مقالة منهجية

النظام البيئي النموذجي القائم على الأغاروز لزراعة الميثانوتروف في تدرج مضاد للميثان والأكسجين

1.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67191

⸱

سبتمبر 6, 2024

 , 
1Department of Chemistry and the Henry Eyring Center for Cell and Genome Science, University of Utah

في هذه المقالة

ملخص

يتم وصف بروتوكول لإعداد نظام بيئي نموذجي بسيط يعيد إنشاء التدرج المضاد للميثان والأكسجين الموجود في الموائل الطبيعية للبكتيريا المؤكسدة للميثان الهوائية ، مما يتيح دراسة فسيولوجيتها في سياق يتم حله مكانيا. كما تم وصف التعديلات على المقايسات البيوكيميائية الشائعة للاستخدام مع النظام الإيكولوجي النموذجي القائم على الأغاروز.

الملخص

تلعب البكتيريا المؤكسدة للميثان الهوائية ، والمعروفة باسم الميثانوتروف ، أدوارا مهمة في الدورة البيوجيوكيميائية. تحتل الميثانوتروف مكانة بيئية محددة داخل تدرجات مضادة للميثان والأكسجين الموجودة في التربة والرواسب ، مما يؤثر على سلوكها على المستوى الفردي والمجتمعي. ومع ذلك ، فإن الطرق التقليدية لدراسة فسيولوجيا هذه الكائنات الحية الدقيقة المخففة لغازات الدفيئة غالبا ما تستخدم ثقافات العوالق المتجانسة ، والتي لا تمثل بدقة التدرجات المكانية والكيميائية الموجودة في البيئة. هذا يعيق فهم العلماء لكيفية تصرف هذه البكتيريا في الموقع. هنا ، يتم وصف نظام بيئي نموذجي بسيط وغير مكلف يسمى حقنة التدرج ، والذي يستخدم الأغاروز شبه الصلب لإعادة إنشاء التدرجات المضادة للميثان والأكسجين شديدة الانحدار المميزة للموائل الطبيعية للميثانوتروفس. تسمح المحقنة المتدرجة بزراعة سلالات ميثانوتروفية وإثراء اتحادات مختلطة مؤكسدة للميثان من عينات بيئية ، مما يكشف عن الأنماط الظاهرية المرئية فقط في هذا السياق الذي تم حله مكانيا. يبلغ هذا البروتوكول أيضا عن العديد من المقايسات الكيميائية الحيوية التي تم تعديلها لتكون متوافقة مع مصفوفة الأغاروز شبه الصلبة ، والتي قد تكون ذات قيمة للباحثين الذين يزرعون الكائنات الحية الدقيقة داخل الأنظمة الأخرى القائمة على الأغاروز.

المقدمة

غالبا ما تخدم الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش في واجهة نقص الأكسجين والأكسجين أدوارا بيئية مهمة1. أحد الأمثلة على ذلك هو البكتيريا المؤكسدة للميثان الهوائية (methanotrophs) ، والتي توجد في تدرجات مضادة للميثان والأكسجين في التربة والرواسب2. تمتلك هذه الكائنات الحية الدقيقة خصائص أيضية وفسيولوجية فريدة تمكنها من استغلال تدرجات الغاز الموجودة في بيئاتها وكانت موضوع بحث مستمر منذ عقود3،4،5. في الوقت الحالي ، تستند معظم الأبحاث المنشورة حول الميثانوتروف والمجتمعات المؤكسدة للميثان إلى العمل مع ثقافات العوالق المتجانسة التي غالبا ما تفشل في التقاط التدرجات المكانية والكيميائية المتأصلة في موائلها الميكروبية الطبيعية. يعيق هذا القيد فهمنا لعلم وظائف الأعضاء الميكروبية وقدرتنا على ربط المعلومات الجينومية بسمات النمط الظاهري.

يبلغ هذا البروتوكول عن نظام بيئي نموذجي بسيط قائم على المختبر يخلق ظروفا قابلة للتكرار لدراسة كل من الميثانوتروف المحددة ، مثل سلالة Methylomonas sp. LW13 ، والمجتمعات المؤكسدة للميثان مباشرة من عينات التربة البيئية. الأهم من ذلك ، أن الزراعة في حقنة التدرج تؤدي إلى أنماط ظاهرية خاصة بالتدرج المضاد غير موجودة في مزارع العوالقالمتجانسة 6 ، مما يسلط الضوء على قدرة النظام على الكشف عن جوانب جديدة من فسيولوجيا الميثانوتروف. مستوحاة من النظم الإيكولوجية النموذجيةالمنشورة سابقا 7،8،9 ، فإن حقنة التدرج هي طريقة مبسطة يمكن استخدامها لجمع المعلومات الكيميائية والجزيئية من الكائنات الحية الدقيقة المستزرعة باستخدام هذا النهج.

تم تعديل الإجراءات المبلغ عنها للتحليلات الجينية والكيميائية والجزيئية للعمل بشكل موثوق على الثقافات الميكروبية المزروعة داخل مصفوفة الأغاروز شبه الصلبة. قد تكون هذه الإجراءات مفيدة أيضا لتحليل البكتيريا المزروعة في أنظمة أخرى شبه صلبة قائمة على الأغاروز ، مثل تلك المستخدمة في فحوصات سباحة الأجار اللينة البكتيرية. قد يفتح تكييف هذه التحليلات مع السياقات التي تم حلها مكانيا طرقا جديدة لدراسة الحياة الميكروبية في بيئات أكثر صلة بالبيئة.

البروتوكول

يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. تحضير وقذف المحاقن المتدرجة

ملاحظة: يجب إجراء تحضير حقنة متدرجة باستخدام تقنية معقمة.

  1. استخدم عدة مستعمرات من Methylomonas sp. LW13 نمت حديثا على طبق لتلقيح 6 مل من وسط أملاح النترات المعدنية (NMS) في أنبوب زجاجي 18 مم × 150 مم. أغلق الأنبوب بسدادة مصل وختم تجعيد من الألومنيوم ، وأضف الميثان باستخدام حقنة إلى جو نهائي بنسبة 50٪ (v / v) من الميثان في الهواء. هز هذا النبات السائل العوالق عند 200 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى تعكر (حوالي يوم واحد).
  2. مرور الثقافات السائلة 1:10 إلى وسائل الإعلام الجديدة. الاستمرار في زراعة المزارع السائلة من الميثانوتروف إلى نمو الطور اللوغاريتمي (OD600 من ~ 0.5) والتكيف مع OD600 = 1.0.
  3. تحضير المحاقن عن طريق إزالة المكبس المصاحب والاحتفاظ بها في حاوية معقمة. قم بتوصيل طرف مرشح PTFE معقم بالمحقنة وضعه في رف أنبوب اختبار قياسي مع توجيه الطرف لأسفل.
  4. لكل حقنة سعة 10 مل ، امزج جيدا 1 مل من الخلايا من الخطوة 1.2 مع 5 مل من NMS و 4 مل من الأغاروز المنصهر (0.5٪ م / فولت ، مبرد إلى 55 درجة مئوية) في أنبوب مخروطي معقم. يمكن توسيع نطاق هذه الأحجام لملء محاقن متعددة بالتوازي.
  5. صب ببطء أو استخدم ماصة مصلية لإضافة الخليط إلى كل حقنة ، حتى علامة 8 مل. اترك الأغاروز داخل المحاقن ليتصلب (~ 15 دقيقة) ، ثم قم بتغطيته بسدادة بوتيل مطاطية معقمة مقاس 20 مم. ثبت السدادة بالمحقنة باستخدام شريط المختبر وقم بلصقها بمحتويات المحقنة.
  6. لإضافة الميثان إلى فراغ رأس المحقنة ، املأ حقنة كبيرة (60 مل) بنسبة 100٪ CH4 وأرفق طرف مرشح PTFE (0.2 ميكرومتر ، 25 مم) متصلا بإبرة معقمة (23 جم). اخترق السدادة المطاطية بالمحقنة الكبيرة واخترق إبرة معقمة ثانية من خلال السدادة لإنشاء مخرج غاز.
  7. اضغط على المكبس الموجود على المحقنة الكبيرة للسماح ل 20 مل من 100٪ CH4 بالتدفق عبر فراغ الرأس ، مع الحرص على إزالة إبرة المخرج عندما يكون هناك 1-2 مل من CH4 متبقي في المحقنة الكبيرة لمنع تدفق الأكسجين عبر إبرة المخرج.
  8. احتضان المحاقن عند 18 درجة مئوية ، مع تكرار الخطوتين 1.6 و 1.7 يوميا لتجديد الميثان.
  9. لبثق الأغاروز ، استبدل طرف مرشح PTFE بإبرة معقمة 23 جم واستبدل السدادة المطاطية بكباس المحقنة المرفق. اضغط ببطء على المكبس لتوزيع زيادات 1 مل في أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة معقمة سعة 1.5 مل.

2. تحديد تركيزات الغاز المتدرج المضاد

  1. قياس تدرج الأكسجين المذاب
    1. استخدم شفرة حلاقة لتقطيع عرض حقنة مملوءة بالأغاروز (محضرة باتباع الخطوات 1.1-1.8) بالقرب من مرشح PTFE. اربط المحقنة المفتوحة بمضخة حقنة موجهة نحو قطب كهربائي دقيق من نوع كلارك ، بحيث يواجه الطرف المفتوح طرف القطب.
    2. اضبط إعدادات مضخة المحقنة لتحريك المحقنة نحو القطب الدقيق بمعدل 1 مل / دقيقة (0.6 سم / دقيقة) ؛ ابدأ في تسجيل قياسات الأكسجين المذاب على برنامج Unisense Logger بمجرد أن تبدأ مضخة المحقنة في التحرك.
  2. قياس تدرج الميثان
    1. مباشرة قبل البثق ، استبدل طرف مرشح المحقنة بمحبس أحادي الاتجاه متصل بإبرة 23 جيجا ، وقم بتبديل السدادة المطاطية بسرعة بمكبس حقنة. أضف ثمانية قسامات أغاروز سعة 1 مل لفصل قوارير مفراة مفررغة 12 مل مانعة لتسرب الغاز واسمح للعينات بالتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
    2. قم بموازنة قوارير العينة مع الضغط الجوي عن طريق فتح القوارير أو ثقبها وإعادة إغلاقها على الفور أو ثقب الإبرة وإزالتها بسرعة. قم بحقن 500 ميكرولتر من مساحة رأس القارورة في كروماتوجراف الغاز مع الكشف عن تأين اللهب (GC-FID) باستخدام حقنة مانعة لتسرب الغاز. قم بإنشاء منحنى معايرة مشتق من معايير CH4 لتحويل مساحة الذروة (pA * min) إلى μmol / L.

3. عد الخلايا في حقنة التدرج

  1. قياس التدفق الخلوي
    1. قذف 1 مل من شرائح الأغاروز من المحاقن المتدرجة الملقحة إما بالنوع البري أو LW13 الطافر كما هو موضح في الخطوة 1.9. أيضا ، تحضير وقذف agarose من حقنة معقمة خالية من الخلايا كعنصر تحكم سلبي.
    2. أضف 0.75 مل من 0.85٪ (م / حجم) كلوريد الصوديوم في الماء إلى جميع عينات الأغاروز المبثوقة وتجانسها عن طريق الدوامة. علاوة على ذلك ، قم بتخفيف العينات 1:10 عن طريق نقل 100 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وإضافة 900 ميكرولتر من محلول الملح.
    3. أضف 3 ميكرولتر من خليط 1: 1 من بقع SYTO9 ويوديد البروبيديوم ، ثم احتضانها في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. لتحديد الخلايا لكل مل من الأغاروز ، صوتنة تعليق حبة عد المجهرية في حمام مائي لمدة 5 دقائق. ثم أضف 10 ميكرولتر من المعلق إلى كل عينة قبل تحليل قياس التدفق الخلوي.
    4. قم بتحليل العينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي 10,11 باستخدام المعلمات التالية: التشغيل على مضان أخضر ، ومعدل تدفق 10 ميكرولتر / ثانية ، ومعدل تحليل الجسيمات أقل من 1,000 جسيم / ثانية.
      1. قارن SSC مقابل. يرسم FITC النقطي بين عينات التحكم الخالية من الخلايا وعينات الأغاروز الملقحة لرسم بوابات جهد "الحدث البكتيري" التي تستبعد جزيئات الأغاروز الخلفية. بالإضافة إلى ذلك ، ارسم بوابات الجهد لخرز عد الكرة المجهرية ، والتي يجب أن تكون متسقة بين العينات.
    5. لتحديد تركيز الخلايا في كل قطعة من الأغاروز داخل محقنة التدرج ، استخدم المعادلة التالية ، مع ملاحظة أن عامل التخفيف للبروتوكول أعلاه هو 17.7275 وأن 10-6 مل هو حجم حبة مجهرية واحدة.
      figure-protocol-1
  2. عد وحدات تشكيل المستعمرة داخل المحقنة المتدرجة
    1. قم ببثق 1 مل من شرائح الأغاروز إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة ومعقمة سعة 2 مل ، وأضف 800 ميكرولتر من NMS ، ودوامة لمدة 10 ثوان للمساعدة في سحب الماصات.
    2. قم بإعداد صفيحة معقمة من 96 بئرا بإضافة 180 ميكرولتر من NMS إلى كل بئر. أضف 20 ميكرولتر من عينات الأغاروز المخففة إلى كل بئر في العمود الأول وماصة للخلط.
    3. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بتخفيف العينات بشكل متسلسل عشرة أضعاف عن طريق نقل 20 ميكرولتر من الصف الأول من الآبار إلى الصف الثاني من الآبار وسحب العينات 10 مرات للخلط. استمر في هذه العملية حتى الصف الأخير من اللوحة.
    4. لوحات شبكية مربعة تحتوي على NMS agar أو الوسائط المفضلة. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، حدد 5 ميكرولتر من عمود من لوحة 96 بئرا على لوحة أجار. اعتمادا على حجم لوحة أجار ، يمكن رصد أعمدة متعددة على نفس اللوحة.
    5. احتضان الألواح التي تقل عن 40٪ من الميثان في الهواء وتنمو عند 18 درجة مئوية. عد المستعمرات البكتيرية بعد 2-3 أيام وحدد وحدات تكوين المستعمرة لكل ملليلتر (CFU / mL).

4. مقايسات الكشف عن الجزيئات الحيوية

  1. مقايسة السكاريد
    1. قذف 1 مل من شرائح الأغاروز إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة سعة 2 مل واخلطها مع 1 مل من محلول Na2CO3 بنسبة 1٪ (م / حجم) في الماء. تسخين العينات إلى 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع دوامة كل 5-10 دقائق ، تليها الطرد المركزي عند 4000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
    2. اجمع المادة الطافية مع ثلاثة مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪ واحتضانها عند 20 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل (أو طوال الليل).
    3. جمع السكريات المترسبة بالإيثانول عن طريق الطرد المركزي عند 16100 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية وجفف الحبيبات بالهواء. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.
    4. قم بقياس محتوى السكاريد النسبي لكل قطعة أغاروز باستخدام مقايسة قياس لوني لحمض الفينول والكبريتيك12,13. امزج 50 ميكرولتر من المستخلص المعاد تعليقه مع 150 ميكرولتر من حمض الكبريتيك المركز و 30 ميكرولتر من 5٪ (v / v) فينول في الماء في صفيحة شفافة من 96 بئرا.
    5. قم بقياس الامتصاص عند 490 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة واحسب محتوى السكاريد النسبي لكل قطعة أغاروز كنسبة مئوية من امتصاص قطعة الأغاروز الأقرب إلى مرشح PTFE.
  2. مقايسة البروتين
    1. بثق الأغاروز إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة سعة 1.5 مل ونقل 100 ميكرولتر من كل حصة إلى أنابيب اختبار زجاجية.
    2. حدد تركيز البروتين الكلي باستخدام بروتوكول أنبوب الاختبار لمجموعة فحص البروتين BCA. إعداد معايير الألبومين BSA مع الأغاروز مقذوف من حقنة معقمة كمخفف.
  3. فحص الحمض النووي خارج الخلية
    1. بثق الأغاروز إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة سعة 1.5 مل ونقل 20 ميكرولتر من كل منها إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 0.2 مل.
    2. قم بقياس تركيزات الحمض النووي باستخدام مجموعة مقايسة 1x dsDNA عالية الحساسية المتاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

5. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت للاستخراج عن طريق الجمع بين ما يلي في 800 مل من الماء الخالي من RNase: 2.0 جم من CTAB ، و 2.0 جم من البولي فينيل بيروليدون (PVP 40) ، و 81.8 جم من كلوريد الصوديوم ، و 100 مللي مول من Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) ، و 20 مللي مول من EDTA. رفع مستوى الصوت إلى 1 لتر والأوتوكلاف ؛ يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  2. قلص المخزن المؤقت للاستخراج المحضر وأضف 1٪ (v / v) التركيز النهائي لبيتا ميركابتوإيثانول قبل الاستخدام مباشرة. قم بتسخين المخزن المؤقت إلى 65 درجة مئوية باستخدام حمام مائي أو كتلة حرارية.
  3. قسم كل حقنة متدرجة إلى أقسام سعة 1 مل عن طريق بثق الأغاروز إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة خالية من RNase سعة 2 مل باتباع الإجراء الوارد في الخطوة 1.9.
  4. عينات من أجهزة الطرد المركزي عند 21000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 15 دقيقة وتخلص من المادة الطافية ، مع الاحتفاظ بالعينات على الجليد.
  5. أضف 600 ميكرولتر من محلول الاستخراج المسخن مسبقا إلى كل 1 مل حبيبي من الأغاروز المبثوق. أضف ما يقرب من 200 ميكرولتر من حبات الزركونيا / السيليكا وقم بتجانس العينات لمدة 3 دقائق عند 30 هرتز / ثانية باستخدام مضرب حبة ، مع التوقف مؤقتا في منتصف الطريق لوضع العينات على الثلج لمدة 2 دقيقة.
  6. أجهزة الطرد المركزي العينات في 15000 × غرام ، 4 °C ، لمدة 2 دقيقة للحد من الرغوة. استخراج العينات عن طريق إضافة 600 ميكرولتر من الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل (24: 1) إلى الأنابيب والدوامة لمدة 10 ثوان.
  7. أجهزة الطرد المركزي العينات عند 15000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 8 دقائق. انقل المرحلة المائية العليا بعناية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد خال من RNase وأضف 600 ميكرولتر من الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل (24: 1) إلى المرحلة العليا المنقولة والدوامة لمدة 10 ثوان.
  8. قم بطرد العينات عند 15000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 8 دقائق ونقل المرحلة المائية العليا الجديدة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد خال من RNase. أضف كمية متساوية من الأيزوبروبانول إلى المرحلة العليا المنقولة واحتضان العينات لعدة ساعات عند -20 درجة مئوية. اختياري: يمكن ترك العينات عند -20 درجة مئوية طوال الليل.
  9. جمع الرواسب المحتوية على الحمض النووي الريبي عن طريق عينات الطرد المركزي عند 16100 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
  10. تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات ب 300 ميكرولتر من الإيثانول البارد 75٪ (v / v) المصنوع من الماء الخالي من RNase وأجهزة الطرد المركزي عند 16100 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 5 دقائق.
  11. اغسل الكريات مرة أخرى باتباع الخطوة 5.10.
  12. بعد إزالة طاف الإيثانول, اترك الكريات تجف في الهواء لمدة 15 دقيقة. قم بإذابة الكريات في 100 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
  13. عالج العينات باستخدام DNase I عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  14. قم بتعطيل DNase I بإضافة 300 ميكرولتر من حمض الفينول: الكلوروفورم: IAA (125:24: 1 ، الرقم الهيدروجيني 4.5). دوامة لمدة 10 ثوان واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  15. جهاز طرد مركزي عند 16100 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 5 دقائق والحفاظ على المرحلة المائية العليا عن طريق نقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد خال من RNase.
  16. اختياري: قم بتجميع الحمض النووي الريبي من نفس الجزء عبر جميع المحاقن المكررة عن طريق الجمع بين المراحل العليا في أنبوب مخروطي.
  17. أضف 1 حجم من الأيزوبروبانول يساوي حجم المرحلة العليا المحتوية على الحمض النووي الريبي وأضف 7.5 M من LiCl إلى تركيز نهائي قدره 0.8 M ، مع عكس عدة مرات للخلط.
  18. احتضان العينات لعدة ساعات عند -20 درجة مئوية. اختياري: يمكن ترك العينات عند -20 درجة مئوية طوال الليل.
  19. أجهزة الطرد المركزي العينات عند 16100 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 15 دقيقة وتخلص بعناية من المادة الطافية. اغسل الحبيبات المحتوية على الحمض النووي الريبي مرتين عن طريق إضافة الإيثانول البارد بنسبة 70٪ (v / v) في الماء الخالي من RNase ، والطرد المركزي عند 16100 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 5 دقائق ، وإزالة المادة الطافية.
  20. اترك الكريات تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق وأعد تعليقها في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. قم بتخزين عينات الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية.
  21. اختياري ، اعتمادا على جودة الحمض النووي الريبي: يمكن إعادة تنقية العينات باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي لإزالة الحمض النووي الريبي الصغير (<200 nt).
  22. للتأكد من أن عينات الحمض النووي الريبي لا تحتوي على الحمض النووي المتبقي ، استخدم 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المنقى كقالب لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات الجينات البكتيرية العالمية 16S rRNA 27F / 1492R. قم بتضمين تفاعلين إضافيين لتفاعل البوليميراز المتسلسل يحتويان على 1 ميكرولتر من الحمض النووي الجينومي (المخفف 1: 100) أو الماء الخالي من النيوكلياز ليكون بمثابة عناصر تحكم إيجابية وسلبية ، على التوالي.
  23. قم بتشغيل المنتجات على جل 1٪ من الأغاروز TBE باستخدام هلام الكهربائي14.
    ملاحظة: يجب أن تؤدي عينات الحمض النووي الريبي التي لا تحتوي على تلوث بالحمض النووي إلى عدم وجود شريط في ممر العينة. إذا أظهرت عينات الحمض النووي الريبي تلوثا بالحمض النووي ، فأعد معالجة العينات بدءا من الخطوة 5.13. الحمض النووي الريبي جاهز للتحليل النهائي ويمكن تحليله اختياريا لتحديد سلامته عن طريق قياس رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN).

النتائج

هنا ، تم استخدام النظام البيئي لنموذج حقنة متدرجة لزراعة سلالة واحدة (سلالة Methylomonas sp. methanotroph LW13) (الشكل 1A) 6 ، ولكن يمكن استخدامه أيضا لإثراء مجتمع ميكروبي مؤكسد بالميثان عن طريق التلقيح المباشر للتربة (الشكل 1 ب). تم التحقق من وجود تدرج مضاد للميثان والأكسجين عن طريق قياس تركيز الميثان والأكسجين عبر المحاقن الخالية من الخلايا والملقحة (الشكل 1C). بالنسبة للمحاقن المتدرجة الملقحة ب LW13 ، تشكل تدرج مضاد في غضون يوم واحد من شطف المحقنة ، والتي انحدرت على مدار ثلاثة أيام من الحضانة. خلال نفس الفترة الزمنية ، تشكل شريط أفقي على نفس العمق الذي وصلت فيه ركيزتا الغاز إلى أدنى تركيزاتهما (الشكل 1 أ). أظهر التدرج الحاد للغاز واستنفاد الميثان والأكسجين بعد عمق النطاق الأفقي أن LW13 استقلاب الميثان هوائيا وأنتج نمطا ظاهريا لم يلاحظ في ثقافة العوالق المتجانسة. يتم إنتاج هذا النمط الظاهري أيضا بواسطة بكتيريا ميثانوتروفية أخرى معزولة من نفس العينة البيئية مثل LW136. يشير الاختلاف المعتمد على الإجهاد في توقيت وعمق تطور النطاق الأفقي بين سلالات الميثانوتروم المختلفة إلى أن النطاق الأفقي تأثر بالسلوك المحدد لكل ميكروب عند زراعته في سياق تم حله مكانيا6.

تم قياس عدد الخلايا في سدادة الأغاروز بأكملها باستخدام قياس التدفق الخلوي وعدد المستعمرات (CFU / mL) (الشكل 2A). تم استخدام هذه الطريقة لمقارنة توزيع الخلايا وبقاء LW13 من النوع البري إلى سلالة متحولة من LW13 تحتوي على حذف في جين fucose 4-O-acetyltransferase (OAT) ، والذي ثبت سابقا أنه يؤثر على تطور النطاق الأفقي6. كان لطافر ΔOAT ل LW13 نمو إجمالي أقل في المحقنة المتدرجة على مدى 6 أيام مقارنة بالنوع البري ، وهو تأثير لم يلاحظ في مزارع العوالق المتجانسة من نفس السلالات6. لم تشكل السلالة الطافرة نفس النطاق الأفقي المميز مثل النوع البري LW13 عند استزراعها في المحقنة المتدرجة (الشكل 2B). تمت استعادة أعداد الخلايا ومظهر الشريط الأفقي إلى مستويات مماثلة للنوع البري عند التكامل الجيني في السلالة الطافرة. توضح هذه النتائج أنه يمكن استخدام حقنة التدرج لربط الجينات بأنماط ظاهرية محددة موجودة فقط في التدرج المضاد للميثان والأكسجين.

تم تكييف مجموعة متنوعة من التقنيات الجينية والكيميائية والجزيئية للاستخدام مع البكتيريا المزروعة داخل مصفوفة أغاروز شبه صلبة. يمكن استخدام النظام البيئي لنموذج المحاقن المتدرجة بسهولة لمقايسات القياس الكمي الجزيئي الحيوي القياسية مع إدراج الأغاروز غير الملقح كعنصر تحكم سلبي. تم قياس تركيز ثلاثة جزيئات حيوية مختلفة توجد عادة في المواد البوليمرية خارج الخلية والأغشية الحيوية: السكريات والبروتين والحمض النووي خارج الخلية15 (الشكل 3). في شرائح المحاقن الملقحة ب LW13 ، كان الشريط الأفقي يحتوي على عديد السكاريد أكثر بكثير من الأجزاء الأخرى ، مع عدم وجود زيادة كبيرة في البروتين أو الحمض النووي خارج الخلية.

تم استخدام RNA-seq لقياس الاختلافات النسخية في LW13 التي تنمو على أعماق مختلفة من المحقنة. تم تحقيق استخراج قوي للحمض النووي الريبي باستخدام مخزن مؤقت للاستخراج قائم على CTAB متبوعا بالفينول التقليدي: استخراج الكلوروفورم وخطوات الترسيب. تم استخدام نتائج تحليل RNA-seq لاحقا لتحديد الجينات المتورطة في إنتاج شريط السكاريد الأفقي. تشير هذه النتائج إلى أن الأغاروز شبه الصلب الضروري لإنشاء نظام إيكولوجي نموذجي تم حله مكانيا لا يمنع إجراء المزيد من التحليلات الكيميائية الحيوية التي يتم تخصيصها عموما للعوالق والثقافات القائمة على الصفائح.

figure-results-1
الشكل 1: النظام البيئي لنموذج المحاقن المتدرجة. (أ) المحقنة المتدرجة الملقحة بميثيل أوموناس الميثيل لوموناس الميثيل LW13 . يتطور شريط أفقي مميز (رأس سهم) في غضون يومين من غسل المحقنة بغاز الميثان بنسبة 100٪. (ب) صور مقربة لمحاقن متدرجة ملقحة بالتربة المخففة 10-1 و 10-4 والمحتضنة لمدة أسبوعين. أدت المحاقن المتدرجة التي تحتوي على تربة مخففة أكثر إلى مستعمرات كروية في جميع أنحاء الأغاروز ، في حين أدى لقاح التربة الأكثر تركيزا إلى شريط مميز. (ج) توصيف التدرج المضاد للميثان والأكسجين في المحاقن المتدرجة والمعقمة LW13 بعد ثلاثة أيام من الحضانة. يشير الشريط الرمادي إلى نطاق الأعماق التي يقع فيها شريط السكاريد ؛ تظهر البيانات متوسط ± SD لثلاث تجارب مستقلة مع ثلاث نسخ مكررة تقنية لكل منها. () عدلت اللوحتان (ألف) و (جيم) من بيلز وآخرين 6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: القياس الكمي للنوع البري LW13 والطافر بعد الحضانة في المحقنة المتدرجة. (أ) العدد الإجمالي لخلايا LW13 لكل مل من الأغاروز المبثوق المستعاد من المحاقن المتدرجة في اليوم 0 واليوم 7 مقاسا بقياس التدفق الخلوي. يحتوي ΔOAT على حذف جين fucose 4-O-acetyltransferase ، والذي وجد أنه يتم التعبير عنه بشكل كبير في الخلايا الموجودة في عمق شريط السكاريد. يحتوي ΔOAT + OAT على جين الشوفان الذي تم إدخاله في موقع بعيد من جينوم ΔOAT. * ، يختلف اختلافا كبيرا ( اختبار t غير المتجانس ثنائي الذيل ، α = 0.05) ؛ N.S. ، لا يختلف اختلافا كبيرا. تظهر البيانات متوسط ± SD لثلاث تجارب مستقلة مع نسختين تقنيتين لكل منهما. (ب) تطور الشريط الأفقي في المحاقن المتدرجة الملقحة بالنوع البري LW13 أو ΔOAT أو ΔOAT + OAT بعد سبعة أيام من الحضانة. تم تعديل هذا الرقم من Beals et al.6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: القياس الكمي للجزيئات الحيوية عند الأعماق المتزايدة للمحقنة المتدرجة. محتوى السكاريد النسبي (٪) ، تركيز البروتين (ميكروغرام / مل) ، وتركيز الحمض النووي (نانوغرام / ميكرولتر) في ثمانية أقسام من المحاقن المتدرجة الملقحة LW13 المحتضنة لمدة سبعة أيام (الدوائر المملوءة ؛ تظهر الدوائر المفتوحة قيما من المحاقن المتدرجة المعقمة). تظهر البيانات متوسط ± SD لثلاث تجارب مستقلة مع ثلاث نسخ مكررة تقنية لكل منها. بالنسبة لمحتوى عديد السكاريد النسبي ، يشير * إلى اختلاف كبير عن التحكم المعقم عند العمق المكافئ ( اختبار t غير المتجانس ثنائي الطرف ، α = 0.05). بالنسبة لتركيزات البروتين والحمض النووي ، * يشير إلى اختلاف كبير عن القسم الذي يحتوي على النطاق الأفقي (ANOVA أحادي الاتجاه مع تحليل Tukey-Kramer اللاحق) ؛ N.S. ، ليست كبيرة. تم تعديل الرقم من Beals et al.6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

طرق زراعة الميثانوتروف
تمت دراسة Methanotrophs لعقود من الزمن لفهم فسيولوجيتها ، وسلوكها الفردي والمجتمعي في البيئة الطبيعية ، وقدرتها على التخفيف من الميثان في التطبيقات الصناعية. خلال هذه الدراسات ، تم إجراء الكثير من الأبحاث التي أجريت باستخدام ثقافات العوالق المتجانسة حيث يتم فقدان السياق المكاني. تم تطوير النظام البيئي لنموذج الحقن المتدرج لتكرار خاصية التدرج المضاد للميثان والأكسجين لموائل الميثانوتروف الطبيعية في المختبر ، مما يسمح للباحثين بدراسة نمو الميثانوتروف في بيئة تشبه إلى حد كبير المكان الذي تطورت فيه هذه الكائنات الحية.

على مدى السنوات ال 30 الماضية ، أعاد الباحثون إنشاء تدرج عداد الميثان والأكسجين في المختبر باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق ، غالبا بهدف أساسي هو عزل وتصنيف الميثانوتروف من اتحادات مؤكسدة الميثان المختلطة. يمكن تقسيم هذه الطرق إلى طريقتين ، كلاهما ينطوي على استخدام غرف متعارضة من الميثان والأكسجين: تعليق التربة غير المضطربة نسبيا على غشاء16،17،18 ، أو تلقيح كميات صغيرة من التربة أو الثقافة البكتيرية النقية في وسط صغير في الأغاروز7،8،19. تجمع طريقة الحقن المتدرجة الموصوفة هنا بين النهج القائم على المحاقن ل Dedysh وزملاء العمل9 مع زراعة الميثانوتروف من العمل السابق من قبل Amaral و Knowles8 و Schink وزملاء العمل7. وضعت هذه الطرق الأخيرة الأساس لزراعة الميثانوتروف في تدرج مضاد للميثان والأكسجين واستخدمت تدفقا مستمرا من الميثان والأكسجين على جانبي سدادة الأغاروز. في حين أن هذا يوفر بيئة أكثر ثباتا ، فإن هذا النهج يضيف تعقيدا إلى الإعداد التجريبي ويتطلب مصادر غاز مخصصة.

في المقابل ، تعتمد المحقنة المتدرجة الموصوفة هنا على التنظيف اليومي للمحقنة لتوفير الميثان الطازج ، وهي عملية تستغرق أقل من دقيقة لكل حقنة ، مع توفير الوصول المستمر إلى الأكسجين الجوي من خلال طرف مرشح PTFE معقم. قد تمكن هذه الطريقة الأبسط من اعتماد هذا النظام البيئي النموذجي على نطاق أوسع لدراسة الميثانوتروف في سياق يتم حله مكانيا. يفصل البروتوكول الموصوف أيضا التحليلات الكيميائية والجزيئية التي يمكن إجراؤها مباشرة على البكتيريا المحتضنة في الأغاروز شبه الصلب. نتيجة لذلك ، لا تحتاج البكتيريا إلى استئصالها واستزراعها خارج مصفوفة الأغاروز قبل التحليل ، مما يحافظ على ظروف تدرج الغاز في وقت أخذ العينات.

ملاحظات على البروتوكول
نظرا لأن البكتيريا مستزرعة داخل حقنة حجمية من مادة البولي بروبيلين ، يمكن للباحثين استخدام مكبس المحقنة المصاحب لتقسيم سدادة الأغاروز بدقة وتكرار مع الحفاظ على السلامة المكانية لمصفوفة الأغاروز التي لا تزال موجودة في برميل المحقنة. بدون التصميم المحكم للهواء المتأصل في المحقنة ، ستحتاج سدادات الأغاروز إلى إزالتها من برميل المحقنة وتقطيعها إلى شرائح ، مما يؤدي إلى عدم اليقين في حجم شرائح الأغاروز ، وإطلاق كميات غير قابلة للقياس الكمي من الميثان والأكسجين المذاب في الغلاف الجوي. قذف الأغاروز من خلال إبرة معقمة يبسط تحضير العينة ويساعد على تجانس الأجزاء المبثوقة دون قص الخلايا البكتيرية. تسمح هذه الطريقة للباحثين بتقسيم كل حقنة متدرجة ملقحة إلى ثمانية أجزاء من الأغاروز على الأقل وإجراء تجارب موازية على الميثانو تروفس الذي ينمو في مجموعة من تركيزات الأكسجين والميثان.

في تحسين استخراج الحمض النووي الريبي من محتوى السكاريد العالي ، وجد أن الكواشف الشائعة مثل ثيوسيانات جوانيديوم وتريزول أدت إلى هلام الأغاروز ، الذي أعاق أعمدة التنقية وقاوم التكوير عن طريق الطرد المركزي. كانت غلة الحمض النووي الريبي المنخفضة وجودتها مصدر قلق أيضا لأن جزيئات السكاريد الكبيرة يمكن أن تحبس الأحماض النووية بينما يمكن أن تترسب السكريات الصغيرة مع الحمض النوويالريبي 20. بدلا من ذلك ، تم استخدام مخزن استخراج يحتوي على الفاعل بالسطح الكاتيوني CTAB ، والذي يذيب الأغشية الدهنية20 ؛ وكلوريد الصوديوم، الذي يمنع تكون معقدات الحمض النووي CTAB، ويسمح للأحماض النووية بالترسب، لكنه يحتفظ بمتعددات السكريات في المحلول21. تم تغيير طبيعة RNases عن طريق إدراج β-mercaptoethanol في المخزن المؤقت CTAB. بالنسبة لتجربة RNA-seq ، تم تضمين خطوة تنقية اختيارية قائمة على العمود لاستبعاد الحمض النووي الريبي الصغير (<200 نيوكليوتيدات) قبل إعداد المكتبة.

القيود والاعتبارات
في حين أن NMS والأغاروز يوفران مصفوفة متوسطة دنيا لزراعة البكتيريا الميتانوتروفية ، فإن المحقنة المتدرجة كما هو موضح هنا تعيد فقط إنشاء التدرجات الغازية للموائل الميتانوتروفية ، ولكن ليس التدرجات الأخرى الموجودة في تلك البيئات مثل المعادن النزرة22 أو الملوحة23 أو العناصر الغذائية الأخرى24. من الممكن إضافة هذه التدرجات إلى نظام مماثل في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حجم المحقنة (8 مل من الأغاروز) يحد من الكتلة الحيوية الكلية لكل حقنة ، مما يستلزم تجميع محاقن متعددة لبعض التحليلات (كما هو موضح في الخطوة 5.16). على الرغم من أن المحقنة المحمولة تقسم الأغاروز بشكل ملائم إلى حصص 1 مل ، إلا أن حجمها يحد أيضا من مساحة الرأس إلى حوالي 4 مل ، مما يحد من كمية الميثان السائبة التي يمكن تخزينها للميكروبات المزروعة. نظرا لأن معدلات أكسدة الميثان تتناسب مع معدل نمو الميثانوتروف الهوائية25 ، يوصى بالتجديد اليومي لميثان فراغ الرأس. في حين أن هذا قد لا يزال يؤدي إلى فترات من الحد من الميثان ، فإن هذه الفترات قابلة للتكرار في المختبر ومن المحتمل أن تحاكي المواقف الموجودة في البيئات الطبيعية.

أثناء استخدام المحقنة المتدرجة ، فإن وجود السكريات الأغاروز يستلزم بعض التعديلات على المقايسات المستخدمة لتحليل الميثانوتروف المزروع في هذا النظام. على سبيل المثال ، تحتاج البروتوكولات التي تتطلب نقل كميات صغيرة من الأغاروز المبثوق إلى خطوات تخفيف متعددة مع تجانس شامل بين كل تخفيف لسحب دقيق للسحب. بالإضافة إلى ذلك ، في حالات مثل مقايسة السكريات حيث تتفاعل السكريات المتأصلة في مصفوفة الأغاروز مع كاشف حمض الكبريتيك والفينول ، فإن إدراج عنصر تحكم سلبي معقم خال من الخلايا من الأغاروز أمر ضروري. لم تنجح المحاولات المبكرة للتخفيف من هذه المشكلات من خلال تضمين إنزيم الأغاروز المتحلل بالماء β-agarase وقدمت متغيرا غير معروف للتجارب البيولوجية. يمكن استخدام العديد من النسخ المتماثلة التقنية ، والتخفيف الشامل ، والتجانس ، وإدراج الضوابط للتخفيف من معظم التحديات الكامنة في مصفوفة الأغاروز.

التطبيقات
بالإضافة إلى دراسات السلالة الواحدة ، يمكن أن تدعم حقنة التدرج الزراعة المشتركة لسلالات متعددة ، ويمكن استخدام التربة كلقاح بدلا من الثقافة البكتيرية النقية. التصميم البسيط للنظام البيئي لنموذج حقنة التدرج قابل لثقافة أنواع أخرى من الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في الواجهة بين بيئات نقص الأكسجين والأكسجة باستخدام ركيزة غازية مختلفة ، مثل H2 أو CO ، بدلا من الميثان. باختصار ، يسمح استخدام نظام بيئي نموذجي بسيط تم حله مكانيا للباحثين بدراسة علم وظائف الأعضاء الفريد والتكيفات الأيضية للكائنات الحية الدقيقة غير المؤكسجة ويمكن استخدامها لربط الجينات بالأنماط الظاهرية للكائنات الحية.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال تمويل بدء التشغيل من قسم الكيمياء بجامعة يوتا وجائزة NSF CAREER #2339190. نشكر أعضاء مختبر بوري على المناقشات المفيدة. نشكر راشيل هوريل (جامعة يوتا) على التوجيه الأولي لتجربة قياس التدفق الخلوي.

المواد

2< / sub >-EDTA ، 2.0 جم / لتر FeSO4< / sub> & middot ؛
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1٪ معيار تحليلي لمزيج الغازSupelco225611٪ كل مكون من النيتروجين: أول أكسيد الكربون وثاني أكسيد الكربون والهيدروجين والميثان والأكسجين
100٪ غازالهواءME CP300نقية كيميائيا
15 جزء في المليون معيار تحليلي لمزيج الغازSupelco23470-U15 جزء في المليون كل مكون في النيتروجين: الميثان والإيثان والإيثيلين والأسيتيلين والبروبان والبروبيلين والبروبين والن-بوتان
1x أملاح معدنية نترات انظر أرقام CAS أدناهقم بإذابة ما يلي في ماء Mili-Q والأوتوكلاف:  0.2 جم / لتر MgSO4< / sub>· 7H2O, 0.2 g/L CaCl2· 6H2O ، 1 جم / لتر KNO3< / sub> ، و 30 & مو ؛ M LaCl3. قبل الاستخدام ، أضف العناصر النزرة إلى تركيز نهائي 1X ومخزن الفوسفات (الرقم الهيدروجيني 6.8) إلى التركيز النهائي البالغ 5.8 ملليمتر.
23 G إبرةBD Biosciences305194المعقمة ، Luer-Lok
500xانظر أرقام CAS أدناه 7H2O, 0.8 g/L ZnSO4· 7H2O, 0.03 g/L MnCl2& middot; 4H2O, 0.03 g/L H3BO3, 0.2 g/L CoCl2· 6H2< / sub>O ، 0.6 جم / لتر CuCl 2 < / sub> & middot ؛ 2H2O, 0.02 g/L NiCl2· 6H2O ، و 0.05 جم / لتر Na2< / sub>MoO & middot ؛ 2ح2O.
96 لوحة البئرCELLTREAT229596
حمض معقم الفينول: الكلوروفورم: IAA (125: 24: 1)InvitrogenAM9720& nbsp ؛ درجة الحموضة 4.5
AgaroseFisher ScientificBP160درجة البيولوجيا الجزيئية ، CAS 9012-36-6
أختام تجعيد الألومنيومVWR30618-46020 مم
مضرب حبةQiagen9003240TissueLyser III
سدادة مطاطية بوتيلChemglass Life Science50-143-85420 مم ، أزرق
الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (24: 1)Millipore Sigma25666BioUltra ، للبيولوجيا الجزيئية
كلارك من النوع O 2< / sub > القطب الكهربائي الدقيقUnisenseOX-500
DEPC المياه المعالجةThermo ScientificR0601
DNase I (Ambion)InvitrogenAM2222
مقياس التدفقالخلوي Beckman CoulterCytoFLEX
كروماتوجراف الغاز (تأين اللهب الكشف)Agilent6890N
حقنة تحليلية محكمة الغلقHamilton812201750 TLL
إبرة حقنة تحليلية محكمة الغلقهاميلتون7729-0722 جم ، إبرة محور معدنية ، 2 بوصة ، نمط نقطة 5
قوارير محكمة الغلق للغازLabco938Wقارورة Exetainer: 12 مل ، أنابيب
ثقافة زجاجيةBellco Glass2048-0015018 ×
محلول هطول الأمطار LiCl 150 مم (7.5 م)InvitrogenAM9480
مدخل VWR MFLX30600 أحادي الاتجاهVWR: أنثى لوير ، منفذ المخرج: طبق بتري بتر بقفل لورير
ذكر ، FB0875711A فيشرساينتفيك100 × 100 مم
عازلة الفوسفات ، 0.2 متر (درجة الحموضة 6.8)انظر أرقام CAS أدناهقم بإذابة ما يلي في ماء Milli-Q والأوتوكلاف: 12.24 جم / لتر KH< 2 / sub>PO 4< / sub> ، 26.29 جم / لتر Na 2< / sub>HPO4< / sub> & middot ؛ 7H2O
بيرس BCA بروتين الفحص كيت Thermo Scientific23225
PTFE طرف مرشح حقنةThermo Scientific03-050-469مسعور ، حجم المسام: 0.2 & م ، القطر: 4 مم
كيوبت 1x dsDNA مجموعة فحص عالية الحساسية   ؛InvitrogenQ33230
Qubit 4 مقياس الفلورInvitrogenQ33238
RNA Clean & المكثف -5Zymo ResearchR1013
سدادة مصلفيشر Scientific03-340-30220 مم
حقنةBD Biosciences302995Luer-Lock ، 10 مل ، تستخدم مرة واحدة ،
مضخة حقنةمعقمة New Era Pump Systems Inc.1000-USNE-1000 قناة واحدة قابلة للبرمجة
SYTO9 ، يوديد البروبيديوم ، الكريات المجهريةInvitrogenL34856LIVE / DEAD BacLight مجموعة الجدوى البكتيرية
زركونيا / حبات السيليكامنتجات BioSpec11079101z0.1 مم
القطر <قوي > الكواشف الكيميائية< قوي >< قوي > رقم CAS < / قوي>
CaCl2· 6H2O7774-34-7
CoCl2· 6H2< / sub>O7791-13-1
حامض الكبريتيك المركز7664-93-9
CTAB ، بروميد السيتريمونيوم57-09-0
CuCl 2< / sub> & middot ؛ 2H2O10125-13-0
الإيثانول64-17-5   
FeSO4· 7ح2O7782-63-0
H3BO3>10043-35-3
Isopropanol69-63-0
KH2PO47778-77-0
KNO37757-79-1
LaCl310099-58-8
MgSO4· 7H2O10034-99-8
MnCl2· 4H2O13446-34-9
Na2CO3, كربونات الصوديوم497-19-8
Na2-EDTA139-33-3
Na2HPO4 · 7H2O7782-85-6
Na2MoO· 2H2O10102-40-6
كلوريد الصوديوم ، كلوريد الصوديوم7647-14-5
NiCl2< / sub>& middot ؛ 6H2< / sub>O7791-20-0
الفينول (محلول 90٪ في الماء)108-95-2
PVP40 ، بولي فينيل بيروليدون9003-39-8
تريس-حمض الهيدروكلوريك1185-53-1
ZnSO4< / sub> & middot ؛ 7H2O7446-20-0
&-Mercaptoethanol60-24-2
درجة العناصر النزرة قم بإذابة ما يلي في ماء Milli-Q: 1.0 جم / لتر Na مستديرة القاع منفذ مربع

المراجع

  1. Brune, A., Frenzel, P., Cypionka, H. Life at the oxic-anoxic interface: microbial activities and adaptations. FEMS Microbiol Rev. 24 (5), 691-710 (2000).
  2. Auman, A. J., Stolyar, S., Costello, A. M., Lidstrom, M. E. Molecular characterization of methanotrophic isolates from freshwater lake sediment. Appl Environ Microbiol. 66 (12), 5259-5266 (2000).
  3. Whittenbury, R., Phillips, K. C., Wilkinson, J. F. Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria. J Gen Microbiol. 61 (2), 205-218 (1970).
  4. Koo, C., Rosenzweig, A. Biochemistry of aerobic biological methane oxidation. Chem Soc Rev. 50 (5), 3424-3436 (2021).
  5. Strong, P. J., Xie, S., Clarke, W. P. Methane as a resource: Can the methanotrophs add value. Environ Sci Technol. 49 (7), 4001-4018 (2015).
  6. Beals, D. G., Puri, A. W. Linking methanotroph phenotypes to genotypes using a simple spatially resolved model ecosystem. ISME J. 18 (1), wrae060(2024).
  7. Bussmann, I., Rahalkar, M., Schink, B. Cultivation of methanotrophic bacteria in opposing gradients of methane and oxygen. FEMS Microbiol. Ecol. 56 (3), 331-344 (2006).
  8. Amaral, J. A., Knowles, R. Growth of methanotrophs in methane and oxygen counter gradients. FEMS Microbiol Lett. 126 (3), 215-220 (1995).
  9. Danilova, O. V., et al. A new cell morphotype among methane oxidizers: a spiral-shaped obligately microaerophilic methanotroph from northern low-oxygen environments. ISME J. 10 (11), 2734-2743 (2016).
  10. Ou, F., McGoverin, C., Swift, S., Vanholsbeeck, F. Absolute bacterial cell enumeration using flow cytometry. J Appl Microbiol. 123 (2), 464-477 (2017).
  11. Krause, S. M. B., et al. Lanthanide-dependent cross-feeding of methane-derived carbon is linked by microbial community interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (2), 358-363 (2017).
  12. Masuko, T., et al. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Anal Biochem. 339 (1), 69-72 (2005).
  13. Felz, S., Al-Zuhairy, S., Aarstad, O. A., van Loosdrecht, M. C. M., Lin, Y. M. Extraction of structural extracellular polymeric substances from aerobic granular sludge. J Vis Exp. (115), e54534(2016).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923(2012).
  15. Costa, O. Y. A., Raaijmakers, J. M., Kuramae, E. E. Microbial extracellular polymeric substances: Ecological function and impact on soil aggregation. Front Microbiol. 9, 1636(2018).
  16. Sinke, A. J. C., Cottaar, F. H. M., Buis, K., Keizer, P. Methane oxidation by methanotrophs and its effects on the phosphate flux over the sediment-water interface in a eutrophic lake. Microb Ecol. 24 (3), 259-269 (1992).
  17. Murase, J., Frenzel, P. A methane-driven microbial food web in a wetland rice soil. Environ Microbiol. 9 (12), 3025-3034 (2007).
  18. Reim, A., Lüke, C., Krause, S., Pratscher, J., Frenzel, P. One millimetre makes the difference: High-resolution analysis of methane-oxidizing bacteria and their specific activity at the oxic-anoxic interface in a flooded paddy soil. ISME J. 6 (11), 2128-2139 (2012).
  19. Rahalkar, M., Bussmann, I., Schink, B. Methylosoma difficile gen. nov., sp. nov., a novel methanotroph enriched by gradient cultivation from littoral sediment of Lake Constance. Int J Syst Evol Microbiol. 57 (5), 1073-1080 (2007).
  20. Wang, L., Stegemann, J. P. Extraction of high-quality RNA from polysaccharide matrices using cetlytrimethylammonium bromide. Biomaterials. 31 (7), 1612(2010).
  21. Liyanage, N. M. N., Chandrasekara, B. C. H. W. M., Bandaranayake, P. C. G. A CTAB protocol for obtaining high-quality total RNA from cinnamon (Cinnamomum zeylanicum Blume). 3 Biotech. 11 (4), 201(2021).
  22. Semrau, J. D., DiSpirito, A. A., Gu, W., Yoon, S. Metals and methanotrophy. Appl Environ Microbiol. 84 (6), e02289-e02317 (2018).
  23. Zhang, S., et al. Salinity significantly affects methane oxidation and methanotrophic community in Inner Mongolia lake sediments. Front Microbiol. 13, 1067017(2023).
  24. Fox, A. L., Trefry, J. H. Nutrient fluxes from recent deposits of fine-grained, organic-rich sediments in a Florida estuary. Front Mar Sci. , (2023).
  25. He, L., et al. A methanotrophic bacterium to enable methane removal for climate mitigation. Proc Natl Acad Sci. 120 (35), e2310046120(2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Methylomonas LW13

مقالات ذات صلة