من خلال التعبير عن علامات سطح الخلية مثل CD206 وإنتاج السيتوكينات مثل IL-10 و IL-47. وبالمثل ، يمكن للبلاعم التي تم استقطابها بالفعل إعادة برمجة نفسها في بيئة مصغرة جديدة.

أظهرت العديد من الدراسات حول تفاعلات الخلايا والمواد الحيوية أهمية البلاعم في سلسلة الاستجابات المناعية تجاه المواد الحيوية القابلة للزرع وفي تنسيق العمليات المشاركة في التئام المضاعفات المرتبطة بالزرع8،9،10. على الرغم من أن الهندسة الطبية الحيوية قد أحرزت تقدما كبيرا في السنوات الأخيرة ، إلا أن هناك حاجة إلى مزيد من البحث لفهم كيفية تعديل الغرسات لسلوك البلاعم والاستقطاب11،12،13.

في زراعة الخلايا ، يمكن تمييز خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المشتقة من الخلايا الأحادية (PBMCs) إلى ضامة M0 ملتصقة متبوعة باستقطاب مستحث نحو الأنماط الظاهرية M1 أو M2 باستخدام LPS و IFN-γ أو IL-4 ، على التوالي. بعد الحضانة في المختبر مع عينات جديدة من المواد الحيوية ، من الممكن استخدام مستقبلات سطح الخلية المختلفة وملامح السيتوكين للبلاعم M1 و M2 للكشف عن إمكانات التعديل المناعي للمواد الحيوية في المختبر14،15. تهدف هذه الدراسة إلى تطوير بروتوكول في المختبر يمكن استخدامه للتحقيق في استقطاب MDMs استجابة لأسطح الزرع المختلفة. يمكن استخدام تحليلات التعبير الجيني وتقنيات الفحص المجهري و ELISA لتحديد علامات النمط الظاهري وملامح السيتوكين المحددة للبلاعم M1 و M2 التي تم تعديلها بواسطة المادة الحيوية. ومن ثم ، يمكن توضيح التفاعلات المعقدة بين البلاعم وأسطح المواد الحيوية ، ويمكن الحصول على معلومات قيمة لفهم تفاعلات البلاعم والمواد الحيوية بشكل أفضل. أخيرا ، يضمن البروتوكول الموحد في المختبر قابلية التكرار والموثوقية وقابلية المقارنة للنتائج التجريبية عن طريق تقليل التباين في الإعداد التجريبي.

البروتوكول

تم الحصول على الدم المحيطي البشري من المتبرعين بالدم الأصحاء وفقا للبروتوكول المعتمد من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة لكلية الطب في جامعة توبنغن (الموافقة الأخلاقية: 286/2021 BO). تم عزل PBMCs البشرية باستخدام الطرد المركزي المتدرج للكثافة ، كما هو موضحسابقا 16. تم تحديد البروتوكول التالي ل PBMCs المعزولة من 24 مل من الدم. يظهر تمثيل تخطيطي للبروتوكول في الشكل 1.

ملاحظة: يجب ضبط حجم الدم اعتمادا على عدد البلاعم M0 المستخدمة.

تم الحصول على ما مجموعه 35.46 ± 9.1 مليون PBMCs من 24 مل من الدم ، مما أدى إلى 1.97 ± 0.46 مليون M0 ضامة (ن = 5). يتم سرد جميع الكواشف والمواد الاستهلاكية والأجهزة في جدول المواد. المخازن المؤقتة مدرجة في الجدول 1.

1. تمايز خلايا الدم البشري الوحيدة إلى البلاعم

  1. أعد تعليق PBMCs المعزولة في 15 مل من وسط ربط الخلايا الأحادية الدافئ مسبقا ونقلها إلى قارورة واحدة لزراعة الخلايا T75.
  2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 90 دقيقة للسماح بالالتصاق.
  3. تخلص من المادة الطافية واغسل الخلايا مرة واحدة بوسط كامل دافئ مسبقا مع إمالة لطيفة لإزالة الخلايا غير الملتصقة أو غير الملتصقة بشكل فضفاض.
    ملاحظة: الخلايا المرفقة عبارة عن خلايا وحيدة تشكل حوالي 10٪ من إجمالي PBMCs المضافة في الأصل إلى القارورة.
  4. أضف 15 مل من الوسط الكامل الذي يحتوي على 10 نانوغرام / مل عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) إلى الخلايا الملتصقة واحتضانه لمدة 6 أيام لتعزيز التمايز.
  5. استبدل الوسط بوسط جديد كامل يحتوي على 10 نانوغرام / مل M-CSF كل يومين.

2. زراعة واستقطاب MDMs على سطح غرسة التيتانيوم

ملاحظة: في اليوم 6 من التمايز ، تم زرع البلاعم M0 على أسطح المواد الحيوية بمحفزات مختلفة لمدة 48 ساعة للحصول على البلاعم M1 أو M2 المستقطبة بالكامل. لكل سطح تم فحصه ، تم استخدام ثلاثة أقراص لزرع البلاعم M0 و M1 و M2. تم استخدام الأغطية البلاستيكية المعالجة بزراعة الخلايا كأسطح تحكم.

  1. قم بإزالة وسط الثقافة من قوارير T75 واغسل الخلايا ب 10 مل من PBS لمدة 5 دقائق.
  2. افصل الخلايا الملتصقة عن طريق احتضانها ب 10 مل من محلول انفصال الخلايا الدافئ مسبقا لمدة 30 دقيقة.
  3. اضغط على الخلايا برفق وانقلها إلى أنبوب سعة 50 مل. افصل الخلايا المتبقية عن طريق كشطها برفق في 10 مل من PBS.
  4. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب سعة 50 مل وقم بطردها بمعدل 300 × جم لمدة 10 دقائق.
  5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 5 مل من الوسط الكامل الدافئ مسبقا.
  6. عد الخلايا باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق ومقياس كثافة الدم لتحديد عدد الخلايا وقابليتها للحياة.
  7. قم بإعداد معلق الخلية عن طريق ضبط عدد الخلية إلى 160,000 خلية لكل 1 مل من الوسط الكامل.
  8. قم بتنظيف أقراص المواد الحيوية بالموجات فوق الصوتية في 70٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق ، متبوعا بالتعقيم في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة.
  9. جفف أقراص التيتانيوم لمدة 1-2 ساعة ، ثم ضعها في أطباق غير معالجة من 24 بئرا وأضف 1 مل من تعليق الخلية المحضر إلى كل بئر.
  10. للحصول على البلاعم المستقطبة M1 ، أضف IFN-γ و LPS بتركيز 50 نانوغرام / مل و 10 نانوغرام / مل ، على التوالي. بالنسبة لاستقطاب M2 ، أضف IL-4 و IL-13 بتركيز 20 نانوغرام / مل لكل منهما. تأكد من نمو خلايا M0 بدون أي عوامل استقطاب. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 للحث على الاستقطاب.

3. توصيف البلاعم المستقطبة باستخدام ELISA

ملاحظة: في اليوم الثاني من الاستقطاب ، تم إعداد عينات لتحليلات التوصيف. تم قياس سيتوكين TNF-ɑ و CCL13 chemokine لتوصيف الضامة المستقطبة M1 و M2 ، على التوالي. تم تطبيع تركيز البروتينات المفرزة إلى التركيز الكلي للبروتينات المفرزة في المادة الطافية المقابلة.

  1. اجمع المادة الطافية في أنبوب سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
  2. انقل الأقراص إلى لوحة جديدة سعة 24 بئرا لمزيد من التجارب. والغرض من ذلك هو القضاء على الخلايا الميتة أو المرتبطة بشكل فضفاض في ألواح 24 بئرا غير معالجة.
    ملاحظة: يجب التحقق من صلاحية الخلية على الأسطح قبل إجراء أي تحليل. يمكن تحديد صلاحية الخلايا عن طريق فحوصات بقاء الخلايا الحية / الميتة أو بشكل غير مباشر من خلال اختبارات تكاثر الخلايا والسمية الخلوية.
  3. قم بقياس السيتوكينات والكيموكينات وفقا للتعليمات المحددة التي تقدمها الشركة المصنعة. قم بقياس السيتوكينات إما على الفور أو قم بتخزين العينات عند -80 درجة مئوية للقياس المستقبلي.
    ملاحظة: لكل نوع من أنواع المجموعات (مع الأخذ في الاعتبار حدود الحساسية والكشف لمجموعة ELISA) ، يجب تحديد تخفيف العينة المناسب. بالنسبة لمقايسة حمض البيسنكونينيك (BCA) ، تم تخفيف العينات بنسبة 1: 5. تم تخفيف عينات M1 ل TNF-ɑ بنسبة 1:10 ، وتم تخفيف عينات M2 ل CCL13 بنسبة 1:12.
  4. احسب تركيز السيتوكينات / الكيموكينات المفرزة باستخدام المنحنى القياسي باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  5. قم بقياس كمية البروتين الإجمالية باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA.
  6. تطبيع تركيز البروتينات المفرزة إلى ملغ من البروتين الكلي.

4. توصيف البلاعم المستقطبة باستخدام CLSM

ملاحظة: تميزت البلاعم المستقطبة أيضا بتلطيخها بالأجسام المضادة لعلامات سطح الخلية CD209 و CCR7. تم تلبوخ النوى باستخدام DRAQ5. يمكن استخدام CD68 أو علامات أخرى كعلامات عموم البلاعم.

  1. اغسل الخلايا 2x في 800 ميكرولتر من PBS. احتضان الأقراص لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت.
  2. بعد إزالة المخزن المؤقت للتثبيت ، اغسل ثلاث مرات في 400 ميكرولتر من PBS. قم بتلطيخ العينات على الفور أو قم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية في 1 مل من المخزن المؤقت للتخزين.
    ملاحظة: باستخدام بروتوكول التثبيت والتخزين هذا ، تم تلطيخ العينات بنجاح وتصويرها في غضون 1-6 أسابيع من التثبيت.
  3. قبل الخطوة التالية ، اغسل الأقراص مرتين باستخدام 800 ميكرولتر من PBS بعد التخزين.
  4. احتضان الأقراص مع 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لمدة 30 دقيقة في RT لمنع مواقع الربط غير المحددة.
  5. تخلص من المخزن المؤقت للحجب واحتضان الأقراص في RT لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ.
    1. قم بإجراء التألق المناعي باستخدام تلطيخ مزدوج لفحص التعبير عن CCR7 و CD209 في عينة واحدة. لهذا الغرض ، اجمع بين الأجسام المضادة الأولية التي يتم جمعها من أنواع مختلفة (الفأر والأرانب) في نفس خطوة التلوين.
      ملاحظة: لتحقيق إشارة قوية بأقل قدر من الخلفية ، قم بتحسين تركيز الجسم المضاد. تم استخدام الجسم المضاد CCR7 بتركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام / مل ، وتم تخفيف الجسم المضاد CD209 1/400.
  6. قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية وغسل 3 مرات باستخدام 400 ميكرولتر من محلول الغسيل.
  7. أضف الأجسام المضادة الثانوية المسماة بالفلوروفور المخففة في مخزن التلوين واحتضانها لمدة ساعة واحدة في RT في الظلام.
    ملاحظة: يجب تحسين تركيز الأجسام المضادة الثانوية للحصول على أقصى قدر من الإشارات المحددة بأقل قدر من الخلفية. في هذه الدراسة ، تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية بتركيز 5 ميكروغرام / مل للتلطيخ.
  8. بعد إزالة المادة الطافية ، اغسل العينات ثلاث مرات في مخزن الغسيل لمدة 3 دقائق لكل منها.
  9. أضف 10 ميكرومتر DRAQ5 في PBS واحتضن لمدة 15 دقيقة في RT ، محميا من الضوء.
  10. قم بإزالة المادة الطافية واغسل الأقراص مرة واحدة في PBS.
  11. قم بإزالة PBS المتبقي وأضف 1 قطرة من وسط التثبيت.
  12. بعد 5 دقائق ، ضع أكواب الغطاء واترك العينات تجف لمدة 1 ساعة.
  13. بعد تجفيف العينات ، أغلق الحواف بطلاء أظافر شفاف وقم بتخزينها على حرارة 4 درجات مئوية في الظلام حتى التصوير.
  14. للحصول على نظرة عامة على الخلايا ، قم بتصوير العينات بتكبير 25x. لتحديد هيكل وتحديد مواقع علامات السطح بشكل أكبر ، احصل على صور بتكبير 63x.
  15. حدد كثافة التألق ل CCR7 و CD209 باستخدام برنامج ImageJ.
    ملاحظة: تم إجراء الحصول على الصور باستخدام المضاعف الضوئي (PMT) باستخدام نظام CLSM ، والذي تم تجهيزه بليزر الأرجون (488 نانومتر) ، وليزر DPSS (561 نانومتر) ، وليزر HeNe (633 نانومتر).

5. توصيف البلاعم المستقطبة باستخدام qRT-PCR

ملاحظة: لعزل الحمض النووي الريبي ، تم استخدام قرصين لكل عينة من أجل الحصول على ما يكفي من الحمض النووي الريبي لتخليق (كدنا).

  1. اغسل الأقراص 2x مع 800 ميكرولتر من PBS.
  2. أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى القرص الأول وقم بتحلل الخلايا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
  3. انقل المحللة إلى القرص الثاني وكرر عملية التحلل.
  4. أضف 350 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول إلى المحللة والماصة لأعلى ولأسفل حتى تتجانس.
  5. انقل المحللة إلى عمود الدوران واتبع تعليمات الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي الريبي.
  6. حدد كمية الحمض النووي الريبي باستخدام nanodrop أو جهاز آخر.
  7. تطبيع تركيزات الحمض النووي الريبي لعينات مختلفة وتصنيع (كدنا) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام نظام RT-PCR لتخليق الحبلا الأول.
  8. قم بتصنيع (كدنا) باستخدام 350 نانوغرام من الحمض النووي الريبي باتباع بروتوكول الشركة المصنعة وتخزينه عند -20 درجة مئوية حتى يتم إجراء تحليل qRT-PCR.
    ملاحظة: هنا ، تم استخدام 350 نانوغرام من الحمض النووي الريبي المنقى لتصنيع (كدنا) باستخدام 4 ميكرولتر من RT Mix (5x) في 20 ميكرولتر.
  9. قم بإجراء qRT-PCR على نظام PCR في الوقت الفعلي في ألواح 96 بئرا وتفاعلات فردية 15 ميكرولتر (1x مزيج رئيسي أخضر Syber ، و 0.2 ميكرومتر من البادئات الأمامية والخلفية ، و 4.5 ميكرولتر من 1:10 cDNA المخفف).
    ملاحظة: يبدأ برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل بغطاء ساخن (105 درجة مئوية) متبوعا بثلاث خطوات: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، متبوعا ب 15 ثانية عند 95 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 55 درجة مئوية لمدة 40 دورة.
  10. تطبيع مستويات التعبير عن الجينات المختلفة لجين التدبير المنزلي GAPDH (أو جينات التدبير المنزلي الأخرى مثل β-actin).
  11. احسب التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة 2−ΔΔCt عن طريق أخذ M0 الخلايا المزروعة على أغطية زراعة الأنسجة كمرجع. يسرد الجدول 2 جميع البادئات المستخدمة في هذه الدراسة.

6. التحليل الإحصائي

  1. اعرض جميع البيانات كمتوسط ± SEM. كرر جميع المقايسات (في هذه الدراسة ، تكررت المقايسات خمس مرات) لضمان قابلية التكرار. قم بتقييم الفروق ذات الدلالة الإحصائية بين البيانات الموزعة بشكل طبيعي باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعا باختبار Tukey المتعدد.
  2. استخدم اختبار فريدمان واختبار المقارنة المتعددة ل Dunn لتحليل مجموعات البيانات غير المعلمية. استخدم برنامج تحليل البيانات المناسب لتحليل البيانات وتحديد الدلالة الإحصائية على أنها قيمة p أقل من 0.05.

النتائج

تظهر نتائج هذه الدراسة تمايزا واستقطابا ناجحا ل MDMs على أسطح التيتانيوم ، متبوعا بتوصيف البلاعم المستقطبة M1 أو M2. في الخطوة الأولى ، قمنا بتمييز MDMs المستقطبة باستخدام CLSM. بناء على دراساتنا الأولية ، تم استخدام CD209 و CCR7 كعلامات محددة للتمييز بين M1 و M2 MDMs المستقطبة. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، ب ، استقطبت MDMs بنجاح إلى البلاعم M1 و M2. على سطح التيتانيوم ، تم التعبير عن CCR7 بقوة أكبر في البلاعم المستقطبة M1 من CD209 ، والتي تم التعبير عنها على وجه التحديد في البلاعم المستقطبة M2. علاوة على ذلك ، سهل تحديد كثافة التألق النسبية تعيين علامات للأنواع الفرعية M1 أو M2 (الشكل 2 ج).

يوضح الشكل 3 تحليلا تمثيليا qRT-PCR ل MDMs على أسطح التيتانيوم والغطاء. أظهرت النتائج أن MDMs على كلا السطحين تم استقطابها بنجاح ، كما يتضح من التعبير العالي عن علامات الاستقطاب M1 (CCR7 و TNF-ɑ) و M2 (CD209 و CCL13). تم تأكيد ذلك أيضا على مستوى البروتين من خلال ملاحظة مستويات عالية من السيتوكينات الالتهابية TNF-α (الشكل 4 أ) و IL-13 الكيموكينات (الشكل 4 ب) في الخلايا المستقطبة M1 و M2 ، على التوالي.

figure-results-1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للبروتوكول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: توصيف MDMs المستقطبة باستخدام CLSM. تم تأكيد تخصيب البلاعم المستقطبة M1 و M2 من خلال تلطيخ الأجسام المضادة المحددة وتحليل CLSM باستخدام الأجسام المضادة CCR7 و CD209 في اليوم 2 من ما بعد البذر. وفقا لتلطيخ التألق وتحليل CLSM ، (أ) تكبير 25x و (ب) تكبير 63x ، عبرت خلايا M1 عن CCR7 أعلى (باللون الأخضر) من M0 أو M2. تظهر خلايا M2 نمط تعبير CD209 كبير (باللون الأخضر). (ج) التحليل الكمي لشدة التألق النسبية ل CCR7 و CD209. تم تلطيخ النوى ب DRAQ5 (باللون الأرجواني). تمثل النتائج 5 تجارب مماثلة تم إجراؤها بشكل مستقل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: توصيف MDMs المستقطبة باستخدام ملامح التعبير الجيني. تم استخدام بوليميراز النسخ العكسي الكمي لدراسة مستويات الرنا المرسال للجينات المختلفة المرتبطة باستقطاب M1 (CCR7 و TNF-ɑ) و M2 (CD209 و CCL13). تم استخدام GAPDH كجين للتدبير المنزلي. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM (ن = 5). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: إنتاج السيتوكينات بواسطة البلاعم M0 و M1 و M2 المزروعة على أغطية التيتانيوم والبلاستيك. (أ) تم قياس مستوى السيتوكين TNF-ɑ و (ب) مستويات CCL13 في المواد الطافية لزراعة الخلايا باستخدام ELISA. تم تطبيع إفراز السيتوكين إلى إفراز البروتين الكلي الذي تم قياسه بواسطة مقايسة BCA. تمثل الرسوم البيانية الشريطية متوسط ± التسويق عبر محرك البحث (ن = 5). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المخزن المؤقت / الحلمحتوى
تلطيخ / حجب المخزن المؤقتبرنامج تلفزيوني + 1٪ BSA + 0.1٪ توين 20
عازلة الغسيلبرنامج تلفزيوني + 0.1٪ توين 20
المخزن المؤقت للتثبيت3٪ من بارافورمالدهايد (PFA) في PBS
المخزن المؤقت للتخزين1٪ من البنسلين والستربتومايسين في PBS

الجدول 1: قائمة المخازن المؤقتة.

اسم التمهيديتسلسلات التمهيدي الأماميةتسلسل التمهيدي العكسي
جابد دي إتش5 '-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'
CCR75 '- TGGTGATCGGCTTTGGTC-3 '5 '- CACCTTGATGGCCTTGTTGC-3'
CD2095 '- GGAGCAGAACTTCCTACAGC-3'5 '- CAACGTTGTTGGGCTCTCCT-3 '
CCL135'-ATCTCCTTGCAGAGGCTGAA-3'5 '-ACTTCTCCTTTGGGTCAGCA-3'
TNF-ɑ5 '- GCTGCACTTTGGAGTGATCG-3'5 '- TCACTCGGGGTTCGAGAAGA-3'

الجدول 2. تسلسل الاشعال المستخدمة في qRT-PCR.

المناقشة

يعد الفهم الشامل لسلوك البلاعم أمرا ضروريا لفهم الخصائص المناعية للمواد القابلة للزرع. أبلغت العديد من الدراسات عن علامات غير متجانسة ، ومجموعة متنوعة من نماذج الخلايا ، وبروتوكولات لتوصيف استقطاب البلاعم في المختبر17،18،19،20. لتحسين قابلية التكرار والموثوقية وقابلية المقارنة للنتائج التجريبية ، من الضروري استخدام بروتوكولات موحدة ومعتمدة ، جنبا إلى جنب مع نموذج خلية مناسب وعلامات توصيف الإجماع. وفقا لذلك ، تتطلب المحاكاة الدقيقة للخصائص المناعية لمواد الزرع أولا نموذجا مناسبا للخلية. استخدمت دراسات مختلفة مجموعة واسعة من نماذج الخلايا ، مثل البلاعم النسياجية المعزولة ، والضامة المتمايزة المشتقة من الخلايا الوحيدة في الدم ، وخطوط الخلايا أحادية الخلية الخالدة. على الرغم من أن البلاعم المعزولة بالأنسجة يمكن اعتبارها أكثر تمثيلا للظروف في الجسم الحي ، إلا أنها تمثل تحديا تقنياوأخلاقيا 21،22. يتم الحصول على البلاعم أيضا بشكل متكرر من خطوط الخلايا أحادية الخلية الخليدة ، مثل خلايا THP123،24،25،26. في حين أن هذه الخلايا قد توفر مزيدا من التجانس في استجابة الخلية كمصدر غير محدود للخلايا غير القديمة، إلا أنها عادة ما يتم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من أورام الدم، وقد تختلف استجاباتهم اختلافا كبيرا عن الخلايا الطبيعية. على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن أن خلايا THP1 أحادية الخلية أكثر استجابة لمحاكيات M1 ومن المرجح أن تظهر خصائص M122. تتماشى نتائج هذه الدراسة مع نتائج دراستنا الأولية (البيانات غير معروضة هنا).

علاوة على ذلك ، نظرا لأن الخلايا الوحيدة المشتقة من الدم تعتبر سلائف البلاعم المقيمة في الأنسجة ويمكن الحصول عليها بسهولة بإنتاجية أعلى ، فقد تكون بديلا مجديا للبلاعم27،28،29. بناء على دراستنا باستخدام البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة في الدم ، وجدنا أن هذه الخلايا كانت تستجيب بشكل متساو لمحفزات M1 و M2 على كل من التيتانيوم والأغطية المعالجة بزراعة الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، أظهروا العديد من علامات إجماع M1 و M2 ، بعضها موضح في النتائج التمثيلية. أظهرت النتائج أنه يمكن استخدام MDMs كنموذج عملي في المختبر لمحاكاة تفاعلات الزرع والبلاعم.

لمزيد من التقدم في دراسات التعديل المناعي ، تعد علامات التوصيف الثابتة والمحددة ضرورية. أدخلت الدراسات مجموعة متنوعة من العلامات لتوصيف البلاعم التي تختلف ليس فقط بين البلاعم من مصادر مختلفة ولكن أيضا بين البلاعم من نفس المصدر17،18،19،24. تم تحديد لوحة من علامات M1 و M2 المميزة ل MDMs والتحقق منها من خلال تقييم العلامات المختلفة المبلغ عنها. يتم عرض بعض أهم العلامات الرئيسية في هذه المقالة.

يعد تحديد أنسب طرق الكشف جزءا مهما من عملية التقييم. تتطلب تقنيات التحليل المستخدمة بشكل شائع لتقييم علامات سطح الخلية عادة إزالة الخلايا من المواد الحيوية. ومع ذلك ، فقد لوحظ أن هذه العملية تؤثر سلبا على الخلايا عن طريق إتلاف علامات سطحها وتؤدي إلى انخفاض عدد الخلايا المنفصلة30. وبالتالي ، فإن قياس التدفق الخلوي ، الذي يتطلب انفصال الخلية ، ليس مناسبا لتقييم البلاعم المرتبطة بإحكام بالغرسات. في هذه الدراسة ، تم إجراء الكشف عن علامات سطح الخلية باستخدام CLSM. باستخدام العلامات المناسبة وتحسين عملية التلوين ، تمكنا من توصيف الأنواع الفرعية M1 و M2 بنجاح مقارنة ببعضها البعض وبخلايا M0. من المهم ملاحظة أن تلطيخ التألق شبه كمي ، وهو أحد قيوده. يمكن أن يؤدي ذلك إلى تعقيد تقييم الخلايا باستخدام العلامات المعبر عنها عبر جميع الأنواع الفرعية دون اختلافات كبيرة. تم اختيار CCR7 و CD209 بعد اختبار علامات مختلفة لتوصيف MDMs باستخدام CLSM. كان CCR7 و CD209 أعلى باستمرار في النوعين الفرعيين M1 و M2 ، على التوالي.

ضمن حدود هذه الدراسة ، تسلط النتائج الضوء على فائدة وفعالية البروتوكولات المنفذة في استقطاب البلاعم على أسطح الزرع وتوصيفها بدقة من حيث التعبير الجيني والبروتينات المفرزة وعلامات سطح الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، كشف تحليل العلامات الموصوفة عن أنماط تعبير متسقة ومحددة يمكن استخدامها للتمييز بين الأنواع الفرعية المختلفة من MDMs. ومع ذلك ، فإن هذا النموذج في المختبر لا يعكس تماما التنوع الظاهري واللدونة للضامة البشرية. يتم الآن تحديد العديد من الأنواع الفرعية للبلاعم (M2a ، M2b ، M2c ، M2d) ، مما يشير إلى الحاجة إلى نماذج أكثر تنوعا في المختبر لدراسة كيفية تأثير المواد الحيوية المختلفة وخصائصها (على سبيل المثال ، الخصائص الفيزيائية والكيميائية) على اللدونة والاستقطاب31،32. على الرغم من أنه من غير الممكن عكس حالة المعقدة في الجسم الحي باستخدام نماذج في المختبر ، إلا أنه يمكن الحصول على العديد من النتائج باستخدام بروتوكول المختبر المقدم لوصف إمكانات التعديل المناعي للمواد الحيوية الجديدة القابلة للزرع9 بشكل فعال. أخيرا وليس آخرا ، من الضروري إجراء مزيد من التأسيس لتوصيف البلاعم في نماذج أكثر تعقيدا في المختبر أو في الجسم الحي التي تنطوي على دور لاعبين آخرين في السياقات الفسيولوجية المعقدة. بشكل عام ، ستساهم هذه الدراسة في تطوير وتصميم المواد الحيوية المعدلة للمناعة لتحسين وتعزيز عمليات تجديد الأنسجة المواتية والتكامل الناجح للزرع ، وكذلك لمنع الالتهاب المزمن المرتبط بالزرع.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم توفير الأقراص من قبل Medentis Medical ، Bad-Neuenahr-Ahrweiler ، ألمانيا. يقر المؤلفون بالدعم المقدم من قسم جراحة الفم والوجه والفكين (مستشفى جامعة توبينغن).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
لوحة 24 بئر ، غير معالجةCorning Incorporated (Kennebunk ، الولايات المتحدة الأمريكية)   ؛144530
قارئ الامتصاص Infinite F50 TECAN Austria GmbH (Grö حفر ، النمسا)TCAT91000001
Accutase في DPBS ، 0.5 ملي متر EDTAEMD Millipore Corp. (برلنغتون ، الولايات المتحدة الأمريكية)SCR005
للتلاشي مضاد للتألق تصاعد متوسط - مائي ، Fluoroshieldabcam (كامبريدج ، المملكة المتحدة)ab104135
Bio-Rad MJ Research PTC-200 Peltier Thermal CyclerBio-Rad / MJ Research7212
ألبومين مصل الأبقار (BSA)VWR International bvba (لوفين ، بلجيكا)422361V
جهاز طرد مركزي 5804 REppendorf SE (هامبورغ ، ألمانيا)5804 R
DC-SIGN (D7F5C) XP RabbitmAb Cell Signaling Technology13193
ثنائي ميثيل سلفوكسيدشركة Sigma Aldrich Co. (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية)D2438-5X10ML
DRAQ5 محلول تلطيخMilteny Biotec (Bergisch Gladbach ، ألمانيا)130-117-344
الإيثانول & GE ؛ 99.8٪ لعلم الأحياء الجزيئيCarl Roth GmbH + CO. KG (كارلسروه ، ألمانيا)1HPH.1
IgG مضاد للفأر للماعز (H& amp; L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص
، Alexa Fluor Plus 488		InvitrogenA32723TR
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي المتصاص ، Cyanine3InvitrogenA10520
GraphPad PrismGraphPadVersion  9.4.1
CCR7 الأجسام المضادةR & D SystemsMAB197
Human IFN-gamma المؤتلفInvitrogen (روكفورد ، الولايات المتحدة الأمريكية)RIFNG100
IL-13 البشريMilteny Biotec (Bergisch Gladbach ، ألمانيا)5230901032
Human IL-4Milteny Biotec (Bergisch Gladbach ، ألمانيا)130-095-373
Human M-CSFPeprotech (كرانبري ، الولايات المتحدة الأمريكية)300-25
Leica TCS SP5Leica Microsystems CMS GmbH (مانهايم ، ألمانيا)https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp5/
عديدات السكاريد الدهنية من شركة EscherichiaSigma Aldrich Co. (ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية)L4391-1MG
Luna Universal qPCR Master Mix   ؛New England BiolabsNEB #M3003
LunaScript RT SuperMix KitNew England BiolabsE3010L
Lymphocetite Separation Medium 1077PromoCell (هايدلبرغ ، ألمانيا)C-44010
MCP-4 / CCL13 Human ELISA KitInvitrogenEHCCL13
MicroAmp Fast 96-Well Reaction Plate (0.1 مل) الأنظمةالحيوية التطبيقية (والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية)4346907
MicroAmp Optical Adhesive FilmLife Technologies Corporation (كارلسباد ، الولايات المتحدة الأمريكية)4311971
MicroAmp Splash Free 96-Well BaseApplied Biosystems (Waltham ، الولايات المتحدة الأمريكية)4312063
Microliter Centrifuge CD-3124RPhoenix Instrument (ألمانيا)9013111121
نظارات غطاء المجهر ، 10 ممCarl Roth GmbH ، كارلسروه ، ألمانيا4HX4.1
Monocyte Attachment MediumPromoCell (هايدلبرغ ، ألمانيا)C-28051
Multiply-Pro Gef & auml ؛ ß 0.5 مل ، PPSarstedt AG & ثاني أكسيد الكربون (Nü mbrecht ، ألمانيا)7،27،35،100
Nanodrop OneThermo Scientific (الولايات المتحدة الأمريكية)ND-ONE-W
QuantStudio   ؛ 3 SystemLife Technologies GmbH (سانت ليون روت ، ألمانيا)A28567
RNeasy Micro KitQiagen74007
RPMI 1640 ، 1x ، مع L-glutamineMediatech، Inc. (ماناساس ، الولايات المتحدة الأمريكية)10-040-CV
مقعد معقم ، LaminarAir HB 2472   ؛أدوات Heraeus (هاناو ، ألمانيا)51012197
أغطية زراعة الأنسجة 13 مم (بلاستيك)Sarstedt Inc. (نيوتن ، الولايات المتحدة الأمريكية)83،18،40،002
أقراص ميكانيكية من التيتانيوم 12 سم   ؛Medentis Medical (Bad-Neuenahr-Ahrweiler ، ألمانيا)N / A
TNF alpha Human ELISA KitInvitrogenKHC3011
محلول تريبان الأزرق 0.4٪Carl Roth GmbH + Co. KG (كارلسروه ، ألمانيا)1680.1
مضاد Human

المراجع

  1. Othman, Z., Pastor, B. C., van Rijt, S., Habibovic, P. Understanding interactions between biomaterials and biological systems using proteomics. Biomaterials. 167, 191-204 (2018).
  2. Ikada, Y. Challenges in tissue engineering. J R Soc Interface. 3 (10), 589-601 (2006).
  3. Aamodt, J. M., Grainger, D. W. Extracellular matrix-based biomaterial scaffolds and the host response. Biomaterials. 86, 68-82 (2016).
  4. Batool, F., et al. Modulation of immune-inflammatory responses through surface modifications of biomaterials to promote bone healing and regeneration. J Tissue Eng. 12, 20417314211041428(2021).
  5. Mantovani, A., Biswas, S. K., Galdiero, M. R., Sica, A., Locati, M. Macrophage plasticity and polarization in tissue repair and remodelling. J Pathol. 229 (2), 176-185 (2013).
  6. Shrivastava, R., Shukla, N. Attributes of alternatively activated (M2) macrophages. Life Sci. 224, 222-231 (2019).
  7. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol. 5 (12), 953-964 (2005).
  8. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
  9. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  10. Kzhyshkowska, J., et al. Macrophage responses to implants: prospects for personalized medicine. J Leukoc Biol. 98 (6), 953-962 (2015).
  11. Browne, S., Pandit, A. Biomaterial-mediated modification of the local inflammatory environment. Front Bioeng Biotechnol. 3, 67(2015).
  12. Piatnitskaia, S., et al. Modelling of macrophage responses to biomaterials in vitro: state-of-the-art and the need for the improvement. Front Immunol. 15, 1349461(2024).
  13. Rayahin, J. E., Gemeinhart, R. A. Activation of macrophages in response to biomaterials. Results Probl Cell Differ. 62, 317-351 (2017).
  14. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  15. Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biol. 15 (1), 53(2017).
  16. Salma Iqbal, A. K. Characterization of in vitro generated human polarized macrophages. J Clin Cell Immunol. 6, 1-8 (2015).
  17. Hotchkiss, K. M., et al. Titanium surface characteristics, including topography and wettability, alter macrophage activation. Acta Biomater. 31, 425-434 (2016).
  18. Wang, Y., Zhang, Y., Sculean, A., Bosshardt, D. D., Miron, R. J. Macrophage behavior and interplay with gingival fibroblasts cultured on six commercially available titanium, zirconium, and titanium-zirconium dental implants. Clin Oral Investig. 23 (8), 3219-3227 (2019).
  19. Abaricia, J. O., Shah, A. H., Ruzga, M. N., Olivares-Navarrete, R. Surface characteristics on commercial dental implants differentially activate macrophages in vitro and in vivo. Clin Oral Implants Res. 32 (4), 487-497 (2021).
  20. Lu, W., et al. Improved osseointegration of strontium-modified titanium implants by regulating angiogenesis and macrophage polarization. Biomater Sci. 10 (9), 2198-2214 (2022).
  21. Murray, P. J., Wynn, T. A. Obstacles and opportunities for understanding macrophage polarization. J Leukoc Biol. 89 (4), 557-563 (2011).
  22. Nascimento, C. R., Fernandes, N. A. R., Maldonado, L. A. G., Junior, C. R. Comparison of monocytic cell lines U937 and THP-1 as macrophage models for in vitro studies. Biochem Biophys Rep. 32, 101383(2022).
  23. Freytes, D. O., Kang, J. W., Marcos-Campos, I., Vunjak-Novakovic, G. Macrophages modulate the viability and growth of human mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 114 (1), 220-229 (2013).
  24. Zhang, Y., et al. Macrophage type modulates osteogenic differentiation of adipose tissue MSCs. Cell Tissue Res. 369 (2), 273-286 (2017).
  25. Cerqueira, A., et al. Evaluation of the inflammatory responses to sol-gel coatings with distinct biocompatibility levels. J Biomed Mater Res A. 109 (9), 1539-1548 (2021).
  26. Zhang, Y., Cheng, X., Jansen, J. A., Yang, F., van den Beucken, J. J. Titanium surfaces characteristics modulate macrophage polarization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 95, 143-151 (2019).
  27. Nobs, S. P., Kopf, M. Tissue-resident macrophages: guardians of organ homeostasis. Trends Immunol. 42 (6), 495-507 (2021).
  28. Sreejit, G., Fleetwood, A., Murphy, A., Nagareddy, P. Origins and diversity of macrophages in health and disease. Clin Transl Immunology. 9 (12), e1222(2020).
  29. Parisi, L., et al. Preparation of human primary macrophages to study the polarization from monocyte-derived macrophages to pro-or anti-inflammatory macrophages at biomaterial interface in vitro. J Dent Sci. 18 (4), 1630-1637 (2023).
  30. Feuerer, N., et al. Macrophage retrieval from 3D biomaterials: A detailed comparison of common dissociation methods. J Immunol Regen Med. 11, 100035(2021).
  31. Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. J Cell Physiol. 233 (9), 6425-6440 (2018).
  32. Sridharan, R., Cameron, A. R., Kelly, D. J., Kearney, C. J., O'Brien, F. J. Biomaterial based modulation of macrophage polarization: a review and suggested design principles. Mater Today. 18 (6), 313-325 (2015).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

استقطاب الخلايا البلعمية M1استقطاب الخلايا البلعمية M2توصيف الخلايا البلعميةتحليل qRT-PCRالمجهر البؤريمقايسة ELISAمؤشر CCR7مؤشر CD209
استقطاب وتوصيف البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الوحيدة M1 و M2 على أسطح الزرع
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.