مقالة منهجية

القياس الكمي لتنفس الميتوكوندريا في خلايا الخميرة الكاملة

1.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67186

⸱

نوفمبر 8, 2024

 ,  ,  , 
1School of Chemistry, Universidad Autónoma de Querétaro, 2Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Morelia, 3Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

في هذه المقالة

ملخص

يعد تنفس الميتوكوندريا في خلايا الخميرة الكاملة مؤشرا قيما للطاقة الحيوية للخلية. هنا ، نقدم بروتوكولا لتحديد هذا النمط الظاهري الذي ينطبق على أنواع الخميرة المختلفة.

الملخص

يتم تنسيق عملية التمثيل الغذائي بشكل أساسي من خلال توافر الطاقة الخلوية والظروف البيئية. توفر المقايسات لمعرفة كيفية تكيف الخلايا مع التمثيل الغذائي النشط مع الظروف الغذائية والبيئية المختلفة معلومات قيمة لتوضيح الآليات الجزيئية. الفسفرة المؤكسدة هي المصدر الأساسي ل ATP في معظم الخلايا ، ونشاط تنفس الميتوكوندريا هو عنصر رئيسي في الفسفرة المؤكسدة ، مما يحافظ على إمكانات غشاء الميتوكوندريا لتخليق ATP. غالبا ما تتم دراسة تنفس الميتوكوندريا في الميتوكوندريا المعزولة التي تفتقد إلى السياق الخلوي. هنا ، نقدم طريقة لقياس تنفس الميتوكوندريا في خلايا الخميرة السليمة. تنطبق هذه الطريقة على أي نوع من أنواع الخميرة ، على الرغم من أنها استخدمت بشكل عام لخلايا خميرة الخميرة. أولا ، يتم اختبار نمو الخميرة في ظروف محددة. بعد ذلك ، يتم غسل الخلايا وإعادة تعليقها في الماء منزوع الأيونات بنسبة 1: 1 (وزن / حجم). ثم يتم وضع الخلايا في غرفة مقياس التأكسج مع التحريك المستمر ، ويتم استخدام قطب كلارك لقياس استهلاك الأكسجين. يتم وضع بعض الجزيئات بالتتابع في الغرفة ويتم اختيارها وفقا لهذا التأثير على سلسلة نقل الإلكترون أو تخليق ATP. يضاف oligomycin مثبط ATPase أولا لقياس التنفس المقترن بتخليق ATP. بعد ذلك ، يتم استخدام أداة فك التوصيل لقياس القدرة التنفسية القصوى. أخيرا ، يضاف مزيج من مثبطات سلسلة نقل الإلكترون للتخلص من استهلاك الأكسجين الذي لا علاقة له بتنفس الميتوكوندريا. يتم تحليل البيانات باستخدام انحدار خطي للحصول على المنحدر الذي يمثل معدل استهلاك الأكسجين. ميزة هذه الطريقة هي أنها خاصة بتنفس الميتوكوندريا الخميرة ، مما يحافظ على السياق الخلوي. من الضروري تسليط الضوء على أن المثبطات المستخدمة في القياس الكمي لتنفس الميتوكوندريا يمكن أن تختلف بين أنواع الخميرة.

المقدمة

تلعب الميتوكوندريا دورا أساسيا في الطاقة الحيوية الخلوية لأنها المصدر الرئيسي ل ATP لمعظم الخلايا ، وتتلاقى العديد من المسارات وتعتمد على نشاط مسارات الميتوكوندريا1. هناك حاجة إلى الفسفرة المؤكسدة لتخليق ATP الذي يجمع بين نقل الإلكترون عبر سلسلة نقل الإلكترون لتقليل الأكسجين و F1F0- نشاط ATPase ، وتصنيع ATP باستخدام إمكانات غشاء الميتوكوندريا الناتجة عن تدفق الإلكترون2. وبالتالي ، فإن تنفس الميتوكوندريا هو جزء من الفسفرة المؤكسدة3.

تتكون سلسلة تنفس الميتوكوندريا من أربعة مجمعات أو ، في بعض الحالات ، مركب الخميرة I ناقص (على سبيل المثال ، Saccharomyces cerevisiae) ، وثلاثة مجمعات ، وثلاثة بروتينات نازعة الهيدروجين4. مجمعات الجهاز التنفسي مترجمة في غشاء الميتوكوندريا الداخلي. تقدم بعض الخميرة سلسلة نقل الإلكترون المتعارف عليها مع المركب الأول (نازعة هيدروجين NADH) أو ثلاثة نازعة هيدروجين NADH ، يوبيكينون (Co Q) ، المركب الثاني (السكسينات يوبيكوينون أوكسيدوكتاز ) ، المركب الثالث (يوبيكينون سيتوكروم أوكسيدوكتاز ) ، السيتوكروم ج (Cyt c) ، والمركب الرابع (السيتوكروم ج أوكسيديز) 5،6. يسمح نقل الإلكترون عبر المجمعات بضخ البروتونات من مصفوفة الميتوكوندريا إلى الفضاء بين الغشاء ، مما يشكل إمكانات غشاء الميتوكوندريا7. يتم ضخ البروتونات الموجودة في الفضاء بين الغشاء في الاتجاه المعاكس ، باتجاه مصفوفة الميتوكوندريا بواسطة F1F0 -ATPase لتصنيع جزيء ATP واحد لكل أربعة بروتونات يتمضخها 8.

توفر قياسات تنفس الميتوكوندريا رؤى قيمة حول سلامة الميتوكوندريا ، والطاقة الحيوية للخلية ، والقدرة التنفسية للميتوكوندريا9. يمكن تحليل وظيفة تنفس الميتوكوندريا في المختبر أو في الموقع باستخدام تقنيات متنوعة. ومع ذلك ، يمكن أن يقدم تحليل تنفس الميتوكوندريا في الخلايا السليمة سلسلة من المزايا لأنه يشتمل على عملية التمثيل الغذائي للخلية بأكملها ، حيث يتم أخذ تفاعلات الخلايا مع بيئتها والتمثيل الغذائي داخل الخلايا في الاعتبار عند استخدام الخلايا الكاملة10. علاوة على ذلك ، فإن استخدام الخلايا السليمة يسمح بإجراء تقييم سهل للظروف التجريبية المختلفة ويكتشف الحد الأدنى من التغييرات التي لا يمكن ملاحظتها في الميتوكوندرياالمعزولة 10،11. ميزة أخرى لقياس تنفس الميتوكوندريا في الخلايا السليمة هي أنه يتم الاحتفاظ بتأثيرات تكاثر الميتوكوندريا وتوطينها12.

تم وصف تنفس الميتوكوندريا للثدييات في الخلايا السليمة بتفصيلكبير 12 ، مع ترك دراسة الكائنات حقيقية النواة الأخرى ، مثل الخمائر. هنا ، نقترح تقنية لقياس تنفس الميتوكوندريا الذي يتكيف مع الخميرة من بروتوكولات الثدييات. وبالتالي ، تم استخدام مفاهيم من القياس الكمي للثدييات لتنفس الميتوكوندريا في هذه التقنية. على سبيل المثال ، تنقسم هذه التقنية إلى مراحل مختلفة مثل بروتوكول الثدييات: 1) التنفس القاعدي (يعتمد على الركيزة) ، 2) التنفس المرتبط ب ATP (من خلال تثبيط سينسيز ATP) ، 3) قدرة التنفس القصوى (باستخدام أداة فك الاقتران التي تسمح بنفاذية البروتونات من خلال غشاء الميتوكوندريا الداخلي) ، 4) تثبيط تنفس الميتوكوندريا (استخدام مزيج من مثبطات السلسلة التنفسية للتخلص من استهلاك الأكسجين لمصادر أخرى مختلفة عن تنفس الميتوكوندريا)11،13. لذلك ، تهدف هذه الورقة إلى تقديم بروتوكول لتحديد تنفس الميتوكوندريا في الخميرة.

البروتوكول

1. الثقافة والإعلام وإعداد اللقاح

  1. تحضير 100 مل من مستخلص الخميرة - البيبتون - وسط سكر العنب (YPD) عن طريق إضافة 1 جم من مستخلص الخميرة ، و 2 جم من الكازين البيبتون ، و 2 جم من الجلوكوز في 95 مل من الماء المقطر. قم بتوزيع 3 مل في أنابيب اختبار زجاجية سعة 10 مل ، وتعقيمها عند 121 درجة مئوية ، و 1.5 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن تخزين الوسط في درجة حرارة 4-8 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  2. تلقيح أنبوب اختبار زجاجي سعة 10 مل يحتوي على 3 مل من وسط YPD مع 250 ميكرولتر من خلايا الخميرة المحفوظة بالجلسرين -20 درجة مئوية. احتضن بين عشية وضحاها مع تحريك مستمر عند 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن أن تختلف حضانة درجة الحرارة في بعض أنواع الخميرة (على سبيل المثال ، Kluyveromyces marxianus لديها درجة حرارة نمو مثالية تبلغ 37 درجة مئوية).
  3. املأ طبق بتري (60 × 15 مم2) بأجار معقم 2٪ YPD (أضف 10 جم من مستخلص الخميرة ، و 20 جم من الكازين البيبتون ، و 20 جم من الجلوكوز ، و 20 جم من الأجار البكتريولوجي إلى 950 مل من الماء المقطر) وقم بربط طبق بتري بخلايا الخميرة المزروعة في أنبوب اختبار زجاجي سعة 10 مل باستخدام حلقة معقمة. احتضن طبق بتري عند 30 درجة مئوية حتى تظهر مستعمرات معزولة.
  4. قم بإعداد لقاح مسبق عن طريق تلقيح أنبوب اختبار زجاجي معقم سعة 10 مل يحتوي على 3 مل من وسط YPD بنسبة 2٪ جلوكوز مع مستعمتين أو ثلاث مستعمرات معزولة بالخميرة من طبق بتري. احتضن طوال الليل مع تحريك مستمر عند 30 درجة مئوية.

2. ظروف النمو وتصميم التجربة

  1. تلقيح قارورة إرلينماير سعة 500 مل تحتوي على 100 مل من الوسط الاصطناعي الكامل المعقم (وسط SC ؛ 0.18 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة بدون أحماض أمينية ، 0.5 جم من كبريتات الأمونيوم ، 0.2 جم من فوسفات ثنائي البوتاسيوم ، 1 جم من مكملات الخميرة الاصطناعية المتسربة والجلوكوز وفقا للتصميم التجريبي ، في 98.02 مل من الماء المقطر) مع زراعة الخميرة عند ODالأولي 600 ~ 0.1 ، أي ما يقرب من 3 مل من التلقيح قبل التلقيح بين عشية وضحاها (OD600 ~ 3). اضبط الحالة البيئية أو مكمل التحدي الكيميائي الذي سيتم اختباره في تنفس الميتوكوندريا (على سبيل المثال ، إضافة 100 ميكرومتر ريسفيراترول). قم بإعداد التحكم في السيارة في قارورة منفصلة للتحدي الكيميائي. اختبر ما لا يقل عن ثلاثة تكرارات بيولوجية.
    ملاحظة: يوصى باستخدام الحد الأدنى من الوسائط للتخلص من الضوضاء الغذائية في الفحص ، ويتم استخدام الحد الأدنى من الوسائط المقترحة في هذه المرحلة ل S. cerevisiae ويمكن أن تختلف باختلاف أنواع الخميرة الأخرى. أخيرا ، يعد تركيز الجلوكوز المكمل في وسط الثقافة أمرا بالغ الأهمية لتجنب قمع الجلوكوز أو تأثير Crabtree الذي يثبط تنفس الميتوكوندريا. أعطت التركيزات التي تقل عن 0.5٪ (وزن / حجم) استجابات جيدة في تنفس الميتوكوندريا مصحوبة بمعدلات نمو عالية في S. cerevisiae. في الخمائر السلبية Crabtree ، لم تؤثر تركيزات الجلوكوز العالية على تنفس الميتوكوندريا (على سبيل المثال ، K. marxianus).
  2. قم بوزن أنبوب مخروطي فارغ سعة 50 مل واستخدمه لحصاد الخلايا في منتصف مرحلة السجل (OD600 ~ 0.5) عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يوصى بمرحلة منتصف السجل لاختبار تنفس الميتوكوندريا لأنها مرحلة النمو التي يكون فيها التمثيل الغذائي النشط أكثر نشاطا.
  3. تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات 3 مرات ب 25 مل من الماء منزوع الأيونات. قم بوزن الأنبوب المخروطي بخلايا الحبيبات (الوزن الرطب) واطرح وزن الأنبوب المخروطي للحصول على الوزن الرطب الخلوي.
  4. أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من الماء منزوع الأيونات.
  5. سجل التركيز الخلوي بقسمة الوزن الرطب على 2 للحصول على مجم من الخلايا / مل. هذه القيمة ضرورية لتحديد مقدار الحجم الذي يجب إضافته للحصول على 50 ملغ من الخلايا للمقايس.

3. مقايسة استهلاك الأكسجين (الاستقطاب)

  1. استخدم قطب أكسجين من نوع كلارك متصل بشاشة YSI5300A وجهاز كمبيوتر للحصول على البيانات.
    1. ضع 5 مل من حمض السلفونيك مورفو إيثانول المعدل إلى درجة الحموضة 6 مع ثلاثي إيثانول أمين (مخزن MES-TEA المؤقت ؛ 10 ملم) و 50 مجم من الخلايا (الوزن الرطب) في غرفة بولاروغراف. ضع القطب برفق ، مع الحرص على عدم وجود فقاعات.
    2. قم بتشغيل شاشة YSI5300A والكمبيوتر للحصول على البيانات والغرفة للتقليب. اضبط شاشة YSI5300A عن طريق تحديد قرص إعداد القناة 1 في AIR. اضبط القناة 1 إلى 100٪ باستخدام قرص معايرة القناة 1 وقم بتثبيت الإشارة لمدة 5 دقائق عند 100٪.
    3. ابدأ في تسجيل البيانات في الكمبيوتر وقياس الوقت باستخدام الكرونومتر.
      ملاحظة: لا تحتوي شاشة YSI5300A على جهاز كمبيوتر أو برنامج للحصول على البيانات. يمكن للمستخدم تنفيذ ذلك خارجيا.
    4. استخدم التوجيه الجانبي للقطب الكهربائي في غرفة مقياس التأكسج لإضافة الركيزة القابلة للأكسدة ، والأوليغوماسين ، وفصل الاقتران ، ومزيج مثبطات السلسلة التنفسية بالتتابع.
  2. أضف الركيزة القابلة للأكسدة (الجلوكوز ، الجلسرين ، L-lactate ، أو مصدر كربون آخر وفقا للتصميم التجريبي) إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ملي مولار باستخدام حقنة كروماتوغرافيا. حافظ على الغرفة مغلقة طوال الوقت وبتحريض مستمر. سجل استهلاك النسبة المئوية للهواء لمدة 2-3 دقائق لتحديد التنفس الأساسي.
    ملاحظة: يستخدم الجلوكوز والجلسرين واللاكتات لتحليل سلسلة نقل الإلكترون في مواقع مختلفة من السلسلة التنفسية: يقلل استقلاب الجلوكوز من NAD + لتكوين NADH ويستخدم لتحليل سلسلة الجهاز التنفسي بأكملها. ينقل الجلسرين الإلكترونات إلى يوبيكوينون ويستخدم لتقييم سلسلة الجهاز التنفسي من يوبيكوينون. أخيرا ، يتنازل L-lactate عن إلكتروناته للسيتوكروم ج ويستخدم لتحديد التأثير من السيتوكروم c14. يمكن أن تختلف هذه الركائز اعتمادا على القدرة الأنزيمية لأنواع الخميرة.
  3. أضف oligomycin للحصول على تركيز نهائي قدره 0.01 ملي مولار في غرفة مقياس التأكسج باستخدام حقنة كروماتوغرافيا لتقييم التنفس المرتبط ب ATP وتسجيل استهلاك النسبة المئوية للهواء لمدة 2-3 دقائق.
  4. استكمل مفك الاقتران ، 3-كلوروفينيل هيدرازون كربونيل سيانيد (CCCP) للحصول على تركيز نهائي قدره 0.015 ملي مولار في غرفة مقياس التأكسج باستخدام حقنة كروماتوغرافيا لتحديد قدرة التنفس القصوى وتسجيل استهلاك النسبة المئوية للهواء لمدة 2-3 دقائق.
  5. استخدم حقنة كروماتوغرافيا لإضافة مثبطات سلسلة نقل الإلكترون: أولا ، 2- thenoyltrifluoroacetone (TTFA) ثم antimycin A (AA) بتركيزات نهائية تبلغ 1 ملي مولار و 1 مجم / مل ، على التوالي. قم بقياس كل مثبط لمدة 2-3 دقائق.
    ملاحظة: يمكن أن تختلف مثبطات سلسلة نقل الإلكترون بين أنواع الخميرة. يجب مراعاة ذلك في هذه الخطوة.
  6. فحص كل مصدر كربون بشكل مستقل (مثل الجلوكوز أو الجلسرين أو اللاكتات). كرر الخطوات من 3.3 إلى 3.5 لكل مصدر كربون. اغسل الحجرة 3 مرات بنسبة 70٪ من الإيثانول و 3 مرات بالماء منزوع الأيونات بعد كل استخدام.

4. معالجة البيانات

  1. استخدم منحنيات استهلاك الأكسجين (رسم نسبة الهواء مقابل الوقت) لحساب منحدرات الركيزة القابلة للأكسدة (التنفس القاعدي) ، oligomycin (التنفس المرتبط ب ATP) ، CCCP (التنفس الأقصى) ، AA ، و TTFA (وليس التنفس الميتوكوندريا. الشكل 1). احسب المنحدرات الفردية لكل مركب مكمل باستخدام الانحدار الخطي كما هو موضح أدناه.
    1. قم بإنشاء ملف مشروع جديد في البرنامج الإحصائي. اختر XY في قسم إنشاء. حدد الخيار إدخال البيانات أو استيرادها إلى جدول جديد في القسم جدول البيانات.
    2. حدد الأرقام في القسم الفرعي X في قسم الخيارات. انقر فوق إدخال 3 قيم متماثلة في أعمدة فرعية جنبا إلى جنب في القسم الفرعي Y في قسم الخيارات.
      ملاحظة: يحتوي تنسيق الجدول على عمود X واحد وعدة أعمدة Y، يحتوي كل منها على 3 أعمدة فرعية تسمى A: Y1 و A: Y2.
    3. أدخل بيانات الوقت في أعمدة X (على سبيل المثال ، 0 أو 2 أو 4 أو 6 أو 8 ثوان أو 0 أو 1 أو 2 أو 3 دقائق). اكتب النسبة المئوية للهواء في أعمدة Y.
    4. قم بعمل لياقة انحدار خطي. انقر فوق تحليل في شريط القائمة. في خيار التحليل ، حدد الانحدار الخطي البسيط على تحليلات XY وانقر فوق موافق.
    5. احصل على قيمة الميل من جداول النتائج في البيانات في الجزء الأيسر من الشاشة.
  2. اكتب قيم المنحدر في ورقة بيانات واطرح قيمة المنحدر التي تم الحصول عليها من مزيج مثبطات الجهاز التنفسي (AA و TTFA) من المنحدرات التي تم الحصول عليها من الركيزة القابلة للأكسدة ، والأوليغومايسين ، و CCCP للتخلص من استهلاك الأكسجين من مصادر مختلفة عن تنفس الميتوكوندريا.
  3. اضرب القيم التي تم الحصول عليها في 237 ميكرومتر من O2. تعتبر هذه القيمة قابلية ذوبان O2 في وسط الميتوكوندريا المخزن متوازن مع الهواء (20.9٪ O2) عند 25 درجة مئوية ؛ تختلف هذه القيمة وفقا لدرجة الحرارة والارتفاع والمخزن المؤقت المستخدم.
  4. تحويل إلى دقيقة القيم التي تم الحصول عليها هي μM من O2 في كل مرة ، اعتمادا على كيفية رسم الوقت ، للحصول على ميكرومتر من O2 / دقيقة.
  5. يقسم على 50 ، أي ملغ الخلايا المستخدمة ؛ يمكن أن تختلف ملغنيوم الخلية وفقا للتصميم التجريبي. أخيرا ، يتم التعبير عن استهلاك الأكسجين على أنه ميكرومتر من O2 / mg من الخلايا × دقيقة

النتائج

يمكن استخدام تقنية تنفس الميتوكوندريا هذه لأنواع الخميرة بخلاف S. cerevisiae ، مثل Scheffersomyces stipitis15 و K. marxianus16. ومع ذلك ، لأغراض تمثيلية ، نقدم فقط نتائج من S. cerevisiae. من المعروف أن S. cerevisiae يقدم عملية التمثيل الغذائي التنفسي السائدة بتركيزات منخفضة من الجلوكوز (أقل من 0.8 مليمولار)17،18. وهكذا ، لتأكيد النمط الظاهري للجهاز التنفسي ل S. cerevisiae ، تم زراعته في تركيزين من الجلوكوز لتحفيز (0.5٪ جلوكوز) والحد من (5٪ جلوكوز) تنفس الميتوكوندريا18،19. كما هو متوقع ، فإن النتائج التي تم الحصول عليها في التنفس القاعدي (الركيزة المؤكسدة) ، والتنفس المرتبط ب ATP (oligomycin) ، والقدرة التنفسية القصوى (CCCP) تتحقق من صحة التمثيل الغذائي النشط المميز ل S. cerevisiae (الشكل 2). لاحظنا قيما أعلى لاستهلاك الأكسجين (التنفس القاعدي ، والتنفس المرتبط ب ATP ، والقدرة التنفسية القصوى) في الخلايا المزروعة بنسبة 0.5٪ من الجلوكوز مقارنة بالقيم التي تم الحصول عليها في الخلايا المزروعة بنسبة 5٪ من الجلوكوز (الشكل 2).

بالإضافة إلى ذلك ، استخدمت المقايسات ثلاث ركائز: الجلوكوز والجلسرين و L-lactate. الهدف من استخدام ركائز متنوعة هو تقييم أجزاء مختلفة من سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا. في هذه الظروف ، لم يظهر تنفس الميتوكوندريا تغييرات كبيرة تعتمد على الركيزة حيث لم تتم إضافة أي علاج لإزعاج السلسلة التنفسية (الشكل 2).

استخدمنا الكيرسيتين لتقييم قدرة التقنية ، وهو مركب يؤثر سلبا على تنفس الميتوكوندريا20. أظهرت البيانات التي تم الحصول عليها أن الكيرسيتين قلل بشكل كبير من تنفس الميتوكوندريا في الخلايا المزروعة في وسائط مكملة بنسبة 0.5٪ جلوكوز (الشكل 3). من ناحية أخرى ، لم تظهر الخلايا المزروعة في الوسائط المكملة بالغلوكوز بنسبة 5٪ تأثيرا سلبيا كبيرا من الكيرسيتين (الشكل 4).

figure-results-1
الشكل 1: منحنى استهلاك الأكسجين التمثيلي. منحنى استهلاك الأكسجين الذي تم الحصول عليه في S. cerevisiae الخلايا المزروعة في وسط SC (0.5٪ جلوكوز). تمثل الألوان منحدرات مختلفة تم الحصول عليها في الركيزة ، ومفككين ، ومكملات المثبطات. أخضر: استخدمت الركيزة الجلوكوز والتنفس القاعدي المقابل للمنحدر. الأزرق: oligomycin ، مثبط سينسيز ATP ، منحدر يستخدم لتحديد التنفس المرتبط ب ATP. الأصفر: CCCP ، فك التوصيل ، المنحدر المستخدم لتقييم أقصى تنفس. الرمادي والأحمر: مركب المثبط الثاني والثالث ، على التوالي ؛ المنحدر المستخدم لتحديد استهلاك الأكسجين الذي لا يعتمد على الميتوكوندريا. المختصرات: CCCP = 3-كلوروفينيل هيدرازون كربونيل سيانيد; TTFA = 2- thenoyltrifluoroacetone. AA = antimycin A. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: فحوصات استهلاك الأكسجين في S. cerevisiae الخلايا التي نمت بنسبة 0.5٪ و 5٪ جلوكوز. يتم تقييم تنفس الميتوكوندريا من خلال استهلاك الأكسجين المقاس عند التنفس الأساسي ، والقدرة التنفسية القصوى ، والتنفس المرتبط ب ATP في الخلايا المكورة المخيخية المزروعة في SC مكملة بنسبة 0.5٪ و 5٪ جلوكوز. تم استخدام ثلاث ركائز لتقييم تأثيرها المحدد على سلسلة نقل الإلكترون: الجلوكوز (نازعة هيدروجين NADH) ، والجلسرين (تجمع يوبيكوينون) ، و L-lactate (السيتوكروم c). (أ) التنفس القاعدي عند 5٪ و 0.5٪ جلوكوز مع الجلوكوز والجلسرين و L-lactate كركائز. (ب) أقصى تنفس عند 5٪ و 0.5٪ جلوكوز مع الجلوكوز والجلسرين و L-lactate كركائز ؛ (ج) التنفس المرتبط ب ATP عند 5٪ و 0.5٪ جلوكوز مع الجلوكوز والجلسرين و L-lactate كركيزة. يتم تقديم النتائج كمتوسط ± SD من ثلاث تجارب مستقلة ، مع كل تجربة لها تكراران تقنيان. ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey (ص ≤ 0.05 ؛ أحرف مختلفة: فرق كبير ، نفس الأحرف: لا يوجد فرق كبير جدا) للتحليل الإحصائي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: حد الكيرسيتين من تنفس الميتوكوندريا في تركيز منخفض من الجلوكوز في الخلايا المكورية المخيفة المزروعة. تم إجراء قياس استهلاك الأكسجين عند التنفس القاعدي ، والقدرة التنفسية القصوى ، والتنفس المرتبط ب ATP في الخلايا المكورة المخيخية المزروعة في وسط SC (0.5٪ جلوكوز) مكملات الكيرسيتين (100 ميكرومتر). تم استخدام الإيثانول لإذابة محلول الكيرسيتين. يتم تقديم النتائج كمتوسط ± SD من ثلاث تجارب مستقلة ، مع كل تجربة لها تكراران تقنيان. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار t للطالب (* ، ** ص ≤ 0.05). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: لا يؤثر الكيرسيتين على تنفس الميتوكوندريا في تركيز الجلوكوز العالي في S. cerevisiae. تم قياس استهلاك الأكسجين عند التنفس القاعدي ، والقدرة التنفسية القصوى ، والتنفس المرتبط ب ATP في الخلايا المكورة المخيخية المزروعة في وسط SC (5٪ جلوكوز) مكملات الكيرسيتين (100 ميكرومتر). يستخدم الإيثانول لإذابة محلول الكيرسيتين. تظهر النتائج متوسط ± SD من ثلاث تجارب مستقلة ، لكل منها تكراران فنيان. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار t المزدوج للطالب (p ≤ 0.05 ؛ ns: غير معتد به). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

تلعب فسفرة تنفس الميتوكوندريا دورا أساسيا في العديد من المسارات التي تعتمد على إمكانات غشاء الميتوكوندريا وتحافظ على مستويات ATP من خلال الفسفرة المؤكسدة. إن فهم كيفية تأثير الظروف البيئية والغذائية على تنفس الميتوكوندريا للخميرة بمثابة أداة لتوضيح الآليات الجزيئية.

من الضروري مراعاة الخطوات الحاسمة التالية للحصول على نتائج موثوقة من هذه الطريقة. التحريض >200 دورة في الدقيقة أمر بالغ الأهمية للحصول على كتلة حيوية كافية في ظل ظروف نمو الجهاز التنفسي لاختبار تنفس الميتوكوندريا. تتسبب ظروف التحريض التي تقل عن 200 دورة في الدقيقة في ضعف النمو وتكوين الكتلة الحيوية ، مما يستغرق وقتا أعلى للوصول إلى مرحلة النمو المتوسطة ويمكن أن تؤثر على معدلات استهلاك الأكسجين لأن الخلايا تعيش في بيئة أقل أكسجا. يتم ضبط تركيز الجلوكوز في الوسائط وفقا للنمط الظاهري للخميرة (Crabtree-إيجابي أو سلبي) ؛ هذا أمر بالغ الأهمية في حالة الخمائر الإيجابية ل Crabtree لأن تركيزات الجلوكوز العالية تمنع تنفس الميتوكوندريا ويمكن أن تمارس تحيزا في تفسير البيانات. على سبيل المثال ، في S. cerevisiae ، يتسبب الجلوكوز في حدوث قمع تقويضي ، مما يثبط تنفس الميتوكوندريا بتركيزات عالية من الجلوكوز21،22. بناء على هذا الدليل ، يتم الحصول على قيم أقل في التنفس الأساسي ، والتنفس المرتبط ب ATP ، والتنفس الأقصى للخلايا المزروعة بتركيز مرتفع من الجلوكوز (5٪) مقارنة بخلايا الخميرة المزروعة بتركيز منخفض من الجلوكوز (0.5٪). يجب اختيار مثبطات السلسلة التنفسية بعناية وفقا لقابلية الخميرة ؛ هذا أمر بالغ الأهمية للتخلص من مصادر استهلاك الأكسجين الخلوي بخلاف تنفس الميتوكوندريا.

تستخدم الركائز ومفككات الميتوكوندريا والمثبطات لتحديد المعلمات المختلفة لتنفس الميتوكوندريا في الخلايا السليمة. ومع ذلك ، فإن استخدامها له بعض القيود. على سبيل المثال ، يجب مراعاة الأهداف غير المحددة خارج الميتوكوندريا لمثبطات الميتوكوندريا ومفككات الاقتران في الخلايا السليمة لتجنب التحيز في تفسير استهلاك الأكسجين. علاوة على ذلك ، يجب اختبار استخدام مصادر الكربون البديلة لفحص موقع العمل في السلسلة التنفسية بمزيد من التفاصيل حيث يمكن أكسدة المنتجات الثانوية لاستقلاب الجلسرين أو L-lactate لتقليل NAD + أو FAD + ، مما يتنازل عن الإلكترونات وينشط السلسلة التنفسية منذ نازعة هيدروجين NADH والمركب الثاني ، على التوالي. أخيرا ، S. cerevisiae وغيرها من الخميرة تؤوي ناقلات PDR مثل Yor1p (بروتين مقاومة الخميرة oligomycin) ، مما يشير إلى تدفق oligomycin من الخلايا23. علاوة على ذلك ، هناك حاجة إلى فحوصات باستخدام خلايا ناقصة PDR ، على سبيل المثال ، سلالة AD1-8 ، التي تحتوي على ناقلات PDR رئيسية وعوامل نسخ PDR1 / PDR3 محذوفة ، للتحقق من صحة استخدام oligomycin في S. cerevisiae لقياس تنفس الميتوكوندريا.

يحافظ استخدام الخلايا السليمة لقياس كمية تنفس الميتوكوندريا على السياق الخلوي ، مما يعطي تقنية أكثر قوة لمعرفة التأثيرات الغذائية أو البيئية على الطاقة الحيوية للخميرة. علاوة على ذلك ، فإن استخدام خلايا الخميرة السليمة لقياس تنفس الميتوكوندريا أكثر اقتصادا ، وعلى المستوى التقني ، أسهل من الميتوكوندريا المعزولة. بالإضافة إلى ذلك ، كما هو الحال في فحوصات الميتوكوندريا المعزولة ، تشير مصادر الكربون المتنوعة إلى موقع العمل في السلسلة التنفسية لبعض الجزيئات. كدليل على المفهوم ، تؤكد هذه التقنية أن مكملات ريسفيراترول تؤثر على السلسلة التنفسية عند مستوى نازعة هيدروجين NADH حيث أن تثبيط الريسفيراترول على التنفس الأساسي لا يلاحظ إلا مع الجلوكوز وليس مع الجلسرين أو L-lactate24. أظهرت الدراسات المختبرية مع المركب المذاب أن ريسفيراترول يتنافس مع NAD + ، مما يؤثر على النشاط المركبI 25. هذا يؤكد النمط الظاهري الذي لوحظ في الخلايا السليمة بالتقنية المعروضة هنا. إلى جانب ذلك ، هذه التقنية موثوقة أيضا لاستكشاف الآثار السلبية للمواد الكيميائية على تنفس الميتوكوندريا الخميرة. على سبيل المثال ، الكيرسيتين هو مادة البوليفينول التي تمت دراستها على نطاق واسع في العقود الأخيرة. من بين الأدلة الأولية التي تم العثور عليها ، ثبت أنه يحد من تنفس الميتوكوندريا في الخلايا السليمة ، والذي تم التحقق من صحته من خلال نشاط سلسلة الجهاز التنفسي المعقد26،27. الأهم من ذلك ، أن الأبحاث المتنوعة قد أبلغت عن تأثيرات مثبطة للكيرسيتين على تنفس الميتوكوندريا في دراسات نموذجية مختلفة28.

من المهم أن يكون لديك وصف مفصل لعملية التمثيل الغذائي للخميرة ، بما في ذلك الطاقة الحيوية ، لأن هذه الكائنات الحية الدقيقة يمكن أن تكون مسببات الأمراض الحيوانية ، بما في ذلك البشر ، وتستخدم أيضا كمصانع للخلايا أو في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل Tecnológico Nacional de México (Grant 20026.24-PD) الممنوحة ل LAMP.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2- مثبط الثينويل تري فلورو أسيتون (TTFA)مركبمثبط MerckT27006
3-كلوروفينيل هيدرازون كربونيل سيانيد (CCCP) MerckC2759مفك اقتران تنفس الميتوكوندريا   ؛  
الإيثانول المطلقMerck107017لإذابة الكيرسيتين   ؛
AgarMerckA1296YPD أجار تحضير
كبريتات الأمونيوم حبيبية (NH4) 2SO4JT Baker0792-05SC تحضير
مرق Antimycin A (AA) MerckA8674Inhibitor Complex III
aYSI5300A--------Monitor 
جهاز الطرد المركزيHermleZ 206 Aللخلايا الطرد المركزي
كلارك نوع الأكسجين--------القطب الكهربائي 
الكمبيوتر--------للحصول على البيانات 
فوسفات ثنائي البوتاسيوم K2HPO4جي تي بيكر3252-05SC تحضير مرق
الجلوكوزMerckG7021YPD تحضير
مرق الجلسرينMerckG5516مكملات متوسطة الركيزة 
لاكتاتميركL1250مكملات متوسطة الركيزة 
Oligomycin من Streptomyces diastatochromogenes< / em>MerckO4876تثبيط الميتوكوندريا ATP synthase
Orbital ShakerThermo FisherSHKE6000الأنابيب الزجاجية وحضانة اللقاح والقارورة ؛
الببتون من الكازين ، الهضم الأنزيميMerck82303YPD تحضير المرق
Quercetin  ؛337951 ميركلتقليل تنفس الميتوكوندريا
Uracil تحضير مرق MerckU0750SC
مستخلص الخميرةMerckY1625YPD تحضير مرق
الخميرة قاعدة نيتروجين بدون أحماض أمينية وكبريتات الأمونيومMerckY1251SC تحضير مرق
الخميرة الاصطناعية المكملات المتوسطة بدون تحضير مرق اليوراسيلMerckY1501SC
II

المراجع

  1. Jang, D. H., Seeger, S. C., Grady, M. E., Shofer, F. S., Eckmann, D. M. Mitochondrial dynamics and respiration within cells with increased open pore cytoskeletal meshes. Biol Open. 6 (12), 1831-1839 (2017).
  2. Duvezin-Caubet, S., Caron, M., Giraud, M. F., Velours, J., di Rago, J. P. The two rotor components of yeast mitochondrial ATP synthase are mechanically coupled by subunit delta. Proc Natl Acad Sci. 100 (23), 13235-13240 (2003).
  3. Vakifahmetoglu-Norberg, H., Ouchida, A. T., Norberg, E. The role of mitochondria in metabolism and cell death. Biochem Biophys Res Comm. 482 (3), 426-431 (2017).
  4. Matus-Ortega, M. G., et al. New complexes containing the internal alternative NADH dehydrogenase (Ndi1) in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 32 (10), 629-641 (2015).
  5. Avéret, N., Jobin, M. L., Devin, A., Rigoulet, M. Proton pumping complex I increases growth yield in Candida utilis. Biochim Biophys. 1847 (10), 1320-1326 (2015).
  6. Schägger, H. Respiratory chain supercomplexes. IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).
  7. Lasserre, J. P., et al. Yeast as a system for modeling mitochondrial disease mechanisms and discovering therapies. Dis Model Mech. 8 (6), 509-526 (2015).
  8. Turina, P., Samoray, D., Gräber, P. H+/ATP ratio of proton transport-coupled ATP synthesis and hydrolysis catalysed by CF0F1-liposomes. EMBO J. 22 (3), 418-426 (2003).
  9. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Prot. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  10. Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal muscles. Int J Mol Sci. 23 (4), 2252(2022).
  11. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
  12. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
  13. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. J Biol Chem. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  14. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen by Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  15. Granados-Arvizu, J. A., Canizal-García, M., Madrigal-Pérez, L. A., González-Hernández, J. C., Regalado-González, C. Inhibition of alternative respiration system of Scheffersomyces stipitis and effect on glucose or xylose fermentation. FEMS Yeast Res. 21 (2), foab005(2021).
  16. Carrillo-Garmendia, A., et al. Snf1p/Hxk2p/Mig1p pathway regulates hexose transporters transcript levels, affecting the exponential growth and mitochondrial respiration of Saccharomyces cerevisiae. Fungal Genet Biol. 161, 103701(2022).
  17. Maslanka, R., Zadrag-Tecza, R. Reproductive potential of yeast cells depends on overall action of interconnected changes in central carbon metabolism, cellular biosynthetic capacity, and proteostasis. Int J Mol Sci. 21 (19), 7313(2020).
  18. Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol. 102 (10), 4535-4548 (2018).
  19. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Rep. 21 (11), e50845(2020).
  20. Carrillo-Garmendia, A., et al. Cytotoxicity of quercetin is related to mitochondrial respiration impairment in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 39 (11-12), 617-628 (2022).
  21. Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. FEBS J. 281 (21), 4805-4814 (2014).
  22. Gancedo, J. M. Yeast carbon catabolite repression. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (2), 334-361 (1998).
  23. Katzmann, D. J., et al. Expression of an ATP-binding cassette transporter-encoding gene (YOR1) is required for oligomycin resistance in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 15 (12), 6875-6883 (1995).
  24. Madrigal-Perez, L. A., Nava, G. M., Gonzalez-Hernandez, J. C., Ramos-Gomez, M. Resveratrol increases glycolytic flux in Saccharomyces cerevisiae via a SNF1-dependet mechanism. J Bioenerr Biomemb. 47 (4), 331-336 (2015).
  25. Gueguen, N., et al. Resveratrol directly binds to mitochondrial complex I and increases oxidative stress in brain mitochondria of aged mice. PloS One. 10 (12), e0144290(2015).
  26. Lagoa, R., Graziani, I., Lopez-Sanchez, C., Garcia-Martinez, V., Gutierrez-Merino, C. Complex I and cytochrome c are molecular targets of flavonoids that inhibit hydrogen peroxide production by mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1807 (12), 1562-1572 (2011).
  27. de Oliveira, M. R., et al. Quercetin and the mitochondria: A mechanistic view. Biotechnol Adv. 34 (5), 532-549 (2016).
  28. Carrillo-Garmendia, A., Madrigal-Perez, L. A., Regalado-Gonzalez, C. The multifaceted role of quercetin derived from its mitochondrial mechanism. Mol Cell Biochem. , (2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ATP Saccharomyces Cerevisiae

مقالات ذات صلة