بروتوكول لإنتاج واستزراع شرائح الكبد الدقيقة (PCLS) لدراسة كبد الفئران. تركز المقالة على الجوانب الرئيسية للبروتوكول ، والتي لا تتطلب سوى معدات مختبرية قياسية مع إمكانية الوصول إلى الاهتزاز وتسمح ببقاء PCLS لمدة 4 أيام على الأقل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقنية محسنة ومبسطة لإنتاج واستزراع شرائح الكبد المقطوعة بدقة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يقدم هذا البروتوكول نظاما بسيطا لإنشاء واستزراع شرائح الكبد المقطوعة بدقة (PCLS). يحتوي PCLS على جميع الخلايا في بيئة سليمة ، وبالتالي فهو يشبه نموذجا صغيرا للعضو بأكمله. إنها تمكن من دراسة الأنسجة الحية مع تكرار أنماطها الظاهرية المعقدة. يسمح هذا البروتوكول بإعداد شرائح من كبد الفأر باستخدام اهتزاز ومعدات مختبرية قياسية. تفتقر بروتوكولات إنتاج وزراعة PCLS إلى التوحيد القياسي ويمكن أن تختلف بشكل كبير اعتمادا على الأنسجة ذات الاهتمام ونوع الاهتزاز المستخدم والحاجة إلى الأكسجين. قد يكون من الصعب تكاثرها في بعض المختبرات التي لا يمكنها الوصول إلا إلى مرافق الاهتزاز الأساسية ومرافق زراعة الأنسجة المشتركة. لقد وضعنا بروتوكولا يركز على أهمية بعض الخطوات الرئيسية ضمن البروتوكولات المتنوعة المتاحة بالفعل. لذلك ، يؤكد هذا البروتوكول على أهمية طريقة التضمين ، واتجاه القطع ، والنظام الديناميكي مقابل النظام الثابت ، وأهمية الحد الأدنى من حجم الثقافة. يمكن إنشاء هذا البروتوكول وإعادة إنتاجه بطريقة بسيطة في معظم المختبرات التي يمكنها الوصول إلى قطاعة الأنسجة الأساسية. مجتمعة واتباع هذا البروتوكول ، يمكن أن تظل PCLS على قيد الحياة لمدة لا تقل عن 4 أيام. PCLS هو نموذج بسيط واقتصادي وقابل للتكرار لدراسة الفحص الفيزيولوجي المرضي والعلاجي لأعضاء مثل الكبد.
المقدمة
شرائح الأنسجة المقطوعة بدقة (PCTS) هي أقسام رقيقة من الأعضاء. إنها تسمح بالحفاظ على بنية العضو ، وتكرار عضو صغير مع الحفاظ على الجانب ثلاثي الأبعاد للخلايا المجاورة والمصفوفة خارج الخلية. إنه نموذج جذاب نظرا لسهولة الوصول إليه ، وتوفير التكاليف ، وخصائصه الأقل كثافة في العمالة مع الحفاظ على بنية الأنسجة.
تملأ معاهدة التعاون بشأن البراءات الفجوة بين دراسات الخلايا في المختبر والبحوث الحيوانية في الجسم الحي ، وتتغلب على معظم عيوب كلا النموذجين. تم إنشاء PCTS من أعضاء مختلفة ، مثل الكبد1 ، والأمعاء2،3 ، والقولو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم شراء الفئران CD57Bl / 6J من النوع البري من مختبرات نهر تشارلز. كان للفئران حرية الوصول إلى الطعام والماء ، وتوجد في أقفاص جيدة التهوية بشكل فردي مع ظروف درجة حرارة ورطوبة يتم التحكم فيها وبدورة ضوئية مدتها 12 ساعة. تم التضحية بالحيوانات التي تبلغ أعمارها 3 أسابيع ، وتم حصاد الكبد على الفور دون نضح. تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية بعد المراجعة الأخلاقية المحلية من قبل مجلس رعاية والمراجعة الأخلاقية في كلية لندن الجامعية وتم إجراؤها بموجب ترخيص مشروع وزارة الداخلية PP9223137 ووفقا لقانون الإجراءات العلمية لوزارة الداخلية () (1986) وإرشادات ARRIVE. تم بذل جميع الجهود للحد من الضرر الذي يلحق بالحيوانات وفقا للممارسة المعتادة في....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عند الحصاد ، يتم حذف نضح عن قصد لضمان المعالجة السريعة للعضو ومنع تلف الأعضاء. يتم استخراج الكبد بسرعة بعد الشق ووضعه على الفور في مخزن مؤقت واقي للأعضاء مثلج ، على سبيل المثال ، عازلة كريبس24،29. على الرغم من أن تقطيع أنسجة الكبد الطازجة دون التضمين قد تم وصفهسابقا 1 ، فإن تضمين الكبد في agarose30 منخفض الذوبان (الشكل 1) جنبا إلى جنب مع عازلة واقية للأعضاء سيمكن من ظروف القطع المثلى عل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نحن نثبت أنه يمكن تحقيق إنتاج وزراعة PCLS بسهولة مع ضمان عمر نصف لا يقل عن 4 أيام. يلخص هذا البروتوكول خمس خطوات حاسمة: طريقة التضمين إذا تم استخدام هذا النوع من الاهتزاز ، واتجاه القطع ، ونظام ديناميكي للثقافة ، والحد الأدنى من حجم الثقافة ، واستخدام الإدخالات.
تتوفر بروتوكولات إنتاج وثقافة PCLS بشكل شائع. ومع ذلك ، فهي تفتقر إلى التوحيد القياسي. قد يركزون على نقاط متشابهة ومحددة من البروتوكول ولكن قد يكون من الصعب تكرارها بطريقة بسيطة أو في معظم المختبرات ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا توجد مصالح متنافسة يجب الكشف عنها.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون ميرابيلا باندول وسامانثا ريتشاردز ولويز فيشر وريبيكا تاونز والموظفين من UCL Biological Services لمساعدتهم في تربية وصيانة مستعمرات. تم دعم هذا العمل بتمويل من زمالة العلماء السريريين لمجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة MR / T008024 / 1 (JB) ومركز أبحاث الطب الحيوي في مستشفى جريت أورموند ستريت (JB). الآراء المعبر عنها هي آراء المؤلف (المؤلفين) وليس بالضرورة آراء NHS أو NIHR.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| طبق بتري 3 سم | أي | مناسب لزراعة الخلايا | |
| 6 ، 12 ، 24 لوحة ثقافة البئر | أي | مناسبة لزراعة الخلايا | |
| Cyanoacrylate الغراء الفائق | أي | ||
| D-Glucose | Gibco | A24940 | |
| Eosin | Merck | HT110316 | |
| الإيثانول | أي | ||
| مصل الأبقار الجنيني | ThermoFisher | 26400044 | |
| Gentamycin | Gibco | 15750060 | |
| Hematoxylin | Merck | 51275 | |
| HEPES | Gibco | H0887 | |
| إدراج 8um ، ل 12 لوحة بئر | Strastedt | 83.3931.800 | |
| إدراج 8um ، ل 24 لوحة بئر | Strastedt | 83.3932.800 | |
| إدراج 8um ، ل 6 ألواح آبار | Strastedt | 83.3930.800 | |
| KREBS | Merck | K3753 | |
| التدفق الصفحي Hepa | تنقية الهواء | ||
| انخفاض ذوبان الاغاروز | ThermoFisher | 16520050 | |
| كاشف تيترازوليوم MTS | Abcam | ab197010 | |
| قارئ لوحة متعدد الآبار | أي | ||
| أقراص PBS | ThermoFisher | P4417 | |
| Penicillin / Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| شفرة مشرط | أي | ||
| ملقط جراحي | أي | مع طرف مربع مسطح ؛ | |
| مقص جراحي | أي | ||
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| William ' s متوسط E مع GlutaMAX (WME) | ThermoFisher | W4125 |
المراجع
- Pearen, M. A., et al. Murine precision-cut liver slices as an ex vivo model of liver biology. J Vis Exp. (157), e60992(2020).
- De Kanter, R., et al. Prediction of whole-body metabolic clearance of dru....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
