مقالة منهجية

توصيف نقل الإلكترون خارج الخلية بوساطة في بكتيريا حمض اللاكتيك بنظام كهروكيميائي حيوي ثلاثي الأقطاب الكهربائية وغرفتين

DOI:

10.3791/67204

⸱

أغسطس 23, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of BioSciences, Rice University, 2PhD Program in Systems, Synthetic, and Physical Biology, Rice University, 3Department of Bioengineering, Rice University, 4Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Rice University, 5Rice Synthetic Biology Institute, Rice University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولا لتوصيف نقل الإلكترون خارج الخلية بوساطة (EET) في بكتيريا حمض اللاكتيك باستخدام نظام كهروكيميائي حيوي ثلاثي الأقطاب الكهربائية وغرفتين. نوضح هذه الطريقة باستخدام Lactiplantibacillus plantarum ووسيط الأكسدة والاختزال 1،4-dihydroxy-2-naphthoic acid ونقدم وصفا شاملا للتقنيات الكهروكيميائية المستخدمة لتقييم EET بوساطة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقوم العديد من البكتيريا بنقل الإلكترون خارج الخلية (EET) ، حيث يتم نقل الإلكترونات من الخلية إلى متقبل الإلكترون الطرفي خارج الخلية. يمكن أن يكون متقبل الإلكترون هذا قطبا كهربائيا ويمكن توصيل الإلكترونات بشكل غير مباشر عبر جزيء وسيط نشط للأكسدة والاختزال. هنا ، نقدم بروتوكولا لدراسة EET بوساطة في Lactiplantibacillus plantarum ، وهي بكتيريا حمض اللاكتيك بروبيوتيك تستخدم على نطاق واسع في صناعة المواد الغذائية ، باستخدام نظام كهروكيميائي حيوي. نحن نشرح بالتفصيل كيفية تجميع نظام كهروكيميائي حيوي مكون من ثلاثة أقطاب كهربائية وغرفتين وتقديم إرشادات حول توصيف EET في وجود وسيط قابل للذوبان باستخدام تقنيات قياس التوازن الزمني والفولتامتر الدوري. نستخدم بيانات تمثيلية من تجارب EET بوساطة 1،4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA) مع L. plantarum لإثبات تحليل البيانات وتفسيرها. يمكن للتقنيات الموضحة في هذا البروتوكول أن تفتح فرصا جديدة للتخمير الكهربائي والتحفيز الكهربائي الحيوي. أظهرت التطبيقات الحديثة لهذه التقنية الكهروكيميائية مع L. plantarum تسارعا في التدفق الأيضي نحو إنتاج منتجات نهائية للتخمير ، وهي مكونات نكهة مهمة في تخمير الطعام. على هذا النحو ، فإن هذا النظام لديه القدرة على تطويره بشكل أكبر لتغيير النكهات في إنتاج الغذاء أو إنتاج مواد كيميائية قيمة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتفاعل الأنظمة الكهروكيميائية الحيوية بين الميكروبات والأقطاب الكهربائية ، مما يسمح بالتحقيق في آليات نقل الإلكترون خارج الخلية (EET) وتوفير طرق متجددة للتحفيز الكهربائيالحيوي 1،2،3. تعرف الميكروبات التي تؤدي EET بشكل طبيعي باسم الإلكتروجينات الخارجية ، والتي تنقل الإلكترونات المشتقة من التمثيل الغذائي إلى مستقبلات الإلكترون الطرفية خارج الخلية ، على سبيل المثال ، أكاسيد الحديد (الهيدرالية) والأقطابالكهربائية 1. تم تمييز مسارات EET لأول مرة في أنواع Geobacter و Shewanella 4،5 ، ومنذ ذلك الحين تم تحديد مسارات EET في العديد من البكتيريا. تلعب هذه الجينات الكهربائية الخارجية دورا مركزيا في العديد من التقنيات الكهروكيميائية الميكروبية ، مثل توليد الطاقة الكهربائية من تيارات النفايات ، وتثبيت ثاني أكسيد الكربون2 ، وإنتاج مواد كيميائية قيمة عن طريق التخليق الكهربائي1،6،7،8،9،10،11،12.

أحد هذه الإلكتروجين الخارجي هو Lactiplantibacillus plantarum, بكتيريا حمض اللاكتيك موجبةالجرام 13. L. plantarum هي بكتيريا بروبيوتيك بدوية تعيش في مجموعة واسعة من البيئات ، بما في ذلك أحشاء البشر والفقاريات الأخرى ، بالإضافة إلى العديد من أنواع الطعام مثل اللحوم والحبوب والخضروات والأطعمة والمشروبات المخمرة14،15،16،17. يقوم جينومها بتشفير عملية التمثيل الغذائي المرنة وغير المتجانسة ، مما يسمح بالتكيف الناجح عبر هذه البيئات المتنوعة. تمت دراسته جيدا ، ويستخدم على نطاق واسع في صناعات الأغذية والصحة ، ومعترف به عموما على أنه آمن من قبل إدارة الغذاء والدواء18،19. على هذا النحو ، فإن L. plantarum لديه القدرة على العمل كمنصة مفيدة للتقنيات القائمة على EET.

حددت الأبحاث الحديثة في L. plantarum مشغلا متعدد الجينات يشفر مسارا معقدا لليترا بالكفاءة الإلكترونية تم تمييزه في الأصل في Listeria monocytogenes13،20. في L. plantarum ، تسهل البروتينات المركبة من هذا الأوبرون EET في نظام كهروكيميائي حيوي (BES) عند توفير حمض الكينون 1،4-ثنائي هيدروكسي -2-النفثويك (DHNA) كوسيط إلكترون13. أول بروتين أساسي في هذا المسار هو NADH-quinone oxidoreductase المرتبط بالغشاء (Ndh2) ، والذي يؤكسد NADH ويقلل من DHNA. تقوم DHNA إما بتوصيل الإلكترونات مباشرة إلى قطب كهربائي أو بشكل غير مباشر عبر البروتين الملحق PplA (الشكل 1) 13،21،22. تشير الأبحاث الحديثة إلى L. plantarum قد تستخدم أيضا الكينونات الأخرى التي تشبه هيكليا DHNA كوسطاء إلكترونيين. ومع ذلك ، فإن L. plantarum غير قادر على إنتاج DHNA أو هذه الكينونات البديلة ، وبالتالي يجب أن يكون الوسطاء موجودين خارجيا في البيئة حتى يحدث EET13،22،23.

figure-introduction-1
الشكل 1: تدفق الإلكترون في Lactiplantibacillus plantarum EET. Ndh2 يمرر الإلكترونات من NADH إلى quinone DHNA. يتم نقل الإلكترونات إلى القطب الكهربائي لإنتاج التيار ، إما مباشرة عن طريق تقليل الكينون أو بشكل غير مباشر من خلال البروتين الملحق PplA. الاختصارات: FAD = فلافين الأدينين ثنائي النوكليوتيد. FMN = فلافين أحادي النوكليوتيد. EET = نقل الإلكترون خارج الخلية ؛ NADH = انخفاض نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد; Ndh2 = NADH-quinone oxidoreductase; DHNA = 1،4-ثنائي هيدروكسي -2-حمض النفثويك ؛ PplA = phospholipase A. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا شاملا لاستخدام طريقة قائمة على BES لتوصيف EET بوساطة DHNA في L. plantarum. يحصر النظام المكون من ثلاثة أقطاب كهربائية وغرفتين البكتيريا في القطب الكهربائي العامل ، مما يسمح بالتحكم الدقيق في الإمكانات المطبقة على البكتيريا مع منع الحديث المتبادل بين القطب الكهربائي العامل والمضاد. نقدم بروتوكولا شاملا يمتد على مدار 5 أيام ، والذي يغطي التحضير قبل التجربة ، وتجميع BES ، وتحليل EET باستخدام قياس التيار الزمني (CA) وقياس الجهد الدوري (CV) ، وتحليل عينة ما بعد التجربة. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لكشف آليات مسارات EET وبناء أنظمة للتخمير الكهربائي والتحفيز الكهربائي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يشار إلى تجميعات BES المكونة من غرفتين باسم "المفاعلات" في البروتوكول التالي.

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. تحضير L. plantarum الوسائط الزاعية.
    1. إعداد وسائط MRS التجارية (de Man Rogosa Sharpe) حسب التعليمات و mMRS media24 كما هو موضح في الجدول 1. اضبط الرقم الهيدروجيني ل mMRS على 6.5. قم بتصفية وتعقيم كلتا الوسيلتين عن طريق تمريرهما عبر مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينهما عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    2. قم بإعداد وسط محدد كيميائيا باستخدام المانيتول (mCDM) 13،25 كما هو موضح في الجدول 2 ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 6.5. قم بإعداد وسيط كاف لملء الغرفة الأنودية لكل مفاعل ب 110 مل من الوسط. قم بتعقيم mCDM من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظة: يجب تحضير mCDM طازجا في يوم الاستخدام المقصود. يمكن تحضير الحلول المكونة مسبقا. قم بتصفية جميع المحاليل المكونة وتعقيمها من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينها عند 4 درجات مئوية. عند تحضير فيتامينات وولف ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 11 قبل التعقيم وتخزينه في الظلام أو ملفوفا بورق الألمنيوم. عند تحضير معادن وولف ، اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8 بعد إضافة حمض النتريلوتريأسيتيك (NTA). ثم أضف المكونات المتبقية وتعقيمها واحفظها في الظلام أو ملفوفة بورق الألمنيوم.
  2. تحضير 1x PBS والأوتوكلاف للتعقيم. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية للاستخدام في هذا البروتوكول.
  3. قم بإعداد وسائط M9 التجارية حسب التعليمات (الجدول 3) والأوتوكلاف للتعقيم. قم بإعداد وسائط كافية لملء الغرفة الكاثودية لكل مفاعل ب 110 مل. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.

2. اليوم 1: تجميع مفاعل BES وزراعة  L. plantarum الأولية

ملاحظة: الشكل المرجعي 2 لتخطيطي لمفاعل BES ومخطط يوضح بالتفصيل قطع التجميع المشار إليها في البروتوكول.

figure-protocol-1
الشكل 2: مكونات BES ومخطط للتجميع. (أ) تخطيطي لمفاعل BES مكون من غرفتين. تنقل البكتيريا (الخضراء) في الغرفة الأنودية الإلكترونات إلى قطب كهربائي يعمل (دائرة سوداء) في وجود وسيط كينون. تتدفق الإلكترونات عبر الدائرة إلى الغرفة الكاثودية ، مما يسمح بأخذ القياسات الحالية بين الأنود والكاثود بواسطة بوتينسيوستات. (ب) صورة تصور مفاعل BES مجمعا بالكامل، بما في ذلك إبر مدخل ومخرج N2 في الغرفة الأنوديكية. (ج) صورة تصور جميع أجزاء المفاعل المفكك. الاختصار: BES = النظام الكهروكيميائي الحيوي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تجميع وتعقيم المفاعلات.
    1. تحضير أقطاب العمل والمضادة. قم بالرمل مسبقا بقطع أسلاك التيتانيوم بقطر 1.0 مم للعمل وأقطاب كهربائية مضادة بورق صنفرة من أكسيد الألومنيوم حتى تصبح لامعة بشكل متساو. باستخدام كماشة ، قم بثني أحد طرفي كل سلك قطب كهربائي يعمل في خطاف صغير. حرك لباد كربوني مقاس 16 سم2 على كل سلك قطب كهربائي يعمل ، وقم بنسج السلك داخل وخارج لباد الكربون مرة واحدة واسحب الجولة لأسفل السلك حتى يتم تثبيتها على الخطاف. قم بتأمين أقطاب العمل والأقطاب المضادة في أغطية GL45 عن طريق ثقب الحاجز المطاطي بالسلك وسحبه من خلال بضعة سنتيمترات.
    2. لتجميع المفاعلات المزدوجة ، قم أولا بتجميع الحلقة O وضع غشاء تبادل كاتيوني مقطوع مسبقا تم نقعه مسبقا في الماء في الحلقة O المجمعة. ضع الحلقة O مع الغشاء بين الفتحات السفلية الكبيرة لزجاجتي مفاعل مقترنتين. قم بتأمين زجاجات زوج المفاعل والحلقة O بالغشاء بمشبك مفصل لإصبع محكم. قم بإسقاط قضيب التحريك المغناطيسي في كل غرفة أنوديك ، ثم أغلق جميع الفتحات الصغيرة في الجزء العلوي من كل زجاجة بأغطية GL14 مزودة بحاجز مطاطي.
      ملاحظة: لا تفرط في إحكام ربط مشابك المفصل أو أي أغطية لأن ذلك قد يؤدي إلى تشققات أو كسور في الزجاجات.
    3. املأ كل زجاجة مفاعل ب 110 مل من الماء منزوع الأيونات (DI) ، ثم أغلق كل زجاجة بغطاء GL45 المناسب المزود بقطب كهربائي. أدخل أغطية مزودة بقطب كهربائي دائري من اللباد الكربوني عن طريق الضغط برفق على الجزء العلوي من اللباد الدائري بحيث تظل الجولة على الخطاف.
      ملاحظة: لباد الكربون الطازج كاره للماء ويصد الماء في المفاعل في التجميع الأولي. سيؤدي التعقيم في أن يصبح الكربون المحببا للماء بشكل مناسب للتجريب.
    4. اجمع أغطية القطب الكهربائي GL14 المزودة بحلقات مانعة للتسرب من السيليكون.
    5. قم بفك جميع أغطية GL45 برفق قبل التعقيم. الأوتوكلاف المفاعلات المملوءة بالماء وأغطية الأقطاب الكهربائية للتعقيم. بعد التعقيم ، اترك المفاعلات تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. الثقافة L. plantarum NCIMB8826. في ظل ظروف معقمة ، اكشط بعض البكتيريا من أعلى مخزون الجلسرين وتلقيحها في 3 مل من وسائط MRS التجارية. قم بزراعة المزرعة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية دون اهتزاز.
    ملاحظة: L. plantarum لا يستخدم الأكسجين كمتقبل إلكترون طرفي. لذلك ، ليس من الضروري تزويد الوسائط بالأكسجين عن طريق هز26. ومع ذلك ، ستختلف ظروف الاستزراع إذا تم استخدام ميكروبات أخرى.

3. اليوم 2: تحضير الأقطاب الكهربائية المرجعية ، وإعداد المفاعلات لبدء التجربة ، والزراعة الفرعية L. plantarum

  1. تحضير أقطاب Ag / AgCl المرجعية.
    ملاحظة: تصف هذه الخطوات تحضير الأقطاب الكهربائية المرجعية Ag / AgCl المشار إليها في جدول المواد. يجب على المستخدمين اتباع تعليمات الشركة المصنعة في حالة استخدام قطب مرجعي مختلف.
    1. قم بتفكيك الأقطاب الكهربائية المرجعية Ag / AgCl ورمل الأسلاك. اسحب القطب برفق من غلافه الزجاجي وقم بنفض الغبار عن الغلاف الزجاجي لتفريغ محلول KCl القديم. قم برمل أسلاك القطب برفق باستخدام ورق صنفرة أكسيد الألومنيوم حتى تصبح لامعة بشكل متساو لإزالة المواد المؤكسدة.
    2. اجمع جميع أسلاك القطب المرجعي المصقول في دورق صغير بقضيب تقليب صغير واملأ الدورق بالمبيض بنسبة 100٪ حتى يتم غمر الأسلاك بالكامل. قم بكلوريد الأسلاك عن طريق السماح للأسلاك بالتبييض على منصة التحريك لمدة 30 دقيقة حتى تتحول الأقطاب الكهربائية إلى اللون الرمادي الداكن. بعد التبييض ، اشطف أسلاك القطب جيدا بماء DI.
    3. لإعادة تجميع قطب مرجعي ، استخدم حقنة لملء الغلاف الزجاجي بالكامل بمحلول 3 M KCl مشبع بكلوريد الفضة ، مع النقر برفق على الجانب لإخراج أي فقاعات هواء. باستخدام نفس المحقنة ، املأ غطاء سلك القطب بمحلول KCl ، ثم أدخل السلك في السكن. ضع الجزء السفلي من الغلاف الزجاجي على منشفة ورقية على سطح المقعد ، وأدخل القطب الكهربائي في الغلاف الزجاجي ، ثم اضغط بقوة على الغطاء لإغلاق القطب. قم بتخزين الأقطاب الكهربائية المرجعية في دورق ضحل مملوء بمحلول KCl لحين الحاجة وكرر ذلك مع جميع الأقطاب الكهربائية المرجعية المتبقية.
    4. استخدم مقياسا رقميا متعدد لقياس جهد الأقطاب المرجعية Ag / AgCl محلية الصنع.
      1. اغمر نهايات الأقطاب الكهربائية المرجعية Ag / AgCl (المقدرة ب 197 مللي فولت مقابل قطب الهيدروجين القياسي ، SHE) بشكل ضحل في دورق مملوء ب 3 M KCl. قم بتوصيل المقياس المتعدد بإحكام بقطب كالوميل مشبع تم شراؤه تجاريا (SCE ، 241 مللي فولت مقابل SHE) مغمور أيضا في نفس إلكتروليتات KCl.
      2. قم بقياس فرق الجهد بين كل قطب مرجعي و SCE. تأكد من أن الأقطاب الكهربائية المرجعية تختلف عن SCE بمقدار 44 ± 10 مللي فولت. قم بتفكيك وإعادة تجميع أي قطب كهربائي مرجعي يقع خارج هذا النطاق.
    5. أغلق التماس حيث يلتقي الغطاء بالغلاف الزجاجي باستخدام البارافيلم.
  2. تحضير المفاعلات للتجريب.
    1. في خزانة السلامة الحيوية المعقمة ، استبدل الماء المعقمة في المفاعلات بالوسائط المناسبة. اسكب الماء المعقم. املأ الغرف الكاثودية ب 110 مل من وسط M9 المعقم. املأ الغرف الأنودية ب 110 مل من mCDM المحضر حديثا.
    2. قم بتركيب الأقطاب الكهربائية المرجعية. قم بإزالة غطاء GL14 واحد من كل غرفة أنوديك واستبدله بغطاء قطب كهربائي معقم (غطاء GL14 بحلقة مانعة للتسرب من السيليكون). رش الأقطاب الكهربائية المرجعية بنسبة 70٪ من الإيثانول لتعقيمها ، ثم ضع قطبا مرجعيا واحدا عبر غطاء القطب الكهربائي في كل غرفة أنوديك.
      ملاحظة: تأكد من أن القطب المرجعي لا يتلامس مباشرة مع لباد الكربون الدائري.
    3. قبل إزالة المفاعلات من خزانة السلامة الحيوية ، قم بإحكام ربط جميع الأغطية والمشابك لتكون محكمة الإصبع لتجنب التسرب.
    4. قم بتوصيل المفاعلات بنظام مضخة المياه. ضع كل مفاعل على منصة شريط التحريك المناسبة. قم بتوصيل حنفيات سترة الماء لكل مفاعل بالتالي باستخدام أنابيب مطاطية ، وتوصيل المفاعلات الطرفية بأنابيب التدفق والتدفق لمضخة المياه.
      ملاحظة: تأكد من أن جميع التوصيلات محكمة دون تسرب ، باستخدام أربطة مضغوطة لتأمين الأنابيب إذا لزم الأمر.
    5. املأ المضخة بالماء وأضف 4-6 قطرات من مكيف الماء. قم بتشغيل نظام المضخة واضبط درجة الحرارة على 30 درجة مئوية. ابدأ تشغيل المضخة وراقب تدفق المياه عبر جميع سترات المياه للمفاعل ، مع التأكد من عدم وجود تسرب في أي توصيلات.
    6. قم بتشغيل منصات التقليب واضبطها على التقليب المستمر عند 220 دورة في الدقيقة.
    7. قم بتوصيل المفاعلات بخطوط الغاز التي تناثر النيتروجين. قم بتوصيل مرشح هواء بإبرة 4 بوصات و 22 جم وأدخل الإبرة من خلال الحاجز العلوي لغرفة أنوديك المفاعل في الوسائط لتكون بمثابة مدخل النيتروجين. أدخل إبرة أخرى مقاس 1 بوصة و 18 جم في الحاجز العلوي للغرفة الأنودية لتكون بمثابة مخرج النيتروجين. قم بتوصيل خطوط الغاز من مصدر النيتروجين بفلتر الهواء وافتح الصمام للسماح للغاز بالتدفق برفق عبر المفاعل. تأكد من أن فقاعات النيتروجين تمر عبر جميع الغرف الأنودية بشكل مستمر طوال التجربة للحفاظ على الظروف اللاهوائية.
      ملاحظة: تأكد من وضع إبرة المدخل بعيدا عن لباد الكربون الدائري. يجب ألا يتلامس تيار الفقاعة مع لباد الكربون أو الأقطاب الكهربائية المرجعية.
    8. اربط المفاعلات الحيوية بخيوط الجهد. قم بتوصيل مشبك التمساح الكهربائي العامل والعداد والمرجعي من potentiostat إلى الأقطاب الكهربائية المقابلة لها.
      ملاحظة: استخدم مقياسا متعددا للتحقق من المقاومة بين مجمع السلك/التيار والأقطاب الكهربائية لضمان التوصيلات الكهربائية المناسبة وتقليل أخطاء القياس المحتملة.
  3. إدخال معلمات potentiostat للتشغيل المسبق.
    ملاحظة: فيما يلي إعدادات التقنية الحرجة. انظر الجدول 4 للحصول على قائمة موسعة بإعدادات البرامج لكل تقنية.
    1. قم بتشغيل potentiostat وتهيئة برنامج EC-lab على الكمبيوتر. قم بتوصيل potentiostat بالكمبيوتر بالنقر فوق زر رمز potentiostat في اللوحة العلوية اليسرى أسفل الأجهزة. بمجرد الاتصال ، سيظهر اسم الجهاز بدائرة خضراء في مربع النص أدناه.
    2. قم بمزامنة جميع القنوات المتصلة بالمفاعلات الحيوية في مجموعة واحدة بالنقر فوق علامة التبويب تحرير ، ثم تحديد مزامنة. انقر على مربعات أرقام القنوات المناسبة | موافق.
    3. أضف جهد الدائرة المفتوحة (OCV) إلى الجهد بالنقر فوق الزر + في لوحة إعدادات المعلمات على اليسار. في مربع الإعدادات الأزرق ؛ اضبطه لقياس إمكانات قطب العمل (EWE) مقابل القطب المرجعي (RE) ، وتسجيل الوقت في الفاصل الزمني dt كل 36 ثانية ليصبح المجموع 3 ساعات.
    4. بعد ذلك ، أضف تقنية قياس الجهد الدوري (CV) إلى البوتينسيوستات. اضبط الإمكانات الأولية ل EWE على Ei من 0 V مقابل RE بمعدل مسح 2 mV/s. اكتساح إلى جهد الرأس (E1) البالغ 0.4 فولت مقابل عكس الطاقة المتجددة إلى جهد الرأس (E2) البالغ -0.7 فولت مقابل الطاقة المتجددة. كرر الفحص لإجمالي مرتين.
      ملاحظة: في الأنظمة الكهروكيميائية الميكروبية ، يؤدي التلقيح الميكروبي وتكوين الأغشية الحيوية إلى قدرات عالية مقارنة بالمواد المعدنية أو الجزيئات غير العضوية. أثناء المسح الدوري للفولتامتريات ، تختلف الإمكانات ، ويعمل تيار الشحن كخلفية. لتحقيق نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية ، من الضروري تقليل معدلات المسح ، على الرغم من أن هذا يزيد من مدة الفحص. نظرا لأننا نقوم بمسح دورتين تغطيان نافذة كهروكيميائية واسعة تبلغ 1.1 فولت ، فإن معدل المسح الضوئي البالغ 2 مللي فولت / ثانية ينتج عنه نصف دورة تستغرق ما يصل إلى 9.1 دقيقة. وبالتالي ، تستغرق دورتان ما مجموعه 36.4 دقيقة. إن تقليل معدل الفحص بشكل أكبر سيستغرق وقتا طويلا بشكل مفرط.
    5. أضف تقنية قياس التيار الزمني (CA). تطبيق جهد ثابت EWE يبلغ 0.2 فولت مقابل RE لفترة t = 200 ساعة ، مع تسجيل الوقت على فترات dt كل 25-40 ثانية. اضبط الفاصل الزمني بناء على برنامج potentiostat للحصول على المستوى المطلوب من التفاصيل.
      ملاحظة: تبلغ إمكانات نقطة المنتصف ل DHNA حوالي -0.093 فولت مقابل Ag / AgCl. وبالتالي ، فإن الإمكانات المطبقة البالغة 0.2 فولت مقابل RE إلى القطب العامل كافية للسماح بنقل الإلكترون من DHNA إلى القطب.
    6. بعد إدخال جميع المعلمات ، ابدأ التشغيل بالضغط على مثلث البداية الأخضر. احفظ الملف حسب الرغبة وفقا لتوجيهات البرنامج، ثم انقر على حفظ. سيبدأ البرنامج في التقنية 1 ، "OCV". راقب آثار OCV لبضع دقائق للتأكد من أن جميع المفاعلات تقرأ بشكل إيجابي وتغلق مع بعضها البعض بإشارة ثابتة. اترك التجربة لتعمل طوال الليل لإكمال OCV والسيرة الذاتية الأولية (انظر الشكل التكميلي S1 للحصول على السيرة الذاتية للتحكم في الوسائط) والسماح ل CA بالعمل حتى يستقر.
  4. في ظل ظروف معقمة ، استزراع فرعي لثقافة MRS ل L. plantarum 1: 200 في 50 مل من mMRS. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية دون اهتزاز.
    ملاحظة: عادة ما تنتج مزرعة 50 مل بين عشية وضحاها أكثر من خلايا كافية لستة مفاعلات ، بافتراض OD600 نهائي من 0.2 في المفاعل. اضبط أحجام الثقافة وفقا لذلك للتجارب الأكبر أو الأصغر.

4. اليوم 3: حقن الخلايا و DHNA / DMSO

  1. اغسل الخلايا وحقنها في المفاعلات.
    1. قم بإزالة mMRS L. plantarum من الحاضنة في الصباح. في ظل ظروف معقمة ، انقل المزرعة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وضع المزرعة على الجليد.
    2. اغسل الخلايا 2x في معقمة وباردة 1x PBS. للقيام بذلك ، قم بالطرد المركزي للثقافة عند 4,000 × جم لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي 4 درجات مئوية لحبيبات الخلايا. في ظل ظروف معقمة ، قم بإعادة تعليق الخلايا برفق ولكن تماما في 50 مل من PBS ، ثم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى كما كان من قبل ؛ كرر للغسيل الثاني. بعد جهاز الطرد المركزي النهائي ، أعد تعليق الخلايا في PBS البارد إلى OD600 = 11.
    3. في ظل ظروف معقمة ، قم بتحميل 2 مل من الخلايا المعلقة في حقنة سعة 3 مل مزودة بإبرة لكل مفاعل.
    4. في محطة المفاعل ، قم بإزالة غطاء حقنة خلية وأدخل الإبرة في الجزء العلوي من غرفة أنوديك المفاعل. لا تضغط على مكبس المحقنة في هذا الوقت ؛ كرر لجميع المفاعلات. بمجرد وضع جميع المحاقن في مكانها ، اضغط على المكابسات لحقن الخلايا في المفاعلات وتسجيل وقت الحقن من تتبع CA. ينتج هذا الحجم من الخلايا OD600 نهائيا قدره 0.2 في المفاعلات. تخلص من جميع المحاقن في صناديق الإبر البيولوجية في حاوية المخاطر البيولوجية المخصصة. اسمح للتيار بالاستقرار ليصبح مسطحا على تتبع CA لمدة 2-4 ساعات.
      ملاحظة: عند الحقن ، يمكن ملاحظة التقلبات الحالية على تتبع CA. بعد 2-4 ساعات ، ستستقر هذه التقلبات إلى تيار مسطح (<2 ميكروأمبير تغير في التيار على مدار ساعة) ، وعند هذه النقطة يمكن حقن DHNA.
  2. قم بقياس درجة الحموضة الأولية وحقن DHNA.
    1. تحضير محلول DHNA. في أنبوب سعة 1.5 مل ، قم بإعداد 500 ميكرولتر من محلول DHNA 20 مجم / مل عن طريق إذابة مسحوق DHNA في 100٪ DMSO. املأ 3 محاقن أنسولين ب 110 ميكرولتر من محلول DHNA و 3 محاقن أنسولين ب 110 ميكرولتر من DMSO فقط.
      ملاحظة: في حين أن DHNA قابل للذوبان بشكل معتدل في الماء ، فإن DMSO هو مذيب أفضل لمخزون DHNA عند هذا التركيز. قد يختلف مذيب الوسيط إذا تم استخدام وسطاء آخرين.
    2. في محطة مفاعل BES ، قم بتسمية المفاعلات التجريبية على أنها + DHNA ومفاعلات التحكم في المذيبات باسم - DHNA. قم بإزالة غطاء حقنة DHNA وأدخل المحقنة في الجزء العلوي من كل غرفة أنوديك مخصصة على أنها + DHNA. أدخل حقنة DMSO فقط في كل غرفة أنوديك محددة على أنها - DHNA. لا تضغط على غطاسات الحقنة في هذا الوقت.
    3. خذ عينات من 0 ساعة لتحليل العينة. باستخدام حقنة سعة 3 مل مزودة بإبرة 2 بوصة و 21 جم ، خذ عينة وسائط سعة 2 مل من كل غرفة أنوديك من خلال الحاجز الصغير غير المستخدم وانقل العينات إلى صفيحة عميقة 24 بئر لأخذ قياسات الأس الهيدروجيني للنقطة الزمنية 0 ساعة (نقطة حقن DHNA). إذا رغبت في ذلك ، خذ 1 مل من الوسائط المستهلكة من كل غرفة أنوديك وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر في أنابيب نظيفة ذات علامات لقياس المستقلبات باستخدام HPLC أو فحوصات أخرى. قم بتخزين عينات الوسائط المستهلكة عند -80 درجة مئوية.
    4. اضغط على غطاسات جميع محاقن DHNA و DMSO للحقن في المفاعلات. سجل وقت الحقن من تتبع CA. تخلص من جميع المحاقن والإبر بشكل مناسب.
    5. قم بقياس وتسجيل عينات الأس الهيدروجيني 0 ساعة لكل مفاعل.

5. اليوم 4: إكمال التجربة وجمع العينات

  1. إجراء التحليل الكهروكيميائي بعد 24 ساعة من حقن DHNA وأخذ العينات النهائية.
    1. قم بإنهاء تشغيل CA بعد 24 ساعة من حقن DHNA.
    2. خذ عينات من النقطة الزمنية لمدة 24 ساعة لتحليل العينة وفقا للخطوة 4.2.3.
    3. قم بتشغيل السيرة الذاتية مرة أخرى للنقطة الزمنية البالغة 24 ساعة وفقا للمعلمات الموضحة في الخطوة 3.3.4.
    4. قم بقياس وتسجيل الأس الهيدروجيني لعينات 24 ساعة من كل مفاعل.
  2. تفكيك وتنظيف المفاعلات.
    1. قم بإيقاف تشغيل البوتينسيوستات. بعد ذلك ، افصل خيوط العمل والعداد والمرجعية من كل مفاعل. امسح أي رطوبة من مشابك التمساح الرصاصية البالغة.
    2. قم بإيقاف تشغيل تدفق غاز النيتروجين. افصل خيوط الغاز ، ثم قم بإزالة إبر التدفق والخارج. تخلص من جميع الإبر بشكل مناسب في حاوية الأدوات الحادة.
    3. قم بإيقاف تشغيل مضخة المياه. افصل أنابيب التدفق والتدفق الخارجة من المضخة واترك الماء يصب في دلو. عند الفصل ، حافظ على نهايات الأنبوب مرتفعة فوق خط المياه في المضخة لمنع الماء من السحب على الأرض. افصل كل مفاعل واحدا تلو الآخر عن أنبوب سترة الماء ، والعمل من مفاعل التدفق النهائي إلى مفاعل التدفق الأولي.
    4. أفرغ جميع الوسائط من المفاعلات في حاوية كبيرة للمخاطر البيولوجية. اتبع طرق التبييض المزروعة العادية للتخلص منها.
    5. بمجرد إفراغها ، قم بتفكيك وتنظيف جميع قطع المفاعل. تخلص من أغشية التبادل الكاتيوني وجولات اللباد الكربوني في نفايات بيولوجية مناسبة. قم بتنظيف الأقطاب الكهربائية المرجعية وأسلاك التيتانيوم بنسبة 70٪ من الإيثانول وتخزين الأقطاب الكهربائية المرجعية التي تم تنظيفها في دورق مملوء بالماء بشكل ضحل. نظف زجاجات المفاعل والأغطية والحلقات O والمشابك بلطف في الماء الدافئ باستخدام منظف المختبر ، واشطفها جيدا بماء DI ، وجفف جميع الأجزاء بالهواء قبل التخزين.

6. اليوم 5: التحليل الكهروكيميائي

ملاحظة: يوجد أدناه وصف عام لرسم البيانات لهذا البروتوكول. وسيقدم وصف أكثر تفصيلا بشأن التحليل وتفسير البيانات في قسم النتائج التمثيلية.

  1. لتحليل CA: اضبط وقت حقن DHNA على أنه نقطة زمنية 0 ساعة. ارسم متوسط الكثافة الحالية المقاسة والانحراف المعياري لكثافة التيار المقاسة (j بالأمبير/سم 2) المأخوذة كل 36 ثانية لجميع التكرارات من النقطة الزمنية 0 ساعة كدالة للوقت (h). احسب كثافة التيار كدالة لمساحة القطب الكهربائي العامل (16 سم2).
  2. لتحليل السيرة الذاتية: ارسم تتبع سيرة ذاتية تمثيلي لكل حالة تجريبية (الوسائط فقط ، DMSO ، أو DHNA) يصور كثافة التيار (j في μA / cm2) كدالة لجهد القطب الكهربائي العامل (EWE in V). ارسم الدورة الثانية من تشغيل السيرة الذاتية المحددة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل قياس التيار الزمني
يمكن ملاحظة EET ل L. plantarum من خلال بيانات قياس التيار الزمني (CA) الموضحة في الشكل 3 ، حيث يصور تتبع الكثافة الحالية نقل الإلكترون من L. plantarum إلى القطب الكهربائي العامل. راقبنا كثافة التيار (j) مقابل الوقت مع الحفاظ على إمكانات ثابتة تبلغ +200 مللي فولت مقابل Ag / AgCl لمدة 24 ساعة. عند حقن 20 ميكروغرام / مل DHNA في محلول الإلكتروليت التحريك ، لوحظ ارتفاع أكسدة DHNA غير أحيائي ، تليها زيادة سريعة في كثافة التيار الحيوي بلغت ذروتها عند 132.0 ± 2.47 ميكروأمبير / سم2 عند نقطة زمنية 8 ساعات تقريبا. على العكس من ذلك ، أدى حقن DMSO إلى كثافة تيار ضئيلة. تؤكد هذه النتائج على أهمية DHNA كوسيط ضروري وفعال لتسهيل نقل الإلكترون بين L. plantarum والقطب. يمكن للمستخدمين ضبط الإخراج الحالي عن طريق ضبط تركيز DHNA في BES. تشير الأبحاث السابقة أيضا إلى أن L. plantarum يستجيب ل DHNA بطريقة تعتمد على الجرعة عبر مجموعة واسعة من تركيزات DHNA ، مما ينتج عنه تيار كبير في وجود تركيزات DHNA منخفضة تصل إلى 0.01 ميكروغرام / مل13،22.

figure-results-1
الشكل 3: تحليل قياس التيار الزمني ل Lactiplantibacillus plantarum plantarum EET بوساطة DHNA. تم حقن DHNA (20 ميكروغرام / مل) أو DMSO في إلكتروليتات mCDM (درجة الحموضة ~ 6.5) مع تحديد وقت الحقن على أنه t = 0. يمثل j كثافة التيار كدالة لمساحة القطب الكهربائي العامل. أجريت التجارب عند 200 مللي فولت مقابل Ag / AgCl باستخدام قطب كهربائي محسوس بالكربون (16 سم2) وتقليب. يتم رسم القيم كمتوسط ± sd تم الحصول عليها في مفاعلات BES ثلاثية. الاختصارات: EET = نقل الإلكترون خارج الخلية ؛ DHNA = 1،4-ثنائي هيدروكسي -2-حمض النفثويك ؛ DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد. mCDM = وسط محدد كيميائيا مع المانيتول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحليل قياس الجهد الدوري
لمزيد من التقييم لزيادة EET بوساطة DHNA في L. plantarum ، أجرينا قياس الفولتامتر الدوري بعد 24 ساعة من حقن DHNA. نعرض هنا آثار السيرة الذاتية لثلاثة شروط: L. plantarum مع 20 ميكروغرام / مل DHNA ، L. plantarum مع DMSO ، والوسائط مع 20 ميكروغرام / مل DHNA. كما هو موضح في الشكل 4 أ ، فإن وجود 20 ميكروغرام / مل DHNA في المفاعلات التي تحتوي على L. plantarum أدى إلى زيادة واضحة في التيار التأكسدي عند 50 مللي فولت لم تحدث في وجود DMSO وحده. تؤكد هذه البيانات أن إضافة وسيط الأكسدة والاختزال DHNA ضروري لتسهيل نقل الإلكترون بين L. plantarum والأنود. بينما لاحظنا العديد من قمم الأكسدة والاختزال الأصغر في L. plantarum + DMSO ، كانت هذه القمم مشابهة لتتبع التحكم في الوسائط ومن المحتمل أن تعزى إلى المكونات النشطة للأكسدة والاختزال في mCDM (الشكل التكميلي S1). في الشكل 4 ب ، قارنا آثار DHNA في ظل الظروف الحيوية (L. plantarum + DHNA) مقابل DHNA في ظل ظروف غير أحيائية (Media + DHNA). في حين أن كلا الأثرين أظهرا ذروة أكسدة DHNA مميزة حوالي 50 مللي فولت ، فقد لاحظنا زيادة مستمرة في التيار يتجاوز 50 مللي فولت فقط في ظل الظروف الحيوية. وصلت الذروة التحفيزية إلى كثافة تيار تبلغ 129 ميكرو أمبير / سم2 عند 300 مللي فولت ، وهو ما يمثل زيادة بنسبة 256٪ مقارنة بالأثر اللاأحيائي. هذا الدوران هو سمة من سمات EETالميكروبية 27 ، مما يشير إلى إعادة تقليل DHNA بواسطة L. plantarum الخلايا في وجود مصدر إلكترون (مانيتول) بعد أكسدة DHNA في الأنود. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر الأثر اللاأحيائي قمم تأكسدية جديدة حول -240 مللي فولت و -180 مللي فولت. تشير الأبحاث السابقة إلى أن ظهور هذه القمم قد يكون بسبب تدهور DHNA إلى ACNQ (2-أمينو-3-كربوكسي -1،4-نفثوكينون)21،28. لم نلاحظ هذه القمم في الأثر الحيوي ، مما يشير إلى أن تفاعل L. plantarum الخلايا مع DHNA قد يؤدي إلى استقرار DHNA ومنع التدهور. نقطة يجب ملاحظتها هي أن التتبع لمدة 24 ساعة للوسائط التي تحتوي على 20 ميكروغرام / مل DHNA تم إجراؤه بشكل منفصل وفقا لهذا البروتوكول دون إضافة خلايا.

figure-results-2
الشكل 4: آثار قياس الفولتامتر الدوري التمثيلي. تم إجراء جميع تجارب السيرة الذاتية في mCDM باستخدام لباد الكربون (16 سم2) كقطب كهربائي يعمل بمعدل مسح 2 مللي فولت / ثانية أثناء تقليب المحلول. (أ) آثار السيرة الذاتية ل Lactiplantibacillus plantarum مع DHNA (20 ميكروغرام / مل) أو DMSO عند t = 24 ساعة. (ب) آثار السيرة الذاتية ل 20 ميكروغرام / مل DHNA إما في L. plantarum (الظروف الحيوية) أو mCDM فقط (الظروف اللاأحيائية) عند t = 24 ساعة. الاختصارات: السيرة الذاتية = قياس الفولتامتر الدوري. mCDM = وسط محدد كيميائيا مع المانيتول ؛ DHNA = 1،4-ثنائي هيدروكسي -2-حمض النفثويك ؛ DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحليل الأس الهيدروجيني
أدى نشاط EET في L. plantarum إلى انخفاض ملحوظ في درجة الحموضة على مدى 24 ساعة. كما هو موضح في الشكل 5 ، متوسط الرقم الهيدروجيني للعينة ل L. plantarum المعرضة ل DHNA انخفض إلى 3.33 ± 0.01 (ص = 6.85 × 10-6 ، ن = 3) ، بينما انخفض متوسط درجة الحموضة في عينة L. plantarum المعرضة ل DMSO إلى 6.50 ± 0.06 (ص = 0.0409 ، ن = 3). كما هو موضح في الأبحاث السابقة ، يعزى هذا الانخفاض إلى زيادة في التمثيل الغذائي المخمر الذي يحدث عندما يقوم L. plantarum بإجراء EET13. L. plantarum عادة ما يستقلب المانيتول من خلال تحلل السكر والمسارات المخمرة ، والتي تنتج الأسيتات واللاكتات والإيثانول كمنتجات تخمير نهائي وتولد ATP من خلال الفسفرة على مستوىالركيزة 29. في ظل ظروف EET ، يزداد التدفق الأيضي من خلال التخمير ، وبالتالي زيادة إنتاج منتجات التخمير النهائي في وسائط BES13. يتسبب هذا التحول الأيضي في انخفاض درجة الحموضة في الوسائط بسرعة أكبر في المفاعلات التي تحتوي على DHNA مقارنة بمفاعلات التحكم DMSO.

figure-results-3
الشكل 5: تحليل الأس الهيدروجيني للنظام الكهروكيميائي الحيوي Lactiplantibacillus plantarum . تم جمع العينات عند t = 0 و t = 24 ساعة أثناء قياس التيار الزمني. يتم رسم القيم كمتوسط ± sd تم الحصول عليها في مفاعلات BES ثلاثية. تم تحديد الأهمية من خلال اختبار t أحادي الذيل. DHNA: قيمة P = 6.85 × 10-6. DMSO: قيمة P = 0.0409. الاختصارات: DHNA = 1،4-dihydroxy-2-naphthoic acid; DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: مكونات تحضير وسائط mMRS24. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: مكونات تحضير وسائط mCDM. هذا الجدول مأخوذ من Tejedor-Sanz et al.13 و Aumiller et al.25. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: مكونات تحضير وسائط M9. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: إعدادات معلمات EC-Lab لتقنيات OCV و CA و CV. الاختصارات: OCV = جهد الدائرة المفتوحة ؛ CA = قياس التوازن الزمني. السيرة الذاتية = قياس الفولتامتر الدوري. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الشكل التكميلي S1: آثار قياس الفولتامتر الدوري التمثيلي ل Lactiplantibacillus plantarum مع DMSO و mCDM وحدها. آثار السيرة الذاتية ل L. plantarum مع DMSO عند t = 24 ساعة و mCDM وحده عند t = 0 ساعة. تم إجراء جميع تجارب السيرة الذاتية باستخدام لباد الكربون (16 سم2) كقطب كهربائي يعمل بمعدل مسح 2 مللي فولت / ثانية أثناء تحريك المحلول. الاختصارات: السيرة الذاتية = قياس الفولتامتر الدوري. mCDM = وسط محدد كيميائيا مع المانيتول ؛ DHNA = 1،4-ثنائي هيدروكسي -2-حمض النفثويك ؛ DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام النظام الكهروكيميائي الحيوي المكون من ثلاثة أقطاب كهربائية والغرفتين الموصوف هنا ، أظهرنا قياس الجيل الحالي من EET بوساطة DHNA في L. plantarum. تولد تجارب BES هذه بيانات عالية الجودة. ومع ذلك ، فإن BESs حساسة. وبالتالي ، يعتمد نجاح البروتوكول على دقة المستخدم ، لا سيما في تجميع المفاعل والقطب المرجعي ، ووضع الإبر والأقطاب الكهربائية داخل الغرفة الأنودية ، واستبدال غشاء التبادل الكاتيوني. من الأهمية بمكان تجميع المفاعلات بعناية ، مما يضمن عدم تسرب المياه / الوسائط أثناء التعقيم أو التجريب. يمكن حل تسرب المياه عن طريق ضمان قطع أغشية التبادل الكاتيوني لتناسب الحلقة O بدقة وتشديد مشبك المفصل بإحكام الإصبع. من الضروري أيضا غمر الكربون بالكامل في الماء أثناء التعقيم للسماح له بأن يصبح محبا للماء للتجريب. نوصي المستخدمين الجدد بالسماح للمفاعلات المجمعة حديثا المملوءة بالماء بالجلوس لمدة ساعتين قبل التعقيم ، والتحقق من علامات التسربات البطيئة أسفل تقاطعات الزجاجة الرئيسية. علاوة على ذلك ، فإن ضمان تجميع القطب المرجعي المناسب يضمن تكرارا متسقا للبيانات عبر المفاعلات. إذا تغير لون فريت التفلون الموجود داخل الغلاف الزجاجي أو تشققه أو جفف ، فقد يتسبب ذلك في مقاومة عالية للقطب المرجعي. يمكن للمستخدمين استبدال الغلاف الزجاجي لاستعادة أداء القطب المرجعي.

يعد التوجيه الصحيح لجميع الإبر والأقطاب الكهربائية داخل الغرفة الأنودية أثناء التجربة أمرا بالغ الأهمية لنجاح التجربة. يجب ألا يتصل القطب المرجعي مباشرة بأي جزء من القطب الكهربائي العامل المحسوس بالكربون. يمكن للمستخدمين ضبط موضع شعر الكربون عن طريق تدوير سلك التيتانيوم الكهربائي العامل برفق من فوق المفاعل. بالإضافة إلى ذلك ، يجب ألا يؤدي وضع الإبرة لتقشير النيتروجين إلى اتصال مباشر بأقطاب كهربائية داخل الغرفة أو أي وصلات قطب كهربائي / جهد فوق الغرفة. يجب ضبط تيار النيتروجين بحيث لا يتدفق إلى أي من القطبين. أخيرا ، يجب على المستخدمين التأكد من أن قضيب التحريك لا يتصل بقطب العمل عن طريق وضع قطب العمل 1-2 سم فوق قضيب التقليب. إذا لوحظت إشارة غير منتظمة في OCV ، فيمكن حل ذلك عادة عن طريق ضمان الوضع المناسب للأقطاب الكهربائية وتيار النيتروجين داخل المفاعل ، والتحقق من صحة الوصلات بين خيوط الجهد وأقطاب المفاعل الصحيحة والآمنة. أخيرا ، تظهر تجربتنا أنه يمكن الاحتفاظ بوسطاء الإلكترون مثل DHNA داخل غشاء التبادل الكاتيوني وتسبب تيارا عاليا في الخلفية إذا أعيد استخدامها عدة مرات. نوصي باستبدال غشاء التبادل الكاتيوني بعد استخدامين إلى ثلاثة استخدامات، خاصة عند التحقيق في EET بوساطة، لضمان نتائج تجريبية موثوقة.

على عكس EET المباشر ، حيث يسهل الارتباط الميكروبي المباشر بالقطب نقل الإلكترون ، فإن EET بوساطة يتطلب انتشارا ثابتا لمكوكات الإلكترون عبر غشاء الخلية والقطب الكهربائي ، مما يؤدي إلى إعدادات BES الفريدة الموضحة هنا. أولا ، اخترنا BES مزدوج الغرفة على نظيره أحادي الغرفة في بروتوكولنا لفصل التفاعلات الأنودية والكاثودية بغشاء التبادل الكاتيوني. يمنع هذا الفصل وسطاء الإلكترون المنتشرين بحرية (DHNA) والميكروبات من التفاعل المتبادل مع الكاثود ، مما يضمن أن EET الميكروبي هو مصدر الإلكترون الرئيسي لتقليل وسطاء الإلكترون والأنود. يسمح الفصل أيضا بالتحكم الدقيق في المعلمات مثل تركيز / توزيع الوسيط والإمكانات الجاهزة للأنود. بالإضافة إلى ذلك ، اخترنا لباد الكربون كمادة أنود من بين خيارات أخرى مثل قضبان الجرافيت أو الأقطاب الكهربائية المعدنية أو الكربون الزجاجي أو أكسيد قصدير الإنديوم (ITO). وذلك لأن الهيكل المسامي ثلاثي الأبعاد للشعر الكربوني يوفر مساحة سطح أكبر بكثير من تلك الأقطابالكهربائية 30 ، مما يسمح بالاستخدام الفعال للوسطاء حتى عند التركيزات العالية. توفر إعدادات BES المكونة من ثلاثة أقطاب كهربائية وغرفتين قراءة موثوقة وقابلة للتكرار لتجربة EET الوسيطة حتى خلال المراقبة طويلة المدى. ومع ذلك ، فإن هذه العملية إنتاجية منخفضة نسبيا. هذا البروتوكول مناسب لفهم آليات EET على نطاق الطاولة أو لاختبار تطبيقات EET النموذجية. يمكن للباحثين النظر في معماريات BES البديلة مثل BESs المحمولة أو المطبوعة31،32 ، أو مصفوفات أشباه الموصلات التكميلية لأكسيد المعادن (CMOS)33 ، أو BESs34 المطورة لأغراض أساسية أو تطبيقية مختلفة.

في هذا البروتوكول ، نقدم تعليمات مفصلة للتقنيات الكهروكيميائية الأكثر استخداما: قياس التيار الزمني (CA) والقياس الفولتاميكي الدوري (CV). تجدر الإشارة إلى أن التقنيات الكهروكيميائية الأخرى ، مثل التحليل الطيفي للمقاومة الكهروكيميائية (EIS) وقياس الجهد النبضي التفاضلي (DPV) ، يمكن أن توفر رؤى أعمق في BES من خلال تحليل مقاومة نقل الشحنة والسعة مزدوجة الطبقة35،36،37. في حين أن بروتوكول BES هذا يتيح قياسات EET ، فإن استكمال البيانات الكهروكيميائية بنشاط التمثيل الغذائي وقياسات الكتلة الحيوية للخلية يمكن أن يكون ضروريا أيضا لإجراء تحليل شامل. الميكروبات مثل L. plantarum تشرك EET كواحد من أحواض الإلكترون جنبا إلى جنب مع منتجات التخمير الثانوية الأخرى مثل اللاكتات والإيثانول. علاوة على ذلك ، من الجدير بالذكر أن نمو الكتلة الحيوية للخلية يعمل أيضا كحوض للإلكترون13. لذلك ، فإن القياس الكمي للمتبرعين بالإلكترون المستهلك (على سبيل المثال ، المانيتول) ، وتقييم نمو الكتلة الحيوية للخلية ، ومراقبة المنتجات الثانوية للتخمير يوفر رؤى أعمق حول الكفاءة والتداعيات الفسيولوجية ل EET. عادة ما يتم قياس المستقلبات الخلوية باستخدام الكروماتوغرافيا والمقايسات الأنزيمية ، بينما يتم تقييم صلاحية الخلية ونموها عن طريق حساب وحدات تكوين المستعمرات وقياس الكثافة البصرية للوسائط المستهلكة عند 600 نانومتر ، على التوالي13. من المهم أيضا ملاحظة أن قياسات EET حساسة للاضطرابات الصغيرة في الظروف التجريبية. وهذا يشمل على سبيل المثال لا الحصر الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة وسرعة التقليب ومعدل تشبع غازالنيتروجين 38. لذلك ، فإن تطبيع مستويات EET المقاسة مع قياسات التحليل الحيوي يعمل كعنصر تحكم داخلي ، مما يسهل التقييم المتسق عبر التجارب التي أجريت في أيام مختلفة.

من خلال الجمع بين التقنيات الكهروكيميائية والقياسات التحليلية الحيوية الأخرى ، يخلق EET بوساطة فرصا جديدة للتخمير الكهربائي والتحفيز الكهربائي الحيوي. يشكل الاستخدام التقليدي للمحفزات الكهربائية العضوية أو غير العضوية أو الأنزيمية تحديات بسبب تكلفتها العالية وعرضة للتدهور. بدلا من ذلك ، يوفر استخدام الميكروبات كمحفزات كهربائية حية حلا أقل تكلفة وأكثر قابلية للتطوير بسبب قدرات الميكروبات على الإصلاح الذاتي والنسخ الذاتي39. L. plantarum ، المعترف بها عموما على أنها بكتيريا حمض اللاكتيك الآمنة ، هي هيكل مثير للاهتمام بشكل خاص. باستخدام الإعدادات الكهروكيميائية المتطابقة الموضحة في هذا البروتوكول ، أظهرنا سابقا أن L. plantarum يمكن أن تخمر عصير اللفت في ظل ظروف EET وتسريع التدفق الأيضي نحو إنتاج المزيد من المنتجات النهائية للتخمير مثل اللاكتات والأسيتات والسكسينات13. هذه الأحماض العضوية هي مركبات نكهة أساسية في تخمير الطعام. هذا يعني أنه باستخدام التقنيات الكهروكيميائية ، يمكن اختطاف EET بوساطة في L. plantarum للتلاعب بالتدفق الأيضي أو تغيير نكهات الطعام أو إنتاج مواد كيميائية قيمة. تجدر الإشارة إلى أن التقنيات الكهروكيميائية المقدمة في هذا البروتوكول لا يمكن تطبيقها فقط على L. plantarum ولكن يمكن أيضا تطبيقها بشكل عام على الميكروبات الأصلية أو الهندسية الأخرى التي تؤدي EET40،41 بوساطة. يمكن اختيار وسطاء الإلكترون المختلفين ، مثل الفلافين ، والفيروسين ، والأحمر المحايد ، والفيريسيانيد ، واللوزون ، والميناديون بناء على آلية نقل الإلكترون للميكروب المحدد المستخدم22،42. علاوة على ذلك ، يمكن توسيع بروتوكول BES الذي تم إنشاؤه في هذا العمل ليشمل الجينات الكهربائية الخارجية التي تؤدي EET بدون وسيط كما هو موضح سابقا مع أنواع Shewanella و Geobacter 43،44. يجب استخدام وسيط نمو محسن لدعم النشاط الخلوي للميكروب المعين لتسهيل أداء EET. يقوم هذا البروتوكول بضبط المعلمات الخاصة ب EET بوساطة DHNA في L. plantarum ، ولكن من المتوقع إجراء تعديلات عند تطبيق وسيطات ميكروب وإلكترون مختلفة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ مصالح متنافسة يعلنون عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر أعضاء مختبر Ajo-Franklin على المناقشات الثاقبة حول تجميع BES والصيانة والخطوات الحاسمة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. تمت رعاية البحث من قبل مكتب أبحاث الجيش وتم إنجازه بموجب المنحة رقم W911NF-22-1-0239 (إلى C.M.A-F ، دعم RA) ومن قبل معهد الوقاية من السرطان والبحوث في تكساس ، منحة # RR190063 (إلى C.M.A-F ، دعم R.C. ، S.L. و B.B.K.). تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،4-حمض ثنائي هيدروكسي -2-النفثويك (DHNA)سيجما ألدريتش281255-25G
سلك تيتانيوم بقطر 1.0 مم045485.BY قطعإلى الحجم للعمل والأقطاب الكهربائية المضادة
120-C صفائح أكسيد الألومنيوم 9 × 11 بوصةجونسون كاشطة10108-15
3 مل محاقن بلاستيكيةثيرمو فيشر14955457العلمي
محلول 3M KCl مشبع بكلوريد الفضةMillipore Sigma60137-250ML
الكربون بسمك 6.35 ممThermo Fisher Scientific043200.RFمقطعة إلى 16 سم < sup > 2 < / sup> جولات
Ag / AgCl القطب المرجعيCH InstrumentsCH111
Air-Tite Premium تحت الجلد الإبرالحرارية فيشر العلمية14-817-102
AlK (SO) 4< / sub> * 12H2< / sub>OSigma-Aldrich237086-100G
سترات الأمونيوم ثلاثية القواعدMillipore SigmaA1332
Avanti J-15R جهاز طرد مركزيBeckman CoulterB99517
BD إبرة انزلاق دقيقة ، 18 جم × 1 بوصةThermo Fisher Scientific14-826-5G
BD إبرة انزلاقية دقيقة، 21 جم × 2 بوصةثيرمو فيشر Scientific14-821-13N
Bel-Art SP Scienceware Cleanware Aqua-Clear Water CondtionerThermo Fisher Scientific23-278339
BiotinMillipore SigmaB4639
CaCl2< / sub>Millipore SigmaC4901
الكالسيوم D- (+) - بانتوثيناتMillipore Sigma1087009
أحماض الكاساميناتMillipore Sigma2240-OP
غشاء التبادل الكاتيونيالأغشية الدوليةCMI-7000مقطعة إلى جولات تناسب BES O-ring
CoCl2< / sub> * 6H2< / sub>OMillipore SigmaC8661
CuSO4< / sub> * 5H2< / sub>OMillipore SigmaC8027
Cysteine-HCl * H2< / sub>OMillipore Sigma30129
DMSOMillipore Sigma5439001000
DS-11 + مقياس الطيف الضوئيDenovixN / A
EC-LAB SOFTWAREBioLogicN / A
ECO E 4 S دائري التدفئةLauda-BrinkmannCat. رقم 115 V; 60 هرتز: L001191
FeSO4< / sub> * 7H2< / sub>OMillipore Sigma215422
حمض الفوليكMillipore SigmaF8758
H3< / sub>BO3< / sub>Millipore SigmaB6768
محاقن الأنسولين مع BD Micro-Fine IV إبرةثيرمو فيشر Scientific14-829-1A
Lactiplantibacillus plantarum NCIMB8826N / AN / Aالمرجع: Tejedor-Sanz et al. ، 2022
Lactobacillus MRS BrothHiMediaM369
M9 BrothMilliport Sigma63011
كبريتات المغنيسيوم اللامائيةMillipore Sigma208094
كبريتات المنغنيز أحادية الهيدراتMillipore Sigma221287
مانيتولميليبور سيجماM1902-1KG
Mettler توليدو FiveEasy مقياس الأس الهيدروجينيHogentoglerF20-KIT
MgCl2< / sub> * 6H2< / sub>OMillipore SigmaM9272
MgSO4< / sub> * 7H2< / sub>OMillipore SigmaM2773
Millex - GV 0.22 & الصغيره; م وحدة تصفية غشاء PVDFMillipore SigmaSLGV004SL
MnCl 2< / sub > * 4H 2 < / sub >OMillipore Sigma203734
MnSO4< / sub> * H2< / sub>OMillipore Sigma221287
MOPSMillipore SigmaM1442
N2< / sub> غازAirgasمرشح NI UHP300قبل الاستخدام
Na2< / sub>MoO4< / sub> * 2H2< / sub>OMillipore Sigma331058
Na2< / sub>SO4< / sub>Millipore Sigma238597
NaClMillipore SigmaS988
NH4< / sub>ClMillipore SigmaA9434
حمض النيكوتينيكميليبور سيجماN-0761
حمض النتريلوتريأسيتيك (NTA) ميليبورسيجما72560
p-حمض أمينوبنزويكميليبور سيجماP9879
محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، محلول 10xثيرمو فيشر ScientificBP399-1
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةMillipore SigmaP8281
بوتنتيوستاتBioLogicVMP-300
ببتون البروتياز # 3باكتو211693
بيريدوكسين هيدروكلوريك ميليبورسيجماP6280
ريبوفلافينميليبور سيجما555682
RO10 منصة شريط التحريك المغناطيسيIKA3691000
أسيتات الصوديوم ثلاثي هيدراتميليبور سيجما935700
شريط التحريك ، على شكل بيضةثيرمو فيشر العلمي14-512-121ضع في غرفة أنود من BES
Thiamine HClMillipore SigmaV-014
حمض الثيوكتيك (& - حمض ليبويك)Millipore SigmaT-1395
TryptophanMillipore Sigma9136
Tween80Millipore SigmaP4780
فيتامين ب 12ميليبور سيجماV6629
مجموعة MCF جاكت ، 100 مل ، NW25 ، 2 × GL14 portAdams & amp Chittenden Scientific GlassNAمخصص
مستخلص الخميرةMillipore SigmaY1625
ZnSO4< / sub> * 7H2< / sub>OMillipore SigmaZ0251
شعر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. TerAvest, M. A., Ajo-Franklin, C. M. Transforming exoelectrogens for biotechnology using synthetic biology. Biotechnol Bioeng. 113 (4), 687-697 (2016).
  2. Chen, H., Dong, F., Minteer, S. D. The progress and outlook of bioelectrocatalysis for the production of chemicals, fuels and materials. Nat Catal. 3 (3), 225-244 (2020).
  3. Chen, H., et al. Fundamentals, applications, and future directions of bioelectrocatalysis. Chem Rev. 120 (23), 12903-12993 (2020).
  4. Lovley, D. R., Phillips, E. J. P. Novel mode of microbial energy metabolism: organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese. Appl Environ Microbiol. 54 (6), 1472-1480 (1988).
  5. Myers, C. R., Nealson, K. H. Bacterial manganese reduction and growth with manganese oxide as the sole electron acceptor. Science. 240 (4857), 1319-1321 (1988).
  6. Koch, C., Harnisch, F. Is there a specific ecological niche for electroactive Microorganisms. ChemElectroChem. 3 (9), 1282-1295 (2016).
  7. Zhao, J., et al. Microbial extracellular electron transfer and strategies for engineering electroactive microorganisms. Biotechnol Adv. 53, 107682(2021).
  8. Zhang, J., Li, F., Liu, D., Liu, Q., Song, H. Engineering extracellular electron transfer pathways of electroactive microorganisms by synthetic biology for energy and chemicals production. Chem Soc Rev. 53 (3), 1375-1446 (2024).
  9. Logan, B. E. Exoelectrogenic bacteria that power microbial fuel cells. Nat Rev Microbiol. 7 (5), 375-381 (2009).
  10. Logan, B. E., Rabaey, K. Conversion of wastes into bioelectricity and chemicals by using microbial electrochemical technologies. Science. 337 (6095), 686-690 (2012).
  11. Gu, L., Xiao, X., Yup Lee, S., Lai, B., Solem, C. Superior anodic electro-fermentation by enhancing capacity for extracellular electron transfer. Bioresour Technol. 389, 129813(2023).
  12. Boucher, D. G., et al. Bioelectrocatalytic synthesis: concepts and applications. Angew Chem Int Ed. 62 (46), e202307780(2023).
  13. Tejedor-Sanz, S., et al. Extracellular electron transfer increases fermentation in lactic acid bacteria via a hybrid metabolism. eLife. 11, e70684(2022).
  14. Martino, M. E., et al. Nomadic lifestyle of Lactobacillus plantarum revealed by comparative genomics of 54 strains isolated from different habitats. Environ Microbiol. 18 (12), 4974-4989 (2016).
  15. Fidanza, M., Panigrahi, P., Kollmann, T. R. Lactiplantibacillus plantarum-nomad and ideal probiotic. Front Microbiol. 12, 712236(2021).
  16. Duar, R. M., et al. Lifestyles in transition: evolution and natural history of the genus Lactobacillus. FEMS Microbiol Rev. 41 (Suppl_1), S27-S48 (2017).
  17. Kaushik, J. K., et al. Functional and probiotic attributes of an indigenous isolate of Lactobacillus plantarum. PLOS ONE. 4 (12), e8099(2009).
  18. Seddik, H. A., et al. Lactobacillus plantarum and its probiotic and food potentialities. Probiotics Antimicrob Proteins. 9 (2), 111-122 (2017).
  19. Siezen, R. J., et al. Phenotypic and genomic diversity of Lactobacillus plantarum strains isolated from various environmental niches. Environ Microbiol. 12 (3), 758-773 (2010).
  20. Light, S. H., et al. A flavin-based extracellular electron transfer mechanism in diverse Gram-positive bacteria. Nature. 562 (7725), 140-144 (2018).
  21. Tolar, J. G., Li, S., Ajo-Franklin, C. M. The differing roles of flavins and quinones in extracellular electron transfer in Lactiplantibacillus plantarum. Appl Environ Microbiol. 89 (1), e0131322(2023).
  22. Li, S., De Groote Tavares, C., Tolar, J. G., Ajo-Franklin, C. M. Selective bioelectronic sensing of pharmacologically relevant quinones using extracellular electron transfer in Lactiplantibacillus plantarum. Biosens Bioelectron. 243, 115762(2024).
  23. Blackburn, B., Alba, R., Hatch, A., Ajo-Franklin, C. M., Mevers, E. Understanding the Chemical Properties that Drive Extracellular Electron Shuttles. ChemRxiv. , (2024).
  24. De Man, J. C., Rogosa, M., Sharpe, M. E. A medium for the cultivation of Lactobacilli. J Appl Bacteriol. 23 (1), 130-135 (1960).
  25. Aumiller, K., et al. A chemically-defined growth medium to support Lactobacillus-Acetobacter sp. community analysis. PLOS ONE. 18 (10), e0292585(2023).
  26. Brooijmans, R. J. W., de Vos, W. M., Hugenholtz, J. Lactobacillus plantarum WCFS1 electron transport chains. Appl Environ Microbiol. 75 (11), 3580-3585 (2009).
  27. LaBelle, E., Bond, D. R. Cyclic voltammetry for the study of microbial electron transfer at electrodes. Bio-electrochemical systems: from extracellular electron transfer to biotechnological application. , (2009).
  28. Mevers, E., et al. An elusive electron shuttle from a facultative anaerobe. eLife. 8, e48054(2019).
  29. Dirar, H., Collins, E. B. End-products, Fermentation balances and molar growth yields of homofermentative Lactobacilli. Microbiology. 73 (2), 233-238 (1972).
  30. Huong Le, T. X., Bechelany, M., Cretin, M. Carbon felt based-electrodes for energy and environmental applications: A review. Carbon. 122, 564-591 (2017).
  31. Zhou, A. Y., Baruch, M., Ajo-Franklin, C. M., Maharbiz, M. M. A portable bioelectronic sensing system (BESSY) for environmental deployment incorporating differential microbial sensing in miniaturized reactors. PLOS ONE. 12 (9), e0184994(2017).
  32. Benjamin, S. R., de Lima, F., Nascimento, V. A. do, de Andrade, G. M., Oriá, R. B. Advancement in paper-based electrochemical biosensing and emerging diagnostic methods. Biosensors. 13 (7), 689(2023).
  33. Kumashi, S. R., et al. A CMOS multi-modal electrochemical and impedance cellular sensing array for massively paralleled exoelectrogen screening. IEEE Trans Biomed Circuits Syst. 15 (2), 221-234 (2021).
  34. Jadhav, D. A., et al. Scale-up of the bioelectrochemical system: Strategic perspectives and normalization of performance indices. Bioresour Technol. 363, 127935(2022).
  35. Kim, J., Cestellos-Blanco, S., Shen, Y., Cai, R., Yang, P. Enhancing biohybrid CO2 to multicarbon reduction via adapted whole-cell catalysts. Nano Lett. 22 (13), 5503-5509 (2022).
  36. He, Z., Mansfeld, F. Exploring the use of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) in microbial fuel cell studies. Energy Environ Sci. 2 (2), 215-219 (2009).
  37. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
  38. Zhang, X., Li, X., Zhao, X., Li, Y. Factors affecting the efficiency of a bioelectrochemical system: a review. RSC Adv. 9 (34), 19748-19761 (2019).
  39. Kornienko, N., Zhang, J. Z., Sakimoto, K. K., Yang, P., Reisner, E. Interfacing nature's catalytic machinery with synthetic materials for semi-artificial photosynthesis. Nat Nanotechnol. 13 (10), 890-899 (2018).
  40. Glasser, N. R., Saunders, S. H., Newman, D. K. The colorful world of extracellular electron shuttles. Annu Rev Microbiol. 71 (1), 731-751 (2017).
  41. Gemünde, A., Lai, B., Pause, L., Krömer, J., Holtmann, D. Redox mediators in microbial electrochemical systems. ChemElectroChem. 9 (13), e202200216(2022).
  42. Kundu, B. B., et al. Extracellular respiration is a latent energy metabolism in Escherichia coli. bioRxiv. , (2024).
  43. O'Brien, J. P., Malvankar, N. S. A simple and low-cost procedure for growing Geobacter sulfurreducens cell cultures and biofilms in bioelectrochemical systems. Curr Protoc Microbiol. 43 (1), A.4K.1-A.4K.27 (2016).
  44. Su, L., Fukushima, T., Ajo-Franklin, C. M. A hybrid cyt c maturation system enhances the bioelectrical performance of engineered Escherichia coli by improving the rate-limiting step. Biosens Bioelectron. 165, 112312(2020).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Three Electrode SystemMediated Electron TransferCyclic VoltammetryChronoamperometry TechniqueDHNA MediatorLactiplantibacillus PlantarumElectro Fermentation

مقالات ذات صلة